CN102858947A - 细胞培养体系 - Google Patents

Abstract

本发明公开了包含改进了的细胞培养插件的基于微孔板的细胞培养体系，其适用于且用于粘附细胞和/或三维组织的培养。

Description

细胞培养体系

技术领域

本发明涉及用于将液体或凝胶容置在载体或器皿中的容器，且尤其涉及用于被容置在微孔板中以形成适用于培养粘附细胞或三维组织的细胞培养体系的细胞培养插件（insert）以及其用途。

背景技术

目前，人造生物组织构造，例如人造皮肤或人造软骨替代物，仅以非常小的批量制造，在大多数情况下甚至仅作为个体产品制造。人造生物组织的制造所需的细胞通常通过活组织检查而获得。将细胞分离并置于细胞培养体系以进行繁殖。目前，常规的细胞培养体系包含所谓的多孔或微孔板（microtiter plate），在其表面中形成多个容器或凹陷（‘孔’），用于在一个载体中平行培养数个细胞培养物。孔用于容置被称为细胞培养插件的烧杯形容器。在另外可选的设置中，可以提供容置在载体的单一孔或器皿中的单一容器，例如，用于制备单一的较大细胞或组织鞘。细胞培养插件通常具有底部，其用于支持细胞或组织并且由用于支持和营养其中所含的细胞的特殊的膜形成。

在目前使用的细胞培养体系中，问题在于细胞的培养需要覆盖细胞的液体培养基（liquid medium）。该液体培养基要被直接计量进入容器并计量在细胞上。这会导致损伤，尤其是对机械敏感的细胞或组织造成损伤。当由液面下培养（submerged cultivation）转变成所谓的气升式培养（airliftcultivation）时，甚至有必要主要通过抽吸而从制剂提取覆盖细胞制剂的液体培养基。这也可能导致损伤细胞或组织和/或损害由此获得的最终产物的质量。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供用于容易且安全地从细胞培养物或生物组织移除液体或向细胞培养物或生物组织添加液体（包括细胞培养基的添加和交换）的工具（means），所述细胞培养物或生物组织例如是容置在适用于粘附细胞和/或三维组织的手动和自动培养或部分自动培养的容器或插件中的活组织检查物。更一般地，技术问题是从容置有第一液体或凝胶（尤其是细胞培养物或组织）的容器交换液体（尤其是细胞培养基），而在从容器移除液体或用液体填充容器内部的同时不影响第一液体或凝胶。

通过新的插件或容器完全解决了上述技术问题，所述插件或容器优选地适于被插入或容置在器皿或载体中，更具体地，被插入或容置在用于细胞培养的微孔板或多孔板的孔中。本发明的容器，尤其是插件，适于在其内部保持第一液体或凝胶，尤其是细胞培养物或生物组织。该容器或插件包含用于包围内部的至少一个侧壁元件（side wall element）和底壁元件（bottom wall element）。该容器或插件优选在其上端开口以便进入。容器或插件形成例如圆筒状、立方体或砖块形烧杯状器皿。

本发明的容器或插件的主要特征在于，侧壁元件或底壁元件或这两个壁元件包含至少一个或多个毛细管开口，在容器或插件的内部和其外部之间为至少一种液体或流体培养基提供选择性流体连接。本发明的毛细管开口专门适于选择性地形成作为所述第一液体或凝胶经由穿过容器的壁元件的开口离开的屏障，更具体地，这取决于毛细管开口处存在的一种或多种物理化学条件。在其它变化中，这还存在于毛细管开口中或毛细管开口的附近。可以对第一液体建立流体连接一段时间和/或在某种条件下或仅在满足某种条件之后（而不是之前）建立流体连接。

所述物理化学条件的进一步特征可以在于，其选自以下的一种或多种：所述第一液体和所述毛细管开口之间的特定化学、生物和物理条件和相互作用。在更具体的变化中，该物理化学条件是第一液体在毛细管开口处（其中或附近）的润湿角。润湿角尤其主要或仅仅取决于选自以下的一种或多种因素：所述第一液体和所述毛细管开口之间的特定化学、生物和物理相互作用。

在更具体的变化中，该物理化学条件是毛细管开口水平处存在的静水压力或跨壁压。

在一个实施方式中，所述至少一个毛细管开口形成对第一液体的选择性屏障，同时，毛细管开口适于形成用于第二液体穿过壁元件的液体传导通路，所述第二液体不同于所述第一液体或凝胶之处主要在于其物理和/或化学性质，尤其是粘度、润湿性和/或润湿角。在一个具体的实施方式中，所述第二液体的粘度低于所述第一液体或凝胶。

