FR3140377A1

FR3140377A1 - Dispositif pour culture cellulaire ou tissulaire

Info

Publication number: FR3140377A1
Application number: FR2209949A
Authority: FR
Inventors: Christophe Marquette; Hamza Raza ZAIDI
Original assignee: Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Current assignee: Ecole Sup Chimie Phys Electroniq Lyon; Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Universite Claude Bernard Lyon 1 UCBL; Institut National des Sciences Appliquees de Lyon
Priority date: 2022-09-30
Filing date: 2022-09-30
Publication date: 2024-04-05
Also published as: WO2024068819A1

Abstract

L’invention se rapporte notamment à un dispositif de culture cellulaire comportant un insert (1) présentant une cavité interne (11) délimitée par une paroi latérale (12) d’insert et un fond d’insert (10), ladite cavité interne étant apte à recevoir ladite culture cellulaire dans un fluide de culture cellulaire de manière à créer un tissu de cellules (2). Le dispositif comprenant un récipient (3) qui accueille ledit insert de façon amovible, ladite paroi latérale (12) présentant des premiers trous traversants (13). Le récipient comporte une cheminée interne (30) et une ouverture (33) qui permet l’insertion dudit insert (1) dans ladite cheminée. Le fond d’insert comprend des seconds trous traversants (14) permettant l’observation des cellules à travers lui, lesdits premiers et seconds trous traversants étant des trous capillaires aptes à retenir ledit fluide de culture cellulaire dans ladite cavité interne et servant d’ancrage audit tissu de cellules. Figure pour l’abrégé : Fig. 6

Description

DISPOSITIF POUR CULTURE CELLULAIRE OU TISSULAIRE

DOMAINE DE L’INVENTION

L’invention concerne un dispositif pour culture cellulaire ou tissulaire, comportant un récipient et un insert. L’insert est apte à être placé dans ledit récipient et apte à recevoir des cellules ou des tissus à mettre en culture.

Il est considéré que la culture cellulaire et la culture tissulaire sont deux types de processus utilisés pour la croissance de cellules d'organismes multicellulaires en dehors de leur environnement naturel.

L’objectif de la culture cellulaire est de faire croitre des cellules hors de l’organisme. Son utilisation est importante : elle permet de réaliser des études pharmacologiques, chromosomiques, elle aide à la recherche fondamentale, à la production d’anticorps, à la synthèse de protéine etc.

ETAT DE LA TECHNIQUE

Il existe un fort besoin de réaliser des expériences sur des échantillons de culture cellulaire ou tissulaire dans des domaines d’activités variés, notamment cosmétiques et/ou pharmaceutiques.

Par exemple, il existe un fort besoin d’étudier et de développer des thérapies pour les peaux saines ou malades. Ces thérapies utilisent de plus en plus de modèles équivalents de peau, sur lesquels les produits sont testés.

Ces modèles équivalents de peau sont de plus en plus demandés et créés suite à l'interdiction complète, par l'Union Européenne, des tests réalisés sur les animaux.

Les modèles équivalents de peau sont créés en réalisant une culture de cellules dans des dispositifs, et se présentent par exemple sous la forme d’un tissu de peau artificielle.

Les méthodes utilisées permettent de créer des tissus de peau artificielle.

L’objectif est de créer des tissus de peau artificielle, ou de cellules artificielles, qui présentent des propriétés similaires à celles de la peau humaine native, tant au niveau structurel que fonctionnel. De façon plus générale, l’objectif est de créer des tissus mous, par exemple des tissus de peau mais également des tissus de foie, de rein, de poumon, adipeux, du pancréas etc.

Un moyen connu, pour réaliser ces tissus de peau artificielle, est d’utiliser des inserts de culture cellulaire. Ces inserts sont conçus pour permettre une culture cellulaire statique au cours de laquelle les cellules de peau sont mûries sans conditions environnementales stressantes, jusqu’à obtenir le tissu de taille et d’épaisseur souhaitée.

Le document WO2011127945 décrit, par exemple, un système de culture cellulaire utilisant des inserts qui sont placés dans un récipient et dans lesquels les cellules ou tissus sont introduits pour être mis en culture. Chaque insert permet de réaliser un tissu de cellules qui sert par la suite à l’expérimentation de produits cosmétiques ou pharmaceutiques, par exemple. Dans l’exemple présenté dans le document WO 2011127945, les inserts présentent chacun une paroi latérale et une paroi de fond, la paroi latérale présentant des ouvertures traversantes à travers lesquelles un liquide peut passer. Ces inserts sont placés dans des puits, ménagés dans un support. Un liquide, permettant la culture des cellules est introduit dans les puits.

Les tissus de cellules sont obtenus au bout d’un certain temps, ce temps étant celui qui est nécessaire aux tissus ou aux cellules pour se développer dans des conditions environnementales sans stress.

A l’origine de l’invention, on a cherché à améliorer les propriétés de la peau artificielle obtenue, c’est-à-dire à améliorer les propriétés du tissu de cellules pour qu’il soit encore plus proche d’un tissu de peau naturelle : en effet, jusqu'à présent, les tissus de peau artificielle créés n’imitent pas vraiment certaines propriétés de résistances mécaniques naturelles que présente une peau naturelle lors de son développement.

Il est connu que la croissance naturelle de la peau humaine se produit simultanément lorsque le corps humain est exposé à de multiples contraintes et conditions environnementales : Il a été observé, à partir de plusieurs études, que lorsque les cellules fibroblastes sont exposées à différents types de stress, cela entraîne une augmentation de la production de collagène en raison de l'activation de plusieurs voies de signalisation dans la cellule en réponse au stress exposé sur la protéine de collagène environnante.

La production de protéines de collagène fournit une certaine résistance mécanique à la structure globale de la peau. Ce sont ces propriétés de résistances mécaniques naturelles que l’invention vise à obtenir dans les tissus de peau artificielle créés.

Certaines études ont réussi à développer des bioréacteurs de maturation de la peau en induisant des stress par de multiples techniques. Cependant, ces bioréacteurs développés sont très complexes à construire et ne sont pas accessibles sur le marché. Il n'y a pas encore de bioréacteur dédié disponible sur le marché pour la maturation dynamique des tissus cutanés.

PRESENTATION DE L’INVENTION

L’invention vise donc à proposer un dispositif qui permet d’obtenir des tissus de cellules, par exemple un tissu imitant la peau naturelle en présentant des propriétés mécaniques similaires à celles de la peau naturelle. L’invention vise également à proposer un dispositif permettant de mieux contrôler visuellement (ou par microscopie) le développement cellulaire en évitant les manipulations de la culture elle-même (de façon non destructive).

L’invention concerne à cet effet un dispositif de culture cellulaire comportant un insert présentant une cavité interne délimitée par une paroi latérale d’insert et un fond d’insert, ladite cavité étant apte à recevoir ladite culture cellulaire dans un fluide de culture cellulaire (par exemple un hydrogel) de manière à créer un tissu de cellules, ledit dispositif comprenant un récipient dans lequel est accueilli ledit insert de façon amovible, ladite paroi latérale d’insert présentant des premiers trous traversants.

