CN101126078A - 胚胎干细胞的培养 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了方法、系统、和试剂盒，其用于在体外培养胚胎干细胞，其中所述方法、系统和试剂盒至少部分利用多孔膜插入物与固相支持物，其相互之间通过流体连通。

Description

胚胎干细胞的培养
相关申请的交叉参考
本申请要求2006年06月26日递交的美国临时专利申请No.60/816,514的优先权，通过引用将该文献整体在此并入本申请。
技术领域
本发明总的涉及细胞生物学领域。在某些具体的实施方式中，本发明提供了与干细胞生长相关的系统、试剂盒和方法。
背景技术
胚胎干细胞(ESC)可在受精后任何时间来源于胚前、胚胎或胎儿组织。各种类型干细胞的分离和培养以前已有过记载，参见例如Robertson，1997，Methods of Cell Biology 75：173；Thompson et al.1995，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：7844；Thompson et al.1998，Science 282：114；美国专利No.5,166,065；5,332,672；5,405,772；5,453,357；5,639,618；5,672,499；5,843,780；5,914,268；5,922,597；5,968,829；6,040,180；6,090,622；6,833,269；6,506,574；6,458,589；6,667,176；7,041,438；国际专利出版物WO99/20741。
当在合适条件下培养时，ESC能以未分化状态体外无限增殖，能保持正常的核型，以及能保持分化成所有三种胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的衍生器官的能力。
ESC有潜在的广泛应用。它们可用于药物开发领域和基础科学研究，在此指出的所述应用只是一部分。药物开发过程的早期开发涉及靶位鉴定和确认。靶位确认的一部分是利用遗传修饰的动物模型。除了药物开发，也要求开发功能缺失(“基因敲除”)和功能增加(“基因转入”)的动物模型，以基础阐释疾病发展路径和疾病状态。
人类干细胞可特别用于治疗广泛的疾病和病症，包括自身免疫疾病、传染病、器官和组织移植以及外伤和老化。培养和维持各种来源的人ESC为所有后续应用提供了起点。然而，培养人干细胞的任务令人沮丧。目前培养人干细胞的方法，通常涉及利用与人ESC直接接触而培养的饲养细胞(鼠胚胎成纤维细胞)，或者涉及在鼠胚胎成纤维细胞条件化的培养基存在下，将人ESC培养于基质例如胶原蛋白、纤连蛋白等等。
ESC是遗传修饰鼠模型开发的基本工具。为了确保用于ESC的遗传改变能在基因工程鼠的基因型中保持，ESC必须在培养操作、扩增和后续胚泡注射整个期间保持全部多能性。将ESC保持在未分化状态的要求，是克隆分离和扩增过程中的常规挑战。目前的方法典型地是通过将ESC与鼠胚胎成纤维细胞(MEF)饲养层细胞共培养而完成的，其中在共培养时，两类细胞直接接触。该方法目前在96孔组织培养处理板上进行。
该工艺流程复杂，涉及在96孔板中培养MEF，用γ辐射或丝裂霉素C处理，将MEF有丝分裂去活以阻止其过度生长，以及接着在ESC胚泡注射前除去MEF。除了涉及许多步骤以外，ESC-MEF共培养物代谢也非常活跃，由于96孔制式中培养基体积较小，所以这要求培养基每天更换两次。
因此，体外培养和维持任何来源ESC的条件一般复杂、耗时、劳动强度高、困难而昂贵。因此，需要适合体外生长ESC的方法、系统和试剂盒，它们相对简单、容易使用，并能以最小的人力和财力付出提供稳定的结果。本文公开的本发明的某些实施方式满足这些需求。
发明内容