本发明使用毛细管体系的物理性质，不希望受理论限制，该毛细管体系在本文中用于允许液体的选择性通过，这取决于其流体性质，尤其是其粘度和其润湿性。与毛细管开口的尺寸（尤其是开口的最小横截面直径）相关，且与壁元件和毛细管的材料的表面性质（尤其是润湿性）相关，并且与对液体的表面活性相关，毛细管开口允许或抑制液体穿过。令人惊讶地发现，容器或插件中的这种毛细管开口充当选择性渗透体系，其有利地允许一组特别的液体物质或组合物容易地接近容器的内部。

这种新颖的选择性渗透体系允许液体经过壁上提供的毛细管开口通过毛细管作用而选择性地或受控地传送。传送主要取决于所用的液体或凝胶的粘度。液体的粘度指数是选择性通过的主要决定性因素。这样，本发明的容器对具有例如比较高（comparingly high）粘度的液体或凝胶是不透液的，但对于具有较低粘度的液体可以是自由渗透的。

在另一个具体的变化中，对通过的选择由液体的润湿性确定，尤其是由与壁表面的物理或化学相互作用确定。

在一个具体的实施方式中，可以通过提高或降低容器内部或外部的液体水平来控制液体穿过壁的通过。更具体地，毛细管开口有资格作为外部可控阀门或排放装置。在该具体的实施方式中，选择性和液体经由毛细管开口的通过进一步取决于跨壁压，即毛细管开口所延伸经过的壁元件的内部和外部上的静水压力。

在一个变化中，本发明允许液体取决于（最低）毛细管开口处存在的静水压力（即相对于毛细管开口水平的填充水平）而进入或离开容器内部。更具体地，提供了新颖的通过简单地提高填充水平至高于某一水平而填充或排空容器的方法。根据本发明该具体方面，可以将液体充入容器中，但防止其从容器内部排出。这通过使液体在容器内部的填充水平保持很低并从而使静水压力保持很低以防止毛细管开口的润湿来实现。这样，不会触发毛细管作用，并使容器保持对该液体为不透液的。若容器的毛细管开口是干燥的，即未被液体完全润湿，则这是尤其有效的。在流体水平在容器内部或外部提高至较高填充水平的情况下，增加的静水压力可以克服毛细管开口处的物理化学屏障，并最终导致毛细管的完全润湿，从而触发毛细管作用以建立该液体穿过容器的壁元件的流体连接。本发明预见到通过使液体相对于毛细管开口的填充水平保持在某一低水平以防止流体连接或通过将填充水平增加至引起或产生穿过容器的壁元件的流体连接而控制液体穿过毛细管开口。

因此，本发明提供了用液体（尤其是细胞培养基）来填充或排空容器或插件的方法，其包括以下步骤：提供本发明的容器或插件并将所述液体填充入所述容器中，从而确保不使填充水平增加至高于某一预定的第一水平，以便防止液体完全润湿所述容器的一个或多个毛细管开口，更具体地，防止毛细管作用建立穿过容器的壁元件的流体连接。如本文所详细描述的，所述第一水平主要由存在的物理化学条件确定。为了建立液体穿过壁元件的优选的永久流体连接，将液体水平增加至高于所述第一水平的第二水平，从而发生毛细管开口的完全润湿并建立穿过壁元件的流体连接。

该方法允许容易地排出分布在容器中的细胞悬浮液的液相。通过首先使悬浮液的填充水平保持在低于所述某一第一水平，该容器对该悬浮液是不透液的。可以允许悬浮液中的细胞沉降并最终与容器的底部（尤其是培养膜）连接。然后，可以将剩余的覆盖的液相从容器中排出，这是通过向容器中添加更多的液体或者更优选地通过增加容器外部上的填充水平而增加填充水平至高于所述某一水平，以便建立优选的永久流体连接，从而允许悬浮液的液相从容器中排出。该方法有利地避免了任何向细胞的直接机械加载。

本发明有利地允许填充或清空容器或插件的新颖且简单的方式。因此，本发明还涉及简单且安全地交换插件或容器中的液体的新颖的方法。更具体地，本发明允许将高度粘稠的液体或凝胶组合物（尤其是生物基质细胞培养物、生物组织等）保持在容器或插件内部，同时非常容易地将第二液体（尤其是用于细胞培养物的液体培养基，其优选地应当覆盖保持在容器内部的第一液体或凝胶）经过毛细管开口重复地交换、应用或除去，且不干扰或损害第一液体或凝胶（尤其是生物基质、细胞培养物或生物组织）。

