CN110055221A - 一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型及其制备方法与应用 - Google Patents

一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型及其制备方法与应用。制备方法包括如下步骤：将从大脑病变影响部位提取的原代神经细胞与水凝胶材料及交联剂混合得到打印生物墨水；基于天然大脑皮层层状结构和弹性模量的力学特征，将打印生物墨水采用生物三维打印技术进行打印成型，然后进行组织培养，即得基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型。本发明基于天然大脑的形貌学和力学性能特征，通过生物三维打印技术构建体外类脑模型；能通过控制细胞外基质的弹性模量大小来构建适于神经细胞生长和存活的细胞外基质，能使用不易存活的原代细胞进行打印；具有对不同生物化学性质药物筛选功能，即类血脑屏蔽作用的药物筛选模型。

Description

一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型及其制 备方法与应用
技术领域
本发明涉及一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型及其制备方法与应用，属于生物制造领域。
背景技术
中枢神经系统包含大约15-33亿个神经元，每个神经元通过突触彼此连接到几千个其他神经元，形成复杂而高效的神经网络。当作为神经信号处理单元的神经细胞发生病变，中枢神经系统就会产生不可逆的疾病发展，包括阿尔茨海默氏病，亨廷顿氏病，帕金森病和癫痫等。为了推进大脑疾病治疗的理论研究和加速精准治疗产业技术的开发，疾病样品组织通常直接从病人病变区域获得。天然大脑疾病组织由于结构复杂，在样品有限的情况下很难进行系统性研究，因此将病变神经细胞及其周围健康的神经细胞分离出来构建体外二维神经网络来提高研究效率。然而，体外二维结构因为未能保存三维结构中神经细胞的关系，所以很多在二维结构得到的实验结果无法在三维结构得到运用。因此，基于生物三维打印技术构建体外类脑疾病模型将有利于克服现有体外二维实验方法的不足，丰富神经科学研究手段。
生物三维打印技术作为一种新兴的制备工艺，被广泛地运用于各种细胞成型实验中。在生物三维打印技术中，无溶剂液体基质的成型系统可以直接在打印三维生物材料所构成的支架中掺杂细胞，而生物材料所构成的可降解树脂模型的三维支架则可以用来构成所掺杂细胞的体外微环境，维持细胞的生长和发育。在生物三维打印技术实施过程中，通过空间控制各个要素的打印信息逐层精确打印生物材料，生物化学物质和活细胞等以构成体外生物三维结构。将生物三维打印技术运用到神经科学领域，可以为神经科学研究提供有效的研究工具。西安交通大学王玲课题组将生物三维打印技术运用类脑组织的构建(CN104726332B和CN107164305A)。但是该技术只是强调所构建类脑组织与天然脑组织的形貌结构相似性而没有在结构力学上进行模拟。为了进一步构建神经细胞体外生物环境，从细胞外基质力学性能出发，通过调配生物墨水各组分比列来实现弹性模量对天然脑组织的模拟。此外,神经干细胞(Gu Q,Tomaskovic-Crook E,Wallace GG,and Crook JM.3Dbioprinting human induced pluripotent stem cell constructs for In Situ cellproliferation and successive multilineage differentiation,Advanced HealthcareMaterials,2017:1700175.)和脑瘤癌细胞(CN12N5/095(2010.1)I)也与生物三维打印技术相结合来构建体外类脑结构。由于原代神经细胞相比于干细胞和癌细胞来说非常脆弱，所以鲜有实验室开发原代神经细胞来构建体外类脑疾病模型组织。Lozano等人使用由新型肽修饰的生物聚合物，gellam gum-RGD(RGD-GG)与原代皮质神经元相结合的生物墨水来打印体外类大脑结构则是对这一领域的一个探索(Lozano R,Stevens L,Thompson BC,GilmoreKJ,III RG,Stewart EM,Panhuis MIH,Romero-Ortega M and Wallace GG.3D printingof layered brain-like structures using peptide modified gellan gumsubstrates.Biomaterials,2015,67:264-273.)。相比于神经干细胞和脑瘤癌细胞构建的类脑模型，利用病人病变组织分离而得到的原代神经细胞将会为病人具体的疾病发展和用药治疗提供可靠的医疗指导信息。