在某些实施方式中，本发明涉及ESC能培养在多孔膜表面上这个惊人发现。多孔膜可与包括饲养细胞在内的细胞培养物以流体连通，从而消除ESC与饲养细胞层或含胞外基质蛋白的基材或它们两者直接接触的需要。
在某些实施方式中，本发明提供的体外培养ESC的方法包括：a)使多孔膜表面与ESC接触；b)使固相支持物表面与饲养细胞，例如胚胎成纤维细胞、胎儿成纤维细胞接触；c)向所述ESC提供培养基；d)向饲养细胞提供培养基，其中多孔膜与d)中的培养基以流体连通。
在其它实施方式中，本发明提供了在含一孔或多孔的组织培养板中培养ESC的方法，其中每孔包括多孔膜插件和与该多孔膜插件以流体连通的固相支持物，其中所述方法包括：a)使多孔膜表面与ESC接触；b)使位于多孔膜插件下方的固相支持物表面与饲养细胞接触；c)向ESC提供培养基；d)向饲养细胞提供培养基。
在又一其它实施方式中，本发明提供了体外培养ESC的系统，所述系统包括固相支持物；与固相支持物以流体连通的多孔膜；以及适于培养ESC的培养基。本系统可进一步包括一种或多种下列物质：饲养细胞(例如胚胎成纤维细胞、胎儿成纤维细胞)、胚胎干细胞、培养基添加剂、哺乳动物血清、必需氨基酸、抗生素、遗传筛选转化体试剂、生长因子、以及白血病抑制因子(LIF)。
在再一其它实施方式中，本发明提供了培养ESC的系统，所述系统包括含一孔或多孔的组织培养板，其中每孔包括多孔膜插件和能与多孔膜插件以流体连通的固相支持物以及适于培养ESC的培养基。该系统可进一步包括含成纤维细胞例如胚胎成纤维细胞、胎儿成纤维细胞的饲养细胞、和/或ESC、培养基添加剂、哺乳动物血清、必需氨基酸、抗生素、用于遗传筛选转化体的因子、生长因子、以及白血病抑制因子(LIF)。
在进一步实施方式中，本发明提供了培养ESC的试剂盒，所述试剂盒包括固相支持物；与固相支持物以流体连通的多孔膜；至少一种容器；以及培养ESC的说明书。该试剂盒任选地可包括一种或多种下列物质：适于培养ESC的培养基；适于培养胚胎成纤维细胞的培养基；ESC；饲养细胞，例如胎儿成纤维细胞、胚胎成纤维细胞；一种或多种缓冲液或洗涤液；以及培养基添加剂。
附图说明
图1显示了适用于本发明特定实施方式中的组织培养板的一个实例，所述培养板包括适于体外培养ESC的多孔板。
图2显示了于96孔板中体外培养的ESC培养物的照片，其中每孔包括0.4μm的PCF膜上层孔，所述膜上层孔插入含饲养细胞的塑料下层托盘。图2a显示了培养于不同条件下6天后碱性磷酸酶活性染色的ESC克隆。图2b显示了培养于不同条件下碱性磷酸酶活性染色的连续稀释用于克隆筛选的ESC克隆。
图3显示了于96孔板中体外培养的ESC培养物的照片，其中每孔包括1.0μm的PET膜上层孔，所述PET膜上层孔插入至塑料下层饲养盘。该图比较了用丝裂霉素C和白血病抑制因子(LIF)处理或者单独使用丝裂霉素C处理的饲养细胞层。
图4显示了于96孔板中体外培养的ESC培养物的照片，其中每孔包括1.0μm的PET膜上层孔，所述PET膜上层孔插入至塑料下层饲养盘。饲养孔包括：鼠胚胎成纤维细胞(MEF)；MEF和LIF；仅LIF；或除培养基外的饲养盘空白。
具体实施方式
培养胚胎干细胞的方法
在特定实施方式中，本发明提供了体外培养ESC的方法，所述方法简单、可靠且相对容易操作。所述细胞可保持在未分化状态。在一些实施方式中，所述方法包括将ESC与饲养细胞共培养，但消除了在饲养细胞层和ESC层之间直接物理接触的需要。因此，本发明提供了体外培养ESC的方法，其中ESC可在物理和空间上与饲养细胞层分离，如借助多孔膜，以使经饲养细胞条件化的培养基能被ESC利用。饲养细胞层与ESC层的物理分离有数种潜在的优点。因为饲养细胞层的生长不再需要被抑制，所以饲养层细胞不再需要被有丝分裂去活。因此，可以消除因子例如丝裂霉素C或γ辐射的使用。这些因子都具有潜在毒性，由此可引起一些问题——这不仅涉及饲养细胞本身的良好，而且对于使用丝裂霉素C的情况，还涉及在这些条件下所产生的ESC的潜在下游应用。
