CN116731859B - 一种环形大脑类器官模型及其构建方法与应用 - Google Patents

一种环形大脑类器官模型及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环形大脑类器官模型及其构建方法与应用，所述环形大脑类器官构建方法包括：获得环形大脑类器官芯片，所述环形大脑类器官芯片包括细胞培养板；类器官培养机构；类器官固定支持机构；所述类器官固定支持机构包括：分隔件和设于分隔件中部的柱状件；将细胞悬液加入所述类器官培养腔室中，待细胞聚集以后，吸弃分隔件外侧的细胞，随后进行全培养流程的原位培养获得环形大脑类器官。本发明可在整个培养流程内原位构建高度均一、细胞凋亡减少的环形大脑类器官，同时支持原位成像。本发明还公开了的环形大脑类器官模型及其应用。

Description

一种环形大脑类器官模型及其构建方法与应用
技术领域
本发明涉及组织工程和类器官芯片技术领域，特别涉及一种环形大脑类器官模型及其构建方法与应用。
背景技术
类器官是由人多能干细胞自组织分化而来的三维细胞培养物。类器官包含组织特异性的多种细胞类型，可反映早期组织发育特征，可再现体内对应组织的关键结构和功能。与动物模型相比，类器官不存在种属差异。与二维细胞模型相比，类器官在基因和蛋白质的表达、代谢功能和微尺度组织结构方面更接近原生器官。迄今为止，各种人源类器官(肠道、胃、视网膜、大脑、肝脏、肾、肺、胰岛和心脏等)已经被成功构建。在此基础上，类器官相关应用研究也取得了显著进展。例如，有研究应用大脑类器官揭示了大脑折叠的机制；应用肝导管类器官揭示了COVID-19患者肝脏损伤的机制。此外，有团队使用肝癌类器官筛选了29种抗肿瘤的化合物；应用患者来源的转移性胃肠道类器官模型模拟了患者对药物处理的反应。上述研究说明类器官在发育和疾病研究、药物筛选和精准医疗方面具有重大的应用潜力。
其中，大脑类器官是模拟人类大脑发育过程所产生的具有人类大脑皮层类似的结构和多种细胞种群的(神经干细胞、神经元和星形胶质细胞等)体外脑组织模型，与人类胎儿皮层细胞类型具有高度相似性，并能重现大脑的部分功能(如神经网络和脑电波信号)。随着神经疾病负担日益增加、而基于二维细胞模型和小鼠模型进行神经疾病药物开发成功率低、人脑组织获取受到严格伦理限制。因此，可再现发育过程中人脑关键结构和功能的大脑类器官模型为神经疾病靶点研究和药物开发提供新机遇。
然而，现在通常采用的大脑类器官传统悬浮动态培养方案仍然存在一定的局限性。大脑类器官的传统悬浮动态培养方案包含四个阶段：拟胚体形成、神经外胚层诱导、神经上皮分化和大脑类器官成熟。其中，阶段的转换都需要对大脑类器官进行人为转移操作。上述培养方案存在以下局限性：1)传统悬浮培养方式由于难以精确控制培养环境和类器官融合的原因，产生的类器官不仅在大小和形态上存在差异，还在基因表达、结构和功能上存在差异；2)传统悬浮培养方式在培养过程中对大脑类器官进行了多次人为转移；这种方式操作复杂且伴随着类器官损伤风险和污染风险；3)悬浮培养方式不支持对大脑类器官进行长期原位观察；4)体积逐渐增大的大脑类器官出现坏死核心。
因此，为了克服上述大脑类器官传统悬浮动态培养方案的局限性，有必要开发一种可实现全培养流程原位培养和观察、高均一性、细胞死亡区域面积小的大脑类器官培养体系，促进大脑类器官应用研究的发展。
发明内容
本发明提供了一种基于环形大脑类器官培养芯片的环形大脑类器官模型及其构建方法与应用，以解决大脑类器官传统悬浮动态培养方案需多次转移、无法进行实时原位观察、均一性差和存在核心坏死区的问题。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
在本发明的第一方面，提供了一种环形大脑类器官模型的构建方法，所述方法包括包括：
获得环形大脑类器官培养芯片，所述环形大脑类器官培养芯片，包括：
细胞培养板；
类器官培养机构，设于所述细胞培养板内；所述类器官培养机构上设有类器官培养腔室，所述类器官培养腔室两侧侧壁上设有侧孔，所述类器官培养腔室和所述侧孔一一对应相连通形成灌流通道；