不同于普通细胞，神经细胞体型大，生物功能性完备，对生物微环境有严格的要求。由于细胞对细胞外基质在生物相容性，化学稳定性以及功能维持性上有严格的要求，构建胞外基质微环境需要筛选适用于细胞生长的生物三维打印墨水(类细胞外基质材料，如明胶、海藻酸钠、透明质酸、纤维蛋白等)。对生物墨水进行改性和载体修饰(如添加不同神经信息素和生长因子等)，在满足打印工艺的前提下，为神经元细胞生长发育为新生神经网络提供有利的生物微环境。在所构建的包含原代神经细胞的体外类脑组织结构中，可以利用其模拟神经细胞外基质的三维特性来进一步研究神经药物的扩散作用。因为血脑屏障作用的神经药物作用于病变部位有着显著影响，构建具有类血脑屏障功能的体外三维神经细胞组织已经是体外疾病模型的发展方向。所构建的类神经细胞外基质具有类似血脑屏障功能作用。相比于Wick,et al(WO 2018.027112 A1)按照天然血脑屏障从细胞组成上限定了体外血脑屏障的结构，利用生物材料组分来构成具有类血脑屏障作用的类细胞外基质将更加有利于神经药物筛选模型的构建。但上述专利没有突破天然大脑层状组织与血管之间的血脑屏障作用构建类脑组织。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型及其制备方法与应用，本发明利用生物三维打印技术将含有原代神经细胞的生物墨水打印构建出可体外长期培养类脑模型；该类脑模型的细胞外基质材料因为具有对不同生化性质的药物分子具有筛选作用，模拟了类血脑屏障作用，因而可以用来构建高效神经药物筛选模型。
本发明提供的一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型制备方法，包括如下步骤：将从大脑提取的原代神经细胞与水凝胶材料及交联剂混合得到打印生物墨水；基于设计的天然大脑皮层层状结构分布的结构以及天然大脑的弹性模量力学性能，将所述打印生物墨水采用生物三维打印技术进行打印成型，然后进行组织培养，即得到基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型。
本发明中，所述原代神经细胞可采用病变的神经细胞直接做出疾病模型；可采用健康的神经细胞先做出组织再做疾病模型。
上述的制备方法中，提取所述原代神经细胞的部位包括离体的各类天然脊椎动物大脑病变组织和/或各类天然脊椎动物大脑受病变影响的健康组织；所述病变包括癫痫、阿尔兹海默症、帕金森症、亨特氏症或脑部癌症；
所述原代神经细胞包括健康或病变的神经细胞，所述神经细胞包括神经元、神经胶质细胞、神经干细胞和脑肿瘤细胞中的至少一种。
上述的制备方法中，设计的所述天然大脑皮层层状结构分布的结构为1～10层类脑皮层结构；优选1～6层，更优选3～6层；
所述弹性模量为1kPa～10MPa。
上述的制备方法中，所述类脑皮层结构中所述原代神经细胞的总浓度为1×104～1×1015/mL，具体可为1×106/mL、1×104～1×106/mL、1×106～1×1015/mL或1×105～1×1010/mL；
所述神经细胞具体包括所述神经元和所述神经胶质细胞，其浓度比可为1:0.1～10。
上述的制备方法中，每层所述类脑皮层结构的厚度为0.2mm～0.5mm，且每层所述类脑皮层结构之间有或没有明显界限。
上述的制备方法中，所述水凝胶材料包括海藻酸钠、明胶、纤维蛋白原、透明质酸和丝素蛋白中的至少一种；
所述交联剂包括氯化钙、谷氨酰胺转氨酶和凝血酶中的至少一种。
本发明中，所述水凝胶材料与相对应的所述交联剂配合使用，氯化钙用于海藻酸钠的交联作用，谷氨酰胺转氨酶用于明胶的交联作用，而凝血酶用于纤维蛋白原的交联作用。三种材料的交联循序依次为海藻酸钠交联，纤维蛋白原交联以及明胶交联。
