CN113717940A - 简化的大脑皮层微组织模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种简化的大脑皮层微组织模型及其构建方法。通过反向工程思维，将人体大脑皮层模型简化为六层神经元模型。利用声学操控工程方法，在I型胶原溶液等生物材料预聚物中将成熟神经元、神经干细胞(Neural stem cell,NSC)等种子细胞进行图案化处理，体外构建出了大脑皮层微组织的仿生模型。该模型具有完整的六层仿生结构，层与层之间形成明显的神经突触连接。本发明涉及到的技术方法操作简单、可重复性高，可用于神经药物开发以及临床前神经毒性评估，具有广阔的商业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于组织工程和生物制造领域，具体涉及一种简化的大脑皮层微组织模型及其构建方法
背景技术
大脑皮层是调节躯体运动的最高级中枢，在注意力、知觉、意识、记忆和语言中起着关键作用。根据解剖生理学数据，人类大脑皮层平均厚度为2mm～3mm，可分为六层，平均层厚度约为300至500微米，而哺乳动物如小鼠，其大脑皮层厚度约为0.9mm左右。对于人类而言，大脑皮层的异常发育或损害将导致系列神经退行性疾病，例如阿尔茨海默氏病(AD)和拉福拉(Lafora)疾病，尤其是AD，据世界阿尔茨海默病报告，在全球范围内平均每3秒增加一例AD患者，给全世界造成沉重的公共医疗负担。神经退行性疾病的治疗一直受到世界各国的关注，其相关药物具有广阔的市场价值，据悉，到2022年，神经退行性类疾病市场规模预计可达到450亿美元。由大脑皮层异常导致的系列神经退行性疾病的研究需要模型的支持。目前，国内外研究人员已经使用转基因动物模型和二维细胞培养模型进行了大量研究，以探索与大脑皮层相关的疾病的发病机制。但是，由于动物模型和人类之间在大脑皮层的微观结构和细胞分布存在许多差异，因而限制了其在临床前实验研究中的应用；而二维细胞培养模型过于简单，无法真正形成类似于神经元组织的三维(3D)微观结构。因此，迫切需要与人类大脑皮层微观结构和细胞分布更接近的模型来支撑现有皮层类疾病研究。
目前，已有新兴体外模型用于神经组织工程及其相关疾病方面的研究。利用反向工程原理将人体组织简化，并通过工程化方法结合生物材料体外重建人体组织具有广泛的应用前景。例如：Gordon等人使用3D生物打印技术通过将载有原代神经元的水凝胶进行分层打印体外构建了一个3D类脑组织结构。虽然生物打印技术在对神经元的空间定位操控上具有很高的灵活度，但由于神经元在打印过程中不可避免地受到流体剪切力的影响，从而影响了细胞活性。在我们前期研究工作中，我们使用体超声波悬浮神经祖细胞构建了3D皮层组织，成功构建了六层皮质组织，该建模过程一步成型且生物兼容性良好，体现出声学操控技术在构建神经微组织方面的优势。
因此，本发明拟借助声学操控在体外微组织建模的优势，开发一种体外构建大脑皮层微组织的建模方法，并以此构建大脑皮层微组织模型。
发明内容
本发明的目的是提供一种简化的大脑皮层微组织模型及其构建方法，本发明的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种简化的大脑皮层微组织模型，其特征在于：该模型具有以下特性：
(1)利用反向工程原理，通过将人体复杂大脑皮层模型简化为n层同心圆环神经元结构，从而仿生构建体外大脑皮层微组织模型；所述n为正数，1＜n≤11；
(2)利用声学操控技术方法原理，驱动细胞图案化，形成体外简化大脑皮层模型；