Le dispositif conforme à l’invention est remarquable en ce que ledit récipient qui accueille l’insert comporte une cheminée interne, délimitant une paroi interne audit récipient et formant un conduit présentant une première ouverture à une première extrémité de conduit et une seconde ouverture à une seconde extrémité de conduit, débouchant dans un fond de récipient, ladite première extrémité d’ouverture permettant l’insertion dudit insert dans ladite cheminée du récipient, ledit fond d’insert comprenant des seconds trous traversants permettant l’observation des cellules en culture à travers le fond de l’insert par la seconde ouverture de la seconde extrémité de conduit de ladite cheminée, lesdits premiers et seconds trous traversants étant des trous capillaires aptes à retenir le fluide de culture cellulaire dans ladite cavité interne dudit insert et servant d’ancrage audit tissu de cellules.

En effet, et suivant une première fonction technique que permet l’invention, les ouvertures traversantes qui se présentent sous forme de trous capillaires servent d’ancrage au fluide de culture cellulaire dans l’insert, ce qui permet d’obtenir un tissu de cellules qui adhère à la paroi de l’insert, d’assurer une tension sur le tissu pour éviter sa rétractation (le phénomène de rétractation est un phénomène classiquement observé sur des tissus en culture, au fil des jours de culture : l’invention évite ce phénomène).

De plus, suivant une seconde fonction technique que permet l’invention, l’ouverture dans le fond de la cheminée, dans lequel on place l’insert, permet de voir le fond de l’insert et les trous traversants capillaires permettant d’observer la culture cellulaire à travers le fond de l’insert sans toutefois autoriser la culture cellulaire à « fuir » à travers le fond de l’insert.

On comprendra par « capillaire », le fait que les trous sont suffisamment petits pour empêcher le fluide de culture cellulaire, accueilli dans la cavité de l’insert, de passer à travers eux grâce à la tension de surface du fluide de culture cellulaire.

L’invention permet ainsi une surveillance de l’évolution de la culture cellulaire pendant la création du tissu de cellules et l’insert permet au fluide de culture cellulaire (et à la culture cellulaire qui s’y développe) de s’ancrer dans les premiers et seconds trous traversants que présente l’insert, pour permettre au tissu de cellules créé de s’accrocher aux parois de l’insert (latérale et fond de l’insert) afin de créer un tissu qui se répartit de façon sensiblement homogène dans l’insert avec des tensions plus importantes au points d’ancrage : cela permet de simuler un ancrage de peau sur les limites d’une plaie, par exemple (en simulant l’organisation d’une matrice extracellulaire naturelle), de maintenir la surface initiale de tissu de cellules créé, ainsi que son épaisseur et évite la rétractation du tissu observé avec les solutions de l’Etat de la Technique, comme évoqué ci-avant.

Le dispositif conforme à l’invention peut également comprendre les caractéristiques suivantes, prises séparément ou en combinaison :

De façon avantageuse, la cheminée comprend des troisièmes trous traversants, ménagés dans la paroi interne pour coopérer avec lesdits premiers trous traversants quand l’insert est accueilli dans ladite cheminée, lesdits troisièmes trous traversants assurant le passage d’un fluide nourricier entre la cavité de l’insert et une cuve de réception du fluide nourricier, ladite cuve étant délimitée entre une paroi latérale de récipient, le fond du récipient et la paroi interne formée par la cheminée. Cela autorise un mouvement du fluide nourricier, dans lequel est plongé le fluide de culture cellulaire (par exemple de l’hydrogel dans le cadre d’un exemple qui sera décrit et illustré par la suite) pouvant être accueilli dans le dispositif lors de la culture des cellules, quand le dispositif est soumis à un mouvement, pour récréer des conditions de stress permettant aux cellules de réagir et de se doter de propriétés mécaniques proches de celles d’une peau réelle.

Suivant un mode de réalisation décrit par la suite, non limitatif, la paroi latérale d’insert comporte au moins deux rangées de premiers trous traversants et la cheminée interne comporte au moins deux rangées de troisièmes trous traversants, l’une au moins desdites au moins deux rangées de premiers trous traversants coopérant avec l’une au moins desdites au moins deux rangées desdits troisièmes trous traversants quand ledit insert est inséré dans ledit conduit de cheminée.

Avantageusement encore, lesdits premiers trous traversants et lesdits seconds trous traversants présentent sensiblement la même forme et le même diamètre. De préférence, le diamètre des premiers et seconds trous traversants est compris (ou sensiblement compris) entre 1000 et 4000 µm, de préférence inférieur ou égal à 2000 µm (ou sensiblement 2000 µm).

Suivant un mode de réalisation avantageux, il est prévu que la cheminée comprend des premiers éléments de fixation amovibles de l’insert, l’insert étant équipé de seconds éléments de fixation amovibles qui s’associent auxdits premiers éléments de fixation amovibles. La fixation de l’insert dans la cheminée se fait ainsi au moyen d’éléments de fixation amovibles, l’insert et le récipient étant équipés de moyens complémentaires qui en s’associant, permettent cette fixation amovible.

Les premiers éléments de fixation amovible de l’insert sont répartis sur au moins deux niveaux dans ladite cheminée, chacun desdits au moins deux niveaux étant situés entre lesdites première et seconde extrémités de ladite cheminée. L’insert peut alors se positionner, dans le cadre de ce mode de réalisation, à deux niveaux différents. On peut ainsi créer des couches de développement de cellules différentes, pour reproduire les couches de la peau et introduire une interface air/liquide pendant la croissance du tissus (peau) si nécessaire.

Dans un mode de réalisation avantageux encore, l’insert peut comprendre au moins une patte saillante latérale extérieure, ladite patte saillante comportant au moins un trou borgne, et la cheminée peut comprendre une encoche ménagée suivant une direction axiale à travers la paroi de cheminée, l’encoche présentant une tranche présentant au moins un pion saillant, ledit au moins un trou borgne de ladite au moins une patte saillante constituant ledit au moins premier élément de fixation de l’insert et ledit au moins un pion saillant de ladite cheminée constituant ledit au moins un second élément de fixation de la cheminée, s’associant de façon amovible avec ledit au moins un premier élément de fixation de l’insert.

La patte saillante sert ici de moyens de fixation amovible. Comme il sera vu par la suite, elle peut également servir d’élément de préhension pour saisir l’insert.

De préférence, l’insert comprend au moins un bossage sur une tranche formée par une extrémité libre de ladite paroi latérale d’insert, et au moins un logement ménagé au voisinage du bord du fond dudit insert, ledit au moins un logement présentant une forme complémentaire à celle dudit au moins un bossage, ledit au moins un logement étant apte à recevoir ledit au moins un bossage d’un second insert identique positionné sous l’insert dudit dispositif. Cette particularité technique permet un assemblage de plusieurs inserts du dispositif l’un sur l’autre par gerbage.