从饲养细胞层物理分离ESC，也将有益于观察ESC克隆，例如通过显微镜观察，因此，本申请提供了一种更好的监测ESC的生长和状况的方法。此外，两层分离有利于分离和/或收集ESC克隆，所述克隆用于克隆稀释或下游操作，例如转染、植入至动物或胚泡。
在其它实施方式中，本发明提供了在多孔膜上培养ESC的方法。本发明人发现，多孔膜表面特别适于培养ESC，因此不需要一般用于培养人类ESC的含胞外基质蛋白的基材，多孔膜由此通过免除试剂花费而节省了时间和金钱。
ESC的接种密度可以根据培养盘或培养孔的大小调整。接种密度可由本领域的技术人员容易地确定。培养干细胞是为了从单细胞分离物扩增克隆(例如通过连续稀释)，或者是为了细胞分取(splitting)之后扩增已建立的细胞系。在前一种情况下，细胞从分取培养物典型稀释而扩增，以确保干细胞扩增的典型的细胞密度(即20-80％融合(confluence))，然后再分取，例如1∶2、1∶4，这取决于期望密度。在一些实施方式中，例如当ESC是人源细胞时，可培养细胞直至克隆达到合适大小而无论总培养物融合情况如何，然后分取。例如，当细胞接种至96孔膜板时(图1)，ESC可以每膜1-3000个细胞、1-2000个细胞、1-1500个细胞、10-1000个细胞、20-500个细胞、50-300个细胞的数量范围接种在多孔膜上。
饲养细胞可以每孔1-5000个细胞、1-3000个细胞、1-2000个细胞、1-1500个细胞、10-1000个细胞、20-500个细胞、50-300个细胞的细胞密度接种在固相支持物上，例如塑料盘或位于96孔板下的孔(图1)。典型地，可接种饲养细胞以使细胞形成单层——可得到1/3融合的初始单层。在将ESC接种在与饲养细胞培养物以流体连通的膜之前，可使所述细胞生长至融合。
适于培养ESC或饲养细胞例如鼠胚胎成纤维细胞的培养基，包括Dulbeco的改进的Eagle培养基(DMEM培养基，Dulbeco’s Modified EagleMedia)(Invitrogen，Carlsbad，CA)。本领域技术人员将理解，可以获得适于体外培养干细胞的广泛培养基，例如特制培养基(SpecialtyMedia)(Millipore Corporation，Billerica，MA)；ResgroTM(MilliporeCorporation，Billerica，MA)；StemXvivo(R&D Systems，Minneapolis，MN)。培养基可以补加血清，例如胎牛血清、经ES认证的血清(ES qualifiedserum)(Invitrogen，Carlsbad，CA)，抗生素，例如Pen Strep(Invitrogen，Carlsbad，CA)，非必需氨基酸(Invitrogen，Carlsbad，CA)，以及谷氨酰胺，例如Glutamax-1(Invitrogen，Carlsbad，CA)。某些ESC培养物可进一步补加白血病抑制因子，例如Esgro(Millipore Corporation，Billerica，MA)。
细胞
本发明某些实施方式涉及与饲养细胞系共培养干细胞。合适的干细胞可包括任何哺乳动物干细胞，例如下列来源的干细胞：包括人类、非人类灵长类动物、啮齿类、鼠、兔、牛、山羊、绵羊、狗、猫、等等。在一个实施方式中，干细胞例如ESC可以是鼠ESC。在另一个实施方式中，干细胞可以是例如人ESC。
干细胞可以是有能力形成外胚膜、组织和胚胎本身的全能干细胞。干细胞也可以是有能力形成生物体的大多数组织，例如内胚层、中胚层或外胚层所衍生组织的多能干细胞。干细胞可以是多能干细胞，例如造血干细胞。
干细胞可以分离自培养的胚泡并在培养中传代一次或多次，这样，可以选择来自单一祖先的克隆。干细胞可进行遗传操作以表达期望的性状或基因型。本领域的已知标准技术可用于将遗传物质转移至细胞，例如电脂质或电穿孔转染。转移的遗传物质可包括可选择标记，例如潮霉素抗性标记，等等。
