CN105018420A

CN105018420A - 一种间充质干细胞的分离及应用

Info

Publication number: CN105018420A
Application number: CN201410751907.1A
Authority: CN
Inventors: 向华
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2014-12-09
Filing date: 2014-12-09
Publication date: 2015-11-04

Abstract

本发明涉及一种间充质干细胞的分离及应用，主要涉及经关节镜手术获得大量来自关节各组织的间充质干细胞液，采用分段收集、离心等程序，富集其中细胞成分进行培养与扩增；富集的细胞经过贴壁生长、增殖、分化以及外源微生物污染检测等程序后，参照国际ISCT推荐的间充质干细胞标准对富集的干细胞纯度和均一性的鉴定分析，最后分别储存于主细胞库与工作细胞库用于细胞治疗。本发明充分利用了关节镜手术后的废弃液，分离出干细胞用于患者治疗。

Description

一种间充质干细胞的分离及应用

所属技术领域

本发明涉及一种间充质干细胞的分离及应用，并提供了一种关节镜冲洗液来源间充质干细胞的分离方法和再生修复治疗上的应用，属于医学技术领域。

背景技术

关节镜是一种观察关节内部结构的直径5mm左右的棒状光学器械，是用于诊治关节疾患的内窥镜。该器械从1970年开始推广应用。关节镜在一根细管的端部装有一个透镜，将细管插入关节内部，关节内部的结构便会在监视器上显示出来。因此，可以直接观察到关节内部的结构。关节镜不仅用于疾病的诊断，而且已经广泛用于关节疾病的治疗。关节镜手术是一种微创手术，开始主要应用于膝关节，后相继应用于髋关节，肩关节，踝关节，肘关节及手指等小关节等。

随着内镜技术在我国逐渐普及，关节镜手术已成为骨关节外科常规诊疗手段。至今在全身各系统内镜中，关节镜功能最全面、应用最广泛，并由此形成独立的关节镜外科。关节镜手术业务成为医院和科室绩效的增长点。

2008年，中国共有790个医院拥有关节镜系统设施，可以实施关节镜手术，这些医院主要集中在三甲医院；到了2012年，中国共有2640个医院拥有关节镜系统设施，可以实施关节镜手术，平均年增长率35％，覆盖几乎所有的三级医院和约30％的二甲医院。医院采购关节镜系统的预算并未受到经济危机和中国经济减速的影响。在北京、上海等一些发达城市其关节镜技术水平已经能够和发达国家媲美。关节镜手术已经开始从城市三级医院转向基层，适合我国国情，最大限度的覆盖了人群。

关节镜手术可治疗关节内各种炎症.如骨性关节炎滑膜炎、创伤性关节炎、类风湿性关节炎、结核性关节炎、化脓性关节炎，剥脱性骨软骨炎等，以及滑膜软骨瘤病；髌骨软化症；骨赘(骨刺)，游离体，滑膜皱壁，关节紊乱症，半月板损伤，关节囊粘连，各种关节内骨折，各部关节粘连及关节活动受限，各种不明原因的关节痛。

关节镜手术和关节切开术相比，具有下列优点：切口小，美观，可避免晚期因关节表面和运动部位的瘢痕而引起的刺激症状；属于微创手术，痛苦小，术后反应较小，患者易于接受；术后早期即可活动和使用肢体，避免长期卧床并发症，减少护理人员和费用；并发症相对较少；基本不影响关节周围肌肉结构，术后可早期进行功能锻炼，防止关节长期固定引起的废用和并发症；可以在近乎生理环境下对关节内病变进行观察和检查，有“把眼睛和手指放入关节内”之称，可对关节进行动力性检查，提高了诊断能力，某些疾病如滑膜皱襞综合征，是通过关节镜才确立的；关节镜可施行以往开放性手术难以完成的手术，如半月板部分切除术等。禁忌症少，如身体条件差不能行常规手术，但不一定禁忌关节镜手术。