类器官固定支持机构，设于所述类器官培养腔室内；所述类器官固定支持机构包括：分隔件和设于分隔件中部的柱状件；所述柱状件的顶部所在平面高于所述分隔件的顶部所在平面；所述类器官培养腔室的底部和所述类器官固定支持机构的底部与所述细胞培养板的底部相连通形成培养基储液池。
将细胞悬液加入所述类器官培养腔室中，待细胞聚集以后，吸弃分隔件外侧的细胞；向所述培养基储液池加入培养基，在神经分化阶段向所述类器官培养腔室中加入Matrigel进行全培养流程的原位培养，获得环形大脑类器官。
进一步地，所述分隔件外边界的俯视形状包括：圆形、椭圆形、半圆形、扇形、三角形、四边形、五边形、六边形和任意多边形中的一种。
进一步地，所述分隔件的宽度为0.1～2mm，所述分隔件的高度为0.05～10mm。
进一步地，所述柱状件的横截面形状包括：圆形、椭圆形、半圆形、扇形、三角形、四边形、五边形、六边形和任意多边形中的一种。
进一步地，所述柱状件的横截面积为0.03～13mm2，所述柱状件的高度为0.1～10mm。
进一步地，所述细胞培养板包括384孔板、96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、3.5cm培养皿、6cm培养皿、10cm培养皿的一种。
进一步地，所述类器官培养机构和类器官固定支持机构的材料包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯和树脂中的一种或多种。
进一步地，每个类器官培养腔室接种细胞数量为105～106个。
进一步地，类器官培养腔室的接种细胞包括人诱导多能干细胞、人成体干细胞、人肿瘤干细胞以及动物来源的干细胞。
在本发明的第二方面，提供了一种环形大脑类器官模型，由所述的方法构建获得。所述环形大脑类器官模型的形状为中空；均一性高，投影面积变异系数低于20％；细胞凋亡区域面积小，细胞凋亡区域占比低于20％。
在本发明的第三方面，提供了所述环形大脑类器官模型在神经发育相关生理和病理研究中的应用。
在本发明的第三方面，提供了一种环形大脑类器官培养芯片，包括：
细胞培养板；
设于所述细胞培养板内的类器官培养机构，所述类器官培养机构上设有类器官培养腔室，所述类器官培养腔室两侧侧壁上设有侧孔，所述类器官培养腔室和所述侧孔一一对应相连通形成灌流通道；
设于所述类器官培养腔室内的类器官固定支持机构；所述类器官固定支持机构包括：分隔件和设于分隔件中部的柱状件；所述柱状件的顶部所在平面高于所述分隔件的顶部所在平面；所述类器官培养腔室的底部和所述类器官固定支持机构的底部与所述细胞培养板的底部相连通形成培养基储液池。
本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
本发明在整个培养流程内原位构建了高度均一、细胞凋亡减少的环形大脑类器官，同时支持原位成像，且培养方法的步骤简单；具体地：
(1)成本低且易于制造：本发明采用材料皆为市面上常见且价格低廉的材料。此外，本发明制造步骤简单，所需工具价值低且易于快速上手。因此，本发明适应于实验室和批量生产。
(2)用户自定义：本发明的柱状件尺寸和形状、分隔件尺寸和形状均可根据具体需求进行设计和制备，适用于多种细胞和类器官培养。
(3)高均一性：本发明中的每个类器官都在独立类器官培养腔室中进行培养，每个腔室的培养环境都得到精确控制，同时避免了类器官的融合。本发明培养的环形大脑类器官在大小、RNA总量、蛋白总量和神经分化相关基因表达水平的变异系数均低于传统大脑类器官，说明环形大脑类器官的均一性高。
(4)全流程原位培养和原位观察：本发明兼容细胞培养板，可对类器官进行全培养流程的原位培养和原位观察。
(5)实时追踪大脑类器官关键结构的发生和发展。本发明可实时追踪大脑类器官关键结构(神经花环结构)的发生和发展，可用于研究神经动态发育过程。
(6)类器官损伤风险和污染风险降低：基于本发明的类器官培养方案无需人为转移操作，降低了类器官损伤风险和污染风险。