在某些实施方式中，期望将ESC保持在未分化状态。几种标记可用于监测ESC分化。例如，细胞表面蛋白OCT-3/4和SSEA-1的高表达水平是未分化ESC的指征。类似地，高水平的碱性磷酸酶活性也是未分化ESC的指征。相反，ESC的分化以例如OCT-3/4、碱性磷酸酶表达、SSEA(人或鼠特异性的)的标记的缺失和/或胚层特异性标记的获得为指征。
任何合适的饲养细胞都可用于本发明。合适的饲养细胞可允许ESC生长和传代而不会有显著的细胞死亡或分化。不受任何特别理论的限制，据某些文献提示，饲养细胞是通过分泌合适的细胞因子来维持ESC存活和未分化，而其他文献最近提示，饲养细胞起海绵作用，其隔离了ESC所产生的生长因子。通过隔离正常将会导致ESC分化的因子，ESC保持于未分化状态。饲养细胞可以是成纤维细胞，例如胚胎成纤维细胞、胎儿成纤维细胞。成纤维细胞可来自脐带。成纤维细胞可以是哺乳动物来源的，例如人、鼠等等。
固相支持物和多孔膜
在本发明的某些实施方式中，固相支持物可作为培养饲养细胞的基材。作为本发明实施方式的一个实例，多孔板可用于培养ESC。该板可以包括由合适材料例如塑料构成的底部托盘，其可用于培养饲养细胞。接着，可将ESC培养于位于托盘顶部的多孔膜构成的插件。该插件包括连接或锁定装置以确保插件能稳定连接于底部托盘。此外，固相支持物可用作多孔膜基底，如下文所述。因此，多孔膜可位于固相支持物上或部分位于固相支持物内(例如围绕边缘)。固相支持物可由任何塑性材料构成，所述材料包括如聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯的聚合物，因此固相支持物可制成坚硬的非延展性平坦表面。
在某些实施方式中，固相支持物可包括一元设计，例如单一的组织培养孔、盘、板、瓶等等。例如，固相支持物可制成单一组织培养盘，其包括用于培养饲养细胞的含单孔的基底和位于该基底顶部或孔内的插件，其中所述插件包括适于培养ESC的固相支持物和多孔膜。或者，固相支持物可制成多元装置。在该实施方式中，基底可以包括一个或多个适于培养饲养细胞的孔，而插件可以制成含固相支持物和多孔膜、适于培养ESC的多孔板。典型地，形成固相支持物以使饲养细胞位于ESC基侧，并且ESC顶面暴露于多孔膜顶部。
在某些实施方式中，固相支持物可包括延展性聚合物，例如用于中空纤维生物反应器的纤维素管或乙酸纤维素管。如果该管是多孔的，那么它可以同时用作固相支持物和多孔膜。例如，ESC可培养于管的一侧，而饲养细胞培养于管的对侧。或者，饲养细胞和ESC都培养于管周围毛细管外空间中分离的管上。
用于本发明的多孔膜可以包括本领域已知的任何多孔材料。合适的多孔材料实例包括但不限于，聚对苯二甲酸乙二酯、聚合物涂覆纤维(如Millicell)(Millipore Corp.，Billerica，MA)、聚醚砜，聚酰胺、例如琼脂糖、纤维素、多糖、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、碳氟化合物、例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯醚))、聚碳酸酯、聚乙烯、玻璃、陶瓷、尼龙、以及金属。
系统
本发明的某些实施方式提供了体外培养干细胞的系统。所述系统可以包括固相支持物和与固相支持物以流体连通的多孔膜。固相支持物可适于培养饲养细胞，例如胚胎成纤维细胞。所述系统可包括一种或多种下列物质：适于培养ESC的培养基；适于培养饲养细胞的培养基；饲养细胞，洗涤缓冲液及用于间接共培养ESC和饲养细胞的添加剂，例如LIF、纤连蛋白或其它胞外基质蛋白。
试剂盒