关节镜也具有一些缺点，一是并非每个医生均有耐心进行关节镜手术，因为需经小切口用精细和易损的器械进行操作。二是在紧张的关节间隙内操作器械可能对关节软骨产生明显磨损和划痕，尤其是没有经验的医生。三是在最初使用关节镜操作时可能很费时间。四是专用器械繁杂而昂贵。

公开号为CN103796659A的中国专利公开了一种含胶原、透明质酸衍生物和哺乳动物脐带来源干细胞的软骨细胞治疗物，涉及一种医学复合性生物材料。更具体地，本发明涉及一种包含胶原和透明质酸衍生物的医学复合性生物材料。还有，本发明涉及一种软骨细胞治疗剂，其使用所述生物材料和源自哺乳动物脐带的干细胞。所述生物材料不导致免疫反应，具有优越的持久性，而且包含所述生物材料和干细胞的所述软骨细胞治疗剂使得能进行关节镜手术，由此减少患者的疼痛并有效治疗退行性关节炎和软骨损伤。

公开号为CN103031271A的中国专利公开了一种分离纯化胚胎脑神经干细胞的快捷方法，使用热转换聚合物N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇对神经细胞进行三维立体培养，利用神经干细胞可在凝胶环境中增殖并形成神经球的特性达到对神经干细胞的分离纯化之目的。形成的神经球经免疫荧光标记测定，表明约93％的细胞为Nestin阳性，说明此方法分离纯化神经干细胞简单有效。经此方法分离纯化的胚胎神经干细胞可以在体外分化形成神经元、少突胶质细胞和神经胶质细胞。

公开号为CN102676451A的中国专利公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：(a)取胎盘小叶，用PBS缓冲液充分冲洗，以去除胎盘中残留的血液；(b)将胎盘小叶剪成块状，加入含有组织消化酶的PBS缓冲液，再在37℃孵育消化；(c)将组织块用铜网过滤，必要时研磨以促使过滤；(d)将收集的过滤液离心，分离单个核细胞，再用MSC培养基悬浮所获得的细胞，然后在37℃、5％CO₂培养箱中培养；(e)待散在细胞形成克隆后，挑取各克隆细胞，用MSC培养基分别培养，待细胞融合后，用胰酶消化传代，即得胎盘间充质干细胞；以及任选的下列一个或多个步骤：(f)针对步骤(e)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；(g)将步骤(e)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；(h)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(g)的冻存细胞进行关联。

以上文献资料表明，对关节各组织如软骨组织、滑膜、滑液等，进行关节镜手术时所产生的大量冲洗液并没有充分利用，在手术过程中直接丢弃，而手术所需的干细胞通过其它方式获得，虽然所获得的干细胞排异低，还是会造成手术费用较高。

发明内容

本发明采用的技术方案包括：取经关节镜手术获得大量来自关节各组织(软骨组织、滑膜、滑液)的间充质干细胞液，采用分段收集、离心、膜过滤等程序，富集其中细胞成分进行培养与扩增；富集的细胞经过贴壁生长、增殖、分化以及外源微生物污染检测等程序后，参照国际ISCT推荐的间充质干细胞标准对富集的干细胞纯度和均一性的鉴定分析，最后分别储存于主细胞库与工作细胞库用于细胞治疗。

因此，本发明提供关节镜冲洗液来源间充质干细胞在再生修复中应用，步骤包括：

(1)关节液收集：用无菌的收集管对关节镜手术过程中冲洗液进行分段收集冲洗液，保存备用；

(2)将分段收集冲洗液在500g离心10～20min，所得细胞分别加入培养液后重新悬浮，按3×10⁵/ml浓度接种到培养瓶及事先放置有消毒盖玻片的12孔板中培养，培养液为含15％FBS的L-DMEM培养液，培养5～7d去除未贴壁的细胞后，获得贴壁细胞；

(3)合格供体材料档案：参照国际间充质干细胞标准对贴壁细胞进行纯度和均一性的鉴定分析，确定合格的间充质干细胞，建立相关档案，同时对合格的干细胞进行传代，4～5d传代一次；