所述细胞为成熟神经元、NSC或神经胶质细胞中任一种及两种以上，神经元细胞来自原代分离、干细胞分化、类器官消化或者神经相关的细胞系中任一种，其中干细胞的来源为iPSC、NSC、胚胎干细胞、间充质干细胞或神经干细胞中任一种；
所述生物材料为I型胶原、matrigel、GelMA、海藻酸钠、fibrinogen、HAMA、HA-CA、丝素蛋白、壳聚糖和明胶中的一种或多种以任意比例混合物。
第二方面，本发明提供一种如上述简化的大脑皮层微组织模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：制备Ⅰ型胶原凝胶预聚物，并使用凝胶将消化离心下来的成熟神经元重悬，制成浓度为106～107个/ml或者105～108个/ml细胞悬液，预冷的冻台保存备用；
S2：将I型胶原溶液与神经元均匀混合形成凝胶-神经元混合溶液，然后将其注入内含组装腔室的培养皿中，在此基础上，利用压电陶瓷超声换能器作用于凝胶-神经元混合溶液，使神经元在超声波声辐射力下形成六层同心圆环结构，最后对图案化结构进行交联，形成稳定结构；所述组装腔室的材料为普通玻璃、石英玻璃、PMMA、PDMS或硅片中的任一种。
S3：将内含组装腔室的培养皿放置于37℃二氧化碳细胞培养箱进行含细胞水凝胶培养；
S4：若干天后对其进行神经元活性检测以及神经元免疫荧光染色等，以此鉴定凝胶中神经网络的形成，以及层与层神经元之间神经突触连接的形成情况。
作为优选方案，所述步骤S2中的声组装的对象为细胞或细胞聚集物。
进一步地，所述细胞或细胞聚集物为细胞球状体、饼状聚集体或杆状/条状聚集体中任一种。
更进一步地，所述步骤S2中的压电陶瓷超声换能器包括压电陶瓷、压电陶瓷固定装置和空气背衬板，通过压电陶瓷固定装置将压电陶瓷进行四周固定约束；所述空气背衬板位于压电陶瓷底部。
更进一步地，所述步骤S3中培养含细胞水凝胶的方法为静态或动态培养方法，包括培养基覆盖培养、摇床动态培养、transwell中培养和微流控通道灌流培养。
更进一步地，所述步骤S4中具体方法为：将已交联的凝胶从组装腔室中取出，置于培养皿中；明场照片用于观察组装后的细胞微结构和鉴定尺寸，免疫荧光染色用以表征形成神经网络的关键细胞标记物以及图案化的细胞层与层之间神经突触连接的产生。
作为一种最优选的具体方案，上述简化的大脑皮层微组织模型及其构建方法按如下步骤进行：
S1：制备Ⅰ型胶原凝胶预聚物溶液作为生物材料，于提前预冷的冻台上保存待用。所述的Ⅰ型胶原凝胶预聚物的制备方法为：在提前预冷的冻台上将凝胶预聚物的各组分混合(包括CollagenⅠ原液、NaOH、10x DPBS及H2O)，混合后得到相应浓度的CollagenⅠ凝胶预聚物溶液。
S2：将培养皿中二维培养或分化的成熟神经元消化下来，使用预先配好的凝胶预聚物溶液制备成含106～107个/ml神经细胞的凝胶-神经元细胞悬液。所述的含相应浓度的凝胶-神经元细胞悬液的制备方法按照如下步骤进行：
S2.1将分化成熟的iPSC来源神经元用Accutase消化液温和消化3分钟，镜下观察消化到位后使用不含血清的DMEM/F12培养基终止消化，并离心3分钟，随后弃去上清将细胞以神经元分化第三阶段培养基重悬；
S2.2对重悬后的细胞悬液进行细胞计数，取计算得到的相应体积的细胞悬液置于离心管中，离心后用低温保存的凝胶预聚物溶液重悬，配制相应浓度的凝胶-神经元细胞悬液，用移液器将凝胶-神经元细胞悬液轻轻吹打均匀。