L’invention concerne également un insert pour dispositif tel que défini ci-avant.

L’insert conforme à l’invention comporte une cavité interne délimitée par une paroi latérale d’insert et un fond d’insert, ladite cavité étant apte à recevoir ladite culture cellulaire de manière à créer un tissu de cellules, ladite paroi latérale d’insert présentant des premiers trous traversants. L’insert conforme à l’invention est remarquable en ce que le fond d’insert comprend des seconds trous traversants permettant l’observation des cellules en culture à travers le fond de l’insert, lesdits premiers et seconds trous traversants étant des trous capillaires aptes à retenir ledit fluide de culture cellulaire dans ladite cavité interne dudit insert et aptes à servir d’ancrage au tissu de cellules.

De préférence, les premiers et seconds trous traversants présentent un diamètre compris (ou sensiblement compris) entre 1000 et 4000 µm, de préférence de 2000 µm (ou sensiblement 2000 µm).

En outre, l’insert comprend au moins un bossage sur une tranche formée par une extrémité libre de ladite paroi latérale d’insert, et au moins un logement ménagé au voisinage du bord du fond dudit insert, ledit au moins un logement présentant une forme complémentaire à celle dudit au moins un bossage, ledit au moins un logement étant apte à recevoir ledit au moins un bossage d’un second insert identique positionné sous l’insert dudit dispositif.

L’invention concerne également une installation comprenant au moins un dispositif tel que défini ci-avant, ainsi qu’un support sur lequel ledit au moins un dispositif peut être positionné, ledit support étant monté mobile en étant associé à un appareil d’entrainement en mouvement, pour entrainer en mouvement du fluide nourricier dans lequel est plongé le milieu de culture dans ledit insert lors de la formation dudit tissu de cellules.

L’invention concerne enfin un procédé pour réaliser un tissu de cellules, mettant en œuvre une installation telle que définie ci-dessus,

ledit procédé étant remarquable en ce qu’il comporte les étapes suivantes :
a) positionnement dudit insert dans ladite cheminée dudit récipient,
b) positionnement dudit dispositif sur ledit support de ladite installation,
c) introduction d’un fluide de culture cellulaire et de cellules à mettre en culture dans la cavité dudit insert,
l’étape c) pouvant être réalisée avant l’étape a),

d) introduction d’un fluide nourricier dans ledit dispositif,
e) actionnement de l’appareil d’entrainement en mouvement dudit support au moins partiellement pendant un temps prédéterminé, pour entrainer un mouvement dudit fluide nourricier dans ledit insert, jusqu’à obtention d’au moins une partie de tissu de cellules dans ledit insert,
f) retrait dudit dispositif dudit support, et g) extraction dudit insert dudit récipient, ledit insert comportant ledit tissu de cellules.

De préférence, dans le cas où l’installation comporte un dispositif d’observation microscopique positionné sous ledit support, ledit support étant transparent, le procédé conforme à l’invention peut comporter une étape supplémentaire d1) entre l’étape d) et l’étape e), suivant laquelle on observe le développement dudit tissu de cellules à travers lesdits seconds trous traversants dudit fond de l’insert.

De préférence encore, dans le cas où le dispositif est tel que la cheminée dudit récipient d’accueil comprend quatre pions saillants de la tranche axiale ménagée dans la paroi de la cheminée, pour positionner ledit insert à quatre niveaux différents dans ladite cheminée entre la première et la seconde ouverture de ladite cheminée, les quatre pions saillants comprenant :

- un premier pion saillant sensiblement au niveau du fond dudit récipient, au voisinage de ladite seconde ouverture, ledit niveau de fond dudit récipient définissant un premier niveau dans ladite cheminée,

- des second et troisième pions saillants entre ladite seconde ouverture et ladite première ouverture de la cheminée, le positionnement des second et troisième pions définissant un second et troisième niveau de positionnement dudit insert dans la cheminée du récipient,

- un quatrième pion saillant sensiblement au niveau de la première ouverture de ladite cheminée, le quatrième pion définissant un quatrième niveau de positionnement dudit insert dans la cheminée,

le procédé présente la particularité suivante :

à l’étape c), on positionne ledit insert audit premier niveau de ladite cheminée, puis on réalise l’étape d) ou on laisse les cellules se développer, pendant un premier temps prédéterminé,

à l’issue dudit premier temps prédéterminé, on positionne l’insert audit second niveau, puis on réalise l’étape d) ou on laisse les cellules se développer, pendant un second temps prédéterminé,

à l’issue d’un second temps prédéterminé, on positionne l’insert audit troisième niveau, puis on réalise l’étape d) ou on laisse les cellules se développer, pendant un troisième temps prédéterminé.

Cette étape permet d'introduire optionnellement une interface air/liquide : la surface inférieure et le bord périphérique du fluide de culture cellulaire sont en contact avec le milieu de culture (fluide nourricier) tandis que la surface supérieure de l'insert est maintenue sèche pour la maturation des kératinocytes, par exemple. Le trou supérieur de forme oblongue d’un mode de réalisation, qui sera décrits par la suite, est destiné à arrêter l'écoulement du fluide nourricier en raison de la tension superficielle.

Enfin, et à l’issue d’un troisième temps prédéterminé, on positionne l’insert audit quatrième niveau, puis on réalise l’étape d), ou on laisse les cellules se développer, pendant un quatrième temps prédéterminé. Cette étape peut permettre l'application de composés chimiques à tester sur la peau après sa maturation.

PRESENTATION DES FIGURES

D’autres avantages et caractéristiques de l’invention apparaîtront à l’examen de la description détaillée d’un mode de mise en œuvre nullement limitatif, et des dessins annexés, sur lesquels :

est une vue en perspective et de dessus d’un insert d’un dispositif conforme à l’invention,

est une vue en perspective et de dessous de l’insert montré en ,

est une vue en perspective de plusieurs inserts de dispositif empilés les uns sur les autres,

est une vue en perspective et de dessus d’un récipient de dispositif conforme à l’invention,

est une vue en perspective et de dessous du récipient montré en ,

est une vue en perspective montrant l’insert et le récipient d’un dispositif, l’un au-dessus de l’autre, l’insert étant conçu pour être inséré dans le récipient,

est une vue en perspective et de dessous de l’ensemble conforme à l’invention, l’insert étant reçu à un premier niveau dans le récipient,

est une vue en perspective et de dessus de l’ensemble montré en ,

est une vue en perspective et de dessous de l’ensemble conforme à l’invention, l’insert étant reçu à un second niveau dans le récipient,

est une vue en perspective et de dessus de l’ensemble montré en ,

est une vue en perspective et de dessous de l’ensemble conforme à l’invention, l’insert étant reçu à un troisième niveau dans le récipient,

est une vue en perspective et de dessus de l’ensemble montré en ,

est une vue en perspective et de dessous de l’ensemble conforme à l’invention, l’insert étant reçu à un quatrième niveau dans le récipient,

est une vue en perspective et de dessus de l’ensemble montré en , et

est une photographie en noir et blanc d’un échantillon de peau obtenu, dans la première partie de dispositif, et

illustre de façon schématique une installation conforme à l’invention, ainsi que certaines étapes d’un procédé conforme à l’invention de mise en œuvre de l’installation.

