TWI693283B

TWI693283B - 一種微細胞層片的製造方法

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Publication number: TWI693283B
Application number: TW108108693A
Authority: TW
Inventors: 陳宗基; 楊智惠; 劉恆宇; 陳彥鈞; 丁僑萱; 劉曲婷
Original assignee: 三顧股份有限公司
Priority date: 2019-03-14
Filing date: 2019-03-14
Publication date: 2020-05-11
Also published as: TW202033762A

Abstract

本發明之微細胞層片的製造方法包含有下列步驟：提供具有一培養孔之培養結構，培養孔底部具有複數個凹陷；播植複數個標的細胞於培養孔，使部分標的細胞於凹陷處中培養一預定時間；使該等標的細胞脫離凹陷，而形成複數個微細胞層片。本製造方法可以規格化的量產微細胞層片，步驟簡單、流程快速不傷細胞且擁有高細胞回收率，並製作出高流動性、高存活率與高活性的微細胞層片。

Description

一種微細胞層片的製造方法

本發明提供一種微細胞層片的製造方法，尤其是一種具有高細胞存活率與高細胞活性的微細胞層片製造方法。

生物體的組織與器官易隨著年齡、外力或疾病感染等因素而受到損害，嚴重時甚至導致生理機能異常。人體自我修復的能力有限，通常只能尋求醫療技術的幫助。臨床上普遍以組織或器官移植做為修復的手段，但礙於捐贈源不足及免疫排斥等問題，而催生了再生醫學的興起。再生醫學之目的即是希望在體外的培養製備細胞組織，接著於體內移植細胞組織，使人體之受損組織達到形態、結構與功能上的重建。

細胞於體外培養過程會分泌細胞外基質，基質成分中含有大量的貼附蛋白，有助於細胞彼此相連並附著在培養基材表面。因此，當細胞擴增後，習知技術會利用蛋白酶使細胞脫離基材表面。但蛋白酶除了能裂解細胞外基質，同時也會破壞細胞膜的離子通道、生長因子受體及細胞與細胞間的連接，因而阻斷訊息傳遞，容易導致細胞失去分化能力。

近年來，再生醫學已經發展出一種細胞層片組織工程，可以在不使用蛋白酶的情形下，讓細胞脫離基材表面，並獲得結構完整的細胞層片。其中一種主流技術乃採用溫度敏感型高分子材料作為細胞培養基質，藉由材料具有隨環境溫度變化而產生相轉變的特性，使細胞自發地脫離培養基質，而獲得一徑長介於1cm~15cm且結構完整的生醫工程細胞層片。此種結構有利於移植手術時的操作，也利於細胞與患部緊密穩固的貼合，並維持細胞層片中細胞必要的生理代謝。因此，細胞層片技術已經逐漸利用於外科手術中，例如人工皮膚或人工角膜等。

然而，受限於創傷越小越好的原則，以及器官組織的封閉性要求下，部分的再生醫學手術中還不能選用尺寸較大的細胞層片做為治療手段。是以，細胞層片技術仍有許多開發的空間。此外，由於其優秀的細胞再生與修復能力，細胞層片技術同樣也可以被應用到醫美領域當中。然而，醫美手術對於精準細膩的要求通常遠高於失能組織的重建，但目前尚無有效的量產技術製造適當大小的細胞層片可便於施加在醫美手術的目標組織當中。

有鑑於此，本發明提出了一種微細胞層片的製造方法，量產的微細胞層片能保持高流動性、高存活率與高活性，因此有利於以注射方式施加在目標組織，例如器官組織間隙、皮膚皺紋、坑疤當中。

本發明之微細胞層片的製造方法包含有下列步驟：提供具有一培養孔之培養結構，培養孔底部具有複數個凹陷；播植複數個標的細胞於培養孔，使部分標的細胞於凹陷處中培養一預定時間；使該等標的細胞脫離凹陷，而形成複數個微細胞層片。其中，每一凹陷之面積小於30平方毫米。

