CN115491347A

CN115491347A - 一种块状细胞培养肉的制备方法

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Publication number: CN115491347A
Application number: CN202211123789.0A
Authority: CN
Inventors: 关欣; 堵国成; 费卓成; 严其洋; 陈坚; 周景文
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2022-09-15
Filing date: 2022-09-15
Publication date: 2022-12-20

Abstract

本发明公开了一种块状细胞培养肉的制备方法，属于动物细胞培养及细胞培养肉技术领域。本发明通过MTT细胞毒性试验以及细胞伸展状态的表观观察，表明水凝胶介质对肌肉干细胞无毒性，细胞可伸展为梭状。此外，通过Hoechst染色并测定荧光强度、MyHC及DAPI染色表观细胞分化状态证明水凝胶介质有利于肌肉干细胞的增殖和分化，并通过共聚焦显微镜观察证明于TVP支架内注入水凝胶介质培养细胞并诱导分化具有可行性，解决了植物基细胞支架生物相容性较差、无法黏附细胞的问题，并可代替传统动物源细胞支架生产的细胞培养肉，降低细胞培养肉生产成本，为细胞培养肉的商品化奠定基础。

Description

一种块状细胞培养肉的制备方法

技术领域

本发明涉及一种块状细胞培养肉的制备方法，属于动物细胞培养及细胞培养肉技术领域。

背景技术

近年来，细胞培养肉是生物制造领域较为新兴的研究方向，其以细胞生物学和组织工程技术为基础，在一定条件下对动物干细胞进行体外培养，经过体外扩培后，通过3D打印技术或细胞支架装载后诱导分化，形成接近真实肉类的肌纤维纹理和质感的模拟动物肉制品，为寻求替代畜牧业生产肉制品的方式提供了思路，避免了对动物的屠宰。

如今细胞培养肉技术距离商业化尚有较大发展空间，其中如何制造出与真实有具有相似尺寸厚度和质构口感的块状细胞培养肉是研发重点之一。应用组织工程技术，将细胞接种于支架材料上进行三维培养，为块状培养肉的制造提供研发思路。天然高分子凝胶材料如胶原蛋白、明胶、纤维蛋白原等凝胶材料具有良好的生物相容性以及合适的孔隙结构，可支持细胞黏附以及细胞的高密度生长，故该类材料应用于细胞培养肉中的三维成型极具潜力。但是单纯水凝胶为支架的培养肉产品存在硬度不足、质构不佳等问题。以多孔植物蛋白(Textured vegetable protein，TVP)为原料的植物肉已被用作肉类替代品来模仿和替代传统肉制品。TVP 由大豆拉丝蛋白、小麦粉等为原料，本身具有高蛋白、一定的刚性及类似肉类的质地，并且易获取、成本低，因此具有作为一种可食用细胞支架的潜力。但是植物蛋白与干细胞的生物相容性较差，细胞几乎无法在其表面粘附，更不能进行增殖和分化。因此将水凝胶同TVP结合使用是形成成本低廉且质构风味合适细胞培养肉的潜在方式。