在某些实施方式中，本发明也提供了用于体外培养ESC的试剂盒。该试剂盒可包括固相支持物；适于制成与固相支持物以流体连通的多孔膜；至少一种容器；以及ESC培养说明书。任选地，所述试剂盒可含有用于培养ESC和MEF的不同细胞培养基。该培养基可以液体或粉末形式提供。试剂盒也可包括细胞培养试剂和添加物，例如谷氨酰胺，必需氨基酸，等等。添加物也可以液体或粉末形式提供。类似地，试剂盒可包括一种或多种缓冲液和/或洗涤液。缓冲液和洗涤液也可以液体或粉末形式提供。试剂盒也可再包括细胞样品，例如ESC，饲养细胞，例如MEF。细胞可作为下游应用的起始材料，或者将细胞作为未来实验的对照。细胞可以每独立容器冷冻提供。固相支持物和多孔膜可以套装的且容易使用的预组装形式提供，或者它们可以非组装形式提供，其中非组装部分被任选地单独包装。说明书可以一种或多种语言提供，例如英语、法语、德语、日语等等。
实施例
实施例1：纤连蛋白包被方法
材料：
纤连蛋白0.1％溶液(Sigma，St Louis，MO)
未处理的原代CF-1品系小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(Chemicon，Temecula，CA)
MEF培养基：DMEM(Invitorgen，Carlsbad，CA)
10％胎牛血清(Hyclone Logan，UT)
1％Glutamax-1(Invitorgen，Carlsbad，CA)
1％PenStrep(Invitorgen，Carlsbad，CA)
1％非必需氨基酸(Sigma，St Louis，MO)
DPBS(Hyclone Logan，UT)
将纤连蛋白(0.1％溶液)(Sigma，St Louis，MO)于无菌DPBS中稀释至25μg/ml。加入DPBS中足够量的纤连蛋白(25μg/ml)以包被单孔托盘(约5-10mL/盘)。将托盘在室温下孵育至少45分钟。在接种MEF之前，除去过量的纤连蛋白。将存于-80℃冰箱的MEF解冻。在37℃水浴中轻摇MEF瓶。将MEF转移至含10mL预温MEF培养基的15mL管中。将细胞以1000rpm沉淀4分钟。除去上清液，将细胞重悬于新鲜的预温MEF培养基。将纤连蛋白包被的单孔饲养盘用MEF饲养细胞悬液接种。每单孔盘接种1.67×106MEF细胞，24小时内将产生95％融合。将板盖上盖子，37℃孵育过夜。
实施例2：胚胎干细胞与饲养细胞间接共培养
所用材料：
Millipore细胞培养滤板和单孔饲养盘，24孔，有0.4μm PCF膜或1.0μm PET膜
96孔0.4μm PCF膜(Millipore Corp.，Billerica，MA)
ESC培养基：去除(Knock out)DMEM(Invitorgen，Carlsbad，CA)
20％ES认证血清(Invitorgen，Carlsbad，CA)
1％Glutamax-1(Invitorgen，Carlsbad，CA)
1％PenStrep(Invitorgen，Carlsbad，CA)
1％非必需氨基酸(Sigma，St Louis，MO)
0.1％ESGRO(LIF)(Chemicon，Temecula，CA)
0.1％2-巯基乙醇(Invitorgen，Carlsbad，CA)
MEF培养基：
DMEM(Invitorgen，Carlsbad，CA)
10％胎牛血清(Hyclone Logan，UT)
1％Glutamax-1(Invitorgen，Carlsbad，CA)
1％PenStrep(Invitorgen，Carlsbad，CA)
1％非必需氨基酸(Sigma，St Louis，MO)
2％明胶溶液(Sigma，St Louis，MO)
未处理的原代CF-1品系小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)(Chemicon，Temecula，CA)
丝裂霉素C粉末(Sigma，St Louis，MO)
129/S6鼠胚胎干细胞(ESC)(Chemicon，Temecula，CA)
DPBS(Hyclone Logan，UT)
TrypLETMSelect(1X)，液体(Invitorgen，Carlsbad，CA)