於一具體實施例中，培養結構係一感溫培養皿，且包含有一步驟：調整感溫培養皿溫度至一溫度閾值之下，使該等標的細胞脫離凹陷，而形成該等微細胞層片。

其中，感溫培養皿之凹陷表面覆有溫度響應聚合物，溫度響應聚合物之溫度變化範圍在0℃~80℃之間。溫度響應聚合物可以是丙烯醯胺化合物、聚N-正丙基丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺化合物、聚N-正丙基甲基丙烯醯胺、聚N-異丙基丙烯醯胺、N-焥基取代丙烯醯胺衍生物、聚乙烯醇部分乙酸化物、或乙烯基醚衍生物。

於播植標的細胞於培養孔之步驟中，是以1x10⁴~1x10⁶/mL之細胞濃度播植標的細胞於培養孔。

於一具體實施例中，若培養孔之底部面積小於30平方公分，則播植5x10⁴~5x10⁵顆之標的細胞於該培養孔。

上述的預定時間係介於24小時至120小時之間。於一較佳實施例中，係為60小時至100小時之間。

上述的標的細胞可以是纖維母細胞或是幹細胞，於一實施例中，標的細胞混合了纖維母細胞和幹細胞。

綜上所述，本發明之製造方法可以規格化的量產微細胞層片，步驟簡單、流程快速不傷細胞且擁有高細胞回收率，並可製作出高流動性、高存活率與高活性的微細胞層片。產出的微細胞層片有利於以注射方式施加在目標組織。以本發明之製造方法製作出的微細胞層片可廣泛的應用於各種臨床應用，較大面積的細胞層片更有流動性與彈性，較單細胞更有穩定性和增殖能力。

1‧‧‧培養結構

10‧‧‧培養孔

100‧‧‧凹陷

2‧‧‧培養結構

20、20A、20B、20C‧‧‧培養孔

200‧‧‧凹陷

3、3A、3B、3C‧‧‧培養基

4‧‧‧標的細胞

42‧‧‧微細胞層片

S31~S33‧‧‧步驟

S51~S53‧‧‧步驟

圖1A與圖1B係繪示本發明一具體實施例中之培養結構示意圖。

圖2A與圖2B係繪示本發明另一具體實施例中之培養結構示意圖。

圖3係繪示本發明一具體實施例之步驟流程圖。

圖4A至圖4C係繪示本發明一具體實施例中標的細胞脫離凹陷形成微細胞層片之示意圖。

圖5係繪示本發明一具體實施例中之步驟流程圖。

為了讓本發明的優點，精神與特徵可以更容易且明確地了解，後續將以實施例並參照所附圖式進行詳述與討論。值得注意的是，這些實施例僅為本發明代表性的實施例，其中所舉例的特定方法，裝置，條件，材質等並非用以限定本發明或對應的實施例。

此外，本發明裝置或元件前的不定冠詞“一”、“一種”和“一個”對裝置或元件的數量要求(即出現次數)無限制性。因此“一”應被解讀為包括一或至少一，並且單數形式的裝置或元件也包括複數形式，除非所述數量明顯指單數形式。

在本發明中，若非特別指稱，則所述的標的細胞、細胞、微細胞層片係培養、存放、處理或流動於培養液、培養基、等滲透壓液體或生理食鹽水等可以長期或短期維持細胞存活與機能的液體之中，尤其是添加血清(FBS)的培養基。

本發明提出了一種微細胞層片的製造方法，此製造方法可以量產微細胞層片，並且使微細胞層片保持高流動性、高存活率與高活性，因此有利於以注射方式施加在目標組織，例如器官組織間隙、皮膚皺紋、坑疤當中，然而本發明所製造之微細胞層片並不限於上述用途。

