CN114908052A - 一种培养肿瘤干细胞的试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于干细胞培养技术领域，公开了一种培养肿瘤干细胞的试剂盒及其应用。本发明提供了一种试剂盒，包含：明胶、透明质酸和交联剂；所述交联剂为谷氨酰胺转氨酶、戊二醛、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N‑羟基琥珀酰亚胺、京尼平中的至少一种；该试剂盒可用于制备水凝胶，制备得到的水凝胶可用于培养肿瘤干细胞，培养的肿瘤干细胞在形态学、克隆形成率、ALDH阳性率表征等方面具有优异的效果，尤其与悬浮培养相比，其培养的肿瘤干细胞ALDH阳性率更高，能够更好地维持肿瘤干细胞干性。
Description
技术领域
本发明属于干细胞培养技术领域，具体涉及一种培养肿瘤干细胞的试剂盒及其应用。
背景技术
传统肝癌治疗的的主要方法有手术切除、放疗、化疗和生物治疗等方法或多种方法联合，虽然癌症患者的肿瘤细胞减少了，但是肿瘤治疗效果差、复发转移率高且副作用大、精准性差等挑战急需解决。造成这一结果的根本原因是这些传统疗法主要针对的是已分化并处于增殖期的肿瘤细胞，而非肿瘤的根源—肿瘤种子细胞，即肿瘤干细胞(CSC)。越来越多的研究证明，肿瘤干细胞不仅对常规癌症治疗具有抵抗作用，而且会促发肿瘤的转移和复发。临床上90％的癌症死亡与肿瘤转移和复发有关，肿瘤干细胞在转移和复发过程中起决定性作用。因此，对肝癌干细胞的研究有重大的科学和临床意义，它会直接影响癌症治疗现有模式，从根本上提高癌症病人的生存几率和生活质量。
与正常组织干细胞一样，肿瘤干细胞也处在一个特定、复杂的微环境中，即肿瘤干细胞巢。肿瘤干细胞的微环境构成肿瘤微环境的一部分，如细胞外基质等。研究表明细胞外基质在协调耐药性、疾病进展和肿瘤转移方面发挥着关键作用。癌症的发病机制是一个复杂、多步骤的漫长过程，很难通过体内长期跟踪观察来研究肿瘤干细胞对癌症的作用机制。此外，肿瘤干细胞在肿瘤细胞中含量极低、分离困难，体外扩增培养容易丢失干性，给肿瘤干细胞的研究带来诸多困难。因此，培养肿瘤干细胞具有重大意义，它不仅有助于研究肿瘤干细胞在肿瘤发生发展及癌症转移和复发过程中的作用和机理，而且能为进一步研究肿瘤干细胞的靶向治疗策略和治疗剂奠定基础。
悬浮培养的方法是目前肿瘤干细胞培养最常用的培养方法之一。该方法将细胞接种于无血清培养基中，并采用超低黏附性的培养容器来减少细胞的贴壁，但是悬浮培养在CSC的培养中有着一些局限性：①在培养早期，CSC、前体细胞、和快速增殖期的细胞都可能形成肿瘤球；仅有不到6％的悬浮细胞可以连续传代6代以上；长期传代的细胞球数目少、耗时长；这使得该培养方法培养的细胞中非CSC的比例较高；②无细胞与细胞外基质间的联系。
发明内容
本发明第一方面的目的，在于提供一种培养肿瘤干细胞的试剂盒。
本发明第二方面的目的，在于提供一种水凝胶。
本发明第三方面的目的，在于提供第一方面的试剂盒和/或第二方面的水凝胶在培养肿瘤干细胞中的应用。
本发明第四方面的目的，在于提供一种培养肿瘤干细胞的方法。
本发明第五方面的目的，在于提供第四方面的方法在开发肿瘤药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：
本发明的第一个方面，提供一种培养肿瘤干细胞的试剂盒，包含：明胶、透明质酸和交联剂；所述交联剂为谷氨酰胺转氨酶、戊二醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、京尼平中的至少一种。
优选地，所述交联剂为谷氨酰胺转氨酶。
优选地，使用时，所述明胶和透明质酸的混合质量比为1：(0.25～2)；进一步为1：(0.25～1)；更进一步为1：(0.5～1)。
优选地，使用时，所述明胶、透明质酸、交联剂的混合质量比为1：(0.25～2)：(0.01～0.03)；进一步为1：(0.25～1)：(0.01～0.03)；更进一步为1：(0.5～1)：0.02。
优选地，所述试剂盒还包含肿瘤干细胞培养基。
优选地，试剂盒中的明胶、透明质酸、交联剂和肿瘤干细胞培养基各自独立存在。
优选地，所述明胶为明胶溶液。
优选地，所述明胶溶液中明胶的浓度为0.15～0.45g/mL；进一步为0.25～0.45g/mL。
优选地，所述明胶溶液的溶剂为肿瘤干细胞培养基、细胞缓冲液、水中的至少一种；进一步为肿瘤干细胞培养基。
优选地，所述透明质酸为透明质酸溶液。