MODE DE REALISATION

Les figures 1 à 3 représentent uniquement un insert 1 de dispositif conforme à un mode de réalisation de l’invention.

L’insert 1 a pour fonction d’accueillir une culture cellulaire et sert de support au tissu de cellules qui s’y crée.

Conformément à l’invention, le dispositif comprend également un récipient

3 dans lequel l’insert 1 est accueilli de façon amovible : le récipient 3 sera présenté par la suite en faisant référence aux figures 4 et 5.

Comme montré sur les figures 1 et 2, l’insert 1 se présente globalement sous la forme d’un récipient de section ronde, à fond plat 10.

L’insert présente une cavité interne 11, qui est délimitée par une paroi latérale 12 d’insert et le fond 10.

La culture cellulaire est réalisée dans la cavité 11 de l’insert 1, pour réaliser le tissu 2 de cellules qui est montré en particulier sur la .

La paroi latérale 12 de l’insert 1 présente des premiers trous traversants 13, qui sont suffisamment petit pour interdire le passage d’un fluide de culture cellulaire (dans le cadre de cet exemple, il s’agit d’un hydrogel) dans lequel des cellules sont aptes à se reproduire, quand le fluide de culture cellulaire (l’hydrogel dans le cadre de l’exemple décrit) est au-dessus d’une température prédéterminée.

L’hydrogel est ici le fluide de culture cellulaire choisi pour alimenter les cellules et pour maintenir les conditions physiologiques du milieu dans lequel vont se développer les cellules (par exemple le pH, l’osmolarité…). Il peut être additionné de sérum et d’antibiotique si nécessaire.

On comprendra par « hydrogel » un gel dans lequel l'agent gonflant est l'eau. La matrice d'un hydrogel est généralement un réseau de polymères. Ces derniers sont insolubles dans l'eau, mais sont capables de gonfler substantiellement en présence d'une grande quantité d'eau ou de solutions aqueuses telles que les fluides biologiques.

Un exemple d’hydrogel peut comprendre 5% (poids /volume) de gélatine bovine, 2% (poids /volume) d’alginate à très basse viscosité (Alpha Aesar #A18565) et 2% (poids /volume) de fibrinogène (Sigma #F8630) dissout dans un milieu DMEM (Gibco™ #21068028) à 37°C.

Dans le cadre de notre exemple de réalisation, l’hydrogel présente :
- dans le cadre d’un premier exemple d’hydrogel (connu sous le nom Bio ink, et dont la composition est indiquée dans le paragraphe précédent) une viscosité pouvant être de 1,4 x 10⁵Pa.s (ou sensiblement de de 1,4 x 10⁵Pa.s) à une température de 25 °C, de préférence de 3,3 x 10^-1Pa.s (ou sensiblement de de 3,3 x 10^-1Pa.s) à 37°C, et
- dans le cadre d’un second exemple d’hydrogel Fibrinogène (2% (poids / volume)), une viscosité pouvant être de 4,7 x 10^-2Pa.s (ou sensiblement de de 4,7 x 10^-2Pa.s) à une température de 25 °C, de préférence de 1,2 x 10^-2Pa.s (ou sensiblement de de 1,2 x 10^-2Pa.s) à 37°C

Dans le cadre de l’invention, la viscosité des fluides de culture cellulaire peut être supérieure ou égale à 0.69 mPa.s ) à 37°C. (viscosité de l'eau).

Le diamètre des trous traversants 13 est compris entre sensiblement entre 1000 et 4000 µm. Ils sont également appelés « trous capillaires ».

A température ambiante, l’hydrogel présente une tension de surface telle qu’il s’insère dans les trous traversants sans toutefois les traverser : c’est ainsi que les trous traversants 13 servent de points d’ancrage à l’hydrogel et aux cellules qui se développent dans l’hydrogel.

Cela permet à la culture cellulaire de s’introduire partiellement au moins dans les trous traversants 13 pour s’ancrer dedans, permettant ainsi au tissu de cellules créé d’être retenu sur la paroi latéral 12 de l’insert 1.

Les trous 13 sont, dans le cadre de l’exemple représenté, uniformément répartis tout autour de la paroi 12 de sorte que le tissu de cellules créé puisse s’ancrer de façon uniforme tout autour de la paroi 12 de l’insert 1, et former une pastille globalement uniforme dans l’insert non rétractée sur elle-même, avec des dimensions régulières en hauteur et en épaisseur (voir ).

Il devra être compris que les trous traversants 13 de la paroi 12 de l’insert 1 pourraient présenter une autre forme et être plus ou moins nombreux sans sortir du cadre de l’invention ou réparti non uniformément.

Dans le cadre de l’exemple illustré, les trous traversants 13 sont répartis autour de la paroi latérale 12 de façon équidistante les uns des autres et forment au moins une première rangée de premiers trous traversants.

Un insert avec une paroi 12 présentant plusieurs rangées de trous traversants 13 pourrait également être prévu sans sortir du cadre de l’invention.

Les figures 1 et 2 montrent également que le fond 10 de l’insert 1 présente des seconds trous traversants 14.

Ces seconds trous traversants 14 permettent l’observation des cellules en culture à travers le fond 10 de l’insert 1, par exemple au moyen d’un dispositif équipé d’une caméra positionnée sous un support transparent, sur lequel repose l’insert ou le récipient équipé de l’insert.

L’observateur peut également regarder par-dessous l’insert pour observer le tissu de cellules à travers les seconds trous traversants 14.

Il est prévu que les seconds trous traversants 14 soient également des trous capillaires aptes également à retenir l’hydrogel dans ladite cavité 11 et à servir d’ancrage à la culture de cellules.

Les seconds trous traversants présentent de préférence un diamètre compris entre 1000 et 4000 µm. Dans le cadre de cet exemple, il est prévu des diamètres de trou de sensiblement 2000 µm (ou de sensiblement 2000 µm).

Ainsi, les trous traversants 13 (appelés premiers trous traversants par la suite, pour bien les distinguer des autres trous traversants) et les seconds trous traversants 14 servent d’ancrage audit tissu de cellules, les seconds trous traversants 14 du fond 10 de l’insert servant également à l’observation du développement de la culture cellulaire et au tissu de cellules obtenu.

On remarque sur les figures 1 à 3 que l’insert 1 comporte deux pattes latérales 15, saillantes de la parois latérale 12 et qui s’étendent suivant une direction radiale.

Comme on peut le voir sur la , ces pattes 15 peuvent servir à saisir l’insert 1, par exemple avec une pince.