請參閱圖1A、1B、2A和2B。圖1A與圖1B係繪示本發明一具體實施例中之培養結構1示意圖。圖2A與圖2B係繪示本發明另一具體實施例中之培養結構2示意圖。培養結構1可以是單一的培養皿(culture dish)，具有單一個培養孔10，如圖1A所示。培養皿徑長可介於2公分~15公分之間，底面積可介於3平方公分至180平方公分之間。培養孔10用以承裝培養基3，培養孔10內的培養基3覆過每個凹陷100。培養孔10內所有凹陷100中的標的細胞共用相同培養基3。每個凹陷100的形狀與大小相同或相似，且俯瞰時凹陷100可以是方形、圓形或其他圖形。每一凹陷100之面積介於1平方毫米至30平方毫米之間。於一具體實施例中，凹陷100係為邊長3毫米的正方形，其面積約為9平方毫米。凹陷100的底部塗覆有溫度響應聚合物之一塗層，適於標的細胞貼附，而相對突起處則不塗覆該塗層。藉由塗層與凹陷的設計，標的細胞傾向貼附於凹陷100的底部，而不易貼附於相對突起處。因此，相同凹陷100中的標的細胞在培養後可以細胞外基質相連形成，但不同凹陷100中的標的細胞不會以細胞外基質相連。

如圖2A所示，於另一具體實施例中，培養結構2也可以是具有多個培養孔20的多孔盤，例如4-well plate、6-well plate、12-well plate、24-well plate、48-well plate、96-well plate或384-well plate，如圖2A是繪示6-well plate的培養結構2。此時，培養孔直徑長可能介於8毫米至50毫米之間，底面積可能介於50平方毫米至2000平方毫米之間。培養孔20用以承裝培養基3，培養孔20內的培養基3覆過每個凹陷200。一個培養孔20內所有凹陷200中的標的細胞共用相同培養基3。凹陷200的形狀、大小、塗層、功效與前述的凹陷100相同或相似，於此不再贅述。然而，不同培養孔20並不會共用培養基。例如於圖2B中，培養孔20A、培養孔20B與培養孔20C內的培養基3彼此獨立，但培養孔20A內所有的凹陷200共用同一培養基3A，培養孔20B內所有的凹陷200共用同一培養基3B、培養孔20C內所有的凹陷200共用同一培養基3C。此外，培養結構也可以是非公訂規格結構，本發明僅限制培養結構應具有一個或多個獨立的培養孔，且每個培養孔具有複數個凹陷。

請參閱圖1A、1B、2A、2B和圖3。圖3係繪示本發明一具體實施例之微細胞層片製造方法的步驟流程圖。上述的兩個具體實施例中，皆適用於圖3的微細胞層片製造方法。以圖1A、1B之實施例為例，此製造方法包含有下列步驟：於步驟S31，提供具有一培養孔10之培養結構1，培養孔10底部具有複數個凹陷100；步驟S32，播植複數個標的細胞於培養孔10，使部分標的細胞於凹陷100處中培養一預定時間；步驟S33，使該等標的細胞脫離凹陷，而形成複數個微細胞層片。

習知技術中一個培養孔培養出的細胞會全數相連，形成大面積的細胞層片。為了達到本發明之目的，若單純縮小培養孔的面積，增加培養孔數量，則會不利於人工操作的靈活性，並且增加操作程序的處理時間，進而使細胞存活率、可靠性、再現性(repeatability)降低。因此，習知技術不利於量產細胞層片。藉由本發明的培養結構、培養孔與凹陷的設計，可以在單一培養孔中培養形成多個微細胞層片，但單一微細胞層片的細胞數量介於5x10¹顆到5x10⁴顆之間，而可形成多群、面積小、規格化的微細胞層片。此外，亦可以用相同的概念加大培養孔的尺寸，例如徑長15公分以上培養孔，並且相對地增加播植的細胞數量，可以一次獲得更多的微細胞層片數量。

於一種形成小面積細胞層片之習知作法中，係先以一般的培養基形成大面積的細胞層片，接著利用刀具將大面積細胞層片切成所需尺寸的小面積細胞層片。於此技術中，固然可形成與本發明相似形狀的微細胞層片，但同時卻殺死了為數眾多的細胞。相較於本發明，習知技術的收穫/播植比率較低；更嚴重的是，細胞被剪切後胞器與酵素等物質散布到環境中，引發其它存活細胞的發炎反應，不利於後續的移植手術。相較之下，本發明並非以傷害細胞的形式形成小面積細胞層片，而是在培養過程中便自然地形成複數個小面積的微細胞層片，因此本發明具有低發炎反應，提升生物相容性的功效。