(4)间充质干细胞的成软骨分化：将培养传代3次以上的干细胞，制成浓度为4×10⁵/ml的悬液，取1ml细胞悬液于15m1塑料离心管中，500g离心15min，使其形成细胞微团，小心吸去培养液，加入2ml无血清软骨诱导培养液，然后置于二氧化碳培养箱中培养，4天后首次换液，以后隔2天换液，在培养21天后取出培养的细胞团，检测成软骨分化效果；

(5)植入再生修复效果：将合格的间充质干细胞按一定浓度植入患者关节处，观察关节再生修复效果。

在一个具体实施方案中，步骤(1)所述保存条件是在无菌条件下，4℃储存小于4小时，运输过程中维持在4℃环境下。

在一个具体实施方案中，步聚(2)和(4)中所述细胞培养环境条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。

在一个具体实施方案中，步聚(4)中所述无血清软骨诱导培养液是指高糖DMEM(H-DMEM)含TGF-β11ng/mL、地塞米松10^－7mmol/L、维生素C 50mg/L，胰岛素6.25ng/L，转铁蛋白6.25ug/mL，牛血清白蛋白1.25ug/mL。

所述间国际充质干细胞标准是指参照国际细胞治疗学会(ISCT)推荐的间充质干细胞标准如CD44、CD90、CD105、CD147、CD271、CD166等。

在一个具体实施方案中，步聚(5)中所述植入干细胞浓度在50～4×10⁷/ml。

技术效果

1、本发明充分利用丢弃的关节镜冲洗液中的间充质干细胞，用于针对关节软骨病变的再生修复治疗。

2、通过废弃物再利用能获得大量干细胞，这将大大满足患者对干细胞的需要，也减少了动用患者其它部分干细胞的机率，免受二次手术伤害。

3、通过大规模培养通过关节镜冲洗液中的间充质干细胞，能大大降低了患者的医疗成本，提高了手术的成功率。

4、该方法获得的间充质干细胞分散性较好，不需要借助酶分离开，减少感染的机率，也有利于间充质干细胞的稳定。

附图说明

图1、培养的间充质干细胞P0代光镜下的形态图；

图2、培养的间充质干细胞P1代光镜下的形态图；

图3、培养的间充质干细胞P2代光镜下的形态图；

图4、培养的间充质干细胞P3代光镜下的形态图；

图5、培养的间充质干细胞成软骨分化的阿尔新蓝染色。

具体实施方式

下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任一个或类似实例。

实施例1：

用无菌的收集管对关节镜手术过程中冲洗液进行分段收集冲洗液，在无菌条件下，4℃储存小于4小时，运输过程中维持在4℃环境下。将分段收集冲洗液在500g离心10～20min，所得细胞分别加入培养液后重新悬浮，按3×10⁵/ml浓度接种到培养瓶及事先放置有消毒盖玻片的12孔板中培养，37℃、5％CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，培养液为含15％FBS的L-DMEM培养液，培养5～7d去除未贴壁的细胞后，获得贴壁细胞。

参照国际细胞治疗学会(ISCT)推荐的间充质干细胞标准如CD44、CD90、CD105、CD147、CD271、CD166等，对贴壁细胞进行纯度和均一性的鉴定分析，确定合格的间充质干细胞，建立相关档案，同时对合格的干细胞进行传代，4～5d传代一次见图1、2、3、4。

成软骨分化：将培养传代3次以上的干细胞，制成浓度为4×10⁵/ml的悬液，取1ml细胞悬液于15m1塑料离心管中，500g离心15min，使其形成细胞微团，小心吸去培养液，加入2ml无血清软骨诱导培养液，无血清软骨诱导培养液是指高糖DMEM(H-DMEM)含TGF-β11ng/mL、地塞米松10^－7mmol/L、维生素C 50mg/L，胰岛素6.25ng/L，转铁蛋白6.25ug/mL，牛血清白蛋白1.25ug/mL。然后置于37℃、5％CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养，4天后首次换液，以后隔2天换液，在培养21天后取出培养的细胞团，检测成软骨分化效果，见图5。