优选地，所述透明质酸溶液中透明质酸的浓度为0.09～0.56g/mL；进一步为0.09～0.36g/mL。
优选地，所述透明质酸溶液的溶剂为肿瘤干细胞培养基、细胞缓冲液、水中的至少一种；进一步为肿瘤干细胞培养基。
优选地，所述交联剂为交联剂溶液。
优选地，所述交联剂溶液的溶剂为肿瘤干细胞培养基、细胞缓冲液、水中的至少一种；进一步为细胞缓冲液。
优选地，所述细胞缓冲液为PBS、HBSS、EBSS、HEPES中的至少一种；进一步为PBS。
优选地，所述肿瘤干细胞培养基为含以下组分中至少一种的基础培养基：B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺、烟酰胺；进一步为含有B27、表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的基础培养基。
优选地，所述B27的终浓度为1v/v％～3v/v％。
优选地，所述表皮细胞生长因子的终浓度为10～30ng/mL。
优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为5～10ng/mL。
优选地，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺的终浓度为1v/v％～3v/v％。
优选地，所述烟酰胺的终浓度为0.4～0.6mg/mL。
优选地，所述基础培养基为DMEM/F12、DMEM basic中的至少一种；进一步为DMEM/F12。
优选地，所述肿瘤干细胞培养基中还包含抗生素。
优选地，所述抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素中的至少一种；进一步为青霉素、链霉素和庆大霉素的混合物。
优选地，所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞、胆管癌干细胞、肺癌干细胞、肠癌干细胞中的至少一种；进一步为肝癌干细胞。
本发明的第二个方面，提供一种水凝胶，所述水凝胶的制备方法为：将本发明第一方面的试剂盒中的明胶、透明质酸和交联剂混合，孵育，得到；所述明胶和透明质酸的质量比为1：(0.25～2)。
优选地，所述明胶和透明质酸的质量比为1：(0.25～1)；进一步为1：(0.5～1)。
优选地，所述明胶、透明质酸、交联剂的混合质量比为1：(0.25～2)：(0.01～0.03)；进一步为1：(0.25～1)：(0.01～0.03)；更进一步为1：(0.5～1)：0.02。
优选地，所述孵育的条件为35～39℃下孵育15～60min。
优选地，所述水凝胶的弹性模量为9～2722Pa；进一步为9～640Pa；更进一步为9～36Pa。
本发明的第三个方面，提供第一方面的试剂盒和/或第二方面的水凝胶在培养肿瘤干细胞中的应用。
优选地，所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞、胆管癌干细胞、肺癌干细胞、肠癌干细胞中的至少一种；进一步为肝癌干细胞。
本发明的第四个方面，提供一种培养肿瘤干细胞的方法，包含采用本发明第一方面的试剂盒或本发明第二方面的水凝胶的步骤；为(1)或(2)：
(1)将肿瘤干细胞与本发明第一方面的试剂盒中的明胶、透明质酸、交联剂混合，孵育，得到水凝胶；将得到的水凝胶与本发明第一方面的试剂盒中的肿瘤干细胞培养基混合，培养；
(2)将肿瘤干细胞种于本发明第二方面的水凝胶上，加入肿瘤干细胞培养基，培养。
优选地，(1)中所述明胶和透明质酸的质量比为1：(0.25～2)；进一步为1：(0.25～1)；更进一步为1：(0.5～1)。
优选地，(1)中所述明胶、透明质酸、交联剂的混合质量比为1：(0.25～2)：(0.01～0.03)；进一步为1：(0.25～1)：(0.01～0.03)；更进一步为1：(0.5～1)：0.02。
优选地，(1)中所述肿瘤干细胞在肿瘤干细胞与本发明第一方面的试剂盒中的明胶、透明质酸、交联剂的混合体系中的浓度为2～20万个/mL；进一步为5～10万个/mL。
优选地，(1)中所述孵育的条件为35～39℃下孵育15～60min。
优选地，(1)和(2)中所述培养的条件为35～39℃，4～6％CO2。
优选地，(1)和(2)中所述培养的过程中每隔1～3天更换一次肿瘤干细胞培养基。
优选地，(1)和(2)中第一次加入的肿瘤干细胞培养基中含有Rock抑制剂。