发明内容

本发明提供了一种以填充覆盖天然高分子水凝胶的TVP作为细胞支架生产块状细胞培养肉的方法。

本发明的第一个目的是提供一种细胞可黏附的水凝胶介质组合，所述水凝胶介质组合为如下(a)～(c)的组合物中的任一：

(a)组分A和组分C；

(b)组分B和组分C；

(c)组分A、组分B和组分C；

所述组分A包括明胶、谷氨酰胺转氨酶；所述组分B为海藻酸钠、氯化钙；所述组分C为纤维蛋白原、凝血酶。

在一种实施方式中，所述明胶来源包含但不限于猪、鱼。

在一种实施方式中，所述纤维蛋白原来源包含但不限于猪、鱼。

在一种实施方式中，所述凝血酶来源包含但不限于猪、鱼。

在一种实施方式中，组分A在制备水凝胶介质中的使用浓度为0～1g/mL或0～1000U/mL。

在一种实施方式中，所述明胶使用浓度为30～100mg/mL、谷氨酰胺转氨酶使用浓度为 50～400U/mL。

在一种实施方式中，所述明胶使用浓度为50mg/mL、谷氨酰胺转氨酶使用浓度为150 U/mL。

在一种实施方式中，所述猪明胶使用浓度为30～80mg/mL、谷氨酰胺转氨酶使用浓度为 100～200U/mL。

在一种实施方式中，所述猪明胶使用浓度为40mg/mL、谷氨酰胺转氨酶使用浓度为120 U/mL。

在一种实施方式中，组分B在制备水凝胶介质中的使用浓度为0～1g/mL或0～1000U/mL。

在一种实施方式中，所述海藻酸钠使用浓度为2～15mg/mL、氯化钙使用浓度为2.5～10 mg/mL。

在一种实施方式中，所述海藻酸钠使用浓度为5mg/mL、氯化钙使用浓度为5mg/mL。

在一种实施方式中，组分C在制备水凝胶介质中的使用浓度为0～1g/mL或0～1000U/mL。

在一种实施方式中，所述纤维蛋白原使用浓度为2～20mg/mL、凝血酶使用浓度为1～5 U/mL。

在一种实施方式中，所述纤维蛋白原使用浓度为6mg/mL、凝血酶使用浓度为2.5U/mL。

本发明的第二个目的是提供上述水凝胶介质组合在培养肌肉干细胞中的应用。

本发明的第二个目的是提供上述水凝胶介质组合在制备细胞培养肉中的应用。

在一种实施方式中，所述应用为先将肌肉干细胞与上述水凝胶介质组合中的水凝胶液混合，随后注入组织化植物蛋白(TVP)支架的表面和孔洞中并添加交联剂，完全培养基培养2 天后，更换分化培养基诱导分化14天。

在一种实施方式中，交联剂的添加顺序为谷氨酰胺转氨酶早于凝血酶，凝血酶早于氯化钙。

在一种实施方式中，TVP包含但不限于大豆拉丝蛋白、花生拉丝蛋白、小麦蛋白等。

在一种实施方式中，所述完全培养基和分化培养基由基础培养基和添加物组成。

在一种实施方式中，所述基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DEME/F12培养基、F10培养基中的一种。

在一种实施方式中，所述培养基中还含有青霉素-链霉素双抗溶液。

在一种实施方式中，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。

在一种实施方式中，所述完全培养基的添加物为10vol％胎牛血清。

在一种实施方式中，所述分化培养基的添加物为2vol％马血清。

在一种实施方式中，所述动物干细胞包含但不限于肌肉干细胞、间充质干细胞。

在一种实施方式中，所述动物干细胞的来源包括但不限于猪、牛、兔或禽类。

有益效果：

本发明提供的水凝胶介质，能有效黏附并装载动物干细胞，三维培养下细胞伸展状态与传统贴壁培养类似，同时介质内的细胞可增殖分化，与传统贴壁培养相比，使用水凝胶介质培养的细胞增殖水平为前者的150％-180％，分化水平为前者的120％，表面覆盖该水凝胶介质的组织化植物蛋白支架解决了植物基细胞支架生物相容性较差、无法黏附细胞的问题，并可代替传统动物源细胞支架生产的细胞培养肉，降低细胞培养肉生产成本，为细胞培养肉的商品化奠定基础。

附图说明

图1示出水凝胶介质的MTT细胞毒性试验结果。

图2示出完全培养基培养下肌肉干细胞于24孔板内无介质贴壁培养3天，使用倒置显微镜，在4×视野下的细胞状态。

图3示出完全培养基培养下肌肉干细胞于24孔板内水凝胶介质中三维培养3天，使用倒置显微镜，在4×视野下的细胞状态。

图4示出利用Hoechst荧光染剂染色，于具有365nm激发和458nm发射的酶标仪下通过荧光光谱测量的荧光强度，表观肌肉干细胞无介质贴壁培养和贴附水凝胶介质培养6，12， 24，48h时的增殖水平。

图5示出利用MyHC一抗、二抗及DAPI免疫荧光染色，使用倒置显微镜拍摄，计算肌肉干细胞无介质贴壁培养和贴附水凝胶介质培养并诱导分化6天时的分化率。

图6示出利用Hoechst荧光染剂染色，于具有365nm激发和458nm发射的酶标仪下通过荧光光谱测量的荧光强度，表观肌肉干细胞于水凝胶介质中三维培养12，24，48，96h时的增殖水平。

图7示出利用MyHC一抗、二抗及DAPI免疫荧光染色，使用倒置显微镜拍摄，肌肉干细胞于水凝胶介质中三维培养并诱导分化6天时的分化情况。

图8(A)示出肌肉干细胞基于组织化植物蛋白支架的三维塑形下通过水凝胶介质进行三维培养及诱导分化14天，所生产的细胞培养肉成品图，图8(B)示出利用MyHC一抗、二抗及 DAPI免疫荧光染色，使用共聚焦显微镜拍摄，细胞培养肉内细胞的分布以及分化情况。