Les pattes 15 ont toutefois une fonction principale autre : elles permettent de positionner, de façon amovible, l’insert 1 dans le récipient 3 (le récipient 3 sera décrit par la suite), voire à différents niveaux (ou positions) dans le récipient 3.

On remarque que chacune des pattes 15 présente un trou borgne transversal 16, qui sert également dans la fixation amovible de l’insert 1 dans le récipient 3, comme il sera vu par la suite (second élément de fixation).

Les figures 1 et 2 illustrent également que la paroi latérale 12 de l’insert 1 présente une extrémité libre qui forme une encoche 17, sur laquelle quatre bossages 18 sont saillants.

Il devra être entendu que d’autres modes de réalisations pourraient envisagés sans sortir du cadre de l’invention et que l’insert 1 pourrait présenter plus ou moins de bossages 18 : par exemple, un seul bossage saillant 18, deux bossages saillants 18 diamétralement opposés, ou trois bossages répartis de façon équidistante ou non, etc.

D’autres moyens de positionnement, autres que des bossages et des trous borgnes, pourraient être prévus : des éléments de formes complémentaires et pouvant s’assembler et se désassembler pourraient être prévus sans sortir du cadre de l’invention.

En parallèle, au voisinage du bord du fond 10 de l’insert (voir ) qui rejoint la paroi latérale 12, le fond 10 présente quatre logements 19, de forme complémentaire à celle des quatre bossages 18. De cette façon, les logements 19 d’un premier insert 1 peuvent recevoir les bossages 18 d’un second insert identique, positionné sous le premier insert. Cela permet de pouvoir gerber plusieurs inserts les uns sur les autres, pour ne pas les égarer, pour les ranger et les stocker de façon compacte (voir ). Cela permet aussi de réaliser plusieurs cultures simultanément, dans les mêmes conditions on peut ainsi cultiver plusieurs tissus identiques ou non, en même temps, sans les mettre en contact.

Sur la , on remarque que les inserts 1 sont empilés en présentant leurs pattes saillantes 15 décalées de 90 degrés. Une autre forme d’empilement pourrait être envisagée : les pattes 15 peuvent être également alignées les unes au-dessus des autres.

Il va maintenant être fait référence aux figures 4 et 5 pour décrire le récipient 3 du dispositif conforme à l’invention, apte à recevoir l’insert 1.

Le récipient 3 est de forme globalement cylindrique.

Il comporte une cheminée interne 30, délimitant une paroi interne 31 audit récipient 3.

Dans l’exemple illustré, la cheminée 30 est de forme cylindrique.

Il devra être compris que la forme de la cheminée 30 pourrait être différente, sans sortir du cadre de l’invention. La forme interne de la cheminée est toutefois complémentaire à la forme externe pour pouvoir l’accueillir.

Le récipient 3 comporte une paroi latérale externe 32, qui entoure la paroi interne 31 formée par la cheminée 30.

La paroi interne 31 forme un conduit dans le récipient 3, le conduit présentant une première ouverture 33 à une première extrémité de conduit ( ) et une seconde ouverture 34 à une seconde extrémité de conduit ( ), débouchant dans un fond 35 de récipient 3.

Une paroi de fond 36 de récipient 3 relie les extrémités de fond des parois interne 31 et externe 32.

Ainsi, les parois de fond 36, interne 31 et externe 32 et la paroi de fond 36 forment une cuve 39 (annulaire dans le cadre de notre exemple) autour de la cheminée.

Comme indiqué, la cheminée 30 présente des dimensions internes plus grandes ou sensiblement plus grandes que les dimensions externes de l’insert 1, et une forme complémentaire à la forme de l’insert pour pouvoir l’accueillir.

La première ouverture 33 permet l’insertion de l’insert 1 dans ladite cheminée 30 du récipient 3, comme illustré en . La seconde ouverture 34 permet l’observation de la culture cellulaire à travers l’insert 1, puisque le fond de l’insert 1 est visible à travers cette ouverture 34.

La référence 4 représente l’hydrogel dans lequel la culture cellulaire est réalisée.

Deux encoches 37 axiales sont réalisées à travers la paroi interne 31, au moins sur une partie de la hauteur de la cheminée 30, pour accueillir les pattes saillantes 15 de l’insert 1.

On remarque notamment sur les figures 4 et 5 que les encoches 37 présentent, sur leur tranche, quatre pions saillants 38 qui sont positionnés à quatre niveaux différents dans les encoches 37.

Les pions saillants 38 assurent la fixation amovible de l’insert 1 dans la cheminée 30, par insertion des pions saillants38 dans les trous borgnes 16 des pattes 15 de l’insert 1.

Ainsi, l’insert 1 peut se positionner dans la cheminée 30 à quatre niveaux différents, pour les raisons qui seront exposées par la suite.

Les pions saillants 38 sont en forme de demi-dôme et sont déformables pour s’insérer et se dégager des trous borgne 16, ce qui facilite le changement de position de l’insert dans le récipient 3.

On remarque sur les figures 4 et 5 que la paroi interne 31 de la cheminée 30 comporte des troisièmes trous traversants 23 et 43, qui sont répartis sur trois rangées : deux rangées de trous traversants 23, chacun de forme ronde, correspondent à deux niveaux de positionnement de l’insert dans le récipient, ces deux niveaux étant le niveau le plus bas (où l’insert est positionné au fond du récipient – voir et 8) et le niveau appelé « intermédiaire bas », situé au-dessus du niveau bas.

La rangée de trous traversants 43, chacun de forme oblongue orientée axialement, s’étend sur deux autres niveaux de fixation de l’insert dans le récipient 3 : le niveau intermédiaire haut, situé au-dessus du niveau intermédiaire bas, et le niveau haut.

Les troisièmes trous traversants 23 et 43 sont ainsi ménagés à travers la paroi de la cheminée 30 et s’alignent avec les premiers trous traversant 13 de la paroi 12 de l’insert quand l’insert est positionné dans le récipient, au niveau bas, au niveau intermédiaire bas, ou intermédiaire haut, et au niveau haut.

L’alignement des trous 13 et 23, ou 13 et 43, permet le passage du fluide nourricier introduit dans la cuve 39, à travers la paroi 12 de l’insert et à travers la paroi interne 31 du récipient, de la cavité 11 vers la cuve 39 ou de la cuve 39 vers la cavité 11, quand l’insert est mis en mouvement et quand la viscosité de l’hydrogel le permet : cela est possible si l’hydrogel se trouve à une température inférieure à la température prédéterminée évoquée précédemment.

En effet, sous la température prédéterminée (c’est-à-dire sensiblement sous une température pouvant être comprise entre 15 et 15°C), l’hydrogel présente une plus faible viscosité, lui permettant de présenter une tension de surface plus faible, ce qui permet à l’hydrogel de passer à travers les premiers trous traversants 13. L’hydrogel ne passe pas à travers les trous traversants 14 quand le fond de l’insert se trouve positionné sur un support plan, sur lequel est également positionné le fond du récipient 36 et quand l’insert 1 est positionné dans le récipient 3 au niveau bas.