碱性磷酸酶检测试剂盒(Chemicon，Temecula，CA)
0.1％纤连蛋白溶液(Sigma，St Louis，MO)
第1天，将T75培养瓶用10mL 0.1％明胶DPBS液包被，37℃孵育至少30分钟。将存于-80℃冰箱的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)解冻，在37℃水浴中轻摇MEF瓶。将MEF转移至含10mL预温MEF培养基的15mL管中。将细胞以1000rpm沉淀4分钟。除去上清液，将细胞重悬于新鲜预温MEF培养基。接种前从培养瓶去除过量明胶。将培养瓶用MEF饲养细胞悬液接种。细胞37℃孵育过夜。在T75培养瓶中每25mL MEF培养基用3.75-5×106MEF细胞，将在24小时内产生95％的融合。
第2天，用丝裂霉素C处理MEF饲养细胞，以有丝分裂去活细胞。丝裂霉素C用2mg粉状原料制备。将粉末溶于4mL无菌H2O中以制备500μg/mL溶液。MEF培养基所用工作浓度为10μg/mL。将细胞37℃孵育2小时。去除含丝裂霉素C的MEF培养基，将细胞用预温的DPBS洗涤3次(T75培养瓶每次洗涤10mL)。将新的胚胎干细胞(ESC)培养基加入，37℃孵育细胞直至准备接种ESC。将存于液氮罐的鼠ESC解冻。在37℃水浴中轻摇含细胞的瓶。将ESC转移至含10mL预温的ESC培养基的15mL管中。将细胞以1000rpm造粒4分钟。除去上清液，将细胞重悬于新鲜的预温ESC培养基。将含有丝分裂去活的MEF饲养细胞层和ESC培养基的培养瓶，用ESC悬液以每30mL ESC培养基4.5×106ESC细胞T75培养瓶接种。将细胞37℃孵育过夜。
第3天，用ESC培养基饲养MEF饲养层上的ESC。第4天，用ESC培养基饲养MEF饲养层上的ESC或者如果需要以1∶2的比例传代。通常，允许ESC生长至20-80％融合的密度，然后分取。第4天之后接着是第5-8天。ESC解冻后，在接种至多孔细胞培养滤板之前，一般进行2-3次传代。
第9天，用ESC培养基饲养MEF饲养层上的ESC。将单孔饲养盘用纤连蛋白DPBS溶液包被，室温孵育45分钟。母液是0.1％纤DPBS液。加入足量连蛋白(1000μg/mL)。所用工作浓度是25μg/mL无菌纤连蛋白DPBS液(25μg/mL)以包被单孔盘，每个托盘使用约5-10mL。去除过量纤连蛋白，单孔盘备用。
将存于-80℃冰箱的MEF解冻。在37℃水浴中轻摇细胞瓶。将MEF转移至含10mL预温的MEF培养基的15mL管中。将细胞以1000rpm造粒4分钟。除去上清液，将细胞重悬于新鲜的预温MEF培养基中。将包被有纤连蛋白的单孔饲养盘用MEF饲养细胞悬液接种。每单孔盘1.67×106MEF细胞通常可在24小时内产生95％的融合。将托盘盖上盖子，37℃孵育过夜。
第10天，根据下列方案，将ESC和MEF饲养细胞从T75培养瓶除去。将培养瓶用预温的DPBS洗涤2次(每次洗涤10mL)。每次洗涤，培养瓶应静置1-2分钟。去除DPBS，每培养瓶加入3mL TrypLE(Invitorgen，Carlsbad，CA)。将培养瓶室温孵育2-3分钟。在显微镜下观察培养瓶，当细胞成球并从培养瓶脱离时，加入ESC培养基以去活TrypLE(Invitorgen，Carlsbad，CA)。混好培养瓶并洗涤，以从培养瓶除去所有细胞。按下列方法将ESC从MEF饲养细胞中分离：将ESC/MEF细胞悬液转移至新T75培养瓶，37℃孵育45分钟；除去未附着细胞，将其转移至另一新T75培养瓶，37℃温育45分钟；除去未附着细胞，用ESC悬液接种细胞培养滤板孔。将每孔200-500细胞接种于96孔细胞培养滤板顶孔的100μl ESC培养基中。将每孔1000-1500细胞接种于24孔细胞培养滤板顶孔的400μlESC培养基中。去除单孔盘中的MEF培养基，换为ESC培养基，每盘使用32mL ESC培养基。将接种ESC的细胞培养滤板加至单孔盘中，将该装置37℃温育过夜。