(7)核心区细胞凋亡区域减少。本发明中环形大脑类器官培养芯片的设计导致动态培养过程中营养物质逐渐向类器官培养腔室底部聚集，另外中央柱状件增大了类器官与营养物质的接触面积，充分地提供大脑类器官培养过程中所需的营养成分和氧气，从而减少内部细胞凋亡情况。
(8)减少死细胞对大脑类器官分化的影响。培养过程中产生的死细胞将从分隔件32上表面边缘掉落到类器官培养腔室，从而避免环形大脑类器官与死细胞的直接接触，降低死细胞分泌的炎症因子对环形大脑类器官的影响，促进环形大脑类器官更好地分化。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1为环形大脑类器官培养芯片的结构示意图；
图2为环形大脑类器官培养芯片中的固定支持机构的制作示意图；
图3为环形大脑类器官培养芯片的组装示意图；
图4为环形大脑类器官培养方案；
图5为环形大脑类器官培养芯片中物质扩散分布图；
图6为环形大脑类器官时序明场图片，比例尺：1000μm；
图7为环形大脑类器官中神经花环结构的时序明场图片，比例尺：200μm；
图8为大脑类器官均一性表征结果，比例尺：2000μm(左)、1000μm(右)；
图9为在环形类器官培养芯片培养环形大脑类器官时，qPCR鉴定环形大脑类器官中细胞类型和脑区标志物结果；
图10为在环形类器官培养芯片培养环形大脑类器官时，免疫荧光鉴定环形大脑类器官中细胞类型和脑区标志物结果，比例尺：500μm(A左)、50μm(A中和右)、500μm(B左)、50μm(B中和右)、500μm(C左)、100μm(C中)、50μm(C右)；
图11为大脑类器官中细胞凋亡表征和定量结果，比例尺：500μm。
图中附图标记为：
1、细胞培养板；
2、类器官培养机构；21、类器官培养腔室；22、侧孔；
3、类器官固定支持机构；31、环形件；32、分隔件；33、柱状件。
具体实施方式
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
需要说明的是，当元件被称为“固定于”或“设于”另一个元件上，它可以直接在另一个元件上或者间接设在另一个元件上；当一个元件被称为是“连接于”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或间接连接至另一个元件上。
需要理解的是，术语“长度”、“宽度”、“上”、下”、“前”、“后”、“第一”、“第二”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
此外，在本申请的描述中，“多个”、“若干个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明提供的技术方案总体思路如下：
根据本发明实施例一种典型的实施方式，提供一种基于环形大脑类器官培养芯片的环形大脑类器官构建方法，包括：
获得环形大脑类器官芯片，图1所示，包括：
细胞培养板1；
类器官培养机构2，设于所述细胞培养板1内；所述类器官培养机构2上设有类器官培养腔室21，所述类器官培养腔室21两侧侧壁上设有侧孔22，所述类器官培养腔室21和所述侧孔22一一对应相连通形成灌流通道；
类器官固定支持机构3，设于所述类器官培养腔室21内；所述类器官固定支持机构3包括：分隔件32和设于分隔件中部的柱状件33；所述柱状件33的顶部所在平面高于所述分隔件32的顶部所在平面；所述类器官培养腔室21的底部和所述类器官固定支持机构3的底部与所述细胞培养板1的底部相连通形成培养基储液池。