S3：声学技术对凝胶-神经元细胞混合溶液进行操控，使神经细胞形成六层同心圆环结构，最后对图案化结构进行凝胶交联处理，使之形成稳定结构；随后将含细胞图案化凝胶结构浸泡在培养基中，于37℃二氧化碳培养箱中恒温培养。所述的声学操控神经细胞图案化的方法按照如下步骤进行：
S3.1将压电陶瓷换能器、玻璃环、镊子等工具进行预先灭菌处理，即压电陶瓷换能器喷洒酒精、玻璃环提前高温湿热灭菌；
S3.2将所有器件及工具置于超净工作台中，利用紫外光对整体系统进行灭菌消毒，然后利用超声耦合胶将压电陶瓷换能器、培养皿和玻璃环依次顺序连接，最后将压电陶瓷换能器与信号发生器相连；
S3.3利用移液枪，将均匀混合的凝胶-神经元预聚物溶液注入玻璃环中，待细胞沉淀几秒后，施加一定幅值和频率的正弦波电信号，电信号作用一段时间后停止激励，此时压电陶瓷换能器产生的超声驻波场使细胞排布为层间距约为400μm的六层同心圆环图案。将培养皿迅速转入37℃二氧化碳培养箱中，放置十余分钟等待温度使含细胞水凝胶完成交联；
S3.4凝胶交联固化后，将培养皿中注入神经分化培养基，放置于37℃细胞培养箱摇床上动态摇动培养。
S4：培养十几天后，对凝胶中神经细胞形成的神经微组织进行观察和鉴定。所述的神经微组织的观察和鉴定方法为：使用显微镜查看图案化的凝胶-神经元细胞结构并进行形态、图案尺寸的观察和拍照，使用免疫荧光染色对神经微组织进行部分功能表型鉴定。如TUJI和DAPI共染确定神经元分化成熟情况及各层间神经细胞连接的形成情况，Synapsin-1、PSD-95共染用以鉴定层与层之间神经突触的产生和相连情况。
本发明具有以下优点及有益效果：
本发明拟通过反向工程思维简化真实大脑皮层，并借助声学工程技术方法在体外将种子细胞与生物材料有机整合，构建出大脑皮层仿生模型，该模型具有完整六层同心圆环结构，且层与层之间间距为400um，接近于人体真实大脑皮层结构分布，经过一段时间体外培养，层与层之间出现神经突触连接，具备一定生理功能。本发明涉及到的技术方法操作简单、可重复性高，可用于神经药物开发以及临床前神经毒性评估，具有广阔的商业应用前景。具体优点如下：
1、操作简单可一步成型
由于本发明涉及到的工程技术方法依托声学操控技术，主要通过对压电陶瓷施加电信号的控制来实现对细胞的非接触操作，实验系统构造简单、可拆卸、可重复使用且易上手操作，整个系统基于35mm细胞培养皿，与生物医学实验室的日常细胞培养和分析流程高度兼容，且整个流程只要通过设置输入电信号的参数数值即可控制微组织的形成，对非工程技术背景的研究人员非常友好。
2、高通量且易与孔版结合
由于压电换能器简单可靠，可将其与孔板系统进行耦合，进而将单个培养皿组装体系增大通量，变为高通量体系。
3、生物兼容性好且易于后期成像操作
本发明涉及到的声学操控技术作为一种非接触式的生物制造方法，可控制细胞在生物材料中的精确定位，相比传统组织工程支架材料方法自下而上地产生的组织或器官类似结构，细胞受限于支架材料的结构、性质等特征，往往随机分布于支架材料上，无法受到人为的精确控制定位。声学操纵方法对细胞进行非接触式操纵，使细胞排布为设计的图案，在水凝胶作为细胞外基质的作用下，促进了细胞的紧密排布自组织，不仅快速高效，且相比挤压式生物打印等方法对细胞产生较大剪切力，声学操纵方法几乎不对细胞产生过大的剪切应力，提升了细胞在水凝胶中的生物兼容性，精确排布定位又提升了体外三维微组织模型与人体内真实微生理环境的相关性，非常适用于生命科学应用领域。且由于模型为平面结构，因而易于后期成像操作。
4、可进一步用于诱导构建疾病模型