第12天和14天，将ESC和MEF间接共培养物用ESC培养基饲养。
第16天，按制造商说明书，用试剂盒(碱性磷酸酶检测试剂盒)(SerologicalsCorporation，Norcross，GA)分析ESC的碱性磷酸酶活性。结果显示，培养于多孔膜与饲养细胞培养基有流体连通的ESC未分化(图2和3)。在培养基中含LIF(ESGRO)(Serologicals，Corporation，Norcross，GA)的实验中，LIF在测试ESC扩增期间以1000单位/ml的浓度使用，实验期间也以该指示的相同浓度(初步扩增后)使用。
说明书和权利要求书中所用的所有表示成分数量、反应条件等的数字，都应理解为在该所有情况下用术语“约”进行修饰。因此，除非有相反指示，说明书和所附权利要求书中所涉及的数量参数都应该是近似值，其可根据本发明所获寻求的期望属性变化。最少，且无意于限制在权利要求书的范围内应用等同原则，每数值参数应该根据重要数据的数值和常规舍入法来解释。
在不偏离其精神和范围的情况下，本发明可以有许多修饰和变化，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文记载的具体实施方式只是以实施例的方式提供，而不意味着任何方式的限制。应该想到，说明书和实施例只是例证，本发明的真实范围和精神应由下列权利要求书所指示。

Claims (22)

1.一种体外培养胚胎干细胞(ESC)的方法，包括：a)使多孔膜表面与ESC接触；b)使固相支持物表面与饲养细胞接触；c)向ESC提供培养基；d)向饲养细胞提供培养基，其中多孔膜与d)中的培养基以流体连通。
2.权利要求1的方法，其中ESC保持在未分化状态。
3.权利要求1的方法，其中ESC选自鼠胚胎干细胞和人胚胎干细胞。
4.权利要求1的方法，其中饲养细胞是成纤维细胞。
5.权利要求4的方法，其中成纤维细胞选自鼠成纤维细胞和人成纤维细胞。
6.权利要求5的方法，其中成纤维细胞是胚胎成纤维细胞。
7.权利要求1的方法，其中ESC培养基包括血清。
8.权利要求1的方法，其中ESC培养基任选地包括LIF。
9.权利要求1的方法，其中将多孔膜和固相支持物提供于多孔板内。
10.权利要求9的方法，其中多孔板选自6、12、48或96孔板。
11.权利要求1的方法，其中多孔膜由聚合物组成。
12.权利要求11的方法，其中聚合物选自聚对苯二甲酸乙二酯、聚合物涂覆纤维、聚醚砜、聚酰胺、琼脂糖、纤维素、多糖、聚四氟乙烯、聚砜、聚酯、聚偏二氟乙烯、聚丙烯、碳氟化合物、例如聚(四氟乙烯-共-全氟(烷基乙烯醚))、聚碳酸酯、聚乙烯、玻璃、陶瓷、尼龙、以及金属。
13.一种体外培养ESC的系统，所述系统包括固相支持物；与固相支持物以流体连通的多孔膜；以及适于培养ESC的培养基。
14.权利要求13的系统，进一步包括胚胎成纤维细胞。
15.权利要求13的系统，其中将多孔膜和固相支持物提供于多孔板内。
16.权利要求15的系统，其中多孔板选自6、12、48或96孔板。
17.权利要求13的系统，进一步包括ESC。
18.权利要求17的系统，其中ESC选自鼠ESC和人ESC。
19.一种培养ESC的试剂盒，所述试剂盒包括固相支持物；与固相支持物以流体连通的多孔膜；至少一种容器；以及ESC培养说明书。
20.权利要求19的试剂盒，其中将多孔膜和固相支持物提供于多孔板内。
21.在包含一孔或多孔的组织培养板中培养ESC的方法，其中每孔包括多孔膜插件和与多孔膜插件以流体连通的固相支持物，其中所述方法包括：a)使多孔膜表面与ESC接触；b)使位于多孔膜插件下方的固相支持物表面与胚胎成纤维细胞接触；c)向ESC提供培养基；d)向胚胎成纤维细胞提供培养基。
22.权利要求1的方法，其中培养基不含血清。
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