为了改善液体在插件内部和孔之间的交换，可存在多个毛细管。在一个具体的实施方式中，至少一个毛细管开口，且更优选所有毛细管开口包含在容器的侧壁元件中。在一个具体的变化中，不存在其它的穿过容器或插件的壁的流体连接。

毛细管开口，尤其是其最小横截面，适应于液体或凝胶的物理化学性质，更具体地，适应于其粘度和/或润湿性。在一个具体的实施方式中，毛细管开口的直径可以为100至1,200μm，更具体为200至1,000μm，甚至更具体为600至800μm。在其更具体的一个变化中，毛细管开口的直径为约600μm。

在一个具体的实施方式中，所述毛细管开口是壁元件中的钻孔。在另一个具体的实施方式中，开口是在壁上提供的单独元件。毛细管可以由特定的材料（例如玻璃）制成和/或由与液体相互作用的材料制成。可以将毛细管排列在插件中或将其包埋使与插件成为一体。

为了改变或改善通过的选择性，壁还可以包含表面活性涂层或结构，其存在于毛细管开口中、毛细管开口处或毛细管开口附近。对具体液体的选择性可以通过毛细管开口中、毛细管开口处或毛细管开口附近的化学活性基团或功能来达到。这种结构可以化学地或物理地或物理-化学地与液体或组合物的一种或多种化合物相互作用。可以通过例如与表面改性的选择性相互作用而增加对具体液体的选择性。在第一个变化中，对于具体液体增加润湿角。在另一个变化中，对于具体液体降低润湿角。在一个具体的变化中，表面活性涂层是或结构是疏水性涂层。在另一个变化中，表面活性涂层或结构是亲水性的。这种涂层或结构本身是已知的，且可以包含等离子体诱导的改性或等离子体沉积的涂层以及纳米颗粒表面和用于细胞-表面相互作用的生物活性表面结构，或由其组成，但不限于此。

在一个具体的实施方式中，容器或插件还包含膜，其主要位于底壁元件处或位于底壁元件之中。本发明的膜本身被视为“不透液的”，从而不允许任何液体或凝胶自由地穿过容器的壁元件。膜仅允许营养物和/或气体通过扩散而交换。其尤其用于支持置于容器或插件中的细胞培养物或生物组织的目的。这种适于细胞培养的膜是本领域已知的，且通常包含10μm以下的孔径。在更具体的变化中，本发明的膜的孔径为8μm或以下，更具体为5μm或以下，且可以小至1μm或0.4μm。

在本发明的上下文中，在第一个实施方式中，“第一液体或凝胶”是具有或不具有细胞的细胞培养物组合物。在其一个具体变化中，第一液体或凝胶是细胞悬浮液（其包含适当的细胞培养基中的生物细胞）和主要为高粘度的生物基质组合物。更具体地，生物基质组合物是水凝胶、胶原蛋白凝胶等。在另一个变化中，第一液体或凝胶是优选为固化的或凝胶化的不含细胞的生物基质，其适于容置待接种于其上的细胞或容置生物组织或活组织检查物。这种不含细胞的生物基质也可以是水凝胶、胶原蛋白凝胶等。在另一个实施方式中，第一液体或凝胶是优选为作为悬浮液待接种入容器内部的单层细胞培养物，其中可以允许细胞沉降在容器底部上以形成单细胞鞘。在另一个实施方式中，第一液体或凝胶是三维多层组织培养物，其包含至少两层不同性质的生物细胞，其可以被包埋在上述不含细胞的生物基质中或接种在上述不含细胞的生物基质上。在另一个实施方式中，容器容置可被包埋在上述液体或凝胶培养基或生物基质中的生物组织或活组织检查物。

应当理解，第一液体或凝胶以及第二液体不限于用于培养生物细胞或组织的具体成分。本发明还涵盖采用其它类型的液体或凝胶（例如化学测试试剂、样品或探针）的其它应用。一般地，本发明提供了一种容器，其用于容置或保持第一液体或凝胶，同时允许具有其它物理化学性质（尤其是低粘度）的第二液体自由流入或流出容器。

在一个具体的实施方式中，容器提供细胞悬浮液的保留。在另一个具体的实施方式中，容器提供单层或三维多层组织或组织培养物的保留。在另一个具体的实施方式中，容器提供作为细胞培养物或组织的支持物的凝胶基质的保留。第二液体可以是为了营养而覆盖保持在容器内部的细胞培养物的液体细胞培养基，其拟在细胞培养过程中容易地交换或除去。