具体实施方式

下面通过实例进一步详细说明本发明。

但下述实例仅为实例性，本发明的内容不限于下述实施例。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市售商品或者可以通过已知方法制备。

下述动物干细胞的体外扩增及分化方法与常规的动物干细胞体外培养方法一致。

下述实例采用的完全培养基为：10vol％胎牛血清、79vol％DMEM培养基、1vol％青霉素 -链霉素双抗溶液，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为10mg/mL。

下述实例采用的分化培养基为：2vol％马血清、79vol％DMEM培养基、1vol％青霉素-链霉素双抗溶液，所述青霉素-链霉素双抗溶液中，青霉素含量为10000U/mL，链霉素含量为 10mg/mL。

下述实例的组别a的培养条件为孔板内接种细胞，使用完全培养基和分化培养基培养。

下述实例的组别b的培养条件为在水凝胶介质组合上接种细胞，使用完全培养基和分化培养基培养。

所述水凝胶介质组合由组分A、组分B和组分C组成；所述组分A为明胶(水凝胶液)和谷氨酰胺转氨酶(交联剂)；所述组分B为海藻酸钠(水凝胶液)和氯化钙(交联剂)；所述组分C为纤维蛋白原(水凝胶液)和凝血酶(交联剂)；

水凝胶介质组合的使用方法：将明胶、海藻酸钠和纤维蛋白原按照50mg/mL、5mg/mL 和6mg/mL的终浓度混合均匀，混合均匀后可视实验要求添加细胞，随后按照谷氨酰胺转氨酶，凝血酶和氯化钙的顺序依次加入到水凝胶液体混合溶液中，其中，谷氨酰胺转氨酶终浓度为150U/mL，氯化钙终浓度为5mg/mL，凝血酶终浓度为2.5U/mL。

下述实例中的细胞培养肉的制备方法：将组织化植物蛋白(TVP)支架浸泡入所述应用为先将肌肉干细胞与水凝胶介质组合中的水凝胶液混合，随后注入组织化植物蛋白支架的表面和孔洞中并添加交联剂，完全培养基培养2天后，更换分化培养基诱导分化14天。

下述实例中采用的培养条件为5％(v/v)CO₂培养箱，37℃培养。

下述实例中采用的检测方法，除说明外，其他都为公开的使用方法。

实施例1水凝胶的细胞毒性试验

将水凝胶液铺于24孔板中，加入交联剂，完全成胶凝固后，加入2mL完全培养基，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中放置48h，吸去上层清液即得到水凝胶介质组合的48h浸提液。将肌肉干细胞接种于96孔板内，接种密度为3×10³个/孔，待孔内细胞完全贴壁后吸去培养基，加入200μL上述48h浸提液，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养48h，作为实验组。同时设置空白组和对照组，空白组不接种细胞，加入完全培养基在相同培养条件下静置48h，对照组接种相同密度的细胞，加入完全培养基在相同培养条件下培养48h。

按1：4稀释无酚红DMEM配制的MTT工作母液，各组别吸去培养基并于每孔加入100μL MTT工作液，于37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中孵育4h，吸去MTT工作液，每孔加入 150μL的DMSO，于37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中使用摇床孵育15min，使用酶标仪检测每孔在570nm处的吸光度，绘制成图。

如图1所示，实验组吸光度值与对照组无统计学差异。说明水凝胶介质组合对肌肉干细胞无毒性，可以培养细胞。

实施例2表观细胞伸展状态

将肌肉干细胞与水凝胶介质组合中的水凝胶液混合均匀，使细胞浓度为1.2×10⁶个/mL，接种于24孔板中，每孔300-400μL，加入交联剂，水凝胶完全成胶凝固后，细胞随之悬停于水凝胶中，加入2mL完全培养基，于37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养3天，每隔20-24h更换完全培养基，于倒置显微镜下观察培养3天细胞的伸展状态。

如图2所示，完全培养基培养下肌肉干细胞于24孔板内无介质贴壁培养3天后，伸展呈梭状，如图3所示，肌肉干细胞悬停于水凝胶介质内可伸展为类似普通贴壁细胞的梭形，说明肌肉干细胞悬停于水凝胶介质内培养可正常伸展，在伸展大小、细胞状态上与传统贴壁生长的细胞类似。说明使用水凝胶介质三维培养细胞具有可行性。