如图4所示，将多能干细胞悬液加入所述类器官培养腔室21中，待细胞聚集以后，吸弃分隔件32外侧的细胞；相应地，向培养基储液池加入培养基和神经分化阶段向类器官培养腔室21中加入Matrigel，对环形大脑类器官进行全培养流程的原位培养。每个所述类器官培养腔室21和其两侧的所述侧孔22相连通形成灌流通道可充分地提供类器官生长分化过程中所需的营养和气体。所述柱状件33可固定环形类器官，在整个培养周期内实现环形类器官的原位培养和原位观察。动态培养过程中，营养物质逐渐向类器官培养腔室21底部，此外，所述柱状件33还可增大环形大脑类器官与培养基的接触面积，提升环形大脑类器官吸收营养物质的效率，从而降低环形大脑类器官内部细胞死亡区域占比。所述分隔件32的横截面大于所述柱状件33的横截面，且所述柱状件33的顶部所在平面高于所述分隔件32的顶部所在平面，在环形大脑类器官生长分化过程中，环形类器官围绕柱状件33生长在分隔件32上表面，而培养过程中产生的死细胞将从分隔件32上表面边缘掉落到类器官培养腔室，从而避免环形大脑类器官与死细胞的直接接触，降低死细胞分泌的炎症因子对环形大脑类器官的影响，促进环形大脑类器官更好地分化。
本发明实施例中，所述分隔件可以呈封闭形空心状，也可以为实心的；
当所述分隔件为实心状时，所述柱状件位于所述分隔件中部的上表面；此时，无论所述分隔件和柱状件的高度如何，所述柱状件的顶部所在平面必然是高于所述分隔件的顶部所在平面；
当所述分隔件为空心状时，所述柱状件位于所述分隔件中部空心处，且所述柱状件的大小正好与所述空心处大小相匹配；此时需要所述柱状件的高度高于所述分隔件的高度，才能使得所述柱状件的顶部所在平面高于所述分隔件的顶部所在平面。
作为一种优选的实施方式，所述分隔件32的宽度为0.1～10mm。若宽度过小或者过大，都无法达到在类器官生长分化过程中分隔死细胞和环形类器官的目的。优选地，所述分隔件32的宽度为0.1～2mm。所述分隔件32的宽度是指中央柱状件33外边界到分隔件32外边界的直线距离。例如：若所述分隔件32外边界的俯视形状为椭圆形，不同位置处的中央柱状件33外边界到分隔件32外边界的直线距离并不相等，但所有的中央柱状件33外边界到分隔件32外边界的直线距离均需要在0.1～2mm的范围内。
作为一种优选的实施方式，所述分隔件32外边界的俯视形状包括：圆形、椭圆形、半圆形、扇形、三角形、四边形、五边形、六边形和任意多边形中的一种，其目的在于在环形大脑类器官生长分化过程中分隔死细胞和环形大脑类器官，降低死细胞分泌的炎症因子对环形大脑类器官生长分化的影响，促进环形大脑类器官更好地分化。
作为一种优选的实施方式，所述分隔件32的高度为0.05～10mm。若高度过小，无法达到在类器官生长分化过程中分隔死细胞和环形类器官的目的。优选地，所述分隔件32的高度为0.5～1.5mm。
本发明实施例中，所述柱状件可以为空心的也可以为实心，优选为实心的形状。
本发明实施例中，所述柱状件可以位于分隔件中部，也可位于分隔件其余位置，优选为位于分隔件中部。
作为一种优选的实施方式，所述柱状件33的横截面形状包括：圆形、椭圆形、半圆形、扇形、三角形、四边形、五边形、六边形和任意多边形中的一种，其目的在于构建环形大脑类器官，同时固定环形大脑类器官，实现环形大脑类器官全流程的原位培养和原位观察。此外，所述柱状件33还可增加环形大脑类器官与培养基的接触面积、提升环形大脑类器官的营养吸收效率，减少环形大脑类器官内部细胞死亡区域占比。
作为一种优选的实施方式，所述柱状件33的横截面积为0.03～13mm2。该面积有利于增大环形大脑类器官与培养基的接触面积，该面积若过小，制造技术难度高且不能达到减少环形大脑类器官内部细胞凋亡情况的目的；该面积过大，所需接种细胞数量过大。
作为一种优选的实施方式，所述柱状件33的高度为0.1～10mm。若柱状件33高度过小，类器官容易飘起成球；若柱状件33高度过大，制造技术难度高。优选地，所述柱状件33的高度为0.5～2.5mm。
作为一种可选的实施方式，所述类器官固定支持机构还包括环形件31，所述环形件31为顶部开口的具有底部的圆环形容器，所述环形件31的外壁抵接于所述类器官培养腔室内壁，所述分隔件位于所述环形件的中部。作为一种可选的实施方式，所述环形件与所述分隔件、柱状件一体制备得到，所述类器官固定支持机构的材料采用疏水性材料一体制备得到，其目的在于防止干细胞贴附于固定支持装置表面，促进干细胞自组织成三维组织。