成骨分化：将培养传代3次以上的干细胞，制成浓度为3×10⁵/ml浓度接种到培养瓶及事先放置有消毒盖玻片的12孔板中传代培养，培养液为含15％FBS的L-DMEM培养液。接种24h后，更换培养液并加入10^-7mmol/L地塞米松，10ng/mLβ-甘油磷酸钠和50μg/mL维生素C，同样条件下继续培养，每2-3天用含新鲜的地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C的L-DMEM换液。培养7、14、21天时检测三向分化指标。

成脂肪分化：将培养传代3次以上的干细胞，制成浓度为4×10³个细胞/cm2的密度接种于100mm平皿内，加入含10％FBS的无酚红-DMEM培养基培养24h后换为成脂肪诱导液(胰岛素0.01mg/ml、0.2mM吲哚美辛、0.5mM IBMX、0.2μM地塞米松，10％FBS无酚红L-DMEM培养基)，同时加入相应试剂；每4d换一次培养液。培养7、14、21天时检测三向分化指标。

将合格的间充质干细胞按50～4×10⁷/ml直接植入10例患者关节处，观察关节再生修复效果，其中有9例患者修复效果很好，1例患者修复效果不明显。

成骨分化指标：

1)钙钴法ALP染色试剂配制：碱性磷酸酶孵育液(2％β-甘油磷酸钠25ml、2％巴比妥钠25ml、2％氯化钠5ml、2％硫酸镁2ml、蒸馏水50ml，依次混合后测定PH值9.2—9.4)、2％硝酸钴水溶液(硝酸钴2.0g蒸馏水加至100ml)、1％硫化铵水溶液(硫化铵1ml、蒸馏水99ml)。组织化学ALP染色方法：取P3代间充质干细胞的细胞爬片，漂洗后用用冷丙酮于-4℃冰箱中固定24h，更换冷丙酮2次。加入孵育液(预热至37℃)于37℃恒温箱中孵育3h，速洗一下。用2％硝酸钴水溶液处理2min，水洗三次一定要去除多余的硝酸钴。1％硫化铵水溶液(现配为宜)处理1min，常规脱水透明，中性树胶封固。ALP活性部位或分泌细胞呈棕黑色沉淀。

2)茜素红S法染色试剂配制：1％茜素红染液(1g茜素红S，100ml无水乙醇)。组织化学茜素红S法染色方法：取P3代间充质干细胞的细胞爬片，细胞爬片固定后，用茜素红染液染色2min，蒸馏水洗3次，在0.5％盐酸中速浸一下，水洗后用吸水纸吸干，二甲苯透明封固。结果观察：钙盐呈暗红色，无机铁呈紫色，核红染。

3)硝基苯磷酸二钠法细胞碱性磷酸酶活性检测：用吸管取96孔板内的培养液上清50ul，用PBS冲洗3遍，加入含25mmol/L二乙醇胺，1mmol/L氯化镁和6.7mmol/L PNPP的反应液，每孔150ul.37℃避光放置半小时,然后加0.1mol/L氢氧化钠100ul终止反应，用酶标仪于405nm波长下测定OD值。样品OD值在ALP标准曲线上读取酶活性值(U/L)。

ALP标准曲线的绘制：称取PNP0.0111克用三蒸水溶解后稀释至250ml,此时PNP的浓度为320umol/L.依次倍比稀释成160umol/L，80umol/L，40umol/L，20umol/L，10umol/L和5mol/L.相当于ALP1280U/L,640U/L,320U/L,160U/L,80U/L,40U/L和20U/L(活性值).用酶标仪。405nm波长下测定PNP的OD值。以ALP活性值作为自变量,对应的OD值作为应变量，求得直线回归方程。

4)传代培养7、14、21天qRT-PCR法检测细胞中的RUNX2(cbfa1)、OSX/osterix/SP7、BGLAP/OC(osteocalcin)的mRNA表达，内参GAPDH；