本发明中，所述水凝胶材料具体可由海藻酸钠、明胶、纤维蛋白原、透明质酸和丝素蛋白组成；所述交联剂具体可由氯化钙、谷氨酰胺转氨酶和凝血酶组成；
所述打印生物墨水中，各组分的浓度如下：海藻酸钠0.1～1％；明胶5～10％；纤维蛋白原10～40mg/mL；氯化钙1～3％；谷氨酰胺转氨酶0.1～1％；凝血酶20～40U/mL；透明质酸1.5～5％；丝素蛋白2～8％；其中百分含量以质量百分含量计，
其中，所述谷氨酰胺转氨酶的酶活为40～80U/mL，其1个酶活力单位是指在25℃下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量；
所述凝血酶的酶活为40～80U/mL，其1个酶活力单位是指在25℃下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。
上述的制备方法中，所述原代神经细胞与所述水凝胶材料和所述交联剂的质量比可为1：4.3～4.5：0.1～0.4，具体可为1：4.5：0.1。
上述的制备方法中，所述生物三维打印技术采用的实验系统硬件包括三维微动平台、可在XY方向运动的成形室、可沿z轴运动的喷头组件和喷射细胞一基质材料的喷头模块。
本发明中，在XY方向运动运动范围：10cm×10cm；
沿z轴运动范围：10cm。
上述的制备方法中，所述生物三维打印技术采用挤压打印的方式，打印的条件如下：
扫描速度可为20～40mm/s；挤出流量可为1～10μL/s；温度可为0～40℃；
扫描速度具体可为30mm/s、20～30mm/s、30～40mm/s或25～35mm/s，挤出流量具体可为5μL/s、1～5μL/s、5～10μL/s或2～8μL/s；温度具体可为15℃、0～15℃、15～40℃或10～30℃；
本发明还提供了一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型的制备方法包括如下步骤：
(1)体外类脑组织结构模型设计：
利用仿生学原理，包括形貌学和结构力学特点，模拟大脑皮层3-6层层状结构体外类脑组织结构模型；所构建结构体的弹性模量在该技术所述体外培养方法中可以得到保持，并维持在～kPa范围内，与天然脑组织接近；
(2)原代神经细胞解剖提取：
原代神经细胞(包括神经元和神经胶质细胞)通过天然神经组织提取获得；
(3)三维打印系统平台搭建：
打印平台可以分别实现XY方向平动和Z方向移动，实现的打印工作区域为10×10×10cm3；
(4)水凝胶材料准备：
将海藻酸钠，明胶及纤维蛋白原以及其相应交联物质按顺序进行添加和混合；
(5)含有原代神经细胞的水凝胶进行打印成型：
通过使用25G注射积压喷头，按照电脑打印软件设计的类脑组织结构进行打印；
(6)对体外类脑组织结构进行长期培养；
将所构建体外类脑组织结构置于37℃恒温保育箱并于每两天进行培养液更换。
本发明还提供了上述的制备方法制备得到的基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型。
本发明中，通过所述生物三维打印技术成形完成后得到所述基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型具有一定孔隙率的含有细胞的三维结构体，其细胞存活率大于85％。
本发明中，所述基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型的组织培养方法采用本领域公知的方法，具体如下：
将所述基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型使用Neurobasal基的培养液进行长期培养(Neurobasal培养液，1％B27营养补充液，300μL庆大霉素，以及20μg/ml抑肽酶)，且抑肽酶用于长期维持多层水凝胶结构的稳定性；对于长期培养的体外类脑组织结构，置于37℃恒温保育箱中，且每隔两天换一次培养液。
本发明所述的类脑疾病治疗组织模型应用于神经疾病药物筛选中。
本发明所述的类脑疾病治疗组织模型能针对药物分子的不同极性来进行筛选，并模拟类血脑屏障作用对不同极性的药物分子进行筛选。
上述应用中，所述神经疾病药物具体包括治疗癫痫、阿尔兹海默症、帕金森症、亨特氏症或脑部癌症的药物。
本发明具有以下优点：
1)基于天然大脑的形貌学和力学性能特征，通过生物三维打印技术构建体外类脑模型；