优选地，所述Rock抑制剂为Blebbistatin、HA-100、Y-27632、HA-1077、KD-025、Y-33075、Narciclasine中的至少一种；进一步为Y-27632。
优选地，所述Rock抑制剂的终浓度为5～15μM。
优选地，所述肿瘤干细胞培养基为含以下组分中至少一种的基础培养基：B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺、烟酰胺；进一步为含有B27、表皮细胞生长因子和碱性成纤维细胞生长因子的基础培养基。
优选地，所述B27的终浓度为1v/v％～3v/v％。
优选地，所述表皮细胞生长因子的终浓度为10～30ng/mL。
优选地，所述碱性成纤维细胞生长因子的终浓度为5～10ng/mL。
优选地，所述胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺的终浓度为1v/v％～3v/v％。
优选地，所述烟酰胺的终浓度为0.4～0.6mg/mL。
优选地，所述基础培养基为DMEM/F12、DMEM basic中的至少一种；进一步为DMEM/F12。
优选地，所述肿瘤干细胞培养基中还包含抗生素。
优选地，所述抗生素为青霉素、链霉素、庆大霉素中的至少一种；进一步为青霉素、链霉素和庆大霉素的混合物。
优选地，所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞、胆管癌干细胞、肺癌干细胞、肠癌干细胞中的至少一种；进一步为肝癌干细胞。
本发明第五个方面，提供第四个方面的方法在开发抗肿瘤药物中的应用。
优选地，所述肿瘤为肝癌、胆管癌、肺癌、肠癌中的至少一种。
本发明的有益效果是：
本发明提供了一种试剂盒，包含：明胶、透明质酸和交联剂；所述交联剂为谷氨酰胺转氨酶、戊二醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、京尼平中的至少一种；该试剂盒可用于制备水凝胶，制备得到的水凝胶可用于培养肿瘤干细胞，培养的肿瘤干细胞在形态学、克隆形成率、ALDH阳性率表征等方面具有优异的效果，尤其与悬浮培养相比，其培养的肿瘤干细胞ALDH阳性率更高(悬浮培养七天后ALDH阳性率为64％，而本发明ALDH阳性率为80.6％)，能够更好地维持肿瘤干细胞干性(本发明ALDH阳性率下降14.6％，而悬浮培养下降32.5％)。
进一步地，该试剂盒还包含：肿瘤干细胞培养基，可用于培养肿瘤干细胞，培养的肿瘤干细胞在形态学、克隆形成率、ALDH阳性率表征等方面具有优异的效果，尤其与悬浮培养相比，其培养的肿瘤干细胞ALDH阳性率更高(悬浮培养七天后ALDH阳性率为64％，而本发明ALDH阳性率为80.6％)，能够更好地维持肿瘤干细胞干性(本发明ALDH阳性率下降14.6％，而悬浮培养下降32.5％)。
本发明提供了一种培养肿瘤干细胞的方法，包含采用上述试剂盒的步骤，该方法培养的肿瘤干细胞在形态学、克隆形成率、ALDH阳性率表征等方面具有优异的效果，尤其与悬浮培养相比，其培养的肿瘤干细胞ALDH阳性率更高(悬浮培养七天后ALDH阳性率为64％，而本发明ALDH阳性率为80.6％)，能够更好地维持肿瘤干细胞干性(本发明ALDH阳性率下降14.6％，而悬浮培养下降32.5％)。
附图说明
图1是水凝胶的表征图：其中，A是实施例5～8以及对比例2的水凝胶成胶前后对比图；B是实施例5～8以及对比例2的水凝胶的透明度对比图；C是实施例5～8以及对比例2的水凝胶的扫描电镜代表图；D是实施例5～8以及对比例2的水凝胶的力学性能对比图。
图2是实施例13～20、对比例4、5中培养得到的肝癌干细胞的克隆形态、大小、数量对比图：其中，A是实施例13～16、对比例4中培养得到的肝癌干细胞的克隆形态对比图；B是实施例13～16、对比例4中培养得到的肝癌干细胞的克隆大小对比图；C是实施例13～20、对比例4、5中培养得到的肝癌干细胞的克隆数量对比图。
图3是实施例13、21、22中培养得到的肝癌干细胞的ALDH阳性率结果图。
图4是实施例13～16、对比例4、6中培养1、4、7天后得到的肝癌干细胞的ALDH阳性率结果图：其中，A是实施例13～16、对比例4、6中培养1天后得到肝癌干细胞的ALD H阳性率结果图；B是实施例13～16、对比例4、6中培养4天后得到肝癌干细胞的ALDH阳性率结果图；C是是实施例13、对比例6中培养7天后得到肝癌干细胞的ALDH阳性率结果图。