在一个具体的可选的实施方式中，本发明提供了一种容器，其可用于保留作为第一液体或凝胶组合物的化学测试试剂或探针。第二液体（容器的壁元件对第二液体来说是可渗透的）可以是可以与化学测试试剂反应的化学探针或样品。当化学测试试剂被固定在容器中时，探针或样品可以经过毛细管开口自由地流入或流出容器。

本发明还探索了一种新颖的用于在细胞培养体系中培养细胞的方法，所述细胞培养体系包含至少一个壁，尤其是多孔测试板。该方法或过程包含至少以下步骤，或者在一个更具体的实施方式中由以下步骤组成。在初始步骤(a)中，提供本发明的容器或插件以容置细胞、细胞培养物组合物或生物组织或活组织检查物。在另一步骤(b)中，向容器中转移第一液体或凝胶细胞培养物或细胞培养物组合物，其主要包含生物基质、细胞悬浮液和一种或多种三维组织构造物或活组织检查物，或主要由其组成。本发明提供了防止液体或凝胶细胞培养物组合物经过容器的壁元件离开。在另一步骤(c)中，第一液体或凝胶或组织，分别被第二液体（尤其是液体基质或基质组合物）覆盖，容器的毛细管开口适用于所述第二液体，从而允许第二液体经过毛细管开口跨越壁元件而自由地流入或流出容器。

在一个具体的实施方式中，通过沿容器的侧壁元件的至少一个毛细管开口的相对位置确定或调节覆盖容器或插件内部的液体或凝胶的液体基质组合物的水平。毛细管开口用作液体基质的水平排出（level drain）或溢出；水平高于最低排列的毛细管开口的过量的基质液体可以被允许离开容器，例如进入孔或器皿。

在一个优选的实施方式中，沿侧壁元件分布有多个毛细管开口，以提供覆盖被保持的第一液体或凝胶的第二液体完全排出。为了实现这一点，在每个特定的水平提供毛细管开口。更具体地，开口相对于与容器的底部元件的水平或高度（即距离）而彼此隔开，条件是间距等于或小于每个毛细管开口的横截面直径。这可以通过沿侧壁元件以倾斜的或线状或多线状的方式设置的一排或多排提供毛细管开口来实现，从而每一个水平或高度由至少一个毛细管开口来表示。

在一个具体的实施方式中，液体培养基组合物进入容器并从外部（例如，从孔经过壁元件中的至少一个毛细管开口）连续流在液体或凝胶培养物组合物上。在一个具体的操作方式中，可以将容器或插件浸没或容置在充满液体培养基的孔或类似的器皿中，使得液体经过毛细管开口进入容器并尤其覆盖静置在容器或插件内部的液体或凝胶培养物或培养物组合物。为了迫使液体培养基经过毛细管开口进入或离开容器，可以增加培养基的水平以引起跨过壁元件的静水压力梯度（跨壁压）。

可以通过计量进入容器和孔之间的空间的培养基的初始水平来控制液体培养基流入或流出容器。一旦容器内的水平相对于至少一个毛细管开口的位置与孔中的水平持平，则培养基的流入或流出停止。有利地，这种操作方式不要求使用任何移液工具来充填和/或替换细胞培养体系中的液体培养基组合物。有利地，这种方式避免了将培养基或对应的液体直接计量入容器或插件内部，从而防止了例如对其中保持的细胞培养物的干扰或损害。液体培养基组合物还可以经过毛细管开口排出容器或插件。这可以通过降低孔或器皿中液体的水平或通过提升容器或插件来实现。通过这样，液体培养基通过至少一个毛细管开口离开容器。有利地，这种方式允许容易地且安全地从容器或插件排空或排出液体培养基或对应的液体，而不干扰细胞培养物。

在一个具体的实施方式中，通过增加液体或培养基的水平至高于正常水平以增加静水压力，可以有助于经过壁元件中的至少一个毛细管开口将所述液体从容器或插件内部排空或排出和/或用所述液体填充其内部。不希望受理论限制，跨壁压尤其是静水压力的增加，支持毛细管效应的“开始”，即支持将液体吸入毛细管。此外，毛细管开口相对于液体水平的水平或高度可以初始地决定液体穿过毛细管开口的能力。在一个具体的实施方式中，液体穿过毛细管开口的选择性由相对于壁元件（尤其是侧壁元件）内的毛细管开口的位置的液体水平来确定。