当所述类器官固定支持机构不设置所述环形件时，在进行细胞培养前，需要对所述类器官培养腔室的底部进行疏水处理，具体处理方法为：向类器官培养腔室中加入配好的PEG溶液(37.5mg PEG1000、450μLPEG400、3.6375mL异丙醇、112.5μL去离子水和10mg光引发剂，所述光引发剂可购买于Sigma，货号410896-10G)，然后进行分离曝光，酒精洗涤三次后，类器官培养腔室的底部则具有一层疏水性的PEG薄膜。
作为一种优选的实施方式，所述类器官培养机构2和类器官固定支持机构3的材料包括聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PS)、聚对苯二甲酸乙二酯(PET)和树脂中的一种或多种。上述材料皆为光学透性材料，便于后续的明场观察和免疫荧光染色后的显微观察。
所述类器官固定支持机构的材料为疏水性或进行疏水处理，其目的在于防止干细胞贴附于固定支持装置表面，促进干细胞自组织成三维组织。
上述技术方案中，细胞培养板包括384孔板、96孔板、48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、3.5cm培养皿、6cm培养皿、10cm培养皿的一种。本发明是对市面上常见的细胞培养板进行加工获得，符合生物学者的操作习惯，同时可兼容各式光学仪器。
作为一种优选的实施方式，所述类器官培养腔室21为1个或者多个，每个所述类器官培养腔室21的两侧均设有所述侧孔22。
作为一种具体的实施方式，所述环形大脑类器官培养芯片的构建步骤如图2-3所示，包括：
获得具有多个类器官固定支持机构的PMMA模板；
将琼脂糖倒入所述PMMA模板上，快速去除气泡，室温静置凝固后，分离获得琼脂糖模板；
将PDMS倒入所述琼脂糖模板，放入真空抽气泵消除气泡后，室温静置过夜凝固，分离获得PDMS基底的类器官固定支持机构阵列，然后使用圆冲打孔器打孔获得单个类器官固定支持机构；
激光雕刻机切割获得PMMA材质的类器官培养机构；
将所述类器官固定支持机构、类器官培养机构和细胞培养板三者组装在一起即可获得所述环形大脑类器官芯片。
作为一种具体的实施方式，每个类器官培养腔室接种细胞数量为105～106个。若细胞数量过小，细胞无法聚集成环；若细胞数量过大，分化类器官尺寸过大，不利于类器官的营养和气体吸收。
作为一种优选的实施方式，类器官培养腔室的接种细胞包括人诱导多能干细胞、人成体干细胞、人肿瘤干细胞以及动物来源的干细胞。
根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了采用所述环形大脑类器官构建方法获得的环形大脑类器官模型。作为本发明实施例的一种具体方式，所述环形大脑类器官模型的形状为中空环状；均一性高，投影面积变异系数低于20％；细胞凋亡区域面积小，细胞凋亡区域占比低于20％。
根据本发明实施例另一种典型的实施方式，提供了所述环形大脑类器官模型在神经发育相关生理和病理研究中的应用。
下面将结合附图对本申请的一种环形类器官模型及其构建方法与应用进行详细说明。实施例1一种环形大脑类器官模型及其构建方法
一、环形大脑类器官培养芯片
如图1所示，本发明实施例提供一种环形大脑类器官培养芯片，包括：
细胞培养板1；
类器官培养机构2，设于所述细胞培养板1内。所述类器官培养机构2包括：类器官培养腔室21和多个设于所述类器官培养腔室两侧侧壁上的侧孔22，所述类器官培养腔室和所述侧孔一一对应相连通形成灌流通道；
类器官固定支持机构3，设于所述类器官培养机构2内；所述类器官固定支持机构3包括：环形件31、设于所述环形件31中部的分隔件32和设于分隔件中央的柱状件33；所述类器官培养机构2和类器官固定支持机构3的底部与所述细胞培养板1的底部相连形成培养基储液池。
所述类器官培养机构的高度为6mm；
所述类器官培养腔室的面积为28.26mm2；
所述侧孔的面积为2.25mm2；
所述柱状件的横截形状为圆形；
所述柱状件的横截面积为0.1256mm2；
所述柱状件的高度为1.5mm；
所述分隔件的外边界俯视形状为圆形；
所述分隔件的宽度为0.5mm；
所述分隔件高度为0.5mm。