本发明涉及的大脑皮层微组织模型可进一步利用Aβ、P-Tau以及HSV-1进行药物处理，以此诱导并建立大脑皮层相关病理模型，如AD、PD等。将来有望运用于体外药物筛选和疾病形成机制研究中，为人类研究和治疗神经系统疾病带来曙光。
本发明拟采用反向工程原理，将人体大脑皮层模型简化为六层神经元模型。并利用声学操控工程方法，在I型胶原等生物材料中将成熟神经元等种子细胞进行图案化处理，体外构建出了大脑皮层微组织的仿生模型。该模型具有完整的六层仿生结构，层与层之间形成明显的神经突触连接，可用于神经药物开发以及临床前神经毒性评估，具有广阔的应用前景。
本发明简化的大脑皮层微组织模型及其构建方法，其不仅适合用于构建人类大脑皮层微组织体外模型，还可以根据大脑结构和细胞类型及其分布，进行定制如大鼠、小鼠以及兔子等哺乳动物大脑皮层微组织。
附图说明
为了清楚说明本发明实施例中的技术方案，下面对实施例中的附图进行说明。
图1为反向工程构建大脑皮层微组织模型策略；
图2为实施例1中成熟神经元在体超声波作用下图案化的整体效果，其中图中标尺为1mm；
图3为实施例1中成熟神经元的组装效果及层间连接的荧光图片，其中图A的标尺为1mm，图B中间图的标尺为300μm，图C的标尺为100μm；
图4为实施例2中NSC在体超声波作用下图案化的整体效果，其中图中标尺为1mm；
图5为实施例2中NSC组装后组装效果以及层间连接的荧光图片，其中图中标尺为75μm。
以上：图1说明了本发明的核心思想，涉及方法学，即反向工程原理；图2展示了成熟神经元的组装结果，是六层皮层结构的雏形；图3展示了成熟神经元组装后，层与层之间的神经元连接，说明了具备一定生理功能；图4展示了NSC的六层组装效果；图5展示了NSC组装后的层间连接情况。
具体实施方式
以下描述结合附图说明对本发明做详细阐述，描述内容并不限制本发明的范围及其应用。
实施例1
一种简化的大脑皮层微组织模型及其构建方法，包括以下步骤：
(1)制备2.7mg/ml的CollagenⅠ凝胶预聚物溶液作为生物材料，于提前预冷的冻台上保存待用；
(2)使用Accutase消化液将12孔板中iPSC分化来源的成熟神经元消化约3分钟，显微镜下观察消化到位后使用不含血清的DMEM/F12培养基终止消化，并离心3分钟，随后弃去上清将细胞以神经分化第三阶段培养基重悬；
(3)对重悬后的细胞悬液进行细胞计数，取计算得到的相应体积的细胞悬液置于离心管中，离心后用低温保存的凝胶预聚物溶液重悬，配制相应浓度的神经细胞悬液，用移液器将凝胶-神经元细胞悬液轻轻吹打均匀；
(4)提前灭菌好器件与工具，在超净工作台中进行细胞的声学操纵全流程。利用超声耦合胶将压电陶瓷换能器、3.5mm Corning培养皿和内径4800μm外径7904μm高度1.2mm玻璃环依次顺序连接，最后将压电陶瓷换能器与信号发生器相连；
(5)使用移液枪，取均匀混合的神经元-CollagenⅠ预聚物溶液加入玻璃环腔室中，待细胞沉淀数秒后，施加Vpp＝10V和f＝1.9MHz的正弦波电信号，电信号作用5分钟后停止激励，此时压电陶瓷换能器产生的超声驻波场使细胞排布为层间距约为400μm的六层同心圆环图案。将装有图案化后的水凝胶的培养皿迅速转入37℃二氧化碳培养箱中，放置十余分钟等待温度使含细胞水凝胶完全交联；
(6)凝胶交联固化后，在培养皿中注入神经分化培养基，放置于37℃细胞培养箱摇床上动态摇动培养；
(7)培养17天后，对神经微组织进行观察：使用显微镜查看图案化的凝胶-神经元细胞结构并进行形态、图案尺寸的观察和拍照，神经元在凝胶中组装成图案的情况如图2所示，可以看出，神经元在体超声波作用下，形成了六层同心圆环结构，该结构在层数和层间尺度上与人生理结构类似；经过一段时间培养后，神经元形态与层间细胞连接的形成情况如图3所示，可以看出，神经元具备良好形态，且层与层之间的神经元形成了突触连接，说明了六层神经元同心圆环结构具备一定生理相关性。