在其一个变化中，在壁元件中提供了至少一个额外的开口，其不是毛细管开口，其被特别设为使所有液体穿过，而不使用根据液体的物理化学性质的毛细管效应。该清洗开口(purge opening)可提供以下效果：在初始阶段，液体培养基可以首先经过该清洗开口进入容器或插件内部以填充内部至高于选择性毛细管开口的水平或位置的水平。这在毛细管开口的水平处提供静水压力。通过这样，可以触发毛细管效应。在该初始步骤的第二阶段，经由清洗开口进入内部的液体可以流过毛细管开口的已建立的选择性流体连接，从而使液体的水平现在与毛细管开口持平，即经过清洗开口进入的过量液体可以经过该毛细管开口离开。在该具体实施方式中，在初始步骤之后，可以经过已建立的流体连接很容易地进行液体或培养基交换。

根据本发明，通过适当地选择用于以定向的、液体传导的方式连接插件的内部与孔的工具的尺寸或流动横截面以及选择作为要在孔与插件的内部之间传导的液体的表面张力和粘度的函数的用于插件的适当的材料，可获得液体的定向交换。以这样的方式，可以设计例如具有不从插件内部渗出的液体的三维组织构造，同时为了在插件内部和孔之间交换液体而提供的培养基能够无障碍地穿过该连接。因此，被供给至孔中并提供插件内部和孔之间的液体交换的液体也渗入插件的内部。因此，例如对插件中容置的细胞进行液面下培养所需的液体不再必须被直接计量入插件（即直接计量至插件中所容置的制剂）。而是可以经由计量开口将液体添加至孔。

相反地，由于插件内部和孔之间的定向的、液体传导的连接，从孔中除去液体培养基还导致细胞培养插件内液体水平的降低。因此，从液面下培养转变成气升式培养不再要求直接从插件内部（并从而直接从插件中所容置的细胞制剂）抽吸提取液体。因此，当本发明的细胞培养体系被用于通过液面下培养或通过从液面下培养至气升式培养转变的培养方法培养细胞时，可以大大降低损伤细胞制剂的风险。

在另一方面，本发明还提供了支持物，其适于被容置在载体中，尤其是在多孔测试板中。支持物可以包含至少一个容器。优选地，支持物携带多个容器并且被设置为允许容器被插入到最终形成在载体中的相应的孔中。具体地，支持物可以以这样的方式设置：将由支持物携带的插件以允许插件被插入至载体中形成的相应的孔中的相互距离而设置。携带多个插件的支持物的使用使得插件更容易操作；这是有利的，尤其是当本发明的细胞培养体系被用于以相对较大的批量培养细胞制剂时。此外，支持物可以提供有以适当位置设置的穿孔，从而允许随后将起初互相连接的插件再次彼此分离。

在一个具体的实施方式中，支持物包含基板或基础框架，其中形成多个容置开口，用于容置容器。优选地，容置开口在基板中的设置对应于载体上孔的设置，从而可以通过简单地插入其上连接有插件的支持物而将载体安全地设置在单独的孔或器皿中。设置在容器之间的支持物的基板的区域可进一步用作形成在载体中用于以流体传导的方式连接多个孔的通道的覆盖物。这允许使污染的风险最小化。插件和支持物可以是分离的组件的形式。然而，优选的是，支持物和插件被设计成一体。

在一个具体的实施方式中，在支持物上提供有抓握工具，用于手动或自动操作支持物和由支持物携带的容器。例如，抓握工具可以由腹板(webs)形成，所述网在细胞培养体系的组装状态中基本垂直地从支持物的基板的远离载体的表面延伸。如果期望或要求，支持物还可以具有多个抓握工具。连接至支持物的抓握工具使得支持物更容易操作，因此若细胞培养体系被用于以相对大的批量自动或部分自动地培养细胞制剂，则其是尤其有利的。

因此，在一个具体方面中，本发明提供了基于多孔板的细胞培养体系，其包含多孔板或具有多个孔或器皿的类似结构以及容置在该孔中用于培养细胞或组织的多个本发明的容器或插件。本发明的细胞培养插件可以以烧杯形的方式实施并且在底部区域提供有不透液的膜，该膜允许从孔中容置的培养基向设置在膜上的细胞培养物的方向传送营养物等。本发明的细胞培养体系的多孔板还可以包含计量开口，其与孔以流体传导的方式连接，这样允许将液体或培养基供给至孔消除/或将液体或培养基从孔中除去。例如，计量开口可以形成在多孔板中，并以流体传导的方式经由适当改变的通道与孔连接。可以将液体或培养基添加至孔中或从其中移除，而不需要将孔中的插件或容器从其位置移动。由于本发明的细胞培养体系中的计量开口可以形成在载体自身中，所以其位置被明确地定义，并且因此完全独立于孔中插件或容器的设置。细胞培养体系可以很容易地在自动或部分自动细胞培养方法中使用，其中自动地供给培养基或将其从中移除。具体地，可以可靠地避免由容器计量开口的非明确定义的布置而造成的对自动或半自动计量装置的损坏以及由喷雾所造成的交叉污染。