方法：细胞总RNA的提取：用Trizol公司的RNA提取试剂盒提取哺乳动物总RNA，方法按照试剂盒的说明书进行→逆转录PCR(RT-PCR)：逆转录是用日本Takara公司的 PrimeScript^TMRT-PCR Kit试剂盒进行的，按照试剂盒的说明书进行操作→Real time PCR：Real time PCR实验在ABI PRISM-7700序列检测系统(PE Applied Biosystems，美国)上进行。PCR反应用两步法进行，条件是95度30秒，然后95度5秒和60度34秒，持续40个循环。反应过程中使用的染料是带有荧光染料的PCR反应混合物SYBR Green Realtime PCR Master Mix。得到结果的Ct值(threshold cycle)定义为达到超出荧光信号的检测阈值时所需要的循环数。得到的数据用ABI公司(Applied Biosystems)提供的软件以2^–△△Ct的方法来计算。反应所需要引物合成如下：

5)诱导间充质干细胞的电镜观察：取诱导培养14天后的间充质干细胞，取出细胞爬片用PBS漂洗2遍，以去除培养液，3-4％戊二醛固定3h，1％四氧化锇固定，漂洗后常规乙醇梯度脱水，临近点干燥，喷金后扫描电镜观察。同时收集培养瓶中的细胞，消化后收集于1.5ml的离心管中，3-4％戊二醛固定24h，超薄切片，透射电镜观察细胞超微结构及细胞基质形成情况。

成软骨分化指标：

1)蛋白多糖Alcian Blue(奥辛蓝)染色：主要检查软骨组织和软骨细胞基质中酸性黏多糖(硫酸软骨素)的含量。Alcian blue染色阳性时细胞质染成蓝色，细胞核为红色，计算阳性细胞，去平均值计算阳性率。步骤如下：取诱导培养21天后的间充质干细胞细胞团，石蜡切片(制作同2.2.1)脱腊至水，蒸馏水浸洗3次；用alcian blue孵育5min,流水冲洗2min,麦氏苏木素复染5min,流水冲洗2min,晾干，显微镜下观察细胞的蛋白聚糖沉积。

2)Type-Ⅱ胶原免疫化学染色：阳性表现是棕黄色颗粒分布在细胞质内。SABC法:脱蜡、水化→PBS洗2次各5分钟→用蒸馏水或PBS配制新鲜的3％H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次→抗原修复→PBS洗5分钟→滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体→滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时→PBS洗3次各2分钟→滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃20分钟→PBS洗3次各2分钟→滴加试剂SABC 20℃-30℃20分钟→PBS洗4次各5分钟→DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色→脱水、透明、封片、镜检。

3)qRT-PCR检测SOX9、Aggrecan、Ⅱ型胶原的mRNA测定(方法同上)；反应所需要引物合成如下：

4)电镜观察：取诱导培养14天后的间充质干细胞，透射电镜观察细胞超微结构及细胞基质形成情况(方法同上)。

成脂肪细胞分化指标：

1)油红染色鉴定：诱导12d后，将各组细胞用10％中性缓冲福尔马林固定30min后蒸馏水洗涤；70％异丙醇稍洗，加入预先配制好的油红染液染色10min，70％异丙醇脱色，镜下观察照相。

2)qRT-PCR法：传代培养7、14、21天，细胞中的LPL、过氧化物酶增殖体激活受体PPARγ2、脂肪酸连接蛋白(aP2/FABP4)、LEP/Leptin的mRNA表达。

。

Claims

1.本发明提供一种间充质干细胞的分离及应用，步骤包括：

1)关节液收集：用无菌的收集管对关节镜手术过程中冲洗液进行分段收集冲洗液，保存备用；

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(1)所述保存条件是在无菌条件下，4℃储存小于4小时，运输过程中维持在4℃环境下。

3.根据权利要求1的方法，其中步聚(2)和(4)中所述细胞培养环境条件为37℃、5％CO₂、饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养。

4.根据权利要求1的方法，其中步聚(4)中所述无血清软骨诱导培养液是指高糖DMEM(H-DMEM)含TGF-β11ng/mL、地塞米松10^－7mmol/L、维生素C50mg/L，胰岛素6.25ng/L，转铁蛋白6.25ug/mL，牛血清白蛋白1.25ug/mL。

5.根据权利要求1的方法，其中步聚(5)中所述植入干细胞浓度在50～4×10⁷/ml。