(8)使用免疫荧光染色对神经微组织进行部分功能表型鉴定。如TUJI和DAPI共染确定神经元分化成熟情况及各层间神经细胞连接的形成情况，Synapsin-1、PSD-95共染用以鉴定层与层之间神经突触的产生和相连情况。
实施例2
一种简化的大脑皮层微组织模型及其构建方法，包括以下步骤：
(1)制备2.7mg/ml的CollagenⅠ凝胶预聚物溶液作为生物材料，于提前预冷的冻台上保存待用；
(2)使用Accutase消化液将6孔板中iPSC分化到第7天的NSC消化约3分钟，显微镜下观察消化到位后使用不含血清的DMEM/F12培养基终止消化，并离心3分钟，随后弃去上清将细胞以NSC传代培养基重悬；
(3)对重悬后的细胞悬液进行细胞计数，取计算得到的相应体积的细胞悬液置于离心管中，离心后用低温保存的凝胶预聚物溶液重悬，配制相应浓度的神经细胞悬液，用移液器将凝胶-NSC细胞悬液轻轻吹打均匀；
(4)提前灭菌好器件与工具，在超净工作台中进行细胞的声学操纵全流程。利用超声耦合胶将压电陶瓷换能器、3.5mm Corning培养皿和内径4800μm外径7904μm高度1.2mm玻璃环依次顺序连接，最后将压电陶瓷换能器与信号发生器相连；
(5)使用移液枪，取均匀混合的NSC-CollagenⅠ预聚物溶液加入玻璃环腔室中，待细胞沉淀数秒后，施加Vpp＝10V和f＝1.9MHz的正弦波电信号，电信号作用5min分钟后停止激励，此时压电陶瓷换能器产生的超声驻波场使细胞排布为层间距约为400μm的六层同心圆环图案。将装有图案化后的水凝胶的培养皿迅速转入37℃二氧化碳培养箱中，放置十余分钟等待温度使含细胞水凝胶完全交联；
(6)凝胶交联固化后，在培养皿中继续注入神经分化培养基，放置于37℃细胞培养箱摇床上动态摇动培养；
(7)培养1天后，对NSC组装的微组织进行观察：使用显微镜查看图案化的凝胶-NSC细胞结构并进行形态、图案尺寸的观察和拍照，NSC在凝胶中组装成图案的情况如图4所示，可以看出，NSC在体超声波作用下，形成了六层同心圆环结构，该结构在层数和层间尺度上与人生理结构类似；经过一段时间继续分化培养后，NSC分化为成熟神经元，神经元形态与层间细胞连接的形成情况如图5所示，可以看出，神经元具备良好形态，且层与层之间的神经元形成了突触连接，说明了六层神经元同心圆环结构具备一定生理相关性。
(8)使用免疫荧光染色对神经微组织进行部分功能表型鉴定。利用TUJ1和DAPI共染确定神经元分化成熟情况及各层间神经细胞连接的形成情况。
实施例3
该实施例中，施加正弦波信号Vpp＝10V，f＝1.912MHz，信号作用时间为5min；其他均同实施例1。
实施例4
该实施例中，施加正弦波信号Vpp＝9V，f＝1.9MHz，信号作用时间为5min；其他均同实施例1。
实施例5
该实施例中，施加正弦波信号Vpp＝8V，f＝1.9MHz，信号作用时间为5min；其他均同实施例1。
上述实施例只是本发明涉及到的进一步说明，并不限制本发明所涉及的技术方法。在本发明涉及的宏观框架下进行的若干改变和变形方案均在本发明的权利保护范围之内。
Claims (9)
1.一种简化的大脑皮层微组织模型，其特征在于：该模型具有以下特性：
(1)利用反向工程原理，通过将人类复杂大脑皮层模型简化为n层同心圆环神经元结构，从而仿生构建体外大脑皮层微组织模型；所述n为正数，1＜n≤11；