在一个具体的实施方式中，可以在细胞培养体系的载体或板中仅形成一个或少数几个以流体传导的方式与多个孔连接的计量开口。细胞培养体系的载体还可以提供有多个计量开口，所述多个计量开口各自单独以流体传导的方式连接至孔。例如，第一计量开口可用作培养基供给开口，同时可以提供第二计量开口用于从孔中除去培养基。

可以在载体或板中形成多个孔。细胞培养体系可以以有利的方式用于以相对大的批量生产人造组织构造。理论上，载体中形成的每个孔可以以流体传导的方式连接至用于向孔中供给培养基和/或用于从孔中移除培养基的单独的计量开口。然而，优选的是，载体中形成的多个孔以流体传导的方式各自互相连接。例如，可以经由通道建立孔之间的流体传导连接，所述通道可以形成在载体中，并在孔之间延伸。在本发明的细胞培养体系的这种设置中，仅有用于向孔中供给培养基和/或用于从孔中移除培养基的单独的计量开口需要与以流体传导的方式彼此连接的孔相关联。不言而喻，也可以有两个计量开口与以流体传导的方式彼此连接的孔相关联，例如在自动或部分自动培养方法中，其中一个用于向孔中供给培养基且另一个用于从孔中除去培养基。

此外，可以在载体中形成多组孔。然后一组的单个孔优选以流体传导的方式彼此连接（例如经由载体中形成的通道），而在组之间没有流体传导连接。细胞培养体系的这种设置是有利的，尤其是当细胞培养体系要被用于以相对大的批量使用各种培养基培养细胞制剂时或者当期望在载体内部进行边缘分离（margin separation）时。例如，可以经由一个或多个第一计量开口向以流体传导的方式彼此连接的第一组孔供给第一培养基，而可以经由一个或多个第二计量开口向以流体传导的方式彼此连接但与第一组孔分离的第二组孔供给第二培养基。

容器或插件和/或支持物优选由塑料材料（例如PP、PET或PS）制成。优选地，这些组件被设计为注射成型的组件，这允许简单且经济地生产细胞培养体系。在一个尤其优选的实施方式中，本发明的细胞培养体系的载体、插件和/或支持物由可冷冻贮存的材料制成。这允许将组织构造或细胞迅速深度冷冻。

细胞培养体系还可以包含显示高热转移的冷冻贮存器皿。冷冻贮存器皿的形状优选地适应于支持物（其具有被支持物携带的一个或多个插件）的形状，使得包含一个或多个插件的支持物能够容易地插入到冷冻贮存器皿中。这允许温和且有效的冷冻贮存。

本发明的细胞培养体系尤其适合用于制造作为体外测试体系或移植物的人造皮肤或用于制造人造软骨移植物。此外，细胞培养体系还可以用于培养细胞以构建人造皮肤或软骨移植物。该体系可以用于以实验室规模培养细胞，也可以用于自动或部分自动的细胞培养。

附图简述

现在将参考示意图更详细地描述本发明：

图1示出本发明的载体或插件的示意性剖面图；

图2示出组装在支持物中或由支持物组装的用于细胞培养体系的多个容器或插件；

图3示出一微孔板，其形式为具有孔且孔置于其中的细胞培养体系的载体；以及

图4示出待容置在器皿或载体中的单一容器的另一可选的实施方式。

具体实施方式

图1是本发明的插件或容器(30)的示意性横截面视图，该插件或容器在容器的至少一个壁元件(38,40)中包含毛细管开口(42)。容器(30)被设计为容置在多孔板的孔(14)中或类似器皿中。容器(30)主要被设计成圆筒状或圆锥形旋转对称形状并包含侧壁元件(40)和底壁元件(38)。底壁元件(38)可以进一步包含优选为不透液的膜(39)，用于允许营养物和气体经过容器(30)的底部扩散。在一个操作方式中，容器(30)保持第一液体或凝胶(61)，其优选为细胞培养物组合物，例如细胞培养基质、细胞悬浮液或三维多层组织构造。第一液体或凝胶(61)优选被第二液体(62)覆盖，所述第二液体(62)例如类似于细胞培养基质，用于支持包埋在第一液体或凝胶组合物(61)中或接种于其上的细胞的生长和营养。