具体实施方式
以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。
应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。本实施例中所使用的材料、试剂等，如无特别说明，为从商业途径得到的试剂和材料。
下述实施例/对比例中的明胶购自Sigma(G7041)；透明质酸购自华熙生物(1901075)；谷氨酰胺转氨酶购自Biobomei(BC5582)；B27购自Gibco(17504-044)；三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素溶液)购自Solarbio(P1410)。
下述实施例/对比例中的肝癌干细胞的分离方法如下：(1)分离培养原代肝癌细胞：使用无菌手术剪将从肝癌患者手术切除获得的新鲜肿瘤组织切成1mm3大小的碎片，并在含有10mL DMEM/F12培养基(Gibco)、10ml浓度为1mg/mL的IV型胶原酶(Sigma)和1v/v％青霉素-链霉素-庆大霉素(Gibco)的混合物中消化1小时；然后使用70μm细胞筛网过滤消化所得的细胞悬液，以去除未消化完全的肿瘤组织；再使用红细胞裂解液裂解红细胞后，剩余细胞使用DMEM高糖培养基洗涤3次，重悬于添加10％FBS的DMEM高糖培养基中；取细胞悬液至培养皿中，37℃、5％CO2下培养；培养基(10％FBS的DMEM高糖培养基)每周更新两次；(2)收集肝癌干细胞：当细胞达到70～80％汇合度时，用0.05％胰酶在37℃消化3分钟后，用培养基(10％FBS的DMEM/F12培养基)终止消化，枪头吹打成单个细胞，离心去上清；沉淀用ALDEFLUORTM试剂盒中的ALDEFFLUOR检测缓冲液悬浮，取一小部分细胞加入DEAB试剂作为对照，然后在对照细胞和剩余的细胞中加入ALDEFFLUOR试剂，在37℃温育30分钟，之后加入ALDEFFLUOR缓冲液终止反应并离心沉淀细胞，沉淀的细胞再次悬浮在ALDEFFLUOR缓冲液中并置冰上，在细胞悬液中加入死细胞指示剂DAPI后用细胞流式仪分选收集ALDH高表达的细胞亚群(具体过程参考ALDEFLUORTM试剂盒说明书)，得到肝癌干细胞，加入肿瘤干细胞培养基(含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12)重悬，得到肝癌干细胞的单细胞悬液。
实施例1一种制备水凝胶的组合试剂
一种制备水凝胶的组合试剂，包含：0.45g/mL无菌明胶溶液、0.36g/mL无菌透明质酸溶液、0.018g/mL无菌谷氨酰胺转氨酶溶液；其中，无菌明胶溶液和无菌透明质酸溶液的溶剂为肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12，无菌谷氨酰胺转氨酶溶液的溶剂为PBS，使用时，明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量分别为0.09g、0.09g、0.0018g，其混合质量比为1：1：0.02。
实施例2一种制备水凝胶的组合试剂
一种制备水凝胶的组合试剂，包含：0.45g/mL无菌明胶溶液、0.36g/mL无菌透明质酸溶液、0.018g/mL无菌谷氨酰胺转氨酶溶液；其中，无菌明胶溶液和无菌透明质酸溶液的溶剂为肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12，无菌谷氨酰胺转氨酶溶液的溶剂为PBS，使用时，明胶(Gelatin，Gel)、透明质酸(HA)、谷氨酰胺转氨酶的混合质量混合质量分别为0.06g、0.12g、0.0012g，其混合质量比为1：2：0.02。
实施例3一种制备水凝胶的组合试剂
一种制备水凝胶的组合试剂，包含：0.45g/mL无菌明胶溶液、0.36g/mL无菌透明质酸溶液、0.018g/mL无菌谷氨酰胺转氨酶溶液；其中，无菌明胶溶液和无菌透明质酸溶液的溶剂为肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12，无菌谷氨酰胺转氨酶溶液的溶剂为PBS，使用时，明胶(Gelatin，Gel)、透明质酸(HA)、谷氨酰胺转氨酶的混合质量分别为0.12g、0.06g、0.0024g，其混合质量比为2：1：0.04。
实施例4一种制备水凝胶的组合试剂