二、环形大脑类器官培养芯片的数值模拟仿真和优化
环形大脑类器官芯片设计完成后，使用数值模拟仿真对环形大脑类器官芯片进行流速、剪切力和物质扩散模拟，对环形大脑类器官的培养环境进行模拟及优化。如图5所示，物质扩散模拟结果显示，动态培养过程中，营养物质逐渐向类器官培养腔室底部聚集，这提示环形大脑类器官芯片有利于改善大脑类器官的培养环境。
三、环形大脑类器官培养芯片的制备方法
(1)制造类器官培养机构：使用AutoCAD设计腔室；将图纸导入激光切割机，利用激光切割机切割PMMA获得类器官培养机构；利用激光切割机在类器官培养腔室两侧打出一个边长为1.5mm的正方形侧孔。
(2)制造类器官固定支持机构，如图2所示：
(a)利用AutoCAD设计类器官固定支持机构阵列；
(b)将图纸导入数控机床，利用数控机床加工PMMA获得类器官固定支持机构阵列的PMMA模板；
(c)将琼脂糖倒入所述PMMA模板上，室温静置凝固后，分离获得琼脂糖模板；
(d)将PDMS倒入所述琼脂糖模板，放入真空抽气泵消除气泡后，室温静置过夜凝固，分离获得PDMS基底的类器官固定支持机构阵列；
(e)使用圆冲打孔器打孔获得单个类器官固定支持机构。
如图3所示，将所述类器官固定支持机构、类器官培养机构和细胞培养板三者组装在一起即可获得所述环形大脑类器官培养芯片。
四、环形大脑类器官培养方法
(1)对环形大脑类器官培养芯片进行紫外灭菌，灭菌时长≥4小时；
(2)用灭菌水清洗环形大脑类器官培养芯片，并将水分吸干；
(3)向类器官培养腔室中加入少量培养基，没过分隔件即可，观察去除气泡；
(4)向类器官培养腔室中加入细胞悬液，添加过程中用移液枪轻轻吹打以确保细胞均匀分布在类器官固定支持机构上；
(5)将环形大脑类器官裴燕芯片放入细胞培养箱中2h，待细胞聚集后吸弃分隔件以外的细胞。
(6)在环形类器官培养过程中，可将培养芯片放置在显微镜下对培养的环形类器官进行原位观察；
(7)环形类器官培养结束后，可在芯片内对环形类器官进行鉴定操作，然后再将类器官培养芯片置于显微镜下进行观察。
具体的，如图4所示，采用实施例1所示的环形大脑类器官培养芯片进行环形大脑类器官培养，拟胚体形成以及大脑类器官生长分化步骤如下：
(1)对环形大脑类器官培养芯片进行至少4小时紫外灭菌后，用无菌水润洗类器官培养腔室，并将水分吸干；
(2)拟胚体形成：用Accutase将干细胞消化成单细胞，使用EBs形成培养基将细胞密度调整为2×106cells/mL的细胞悬液，向类器官培养腔室中加入100μL的细胞悬液，置于37℃的二氧化碳培养箱中培养2h，待细胞聚集成环后，吸弃分隔件以外的细胞。向类器官培养机构外的空间加入1mL EBs形成培养基，每两天进行一次换液，培养6天以形成EBs。
(3)诱导EBs向神经上皮方向分化：第6天时，将EBs形成培养基更换为神经诱导培养基NIM。向类器官培养机构外的空间加入1ml神经诱导培养基NIM，每两天进行一次换液，培养6天。所述NIM培养基成分包括：基础培养基DMEM/F12，1X N2(100X)，1X GlutaMax(100X)，1X NEAA(Non-Essential Amino Acid,100X)，1μg/mL heparin，1X penicillin-streptomycin(100X)。
(4)诱导EBs神经分化：第12天时，向类器官培养腔室中加入1-10mg/mL的Matrigel，使Matrigel包裹类器官。此过程需保持低温操作。将类器官培养芯片置于37℃的二氧化碳培养箱中孵育0.5h，使Matrigel充分交联。向类器官培养机构外的空间中加入1ml神经分化培养基NDM，每两天进行一次换液操作，培养3天。同时，将类器官培养芯片置于翘板摇床上进行培养。所述NDM培养基成分包括：50％DMEM/F12，50％Neurobasal Medium，1XN2(100X)，1X B27-vitaminA(50X)，1X GlutaMax(100X)，1XNEAA(Non EssentialAminoAcid,100X)，1Xpenicillin-streptomycin(100X)，0.05mMβ-Mercaptoethanol。