2)本发明能通过控制细胞外基质的弹性模量大小来构建适于神经细胞生长和存活的细胞外基质，能使用不易存活的原代细胞进行打印；
3)具有对不同生物化学性质药物筛选功能，即类血脑屏蔽作用的药物筛选模型。
附图说明
图1为本发明基于生物三维打印的体外长期培养类脑疾病治疗组织模型打印和制备流程示意图。
图2所打印结构材料弹性模量随时间无明显变化，且接近天然大脑弹性模量。
图3体外类脑颞叶组织长期培养电生理实验。(a)在多阵列电极培养至31天的实物图；(b)明场成像所观察到的结构与电极；(c)对该类脑颞叶组织进行高频率强度刺激，可以得到的信号最大峰值范围为100～400μV，模拟该组织处在癫痫状态；(d)对该类脑颞叶组织进行I/O数据分析以评估神经通路的有效性，分别对含细胞和不含细胞的体外组织进行检测，结果表明只有神经通路存在的含细胞组表现出优良的I/O特性，插入图为输入信号信息。该实验选用ANOVA来进行统计数据分析，**p<0.01。
图4TTX药物对类脑颞叶组织神经信号影响。(a)在测量神经信号稳定后向培养环境中添加TTX药物，可以观察到在TTX的影响下神经信号迅速消失；(b)对所检测的三个样品进行信号分析，可以发现在TTX添加前后有明显的信号变化；(c)对所得到的神经信号进行统计分析，***p<0.001。
图5DNOX药物对类脑颞叶组织神经信号影响。(a)在测量神经信号稳定后向培养环境中添加DNQX药物，可以观察到在DNQX的影响下神经信号迅速消失；(b)对所检测的三个样品进行信号分析，可以发现在DNQX添加前后有明显的信号变化；(c)对所得到的神经信号进行统计分析，***p<0.001。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、
按照如图1所示的流程，基于生物三维打印的体外长期培养类脑疾病治疗组织模型的构建方法包括如下步骤：
(1)体外类脑组织结构模型设计：
利用仿生学原理，基于天然大脑层状结构和结构力学性能，模拟大脑皮层具体分别为1、2、3、4、5、6层层状结构体外类脑组织结构模型，并保持该类脑组织模型的弹性模量为4.2kPa；每层类脑皮层结构中原代神经细胞的总浓度为1×107/mL；其中，神经元和神经胶质细胞的浓度比为1:10。
(2)原代神经细胞解剖提取：
原代神经细胞(包括神经元和神经胶质细胞)通过出生后第一天Wistar乳鼠大脑皮层组织提取获得；
(3)三维打印系统平台搭建：
打印平台可以分别实现XY方向平动和Z方向移动，在XY方向运动运动范围：10cm×10cm；
沿z轴运动范围：10cm，实现的打印工作区域为10×10×10cm3；
(4)水凝胶材料准备：
将海藻酸钠，明胶及纤维蛋白原以及其相应交联物质按顺序进行添加和混合；
具体混合质量百分含量(以各组分括号内质量百分含量计)参数为：质量百分浓度为5.3％的明胶(35％)，21.2mg/ml纤维蛋白原(35％)，质量百分浓度为0.5％的海藻酸钠(12％)以及1×107/mL神经细胞悬液(18％)。在培养液中添加抑肽酶(20μg/ml)来维持三维打印结构至少可以培养至一个月。
(5)含有原代神经细胞的水凝胶进行打印成型：
通过使用25G注射积压喷头，打印条件如下：描速度为30mm/s，挤出流量为5μL/s；工作温度为15℃，按照电脑打印软件设计的类脑组织结构进行打印；
(6)对体外类脑组织结构进行长期培养；
将所构建体外类脑组织结构打印在4×4MED64微阵列电极培养皿中，如图3(a)和(b)所示。使用Neurobasal基的培养液进行长期培养(Neurobasal培养液，1％B27营养补充液，300μL庆大霉素，以及20μg/ml抑肽酶)，且抑肽酶用于长期维持多层水凝胶结构的稳定性；置于37℃恒温保育箱并于每两天进行培养液更换。体外培养31天后，对该打印出的类脑结构体进行LFP电信号刺激，可以观察到标准的神经刺激信号(图3(c))，而后进行了电生理输入输出神经刺激信号(I/O)测试实验，得到了持续的输入输出响应(图3(d))，该实验选用ANOVA来进行统计数据分析，**p<0.01。
实施例2、
根据本发明实施例1(1)-(6)中的步骤构建体外三层类癫痫疾病模型(具体采用的原代神经细胞(包括神经元和神经胶质细胞)通过出生后第一天Wistar乳鼠大脑皮层组织提取获得。然后电生理刺激构造类癫痫疾病。)，然后通过添加不同分子极性药物来检测该模型的药物响应特性。