一种制备水凝胶的组合试剂，包含：0.45g/mL无菌明胶溶液、0.36g/mL无菌透明质酸溶液、0.018g/mL无菌谷氨酰胺转氨酶溶液；其中，无菌明胶溶液和无菌透明质酸溶液的溶剂为肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12，无菌谷氨酰胺转氨酶溶液的溶剂为PBS，使用时，明胶(Gelatin，Gel)、透明质酸(HA)、谷氨酰胺转氨酶的混合质量混合质量分别为0.144g、0.036g、0.0029g，其混合质量比约为4：1：0.08。
实施例5一种水凝胶
一种水凝胶，采用实施例1的组合试剂制备得到，具体如下：按明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，混合，37℃下孵育40min，得到。
实施例6一种水凝胶
一种水凝胶，采用实施例2的组合试剂制备得到，具体如下：按明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，混合，37℃下孵育80min，得到。
实施例7一种水凝胶
一种水凝胶，采用实施例3的组合试剂制备得到，具体如下：按明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，混合，37℃下孵育30min，得到。
实施例8一种水凝胶
一种水凝胶，采用实施例4的组合试剂制备得到，具体如下：按明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，混合，37℃下孵育20min，得到。
实施例9一种培养肿瘤干细胞的试剂盒
一种培养肿瘤干细胞的试剂盒，包含：实施例1的制备水凝胶的组合试剂及肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12。
实施例10一种培养肿瘤干细胞的试剂盒
一种培养肿瘤干细胞的试剂盒，包含：实施例2的制备水凝胶的组合试剂及肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12。
实施例11一种培养肿瘤干细胞的试剂盒
一种培养肿瘤干细胞的试剂盒，包含：实施例3的制备水凝胶的组合试剂及肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12。
实施例12一种培养肿瘤干细胞的试剂盒
一种培养肿瘤干细胞的试剂盒，包含：实施例4的制备水凝胶的组合试剂及肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12。
实施例13一种培养肿瘤干细胞的方法
一种培养肿瘤干细胞的方法，包括采用实施例9的试剂盒的步骤，具体如下：
(1)按明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，同时取肝癌干细胞的单细胞悬液450μL(肝癌干细胞共5万个)，混匀，得到1mL水凝胶溶液；将水凝胶溶液加入六孔板中，37℃条件下孵育40min，得到水凝胶；
(2)加入肿瘤干细胞培养基(含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12)2mL，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养(其中第一天加入终浓度为10μM的Y-27632以提高单细胞接种的存活率)，每1天更换一次肿瘤干细胞培养基。
实施例14一种培养肿瘤干细胞的方法
一种培养肿瘤干细胞的方法，包括采用实施例10的试剂盒的步骤，具体如下：
(1)按明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，同时取肝癌干细胞的单细胞悬液467μL(肝癌干细胞共5万个)，混匀，得到1mL水凝胶溶液；将水凝胶溶液加入六孔板中，37℃条件下孵育80min，得到水凝胶；
(2)加入肿瘤干细胞培养基(含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12)2mL，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养(其中第一天加入终浓度为10μM的Y-27632以提高单细胞接种的存活率)，每1天更换一次肿瘤干细胞培养基。
实施例15一种培养肿瘤干细胞的方法
一种培养肿瘤干细胞的方法，包括采用实施例11的试剂盒的步骤，具体如下：