实施例3表观水凝胶对细胞增殖水平的影响

组别a为对照组，于96孔板内接种肌肉干细胞，初始接种密度为3×10³个/孔，加入100 μL完全培养基，分别于37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养6，12，24，48h时吸去培养基，用PBS缓冲液清洗2次，加入Hoechst33528荧光染色试剂，室温避光孵育30min，吸去荧光染色试剂并用PBS缓冲液清洗2次，于具有365nm激发和458nm发射的酶标仪下通过荧光光谱测量强度，即为组别a的荧光强度值，绘制成图。

组别b为将100μL水凝胶液铺于96孔板内，加入交联剂，完全成胶凝固后接种肌肉干细胞，初始接种密度为3×10³个/孔，加入100μL完全培养基，分别于37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养6，12，24，48h时吸去培养基，用PBS缓冲液清洗2次，加入Hoechst33528 荧光染色试剂，室温避光孵育30min，吸去荧光染色试剂并用PBS缓冲液清洗2次，于具有 365nm激发和458nm发射的酶标仪下通过荧光光谱测量强度，得到组别b的初步荧光强度值。同时设置无接种细胞的空白组，以上述荧光强度测定方法测定水凝胶介质染色后的荧光强度，将组别b的初步荧光强度值减去空白组的荧光强度值，以降低水凝胶本身对结果的影响，所得数值即为组别b的实际荧光强度值，绘制成图。

如图4所示，在培养6，12，24，48h四个时间点时组别b的荧光强度值均高于组别a。说明与传统贴壁培养肌肉干细胞相比，贴附于水凝胶介质培养有助于具有促进肌肉干细胞的增殖水平。

实施例4表观水凝胶对细胞分化水平的影响

组别a为对照组，于96孔板内接种肌肉干细胞，初始接种密度为1×10⁴个/孔，加入100 μL完全培养基，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养24h，待孔内细胞密度高于80％时吸去完全培养基，加入100μL分化培养基，每2天更换一次分化培养基，于37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养6天。吸去分化培养基，进行免疫荧光染色，于倒置显微镜下观察诱导分化6天细胞的分化情况，计算分化率。

组别b为将100μL水凝胶液铺于96孔板内，加入交联剂，完全成胶凝固后接种肌肉干细胞，初始接种密度为1×10⁴个/孔，加入100μL完全培养基，于37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养24h，待孔内细胞密度高于80％时吸去完全培养基，加入100μL分化培养基，每2 天更换一次分化培养基，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养6天。吸去分化培养基，进行免疫荧光染色，于倒置显微镜下观察诱导分化6天细胞的分化情况，计算分化率。

免疫荧光染色过程如下，用PBS缓冲液清洗细胞2次，加入150μL 4％多聚甲醛溶液，室温下固定处理15min，吸去溶液，用PBS缓冲液清洗细胞2次，加入150μL 0.5％TritonX-100 溶液，室温下通透处理15min，吸去溶液，用PBS缓冲液清洗细胞2次，加入150μL封闭液，室温下封闭处理30min，吸去溶液，用PBS缓冲液清洗细胞2次，加入100μL在1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液中1：200稀释的MyHC抗体，室温下避光孵育60min，4℃避光保存过夜，吸去抗体溶液，用PBS缓冲液清洗细胞2次，加入100μL在1％BSA的PBS 溶液中1：200稀释的荧光标记的二抗，室温下避光孵育60min，吸去二抗溶液，用PBS缓冲液清洗细胞2次，加入100μL 1：1000稀释的DAPI荧光染剂，室温下避光孵育5-10min，吸去溶液，用PBS缓冲液清洗细胞2次，加入100μL PBS缓冲液。

如图5所示，组别b中细胞的分化率较组别a提高120％。说明贴附于水凝胶介质培养有助于具有促进肌肉干细胞的分化水平。

实施例5表观水凝胶三维培养下细胞增殖情况

将肌肉干细胞与水凝胶液混合均匀，使初始细胞浓度为5×10⁵个/mL，接种于96孔板中，每孔40-60μL，加入交联剂，水凝胶完全成胶凝固后，加入200μL完全培养基，分别于37℃、 5％CO₂的细胞培养箱中培养12，24，48，96h时吸去培养基，用PBS缓冲液清洗2次，加入Hoechst33528荧光染色试剂，室温避光孵育30min，吸去荧光染色试剂并用PBS缓冲液清洗2次，于具有365nm激发和458nm发射的酶标仪下通过荧光光谱测量强度，得到样品组的初步荧光强度值，同时设置不添加细胞、水凝胶的添加量和样品组相同的空白组，以上述荧光强度测定方法测定空白组水凝胶成胶后的荧光强度值，将样品组的初步荧光强度组值减去空白组的荧光强度值，得到样品组的试剂荧光强度值，降低水凝胶本身对结果的影响的同时清晰表观细胞的增殖水平，所得数值绘制成图。