图2至4显示尤其适于培养粘附细胞和/或三维组织的细胞培养体系的各元件的斜视图，该体系一般用附图标记(10)表示。细胞培养体系(10)包含载体(12)。根据图3的实施方式，在载体(12)中形成六组孔(14)。每组孔(14)可以各自以流体传导的方式通过在孔(14)之间延伸的通道(20)彼此连接。在图3的实施方式中，在各组(14)之间没有流体传导连接。因此，向组I的孔(14)供给的培养基可以不同于向其它组的孔(14)供给的培养基。

每个插件(30)包含由膜形成的底(38)，用于容置细胞培养物。烧杯形的插件(30)的侧壁(40)提供有多个开口(42)。当插件(30)如图3所示被插入至形成在载体(12)中的孔(14)中时，形成在插件(30)的侧壁(40)中的开口(42)允许液体在孔(14)和插件(30)的内部(44)之间交换。

第一计量开口(22)可以与每个孔(14)或每组孔(14)相关联，用于向孔(14)中供给培养基。第一计量开口(22)形成在载体(12)中，并与在第一计量开口(22)和孔(14)之间建立流体传导连接的通道连接。

细胞培养体系(10)还包含多个插件(30)。用于向孔(14)中插入而提供的插件(30)可以各自与支持物(32)形成为一体。图2和3中所示的支持物(32)包含基板(34)，其中形成用于容置插件(30)的一个或多个容置开口(36)。支持物(32)和至少一个插件(30)可以形成为一体并可以作为注射成型的组件来制造。

携带至少一个插件(30)的支持物(32)还可以提供有一个或多个抓握工具(46)。抓握工具(46)由腹板形成，所述腹板在细胞培养体系(10)的组装状态中可以基本垂直地从支持物的基板(34)的远离载体(12)的表面延伸(参见图3)。抓握工具(46)使得支持物(32)或插件(30)更容易操作；这是有利的，尤其是当细胞培养体系(10)被用在自动或半自动培养方法中时。

在图3所示的细胞培养体系(10)的组装状态中，在载体(12)中设置计量开口(22)允许将培养基供给至孔(14)中，而不需要将插件(30)从其在孔(14)中的位置移走或甚至从孔(14)中移出。此外，计量开口(22)的位置是明确定义的，且不取决于插件(30)在孔中的位置，因此，细胞培养体系(10)很适于用在自动或部分自动的培养方法中。

孔(14)和插件33的内部(44)之间的选择性液体传导或流体连接是通过每个插件(30)的侧壁(40)中形成的毛细管开口(42)建立的，向孔(14)中供给培养基还允许将培养基供给至插件(30)的内部(44)中。类似地，可以通过从孔(14)中除去培养基来降低插件(30)的内部(44)中的液体水平。因此，细胞培养体系(10)尤其适于通过液面下培养来培养细胞或者适于用在需要从液面下培养至气升式培养转变的培养方法中，因为孔(14)和插件(30)的内部(44)之间的液体交换避免了直接将培养基供给至插件(30)的内部(44)中的需要，以及直接从插件(30)的内部(44)移除培养基的需要。以这样的方式，可以尤其保护敏感性细胞制剂不受损害。

在细胞培养体系(10)的组装状态中，支持物(32)的基板(34)可以覆盖在孔(14)之间延伸的通道(20)，从而可靠地防止孔(14)中容置的培养基的污染。然而，当由支持物(32)携带的插件(30)被插入至载体(12)中形成的孔(14)中时，支持物的基板(34)中形成的凹槽(48,50)与载体板(18)中形成的计量开口(22,26)相互作用，使得支持物的基板(34)不阻碍无障碍地接近计量开口(22,26)。

肋(56)可以与插件(30)的侧壁(40)连接，其在细胞培养体系(10)的组装状态中从支持物的基板(34)朝向载体(12)的表面延伸。肋(46)可以与载体(12)或支持物(32)中相应的凹进或凹槽啮合，以确保插件(30)在载体(12)或支持物(32)内部适当的和可重复的定位。肋(56)还可以使插件(30)与支持物(32)的连接稳定，从而有利地提高其上固定有插件(30)的支持物(32)的机械强度。

细胞培养体系(10)还可以包含显示高热转移的冷冻贮存器皿（图中未示出）。冷冻贮存器皿的形状适应于具有插件(30)的支持物(32)的形状（插件(30)的实施方式是与支持物(32)成一体），使得包含插件(30)的支持物(32)能够容易地插入到冷冻贮存器皿中。这允许温和且有效的冷冻贮存。