(1)按明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，同时取肝癌干细胞的单细胞悬液433μL(肝癌干细胞共5万个)，混匀，得到1mL水凝胶溶液；将水凝胶溶液加入六孔板中，37℃条件下孵育30min，得到水凝胶；
(2)加入肿瘤干细胞培养基(含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12)2mL，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养(其中第一天加入终浓度为10μM的Y-27632以提高单细胞接种的存活率)，每1天更换一次肿瘤干细胞培养基。
实施例16一种培养肿瘤干细胞的方法
一种培养肿瘤干细胞的方法，包括采用实施例12的试剂盒的步骤，具体如下：
(1)按明胶、透明质酸、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，同时取肝癌干细胞的单细胞悬液419μL(肝癌干细胞共5万个)，混匀，得到1mL水凝胶溶液；将水凝胶溶液加入六孔板中，37℃条件下孵育20min，得到水凝胶；
(2)加入肿瘤干细胞培养基(含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12)2mL，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养(其中第一天加入终浓度为10μM的Y-27632以提高单细胞接种的存活率)，每1天更换一次肿瘤干细胞培养基。
实施例17一种培养肿瘤干细胞的方法
本实施例中的方法与实施例13相同，区别仅在于肝癌干细胞共7万个。
实施例18一种培养肿瘤干细胞的方法
本实施例中的方法与实施例14相同，区别仅在于肝癌干细胞共7万个。
实施例19一种培养肿瘤干细胞的方法
本实施例中的方法与实施例15相同，区别仅在于肝癌干细胞共7万个。
实施例20一种培养肿瘤干细胞的方法
本实施例中的方法与实施例16相同，区别仅在于肝癌干细胞共7万个。
实施例21一种培养肿瘤干细胞的方法
本实施例中的方法与实施例13相同，区别仅在于肝癌干细胞共10万个。
实施例22一种培养肿瘤干细胞的方法
本实施例中的方法与实施例13相同，区别仅在于肝癌干细胞共20万个。
实施例23一种培养肿瘤干细胞的方法
一种培养肿瘤干细胞的方法，包括采用实施例5的水凝胶的步骤，具体如下：取实施例5的水凝胶，加入肝癌干细胞的单细胞悬液450μL(肝癌干细胞共5万个)，加入肿瘤干细胞培养基(含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12)2mL，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养(其中第一天加入终浓度为10μM的Y-27632以提高单细胞接种的存活率)，每1天更换一次肿瘤干细胞培养基。
对比例1一种制备水凝胶的组合试剂
一种制备水凝胶的组合试剂，包含：0.45g/mL无菌明胶溶液、0.018g/mL无菌谷氨酰胺转氨酶溶液；其中，无菌明胶溶液的溶剂为肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12，无菌谷氨酰胺转氨酶溶液的溶剂为PBS，使用时，明胶、谷氨酰胺转氨酶的混合质量分别为0.18g、0.0036g，其混合质量比为1：0.02。
对比例2一种水凝胶
一种水凝胶，采用对比例1的组合试剂制备得到，具体如下：按明胶、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，混合，37℃下孵育15min，得到。
对比例3一种培养肿瘤干细胞的试剂盒
一种培养肿瘤干细胞的试剂盒，包含：对比例1的制备水凝胶的组合试剂及肿瘤干细胞培养基，肿瘤干细胞培养基为含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12。
对比例4一种培养肿瘤干细胞的方法
一种培养肿瘤干细胞的方法，包括采用对比例3的试剂盒的步骤，具体如下：
(1)按明胶、谷氨酰胺转氨酶的混合质量取各组分，同时取肝癌干细胞的单细胞悬液400μL(肝癌干细胞共5万个)，混匀，得到1mL水凝胶溶液；将水凝胶溶液加入六孔板中，37℃条件下孵育15min，得到水凝胶；