(5)诱导EBs分化成熟：第15天时，将NDM培养基更换为神经成熟培养基NMM。向类器官培养机构外的空间加入1ml NMM培养基，每天进行一次换液操作。所述NMM培养基成分包括：50％DMEM/F12，50％Neurobasal Medium，1XN2(100X)，1X B27-vitamin A(50X)，1XGlutaMax(100X)，1X NEAA(Non Essential Amino Acid,100X)，1X penicillin-streptomycin(100X)，0.05mMβ-Mercaptoethanol。
如图6所示，环形大脑类器官培养芯片可在整个培养周期内实现对环形大脑类器官的原位培养和原位观察。同时，如图7所示，环形大脑类器官培养芯片还可追踪环形大脑类器官内神经花环结构的产生和生长。如图8所示，环形大脑类器官在大小和神经分化相关基因表达水平层面上的均一性显著优于传统大脑类器官。如图9和图10所示，qPCR和免疫荧光结果证实，环形大脑类器官表达与传统大脑类器官相似的多种细胞类型标志物和脑区标志物(SOX2和Nestin，神经干细胞标志物；TUJ，神经元标志物；PAX6，前脑标志物；ISL1，后脑标志物；TBR1，皮层标志物)。如图11所示，TUNEL染色结果显示，环形大脑类器官中细胞死亡区域占比显著低于传统大脑类器官。
实施例2
该实施例中，所述柱状件的横截面积为0.0314mm2；其他均同实施例1。
实施例3
该实施例中，所述柱状件的横截面积为12.56mm2；其他均同实施例1。
实施例4
该实施例中，所述柱状件高度为0.1mm；其他均同实施例1。
实施例5
该实施例中，所述柱状件高度为2.5mm；其他均同实施例1。
实施例6
该实施例中，所述柱状件高度为10mm；其他均同实施例1。
实施例7
该实施例中，所述分隔件宽度为0.1mm；其他均同实施例1。
实施例8
该实施例中，所述分隔件宽度为2mm；其他均同实施例1。
实施例9
该实施例中，所述分隔件高度为0.05mm；其他均同实施例1。
实施例10
该实施例中，所述分隔件高度为10mm；其他均同实施例1。
实施例11
该实施例中，所述柱状件的横截形状为三角形；所述柱状件的横截面积为0.1256mm2；所述分隔件的俯视形状为三角环形；其他均同实施例1。
实施例12
该实施例采用大脑类器官传统悬浮动态培养方法。在低粘附96孔板中接种多能干细胞悬液，每个类器官的起始细胞数量为3000个细胞。拟胚体形成阶段分化6天，每两天进行1次换液，每次更换150μl培养基。诱导EBs向神经上皮方向分化阶段分化6天，每两天进行1次换液，每次更换150μl培养基。第12天使用Matrigel包被类器官，然后转移至低粘附6孔板中，每孔放置5-6个类器官，每孔加入3ml培养基。随后进行神经分化阶段，静置培养3天。第15天时，进行诱导EBs分化成熟培养，每两天进行1次换液，每次加入3ml培养基。各分化阶段使用培养基如环形大脑类器官分化使用培养基一样。
对比例1
该对比例中，所述柱状件高度为0.05mm；其他均同实施例1。
对比例2
该对比例中，所述分隔件宽度为0.05mm；其他均同实施例1。
对比例3
该对比例中，所述分隔件宽度为2.5mm；其他均同实施例1。
对比例4
该对比例中，所述分隔件高度为0.01mm；其他均同实施例1。
实验例1
对上述实施例1-10和对比例1-4的类器官培养芯片中的类器官的培养效果进行统计，如表1所示，其中面积的标准差变异系数的计算方法为：变异系数C·V＝(标准偏差SD/平均值Mean)×100％。
表1
由表1的数据可知，
对于环形大脑类器官芯片：
对比例1中，柱状件高度低于本发明实施例0.1～10mm的范围，环形大脑类器官飘起成球，环形大脑类器官难以正常生长；
对比例2中，分隔件宽度小于本发明实施例0.1～2mm的范围，细胞无法在分隔件上聚集成环，起始分化细胞数量过多，并且分化过程中无法隔离类器官和死细胞，分化效果差。