Claims (27)

1.容器或插件(30)，其适于被容置在载体(12)的孔(14)中，用于在所述容器的内部(44)选择性地保持第一液体或凝胶(61)，其中所述容器包含用于包围内部(44)的侧壁元件(40)和底壁元件(38)，其特征在于，所述侧壁元件和所述底壁元件中的一个或两者包含一个或多个毛细管开口(42)，所述毛细管开口专门适于依赖毛细管开口处存在的物理化学条件而选择性地形成作为所述第一液体或凝胶(61)穿过壁元件(40,38)离开或进入的屏障。

2.如权利要求1所述的容器(30)，其中所述物理化学条件是以下中的一种或多种：所述第一液体和所述毛细管开口之间的特定化学、生物和物理条件和相互作用。

3.如权利要求1或2所述的容器(30)，其中所述物理化学条件是所述第一液体在所述毛细管开口处的润湿角。

4.如权利要求3所述的容器(30)，其中所述润湿角取决于以下中的一种或多种：所述第一液体和所述毛细管开口之间的特定化学、生物和物理相互作用。

5.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述物理化学条件是静水压力或跨壁压。

6.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述毛细管开口(42)形成用于第二液体(62)穿过所述壁元件(40,38)的液体传导开口，所述第二液体的至少一种物理化学性质与所述第一液体或凝胶(61)不同。

7.如权利要求6所述的容器(30)，其中所述第二液体(62)的所述至少一种物理化学性质是比第一液体或凝胶(61)更低的粘度。

8.如权利要求6或7所述的容器(30)，其中所述第二液体(62)的所述至少一种物理化学性质是比第一液体或凝胶(61)更高的润湿性。

9.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述毛细管开口(42)的直径为200μm至1,000μm。

10.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述壁元件(40,38)在所述毛细管开口(42)中、所述毛细管开口(42)处或所述毛细管开口(42)附近包含表面活性涂层或结构。

11.如权利要求5所述的容器(30)，其中所述表面活性涂层或结构是疏水性的。

12.如权利要求5所述的容器(30)，其中所述表面活性涂层或结构是亲水性的。

13.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述底壁元件(38)还包含不透液的膜(39)，用于容置所述第一液体或凝胶(61)。

14.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述第一液体或凝胶(61)是化学测试试剂。

15.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述第一液体或凝胶(61)是用于细胞培养的生物基质。

16.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述第一液体或凝胶(61)是细胞悬浮液。

17.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述第一液体或凝胶(61)是多层组织培养物。

18.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述第一液体或凝胶(61)是单层细胞鞘。

19.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述第二液体(62)是化学探针或样品。

20.如前述权利要求中任一项所述的容器(30)，其中所述第二液体(62)是细胞培养基。

21.支持物(32)，其适于被容置在载体(12)中，包含基础框架(34)和一个或多个如权利要求1至20中任一项所述的容器(30)。

22.细胞培养体系(10)，其包含具有多个孔(14)的载体(12)，和容置在孔(14)中的权利要求1至20中任一项所述的容器(30)或权利要求21所述的支持物(32)。

23.如权利要求22所述的细胞培养体系(10)，其中所述载体(12)还包含一个或多个与所述孔(14)流体连接的计量开口(22,26)，用于向所述孔(14)供给所述第二液体(62)。

24.用于培养细胞的方法，其包括以下步骤：

-提供权利要求1至20中任一项所述的容器(30)，用于容置细胞，

-将液体或凝胶细胞培养物组合物转移至所述容器中，从而防止所述液体或凝胶组合物经过所述至少一个毛细管开口离开，

-用能够经由所述至少一个毛细管开口自由流入或流出所述容器的液体培养基覆盖所述液体或凝胶细胞培养物。

25.如权利要求24所述的方法，其中覆盖所述液体或凝胶细胞培养物组合物的所述液体培养基在所述容器中的水平由所述容器的所述侧壁元件中的所述毛细管开口的相对位置来确定。

26.如权利要求24或25所述的方法，其中所述液体培养基经过所述至少一个毛细管开口进入和/或离开所述容器。

27.如权利要求24至26中任一项所述的方法，其中通过初始地增加所述液体的水平至高于正常水平以增加静水压力并消除毛细管作用以及建立流体连接，将所述液体培养基经过所述至少一个毛细管开口从所述容器的内部排出和/或吸入所述容器的内部。

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