(2)加入肿瘤干细胞培养基(含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12)2mL，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养(其中第一天加入终浓度为10μM的Y-27632以提高单细胞接种的存活率)，每1天更换一次肿瘤干细胞培养基。
对比例5一种培养肿瘤干细胞的方法
本对比例中的方法与对比例4相同，区别仅在于肝癌肿瘤细胞共7万个。
对比例6一种培养肿瘤干细胞的方法
一种培养肿瘤干细胞的方法，具体如下：
(1)取肝癌干细胞的单细胞悬液500μL(肝癌干细胞共5万个)，加入超低黏附六孔板(购自Corning，货号为3471)中；
(2)加入肿瘤干细胞培养基(含20ng/mL EGF、8ng/mL bFGF、2v/v％B27和1v/v％三抗(青霉素-链霉素-庆大霉素，Gibco)的DMEM/F12)2mL，十字交叉摇匀，于37℃，含5％CO2的培养箱中培养(其中第一天加入终浓度为10μM的Y-27632以提高单细胞接种的存活率)，每1天更换一次肿瘤干细胞培养基。
效果实施例1
实施例5～8以及对比例2的水凝胶成胶前后对比图如图1中A所示：五种水凝胶(1、2、3、4、5分别代表不加透明质酸、明胶与透明质酸质量比分别为4：1，2：1，1：1，1：2)均能成胶；实施例5～8以及对比例2的水凝胶的透明度对比图如图1中B所示(从左至右依次对应对比例2、实施例8、7、5、6)：随着透明质酸的增加，水凝胶的透明度随之降低；分别取实施例7以及对比例2的水凝胶置于-80冰箱预冷，在冷冻干燥机中冷冻干燥2天，待水凝胶完全干燥后取出，粘附在贴有双面导电胶带的扫描电镜载物台上喷金约30分钟，用钨灯丝扫描电子显微镜(仪器型号：FEI Q25)在15KV的电压下观察冻干后的水凝胶表面形貌，在500X对微孔结构拍照记录，结果如图1中D所示(100％Gelatin为对比例2的水凝胶，Gel:HA＝2:1为实施例7的水凝胶)：加入透明质酸后，水凝胶的孔径会变大；分别按照实施例5～8以及对比例2中的水凝胶的制备方法在直径为25mm的模具中分别成型100％Gelatin(对比例2)，Gel:HA＝4:1(实施例8)，Gel:HA＝2:1(实施例7)，Gel:HA＝1:1(实施例5)，Gel:HA＝1:2(实施例6)五种不同浓度的水凝胶，37℃孵育成型，从模具中完整取出，浸泡在培养基中，保持水凝胶处于溶胀状态，将水凝胶置于流变仪(仪器型号：Anton Paar MCR-302)样品台中央，在频率扫描模式下检测0.1Hz～10Hz的水凝胶储能模量及损耗模量曲线，在线性段内取频率为1Hz时对应的储能模量，为水凝胶在室温下的弹性模量，结果如图1中C所示(每种水凝胶制备了3个样品)：随着透明质酸的增加，水凝胶的力学性能随之降低。
效果实施例2
分别观察培养1、7、14天后的实施例13～16、对比例4中的肝癌干细胞的克隆形态，结果如图2中A所示：实施例13、15中的肝癌干细胞的克隆形态更圆，尤其实施例13中的肝癌干细胞的克隆形态更为突出；分别测量培养4、7、10、14天后的实施例13～16、对比例4中的肝癌干细胞的克隆大小，结果如图2中B所示(每种水凝胶制备了3个样品)：实施例13、15中的肝癌干细胞的克隆大小更大，克隆形态更加规则；尤其实施例13中的肝癌干细胞的克隆大小更为突出；分别计算培养7天后的实施例13～20、对比例4、5中的肝癌干细胞的克隆数量，结果如图2中C所示：实施例13、15、17、19中的肝癌干细胞的克隆数量最多，尤其实施例13、17中的肝癌干细胞的克隆数量更为突出。
效果实施例3
分别在培养第1、4天取按实施例13、21、22方法培养肝癌干细胞中的水凝胶，采用1mg/mL的Ⅳ型胶原酶在37℃条件下消化40分钟，收集得到成球样生长的肝癌干细胞(LCSC)，再使用0.05％的胰酶37℃条件下消化5分钟将其消化成单个肝癌干细胞，离心去上清，得到沉淀的细胞。沉淀细胞ALDEFLUORTM试剂盒中的ALDEFFLUOR检测缓冲液悬浮，取一小部分细胞加入DEAB试剂作为对照，然后在对照细胞和剩余的细胞中加入ALDEFFLUOR试剂，在37℃温育30分钟，之后加入ALDEFFLUOR缓冲液终止反应并离心沉淀细胞，沉淀的细胞再次悬浮在ALDEFFLUOR缓冲液中并置冰上，在细胞悬液中加入死细胞指示剂DAPI后用细胞流式仪分析。结果如图3所示：实施例13、21、22方法培养肝癌干细胞1天后，肝癌干细胞的ALDH阳性率分别为：93.9％、93.5％、91.9％；4天后，肝癌干细胞的ALDH阳性率分别为：88.5％、84.3％、78.1％；可见，实施例13方法(接种5万个肝癌干细胞)更有利于肝癌干细胞干性的维持。