对比例3中，分隔件宽度大于本发明实施例0.1～2mm的范围，导致分化过程中无法隔离类器官和死细胞，分化效果差。
对比例4中，分隔件的高度低于本发明实施例0.05～10mm的范围，起始分化细胞数量过多，且分化过程中无法隔离类器官和死细胞，分化效果差。
综上可知，对于环形大脑类器官芯片，柱状件高度在0.1～10mm的范围，分隔件宽度在0.1-2mm的范围，分隔件高度在0.05～10mm的范围才能获得环形大脑类器官。
最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (8)

1.一种环形大脑类器官模型的构建方法，其特征在于，
获得环形大脑类器官培养芯片，包括：细胞培养板；设于所述细胞培养板内的类器官培养机构，所述类器官培养机构上设有类器官培养腔室，所述类器官培养腔室两侧侧壁上设有侧孔，所述类器官培养腔室和所述侧孔一一对应相连通形成灌流通道；设于所述类器官培养腔室内的类器官固定支持机构；所述类器官固定支持机构包括：分隔件和设于分隔件中部的柱状件；所述柱状件的顶部所在平面高于所述分隔件的顶部所在平面；所述类器官培养腔室的底部和所述类器官固定支持机构的底部与所述细胞培养板的底部相连通形成培养基储液池；所述柱状件的横截面积为0.03～13mm2，所述柱状件的高度为0.1～10mm；所述分隔件的宽度为0.1～2mm，所述分隔件的高度为0.05～10mm；
将细胞悬液加入所述类器官培养腔室中，待细胞聚集以后，吸弃分隔件外侧的细胞后，相应地，向培养基储液池加入培养基和神经分化阶段向类器官培养腔室中加入Matrigel，对环形大脑类器官进行全培养流程的原位培养；每个所述类器官培养腔室和其两侧的所述侧孔相连通形成灌流通道可充分地提供类器官生长分化过程中所需的营养和气体，所述分隔件的横截面大于所述柱状件的横截面，且所述柱状件的顶部所在平面高于所述分隔件的顶部所在平面，在环形大脑类器官生长分化过程中，环形类器官围绕柱状件生长在分隔件上表面，而培养过程中产生的死细胞将从分隔件上表面边缘掉落到类器官培养腔室，获得环形大脑类器官。
2.根据权利要求1所述的环形大脑类器官的构建方法，其特征在于，每个所述类器官培养腔室的接种细胞数量为105～106个。
3.根据权利要求1所述的环形大脑类器官模型的构建方法，其特征在于，所述类器官培养腔室的接种细胞包括人诱导多能干细胞、人成体干细胞、人肿瘤干细胞以及动物来源的干细胞中的一种。
4.根据权利要求1所述的环形大脑类器官模型的构建方法，其特征在于，所述类器官培养机构和类器官固定支持机构的材料包括聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯和树脂中的至少一种。
5.一种采用权利要求1-4任一项所述方法制备得到的环形大脑类器官模型。
6.根据权利要求5所述环形大脑类器官模型，其特征在于，所述环形大脑类器官的形状为中空环状；投影面积变异系数＜20％；细胞凋亡区域占比＜20％。
7.权利要求5或6所述的环形大脑类器官模型在神经发育相关生理和病理研究中的应用。
8.一种应用于权利要求1-4任一项所述环形大脑类器官模型的构建方法中的环形大脑类器官培养芯片，其特征在于，包括：
细胞培养板；
设于所述细胞培养板内的类器官培养机构，所述类器官培养机构上设有类器官培养腔室，所述类器官培养腔室两侧侧壁上设有侧孔，所述类器官培养腔室和所述侧孔一一对应相连通形成灌流通道；
设于所述类器官培养腔室内的类器官固定支持机构；所述类器官固定支持机构包括：分隔件和设于分隔件中部的柱状件；所述柱状件的顶部所在平面高于所述分隔件的顶部所在平面；所述类器官培养腔室的底部和所述类器官固定支持机构的底部与所述细胞培养板的底部相连通形成培养基储液池；所述柱状件的横截面积为0.03～13mm2，所述柱状件的高度为0.1～10mm；所述分隔件的宽度为0.1～2mm，所述分隔件的高度为0.05～10mm。
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