(7-1)极性较大药物分子DNQX药物检测；
如图4在4×4MED64微阵列电极培养皿体外微环境中培养所构建类脑组织至31天。对这个类脑结构进行电生理研究，可以检测到兴奋性突出后电位(EPSPs)。神经兴奋抑制药物AMPA受体拮抗剂(DNQX)也被直接添加到培养环境中进行神经电生理测试。DNQX拮抗作用可以阻断ESPS信号。然而DNQX添加至这个模型之后，如图4(a)和(b)，虽然ESPS信号也骤然下降，但是却没有被完全阻断。对ESPS信号采用t-test统计方法进行统计学分析，如图4(c)，结果表明DNQX对该模型的神经信号也起到了显著的阻断作用(***p<0.001)，但是却没有完全消除。由于阵列电极测量的是场电位，所以可以认为DNQX在该模型的扩散受到限制。
实施例3、
根据本发明实施例1(1)-(6)中的步骤构建体外三层类癫痫疾病模型(具体采用的原代神经细胞(包括神经元和神经胶质细胞)通过出生后第一天Wistar乳鼠大脑皮层组织提取获得。然后电生理刺激构造类癫痫疾病。)，然后通过添加不同分子极性药物来检测该模型的药物响应特性。
(7-2)极性较小药物分子TTX药物检测；
如图4在4×4MED64微阵列电极培养皿体外微环境中培养所构建类脑组织至31天。对这个类脑结构进行电生理研究，可以检测到兴奋性突出后电位(EPSPs)。河豚毒素(TTX)被添加到培养环境中。TTX可以阻断钠离子通道，完全阻断神经信号。当TTX添加之后，兴奋性突出后电位(ESPS)被完全阻断，如图5(a)和(b)所示。对添加TTX前后的信号进行统计学分析可以认为该模型对TTX响应非常灵敏。
图5(c)显示对实验所得电生理信号采用t-test统计方法进行统计分析，可以知道添加TTX药物前后的神经信号具有显著性差异，且***p<0.001。

Claims (10)

1.一种基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型制备方法，包括如下步骤：将从大脑病变影响部位提取的原代神经细胞与水凝胶材料及交联剂混合得到打印生物墨水；基于设计的天然大脑皮层层状结构和弹性模量的力学特征，将所述打印生物墨水采用生物三维打印技术进行打印成型，然后进行组织培养，即得到基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：提取所述原代神经细胞的部位包括离体的各类天然脊椎动物大脑病变组织和/或各类天然脊椎动物大脑受病变影响的健康组织；
所述原代神经细胞包括健康或病变的神经细胞，所述神经细胞包括神经元、神经胶质细胞、神经干细胞和脑肿瘤细胞中的至少一种。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述设计的天然大脑皮层层状结构分布的结构为1～10层类脑皮层结构；
所述弹性模量为1kPa～10MPa。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于：每层所述类脑皮层结构中所述原代神经细胞的总浓度为1×104～1×1015/mL。
5.根据权利要求1-4任一项所述的制备方法，其特征在于：每层所述类脑皮层结构的厚度为0.2mm～0.5mm，且每层所述类脑皮层结构之间有或没有明显界限。
6.根据权利要求1-5任一项中所述的制备方法，其特征在于：所述水凝胶材料包括海藻酸钠、明胶、纤维蛋白原、透明质酸和丝素蛋白中的至少一种；
所述交联剂包括氯化钙、谷氨酰胺转氨酶和凝血酶中的至少一种。
7.根据权利要求1中所述的制备方法，其特征在于：所述原代神经细胞与所述水凝胶材料和所述交联剂的质量比为1：3.7～3.9：0.1～0.4。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的制备方法，其特征在于：所述生物三维打印技术采用挤压打印的方式，打印的条件如下：
扫描速度为20～40mm/s；挤出流量为1～10μL/s；温度为0～40℃。
9.权利要求1-8中任一项所述的制备方法制备得到的基于细胞三维打印技术的类脑疾病治疗组织模型。
10.权利要求1-9中所述的类脑疾病治疗组织模型在神经疾病药物筛选中的应用。
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