請參閱圖4A至圖4C以及圖5。圖4A至圖4C係繪示本發明一具體實施例中標的細胞脫離凹陷形成微細胞層片之示意圖。此示意圖並不代表實際的標的細胞4和凹陷100之比例。圖5係繪示本發明另一具體實施例之微細胞層片製造方法的步驟流程圖。於一具體實施例中，培養結構係一感溫培養皿，且包含有下列步驟：於步驟S51，提供具有一培養孔之感溫培養皿，培養孔底部具有複數個凹陷100；於步驟S52，播植複數個標的細胞於培養孔，使部分標的細胞於凹陷100處中培養一預定時間；以及，於步驟S53，調整感溫培養皿溫度至一溫度閾值之下，使該等標的細胞4脫離凹陷100，而形成該等微細胞層片42。

利用感溫培養皿的溫度變化可以避免使用胰蛋白酶，進而降低脫離標的細胞4時對細胞的傷害。然而，本發明中使標的細胞脫離凹陷形成微細胞層片的方法不限於利用感溫培養皿。

於本發明之一實施例中，利用低濃度胰蛋白酶和乙二胺四乙酸(EDTA)處理細胞數秒至數分鐘，分解標的細胞4之附著蛋白，使標的細胞4脫離凹陷100。於另一具體實施例中，使用適當的刮杓，物理性的刮落標的細胞4。於另一具體實施例中，使用敲擊培養皿側邊的方式，物理性的使標的細胞4脫離。再於一具體實施例中，使用微量吸管、吸管或滴管，以液體沖刷細胞而使細胞脫離。再於一具體實施例中，可以先在凹陷底部塗覆刺激應答型聚合物，再將標的細胞種植於凹陷100。刺激應答型聚合物指材料本身的結構或物理性質會隨外在環境刺激(如：溫度、酸鹼值、電場或磁場等)而發生轉變。上述的脫離實施例視實驗的細胞種類、培養方式而可能略為不同，亦可以合理的組合多種脫離方式。但本發明使標的細胞4脫離的手段不限於上述方式。

上述的感溫培養皿覆有之刺激應答型聚合物係為溫度響應聚合物，隨著溫度變化而發生水合與水解，溫度變化範圍在0℃~80℃之間，較佳為10℃~50℃之間，更佳為20℃~40℃之間。超過80℃或低於0℃可能導致細胞死亡。溫度響應聚合物具有下限臨界溶解溫度(LCST)和/或具有上限臨界溶解溫度(UCST)。當環境溫度低於下限臨界溶解溫度或是高於上限臨界溶解溫度時，溫度響應聚合物溶解，附著於其上的細胞無法吸附而自然地整片脫離。溫度響應聚合物具體可以是丙烯醯胺化合物、聚N-正丙基丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺化合物、聚N-正丙基甲基丙烯醯胺、聚N-異丙基丙烯醯胺、N-焥基取代丙烯醯胺衍生物、聚乙烯醇部分乙酸化物、或乙烯基醚衍生物，也可以是上述兩種以上的聚合物的混合。

於播植標的細胞於培養孔之步驟中，是以1x10⁴~1x10⁶/mL之細胞濃度播植標的細胞於培養孔。例如1x10⁴、2x10⁴、5x10⁴、1x10⁵、2x10⁵、5x10⁵、或1x10⁶，根據不同細胞種類可能有不同的最適濃度。

於一具體實施例中，若培養孔之底部面積介於0.5平方公分至30平方公分之間，則播植5x10⁴~5x10⁵顆之標的細胞於該培養孔。例如，底部面積約為9平方公分，則播植1x10⁵顆之標的細胞。在部分實施例中，以此數量播植標的細胞4於此範圍大小之培養孔，可以獲得較佳的細胞數量以及活性。