En effet, conformément au procédé conforme à l’invention, il est prévu de mettre en mouvement le dispositif conforme à l’invention, et donc le récipient 3 accueillant l’insert 1, lors de la culture des cellules. Cela permet de générer des contraintes sur les cellules et de récréer des conditions de stress permettant aux cellules de réagir et de se doter de propriétés mécaniques proches de celles d’une peau réelle.

Lors du mouvement du dispositif, le fluide nourricier circule à travers les premiers et troisième trous traversants, ce qui favorise encore davantage l’ancrage du tissu dans les trous traversant 13 de l’insert.

Pour un passage facile du fluide nourricier à travers les trous traversants 13 et 23 ou 43, les trous sont de mêmes formes et de même taille.

La présence de forme oblongue permet un passage plus important du fluide nourricier. Elle permet également le passage de l’hydrogel à travers plusieurs rangées de premiers trous traversants 13.

Il devra toutefois être entendu que les trous traversants 13, 23 et/ou 43 pourraient être de forme et de taille différentes sans sortir toutefois du cadre de l’invention.

Quand l’insert est positionné dans le récipient 3, il est possible de surveiller l’évolution de la génération du tissu de cellules sans avoir à retirer l’insert du récipient : en effet, comme expliqué précédemment, l’ouverture 34 (seconde ouverture de la cheminée 30) permet de voir l’insert 1 par-dessous, et les seconds trous traversants autorisent la visualisation de l’hydrogel et de la culture cellulaire dans la cavité de l’insert.

Les figures 7 et 8 illustrent l’insert 1 positionné au niveau bas de la cheminée 30 du récipient 3 : les trous traversant 13 de la paroi latérale 12 de l’insert 1 sont positionnés en face de la rangée de troisième trous 23 du niveau bas.

L’insertion des pattes 15 de l’insert 1 dans les encoches 37 de la cheminée 30 impose un sens d’orientation (ou une position) des trous traversants 13 de l’insert par rapport au trous traversant 23 ou 43 de la cheminée. De plus, le fait que les pattes 15 soient insérées dans des encoches 37 empêche toute rotation de l’insert 1 par rapport au récipient, ce qui garantit que les premiers et troisièmes trous traversants restent bien alignés.

Dans cette position, où l’insert se trouve au niveau bas dans le récipient 3. Cette position permet la réalisation de cultures cellulaires gélifiées.

Les figures 9 et 10 illustrent l’insert 1 positionné au niveau bas intermédiaire de la cheminée 30 du récipient 3. Cette position permet de réaliser des cultures cellulaires en submersion.

Les figures 11 et 12 illustrent l’insert 1 positionné au niveau haut intermédiaire de la cheminée 30 du récipient 3. Cette position permet de réaliser des cultures cellulaires avec un contact air/liquide.

Les figures 13 et 14 illustrent l’insert 1 positionné au niveau haut de la cheminée 30 du récipient 3. Cette position permet de réaliser des tissus sur lesquels il peut être réalisé des tests cosmétiques, de dépistage de drogue in vitro, d’étudier la toxicité de certains produits etc.

Le fait de pouvoir positionner l’insert à plusieurs niveau (au moins deux niveaux différents) pour créer des couches de développement de cellules différentes, permet de reproduire les différentes couches de la peau et introduire une interface air/liquide pendant la croissance du tissus (peau) si nécessaire.

La représente, de façon schématique, une installation conforme à l’invention, qui comprend au moins un dispositif tel que décrit ci-avant (c’est-à-dire comprenant au moins un insert 1 et un récipient 3).

La illustre deux dispositifs représentés chacun de manière que le fond 36 du récipient 3 repose sur un support plan 5 qui est incliné par rapport à un plan horizontal H.

Deux double-flèches F illustrent schématiquement que le support plan 5 est entrainé en mouvement, (il est mobile) par un appareil d’entrainement en mouvement.

L’appareil d’entrainement en mouvement n’a pas été réellement représenté sur la mais est schématisé par les doubles flèches F.

Les mouvements entrainés par l’appareil sont symbolisés par les flèches F1, F2 et F3 illustrées au-dessus des dispositifs conformes à l’invention.

Le mouvement illustré par la flèche F1 correspond à un mouvement de balancier : l’appareil d’entrainement en mouvement impose au support plan de pivoter autour d’un axe horizontal, ce qui fait pencher le support 5 (inclinaison) d’un côté et d’un autre par rapport à l’horizontal H, comme illustré en figure

16.

Le mouvement symbolisé par la flèche F2 est un mouvement d’entrainement en rotation autour d’un axe vertical : le support 5, sur lequel est positionné le dispositif conforme à l’invention, peut être entrainé en rotation autour de son axe vertical.

Enfin, le mouvement symbolisé par la flèche F3 est un mouvement qui combine rotation et balancier.

Grâce aux mouvements du fluide nourricier et de l’ensemble du dispositif, une contrainte physique est appliquée sur les cellules en culture et un stress est généré ce qui conduit à un développement de la culture cellulaire proche de celle qui se produit en réalité lors de la reproduction réelle de cellules dans un corps vivant.

L’entrainement en mouvement de la culture cellulaire en cours de développement, combiné à un positionnement sur plusieurs niveaux de l’insert 1 dans le récipient 3 (permettant différentes conditions de développement de la culture cellulaire) permet la réalisation de tissus de cellules dans l’insert plus résistants que ceux réalisés par les dispositifs de l’état de la technique. Le mouvement de la culture cellulaire permet également un meilleur ancrage du tissu dans les premiers et seconds trous traversants 13 et 14 présentés précédemment.

Le développement de la culture cellulaire dans l’insert 1 peut être observé grâce à un dispositif optique 6, tel qu’il est illustré en également.

L’installation peut comprendre ce dispositif, positionné sous le support 5 plan transparent. Le dispositif optique 6 peut également être indépendant et associé à l’installation conforme à l’invention.

Il va maintenant être fait référence à un procédé permettant de réaliser un tissu 2 de cellules, tel qu’illustré en , grâce à la mise en œuvre de l’installation montrée en , comprenant au moins un dispositif conforme à l’invention.

Dans un premier temps, l’insert 1 est positionné au niveau le plus bas dans la cheminée 30 du récipient 3, et le récipient 3 est positionné sur le support plan 5, de sorte que le fond 36 du récipient et le fond 10 de l’insert 1 reposent sur le support plan 5.

On introduit de l’hydrogel dans l’insert 1, ainsi que des cellules à mettre en culture dans la cavité dudit insert, dans l’hydrogel.

Il est à noter que, lors de l’introduction de l’hydrogel dans l’insert 1, il se trouve à une température inférieure à la température telle qu’il présente une viscosité lui permettant de traverser les premiers, seconds, et troisièmes trous traversants (respectivement 13, 14, 23 et 43).