效果实施例4
分别在培养第1、4、7天取按实施例13～16、对比例4方法培养肝癌干细胞中的水凝胶，采用1mg/mL的Ⅳ型胶原酶在37℃条件下消化40分钟，收集得到成球样生长的肝癌干细胞(LCSC)，再使用0.05％的胰酶37℃条件下消化5分钟将其消化成单个肝癌干细胞，离心去上清，得到沉淀的细胞。沉淀细胞ALDEFLUORTM试剂盒中的ALDEFFLUOR检测缓冲液悬浮，取一小部分细胞加入DEAB试剂作为对照，然后在对照细胞和剩余的细胞中加入ALDEFFLUOR试剂，在37℃温育30分钟，之后加入ALDEFFLUOR缓冲液终止反应并离心沉淀细胞，沉淀的细胞再次悬浮在ALDEFFLUOR缓冲液中并置冰上，在细胞悬液中加入死细胞指示剂DAPI后用细胞流式仪分析。结果如图4所示：实施例13、14、15、16、对比例4、6方法培养肝癌干细胞1天后，肝癌干细胞的ALDH阳性率分别为：95.2％、93.4％、95.0％、94.5％、94.4％、96.5％；4天后，肝癌干细胞的ALDH阳性率分别为：88.1％、73.5％、84.0％、84.3％、81.3％、82.3％；7天后，实施例13、对比例6的肝癌干细胞的ALDH阳性率分别为：80.6％、64％；可见，本发明提供的组合试剂、水凝胶、试剂盒、培养肿瘤干细胞的方法可以显著提高肿瘤干细胞培养过程中干性的维持。
实施例23的方法培养得到的肝癌干细胞的形态学、克隆形成率、ALDH阳性率表征与实施例13的方法培养得到的肝癌干细胞相似。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种试剂盒，包含：明胶、透明质酸和交联剂；所述交联剂为谷氨酰胺转氨酶、戊二醛、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、京尼平中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包含肿瘤干细胞培养基；
优选地，所述明胶和透明质酸的混合质量比为1：(0.25～2)。
3.一种水凝胶，所述水凝胶的制备方法为：将权利要求1或2所述的试剂盒中的明胶、透明质酸和交联剂混合，孵育，得到；
优选地，所述水凝胶的弹性模量为9～2722Pa。
4.权利要求1～2中任一项所述的试剂盒和/或权利要求3所述的水凝胶在培养肿瘤干细胞中的应用。
5.一种培养肿瘤干细胞的方法，包含采用权利要求1～2中任一项所述的试剂盒或权利要求3所述的水凝胶的步骤。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述方法为(1)或(2)：
(1)将肿瘤干细胞与权利要求1～2中任一项所述的试剂盒中的明胶、透明质酸、交联剂混合，孵育，得到水凝胶；将得到的水凝胶与肿瘤干细胞培养基混合，培养；
(2)将肿瘤干细胞种于权利要求3所述的水凝胶上，加入肿瘤干细胞培养基，培养。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：
(1)中所述肿瘤干细胞在肿瘤干细胞与所述试剂盒中的明胶、透明质酸、交联剂的混合体系中的浓度为2～20万个/mL。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：
(1)和(2)中所述培养的条件为35～39℃，4～6％CO2；
优选地，(1)中所述孵育的条件为35～39℃下孵育15～60min。
9.根据权利要求6～8中任一项所述的方法，其特征在于：
所述肿瘤干细胞培养基为含以下组分中至少一种的基础培养基：B27、表皮细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胰岛素-转铁蛋白-硒-乙醇胺、烟酰胺；
优选地，所述基础培养基为DMEM/F12、DMEM basic中的至少一种；
优选地，所述肿瘤干细胞培养基中还包含抗生素；
优选地，所述肿瘤干细胞为肝癌干细胞、胆管癌干细胞、肺癌干细胞、肠癌干细胞中的至少一种。
10.权利要求5～9中任一项所述的方法在开发抗肿瘤药物中的应用。
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