上述的預定時間係介於24小時至120小時之間。於一較佳實施例中，係為60小時至100小時之間。依據此預定時間培養標的細胞再使其脫離，可以確保細胞已穩定活性、細胞已貼附於培養孔的凹陷當中、且細胞經過一定程度的擴增。

形成的微細胞層片42可以是任意形狀，例如球狀，丸狀，聚集體，圓柱形，皺褶片狀或任何適當的構型。

每個微細胞層片可以包含有50~5000顆標的細胞；於較佳的實施例中，每個微細胞層片包含有500~2000顆標的細胞。於一具體實施例中，每個培養孔培養後獲得的細胞總數約略相同於播植時的細胞總數。每個微細胞層片的面積為0.1平方毫米到30平方毫米；於較佳的實施例中，每個微細胞層片的面積為0.25平方毫米到10平方毫米；於較佳的實施例中，每個微細胞層片的面積為1平方毫米到9平方毫米。

標的細胞之種類並無限制。上述的標的細胞可以是纖維母細胞(fibroblast)，例如NIH 3T3、Swiss 3T3、10T1/2等細胞株系或是初代細胞(Primary Cell)。上述的標的細胞可以是幹細胞，例如全能幹細胞(Pluripotent stem cell)、多功能幹細胞(Multipotent stem cell)、或專一性幹細胞(Unipotent stem cell)，尤其是間質幹細胞(mesenchymal stem cells)。上述的標的細胞可以是肌肉母細胞(myoblast)、肌纖維母細胞(myoblasts)、癌細胞(cancer cell)或是癌細胞株(cancer cell line)、心肌細胞、內皮細胞、血管內皮細胞、內皮前體細胞、來自骨髓之細胞、來自脂肪之細胞。標的細胞可以是其他未提及但可於體外培養之細胞。標的細胞可以是混合上述的任2種以上細胞的混合物。

於一較佳實施例中，標的細胞混合了纖維母細胞和間質幹細胞。纖維母細胞和間質幹細胞混和培養時，纖維母細胞作為滋養層細胞，滋養層細胞的代謝產物利於其它細胞生長，可提供間質幹細胞重要的生長因子，以使間質幹細胞生長、增殖並維持未分化狀態。因此混合兩者培養而獲得的微細胞層片有較佳的活性、存活率、功能性與生物相容性。

本發明中使用的標的細胞可列舉從活體組織直接採取的細胞或細胞株，對於其種類無限制。細胞的來源亦無限制，可列舉如人、大鼠、小鼠、豚鼠、猴、兔、狗、貓、羊、豬、猩猩。

以下將概略性介紹根據一具體實施例之微細胞層片製造方法的實際步驟，但本發明並非限制於此實施例。首先，提供一個3.5cm培養盤，該培養盤之底部具有多條垂直交錯的牆體，以使牆體之間形成有複數個凹陷，每個凹陷約形成有3mm x 3mm的面積，並在凹陷塗佈有N-異丙基丙烯醯胺聚合物並使聚合物固定化。根據常規方法從小鼠體中取得纖維母細胞，經清洗後以DMEM+10%FBS為主的培養基培養纖維母細胞，儲放至37℃、5% CO₂的恆定培養箱中，直至貼附至培養盤底部。根據常規方法從小鼠體中取得脂肪間質幹細胞，經清洗後以播植1x10⁵顆細胞於纖維母細胞之上，共培養72小時。72小時後多數的纖維母細胞與脂肪間質幹細胞將貼附於凹陷處。接著從培養箱中取出培養皿，移除培養基並以PBS清洗培養皿。接著使培養皿降溫至20℃的溫度中30分鐘，此時細胞將部分或完全脫離凹陷處而形成微細胞層片，未完全脫離的細胞再使用微量吸管輕輕沖刷。細胞數約為1x10⁵顆，之後可直接進行移植或長期保存。