Le procédé s’opérant à température ambiante, l’hydrogel s’épaissit (augmentation de la viscosité), et après quelques secondes, la viscosité de l’hydrogel est telle qu’il ne traverse plus les premiers, seconds et troisièmes trous traversants 13, 14, 23 et 43, lui permettant ainsi de s’y ancrer.

L’appareil d’entrainement en mouvement de l’installation est alors mis en fonctionnement et le support sur lequel repose le dispositif conforme à l’invention est entrainé en mouvement pendant un temps prédéterminé. Le fluide est alors animé d’un mouvement dans l’insert, générant du stress sur l’hydrogel et les cellules en culture dans celui-ci, pendant ledit temps prédéterminé : le fluide nourricier s’écrase sur l’insert et génère une force ou une contrainte sur l’hydrogel contenant les cellules. Cela a pour conséquence de faire murir les cellules à l’intérieur de l’hydrogel pour produire plus de protéine de collagène. De façon plus générale, cela a pour conséquence d’induire soit une différenciation des cellules soit une production par les cellules de matrice extracellulaire spécifique, soit une auto-organisation des cellules en microstructures fonctionnelles (microvaisseaux par exemple). Ces trois phénomènes (non exhaustif) conduisent à la maturation d’un tissu fonctionnel.

On obtient alors une première couche de tissu de cellules dans l’insert 1.

Durant cette première étape, on peut observer le développement des cellules grâce au dispositif optique 6, à travers les seconds trous traversants 14 du fond de l’insert.

A l’issu du premier temps prédéterminé, l’insert 1 est déplacé dans le récipient 3 pour être positionné au niveau intermédiaire bas (c’est-à-dire juste au-dessus du niveau bas).

Le support est alors entrainé en mouvement grâce à l’appareil d’entrainement en mouvement (mouvement F1, F2 ou F3) pendant un second temps prédéterminé.

Cette opération peut être renouvelée en déplaçant l’insert du niveau intermédiaire bas au niveau intermédiaire haut, ou bien au niveau haut, et le support peut de nouveau être entrainé en mouvement (ou non) pendant un temps prédéterminé, jusqu’à ce que le tissu de cellules obtenu soit conforme à ce qui est recherché : par exemple, on peut renouveler certaines étapes, changer la position de l’insert dans le récipient, changer le mouvement du support plan 5, ou ne pas entrainer actionner l’appareil d’entrainement en mouvement et attendre que le tissu de cellules se soit développé au sein de l’insert 1 et présente une certaine épaisseur (correspondant par exemple à la profondeur de l’insert 1).

On comprend ainsi comment le dispositif conforme à l’invention permet de créer des tissus de cellules plus résistants que ceux obtenus par les dispositifs de l’état de la technique en créant des conditions de stress lors des phases de développement des cellules, en changeant le positionnement de l’insert 1 dans le récipient, et créant des mouvements de l’hydrogel dans l’insert 1 etc.

Grâce à la présence des trous capillaires 13, 14, le tissu de culture de cellules s’ancre dans les parois de l’insert, ce qui permet d’obtenir un tissu proche d’un tissu de cellules de peau réelle en reconstitution par exemple, tirant sur les bords sains d’une blessure, par exemple : on observe en effet en que la surface du tissu 2 forme une concavité orientée vers l’extérieur de l’insert. Et permet d’obtenir un tissu qui ne s’est pas rétracté sur lui-même.

Le tissu présente ainsi des propriétés plus proches encore des tissus naturels qui se reconstituent après une blessure pendant la phase de cicatrisation.

Il devra être entendu que l’invention n’est pas limitée au mode de réalisation représenté sur les figures et qu’elle s’étend à la mise en œuvre de tout moyen équivalent.

Le dispositif conforme à l’invention pourra être réalisé dans différents matériaux sans sortir du cadre de l’invention, par exemple en polyacrylate, en polycarbonate, en polystyrène, en céramique, en inox, en polyéthylène téréphtalate.