(2)利用声学操控技术方法原理，驱动细胞图案化，形成体外简化大脑皮层模型；
所述细胞为成熟神经元、NSC或神经胶质细胞中任一种及两种以上，神经元细胞来自原代分离、干细胞分化、类器官消化或者神经相关的细胞系中任一种，其中干细胞的来源为iPSC、NSC、胚胎干细胞、间充质干细胞或神经干细胞中任一种；
所述生物材料为I型胶原、matrigel、GelMA、海藻酸钠、fibrinogen、HAMA、HA-CA、丝素蛋白、壳聚糖和明胶中的一种或多种以任意比例混合物。
2.一种如权利要求1所述简化的大脑皮层微组织模型的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1：制备Ⅰ型胶原凝胶预聚物，并使用凝胶溶液将消化离心下来的成熟神经元重悬，制成浓度为106～107个/ml或者105～108个/ml细胞悬液，预冷的冻台保存备用；
S2：将I型胶原溶液与成熟神经元均匀混合形成凝胶-神经元混合溶液，然后将其注入内含组装腔室的培养皿中，在此基础上，利用压电陶瓷超声换能器激发超声波作用于凝胶-神经元混合溶液，使成熟神经元在超声波声辐射力下形成六层同心圆环结构，最后对水凝胶进行交联从而形成稳定结构；所述组装腔室的材料为普通玻璃、石英玻璃、PMMA、PDMS或硅片中的任一种；
S3：将内含组装腔室的培养皿放置于37℃二氧化碳细胞培养箱进行含细胞水凝胶培养；
S4：若干天后对其进行成熟神经元活性检测以及神经元免疫荧光染色等，以此鉴定凝胶中神经网络的形成，以及层与层神经元之间神经突触连接的形成情况。
3.根据权利要求2所述的简化的大脑皮层微组织模型的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中的声组装的对象为细胞或细胞聚集物。
4.根据权利要求3所述的简化的大脑皮层微组织模型的构建方法，其特征在于：所述步骤S2中的六层同心圆环结构，其层与层之间的间距为300-500μm，用以仿生人类大脑皮层结构，六层组织结构整体厚度为0.4-1.2mm。
5.根据权利要求4所述的简化的大脑皮层微组织模型的构建方法，其特征在于：所述细胞或细胞聚集物为细胞球状体、饼状聚集体或杆状/条状聚集体中任一种。
6.根据权利要求2至5中任一所述的简化的大脑皮层微组织模型的构建方法：所述步骤S2中的压电陶瓷超声换能器包括压电陶瓷、压电陶瓷固定装置和空气背衬板，通过压电陶瓷固定装置将压电陶瓷进行四周固定约束；所述空气背衬板位于压电陶瓷底部。
7.根据权利要求2至5中任一所述的简化的大脑皮层微组织模型的构建方法，其特征在于：所述步骤S3中培养含细胞水凝胶的方法为静态或动态培养方法，包括培养基覆盖培养、摇床动态培养、transwell中培养和微流控通道灌流培养。
8.根据权利要求6所述的简化的大脑皮层微组织模型的构建方法，其特征在于：所述步骤S3中培养含细胞水凝胶的方法为静态或动态培养方法，包括培养基覆盖培养、摇床动态培养、transwell中培养和微流控通道灌流培养。
9.根据权利要求2或3或4或5或8所述的简化的大脑皮层微组织模型的构建方法，其特征在于：所述步骤S4中具体方法为：将已交联的凝胶从组装腔室中取出，置于培养皿中；明场照片用于观察组装后的细胞微结构和鉴定尺寸，免疫荧光染色用以表征形成神经网络的关键细胞标记物以及图案化的细胞层与层之间神经突触连接的产生。
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