如图6所示，在培养的96h内，荧光强度值呈上升趋势。说明肌肉干细胞在水凝胶介质的三维培养下可增殖。

实施例6表观水凝胶三维培养下细胞分化情况

将肌肉干细胞与水凝胶液混合均匀，使初始细胞浓度为2×10⁶个/mL，接种于96孔板中，每孔40-60μL，加入交联剂，水凝胶完全成胶凝固后，加入200μL完全培养基，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养48h，吸去完全培养基，加入200μL分化培养基，每24h更换一次分化培养基，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养6天。吸去分化培养基，进行上述MyHC一抗、二抗及DAPI免疫荧光染色过程，于倒置显微镜下观察诱导分化6天细胞的分化情况，计算分化率。

如图7所示，较多肌肉干细胞已分化，分化率达到80％。说明细胞在水凝胶介质的三维培养下可进行诱导分化形成肌管，使用水凝胶三维培养肌肉干细胞有望产出含肌纤维的类肉糜产品。

实施例7基于组织化植物蛋白支架生产水凝胶细胞培养肉

将肌肉干细胞与水凝胶液混合均匀，使初始细胞浓度为2×10⁶个/mL，填充入组织化植物蛋白(TVP)支架的孔洞中，加入交联剂，待水凝胶完全成胶凝固后，置于6孔板内，加入6 mL完全培养基，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养48h，吸去完全培养基，加入6mL 分化培养基，每24h更换一次分化培养基，于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养14天。吸去分化培养基，进行上述MyHC一抗、二抗及DAPI免疫荧光染色过程，于共聚焦显微镜下观察分化14天细胞的分化情况。

如图8所示，在共聚焦显微镜下可以明显观察到较多肌肉干细胞已分化，且呈现出TVP 支架内孔洞的形状。说明细胞基于组织化植物蛋白支架的三维塑形下通过水凝胶介质进行三维培养及诱导分化具有可行性，可以生产出成本较为低廉的细胞培养肉，解决了植物基细胞支架生物相容性较差、无法黏附细胞的问题，并可代替传统动物源细胞支架生产的细胞培养肉。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.一种肌肉干细胞细胞可黏附的水凝胶介质组合，所述水凝胶介质组合为如下(a)～(c)的组合物中的任一：

(a)组分A和组分C；

(b)组分B和组分C；

(c)组分A、组分B和组分C；

2.根据权利要求1所述的水凝胶介质组合，其特征在于，所述明胶的使用浓度为30～100mg/mL、谷氨酰胺转氨酶的使用浓度为50～400U/mL；所述海藻酸钠的使用浓度为2～15mg/mL、氯化钙的使用浓度为2.5～10mg/mL；所述纤维蛋白原的使用浓度为2～20mg/mL、凝血酶的使用浓度为1～5U/mL。

3.权利要求1或2所述水凝胶介质组合在制备细胞培养肉中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述应用为先将肌肉干细胞与权利要求1～4任一所述水凝胶介质组合中的水凝胶液混合，随后注入组织化植物蛋白支架的表面和孔洞中并添加交联剂，完全培养基培养2天后，更换分化培养基诱导分化14天；所述水凝胶液为明胶、海藻酸钠、纤维蛋白原；所述交联剂为谷氨酰胺转氨酶、氯化钙、凝血酶。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，交联剂的添加顺序为谷氨酰胺转氨酶早于凝血酶，凝血酶早于氯化钙。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，组织化植物蛋白支架包含但不限于大豆拉丝蛋白、花生拉丝蛋白、小麦蛋白。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述完全培养基和分化培养基由基础培养基和添加物组成。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述基础培养基选自DMEM培养基、MEM培养基、DEME/F12培养基、F10培养基中的一种或多种。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述培养基中还含有青霉素-链霉素双抗溶液。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述完全培养基的添加物为10vol％胎牛血清；所述分化培养基的添加物为2vol％马血清。