Claims

Dispositif de culture cellulaire comportant un insert (1) présentant une cavité interne (11) délimitée par une paroi latérale (12) d’insert et un fond d’insert (10), ladite cavité interne (11) étant apte à recevoir ladite culture cellulaire dans un fluide de culture cellulaire de manière à créer un tissu de cellules (2), ledit dispositif comprenant un récipient (3) dans lequel est accueilli ledit insert (1) de façon amovible, ladite paroi latérale (12) d’insert présentant des premiers trous traversants (13),caractérisé en ce que ledit récipient (3) comporte une cheminée interne (30), délimitant une paroi interne (31) audit récipient (3) et formant un conduit présentant une première ouverture (33) à une première extrémité de conduit et une seconde ouverture (34) à une seconde extrémité de conduit, débouchant dans un fond (36) de récipient, ladite première extrémité d’ouverture (33) permettant l’insertion dudit insert (1) dans ladite cheminée interne (30) du récipient (3),
en ce que ledit fond d’insert (10) comprend des seconds trous traversants (14) permettant l’observation des cellules en culture à travers le fond d’insert (10) par la seconde ouverture (34) de la seconde extrémité de conduit de ladite cheminée (30), lesdits premiers et seconds trous traversants (13, 14) étant des trous capillaires aptes à retenir ledit fluide de culture cellulaire dans ladite cavité interne (11) dudit insert et servant d’ancrage audit tissu de cellules (2).
Dispositif selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite cheminée (30) comprend des troisièmes trous traversants (23, 43), ménagés dans la paroi interne (31) qui coopèrent avec lesdits premiers trous traversants (13) quand l’insert (1) est accueilli dans ladite cheminée (30), lesdits troisièmes trous traversants (23, 43) assurant le passage d’un fluide nourricier entre la cavité (11) de l’insert et une cuve (39) de réception dudit fluide nourricier, ladite cuve (39) étant délimitée entre une paroi latérale (32) de récipient (3), le fond (36) du récipient (3) et la paroi interne (31) formée par la cheminée (30).
Dispositif selon la revendication 2, caractérisé en ce que ladite paroi latérale (12) d’insert comporte au moins deux rangées de premiers trous traversants (13) et en ce que la cheminée interne (30) comporte au moins deux rangées de troisièmes trous traversants (23, 43), l’une au moins desdites au moins deux rangées de premiers trous traversants (13) coopérant avec l’une au moins desdites au moins deux rangées desdits troisièmes trous traversants (23, 43) quand ledit insert (1) est inséré dans ledit conduit de cheminée (30).
Dispositif selon la revendication 2 ou 3, caractérisé en ce que lesdits premiers trous traversants (13) et lesdits seconds trous traversants (14) présentent sensiblement la même forme et les mêmes dimensions.
Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite cheminée (30) comprend des premiers éléments de fixation (38) amovibles de l’insert (1), l’insert (1) étant équipé de seconds éléments de fixation (16) amovibles qui s’associent auxdits premiers éléments de fixation (38) amovibles.
Dispositif selon la revendication 5, caractérisé en ce que lesdits premiers éléments de fixation (38) amovible de l’insert (1) sont répartis sur au moins deux niveaux dans ladite cheminée (30), chacun desdits au moins deux niveaux étant situés entre lesdites première et seconde extrémités (33 et 34) de ladite cheminée (30).
Dispositif selon la revendication 5 ou 6, caractérisé en ce que ledit insert (1) comprend au moins une patte saillante (15) latérale extérieure, ladite patte saillante (15) comportant au moins un trou borgne (16),
en ce que ladite cheminée (30) comprend une encoche (17) ménagée suivant une direction axiale à travers la paroi (31) de cheminée (30), l’encoche (17) présentant une tranche comprenant au moins un pion saillant (38), ledit au moins un trou borgne (16) de ladite au moins une patte saillante (15) constituant ledit au moins premier élément de fixation de l’insert et ledit au moins un pion saillant (38) de ladite cheminée (30) constituant ledit au moins un second élément de fixation de la cheminée, s’associant de façon amovible avec ledit au moins un premier élément de fixation de l’insert.
Dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit insert (1) comprend au moins un bossage (18) sur une tranche (17) formée par une extrémité libre de ladite paroi latérale (12) d’insert, et au moins un logement (19) ménagé au voisinage du bord du fond (10) dudit insert (1), ledit au moins un logement (19) présentant une forme complémentaire à celle dudit au moins un bossage (18) pour recevoir ledit au moins un bossage (18) d’un second insert (1) additionnel et identique positionné sous l’insert (1) dudit dispositif.
Insert (1) pour dispositif selon l’une quelconque des revendications précédentes, comportant une cavité interne (11) délimitée par une paroi latérale (12) d’insert et un fond (10) d’insert, ladite cavité (11) étant apte à recevoir ladite culture cellulaire dans un fluide de culture cellulaire de manière à créer un tissu de cellules (2), ladite paroi latérale d’insert présentant des premiers trous traversants (13), caractérisé en ce que ledit fond d’insert (10) comprend des seconds trous traversants (14) permettant l’observation des cellules en culture à travers le fond (10) de l’insert, lesdits premiers et seconds trous traversants (13, 14) étant des trous capillaires aptes à retenir ledit fluide de culture cellulaire dans ladite cavité interne (11) dudit insert (1) et servant d’ancrage audit tissu de cellules (2).
Insert selon la revendication 9, caractérisé en ce que lesdits premiers et seconds trous traversants (13, 14) présentent un diamètre sensiblement compris entre 1200 et 2000 µm.
Insert selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce qu’il comprend au moins un bossage (18) sur une tranche (17) formée par une extrémité libre de ladite paroi latérale (12) d’insert, et au moins un logement (19) ménagé au voisinage du bord du fond (10) dudit insert, ledit au moins un logement (19) présentant une forme complémentaire à celle dudit au moins un bossage (18) pour recevoir ledit au moins un bossage (18) d’un second insert additionnel et identique (1) positionné sous le fond (10) de l’insert (1).
Installation comprenant au moins un dispositif selon l’une quelconque des revendications 1 à 8, ainsi qu’un support (5) sur lequel ledit au moins un dispositif peut être positionné, ledit support (5) étant monté mobile en étant associé à un appareil d’entrainement en mouvement (F1, F2, F3, F), pour entrainer en mouvement ladite culture cellulaire dans ledit insert (1) lors de la formation dudit tissu de cellules (2).
Procédé pour réaliser un tissu de cellules, mettant en œuvre une installation selon la revendication 12,
ledit procédé étant caractérisé en ce qu’il comporte les étapes suivantes :
a) positionnement dudit insert (1) dans ladite cheminée (30) dudit récipient (3)
b) positionnement dudit dispositif sur ledit support (5) de ladite installation,
c) introduction d’un fluide de culture cellulaire et de cellules à mettre en culture dans la cavité (11) dudit insert (1),
d) actionnement de l’appareil d’entrainement en mouvement (F1, F2, F3, F) dudit support (5), au moins partiellement pendant un temps prédéterminé, pour entrainer un mouvement dudit fluide de culture cellulaire dans ledit insert (1) et des cellules en culture dans ledit fluide de culture cellulaire, jusqu’à obtention d’au moins une partie de tissu de cellules (2) dans ledit insert (1),
e) retrait dudit dispositif dudit support (5), et
f) extraction dudit insert (1) dudit récipient (3), ledit insert (1) comportant ledit tissu de cellules (2).
Procédé selon la revendication 13, ladite installation comportant un dispositif d’observation (6) positionné sous ledit support (5), ledit support (5) étant transparent, caractérisé en ce qu’il comporte une étape supplémentaire d1) entre l’étape d) et l’étape e), suivant laquelle on observe le développement dudit tissu de cellules (2) à travers lesdits seconds trous traversants (14) dudit fond (10) de l’insert (1).
Procédé selon la revendication 13 ou 14, mettant en œuvre une installation selon la revendication 12,comportant un dispositif selon la revendication 7, la cheminée (30) dudit récipient d’accueil (3) comprenant quatre pions saillants (38) de la tranche axiale (17) ménagée dans la paroi (31) de la cheminée (30), pour positionner ledit insert (1) à quatre niveaux différents dans ladite cheminée (30) entre la première et la seconde ouverture (33, 34) de ladite cheminée (30), les quatre pions saillants (38) comprenant :
- un premier pion saillant (38) sensiblement au niveau du fond (36) dudit récipient (3), au voisinage de ladite seconde ouverture (34), ledit niveau de fond dudit récipient définissant un premier niveau dans ladite cheminée (30),
- des second et troisième pions saillants (38) entre ladite seconde ouverture (34) et ladite première ouverture (33) de la cheminée (30), le positionnement des second et troisième pions (38) définissant un second et troisième niveau de positionnement dudit insert (1) dans la cheminée (30) du récipient (3),
- un quatrième pion saillant (38) sensiblement au niveau de la première ouverture (33) de ladite cheminée (30), le quatrième pion (38) définissant un quatrième niveau de positionnement dudit insert (1) dans la cheminée (30),
caractérisé en ce que, à l’étape c), on positionne ledit insert (1) audit premier niveau de ladite cheminée (30), puis on réalise l’étape d) ou on laisse les cellules se développer, pendant un premier temps prédéterminé,
en ce que, à l’issue dudit premier temps prédéterminé, on positionne l’insert (1) audit second niveau, puis on réalise l’étape d) ou on laisse les cellules se développer, pendant un second temps prédéterminé,
en ce que, à l’issue du second temps prédéterminé, on positionne l’insert (1) audit troisième niveau, puis on réalise l’étape d) ou on laisse les cellules se développer, pendant un troisième temps prédéterminé, et
en ce que, à l’issue du troisième temps prédéterminé, on positionne l’insert (1) audit quatrième niveau, puis on réalise l’étape d) ou on laisse les cellules se développer, pendant un quatrième temps prédéterminé.