相較於細胞層片，微細胞層片具有更佳的流動性、功能性與移植彈性；而相較於未形成層片或連結的單一細胞，以微細胞層片的方式進行移植，具有易形成細胞群落、細胞交換訊息與營養、和有序匯合排列細胞的能力，進而提升細胞增殖力和穩定性。

綜上所述，本發明之製造方法可以規格化的量產微細胞層片，步驟簡單、流程快速不傷細胞且擁有高細胞回收率，並製作出高流動性、高存活率與高活性的微細胞層片。產出的微細胞層片有利於以注射方式施加在目標組織。以本發明之製造方法製作出的微細胞層片可廣泛的應用於各種臨床應用，較大面積的細胞層片更有流動性與彈性，較單細胞更有穩定性和增殖能力。

藉由以上較佳具體實施例之詳述，係希望能更加清楚描述本發明之特徵與精神，而並非以上述所揭露的較佳具體實施例來對本發明之範疇加以限制。相反地，其目的是希望能涵蓋各種改變及具相等性的安排於本發明所欲申請之專利範圍的範疇內。因此，本發明所申請之專利範圍的範疇應該根據上述的說明作最寬廣的解釋，以致使其涵蓋所有可能的改變以及具相等性的安排。

S31~S33‧‧‧步驟

Claims

一種微細胞層片的製造方法，其包含有下列步驟：提供具有至少一培養孔之一培養結構，該培養孔之底部具有複數個凹陷，每一該凹陷之面積小於30平方毫米，該培養孔之底部面積大於50平方毫米；播植複數個標的細胞於該培養孔，使部分該等標的細胞於該等凹陷中培養一預定時間；以及使該等標的細胞片狀地脫離該等凹陷，而形成複數個微細胞層片。
如申請專利範圍第1項所述之微細胞層片的製造方法，其中該培養結構係一感溫培養皿，且於使該等標的細胞脫離該等凹陷而形成該等微細胞層片之步驟進一步包含：調整該感溫培養皿溫度至一溫度閾值之下，使該等標的細胞脫離該等凹陷，而形成該等微細胞層片。
如申請專利範圍第2項所述之微細胞層片的製造方法，其中該感溫培養皿之該凹陷之表面覆有一溫度響應聚合物，該溫度響應聚合物之一溫度變化範圍在0℃~80℃之間，該溫度響應聚合物包含選自於由丙烯醯胺化合物、聚N-正丙基丙烯醯胺、甲基丙烯醯胺化合物、聚N-正丙基甲基丙烯醯胺、聚N-異丙基丙烯醯胺、N-焥基取代丙烯醯胺衍生物、聚乙烯醇部分乙酸化物和乙烯基醚衍生物組合而成的群組中之至少一者。
如申請專利範圍第1項所述之微細胞層片的製造方法，其中該培養孔之底部面積小於30平方公分，且於播植該等標的細胞於該培養孔，使部分該等標的細胞於該等凹陷中成長培養該預定時間之步驟進一步包含：播植5x10⁴~5x10⁵顆之標的細胞於該培養孔。
如申請專利範圍第1項所述之微細胞層片的製造方法，其中於播植該等標的細胞於該培養孔，使部分該等標的細胞於該等凹陷中成長培養該預定時間之步驟進一步包含：以1x10⁴~1x10⁶/mL之細胞濃度播植標的細胞於該培養孔。
如申請專利範圍第1項所述之微細胞層片的製造方法，其中該預定時間係介於24小時至120小時之間。
如申請專利範圍第1項所述之微細胞層片的製造方法，其中該預定時間係介於60小時至100小時之間。
如申請專利範圍第1項所述之微細胞層片的製造方法，其中該等標的細胞包含有選自於由間質幹細胞、肌肉母細胞(myoblast)、肌纖維母細胞(myoblasts)、癌細胞(cancer cell)、癌細胞株(cancer cell line)、心肌細胞、內皮細胞、血管內皮細胞和內皮前體細胞所組成的群組中之至少一者。
如申請專利範圍第1項所述之微細胞層片的製造方法，其中該等標的細胞包含有複數個纖維母細胞與複數個間質幹細胞。