EP3206791A1 - Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons - Google Patents

Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons

Info

Publication number
EP3206791A1
EP3206791A1 EP14796828.3A EP14796828A EP3206791A1 EP 3206791 A1 EP3206791 A1 EP 3206791A1 EP 14796828 A EP14796828 A EP 14796828A EP 3206791 A1 EP3206791 A1 EP 3206791A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microdrops
oil
trapping
microdroplets
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
EP14796828.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Other versions
EP3206791B1 (fr
Inventor
Charles Baroud
Gabriel AMSELEM
Sébastien SART
Raphaël TOMASI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Polytechnique
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Polytechnique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Polytechnique filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3206791A1 publication Critical patent/EP3206791A1/fr
Application granted granted Critical
Publication of EP3206791B1 publication Critical patent/EP3206791B1/fr
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502769—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements
    • B01L3/502784—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by multiphase flow arrangements specially adapted for droplet or plug flow, e.g. digital microfluidics
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502746—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means for controlling flow resistance, e.g. flow controllers, baffles
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0642—Filling fluids into wells by specific techniques
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2200/00—Solutions for specific problems relating to chemical or physical laboratory apparatus
    • B01L2200/06—Fluid handling related problems
    • B01L2200/0673—Handling of plugs of fluid surrounded by immiscible fluid
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0816—Cards, e.g. flat sample carriers usually with flow in two horizontal directions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0809—Geometry, shape and general structure rectangular shaped
    • B01L2300/0819—Microarrays; Biochips
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2300/00—Additional constructional details
    • B01L2300/08—Geometry, shape and general structure
    • B01L2300/0848—Specific forms of parts of containers
    • B01L2300/0851—Bottom walls
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/086—Passive control of flow resistance using baffles or other fixed flow obstructions
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/08—Regulating or influencing the flow resistance
    • B01L2400/084—Passive control of flow resistance
    • B01L2400/088—Passive control of flow resistance by specific surface properties

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic process for handling samples, in particular biological samples, in hydrogel microdrops.
  • the invention also relates to a device for implementing such a method and to a product of samples obtained by implementing such a method.
  • hydrogel microbeads including cells are made in a first microfluidic system. They are then recovered and washed in a bath, before being injected into a second microfluidic system comprising traps for fixing the microdrops.
  • Such a method is however complex, which requires two separate microfluidic systems and three devices in total. In addition, it does not allow to observe the samples continuously. In particular it does not allow to observe the initial moments between the formation of the drops and their capture.
  • the invention provides a method of handling in a microfluidic system of microdroplets including samples, comprising the steps of:
  • microdrops of interest that is to say the microdrops which contain samples of interest - these microdroplets are first trapped in surface tension traps (or traps capillary), then some of the microdroplets and / or part of the oil surrounding them are gelled. Gelation of microdrops and / or oil around them facilitates sorting by increasing the trapping force of microdrops in traps. In other words, the gelling step makes it possible to prevent microdrops of interest from being lost.
  • surface tension trap is meant a trap a zone of the microfluidic system whose geometry, with the interfacial tension of the microdrop, allows the microdrop to be held in position.
  • Microfluidic system means a system whose parts are manufactured by micro-manufacturing processes. Such a system has ducts of which at least one dimension is typically less than one millimeter.
  • the shape of the microdrop can be controlled. This control of the shape of the microdrop can be combined with the control of the instant of gelation of the microdrop or part of the oil surrounding it, to give access to different applications, in particular on the manipulation of cells .
  • cells are meant eukaryotic cells (for example plant cells, fungi, yeasts, mammalian cells) and prokaryotic cells (for example bacteria).
  • eukaryotic cells for example plant cells, fungi, yeasts, mammalian cells
  • prokaryotic cells for example bacteria.
  • anchorage-independent cells for example, certain cells in the blood line and highly transformed tumor cells
  • anchorage-dependent cells the majority of other cell types
  • spheroids means multicellular structures organized in the form of micro-tissues whose functionalities are similar to those of tissues derived from organs.
  • the method according to the invention comprises one or more of the following characteristics, taken alone or in combination:
  • step iii) comprises gelling at least a portion of the oil in the trapping area, excluding microdrops;
  • step iii) comprises gelling at least a portion of the microdroplets, excluding the oil surrounding the microdroplets in the trapping area;
  • the sample is one of one or more cells, in particular a spheroid of cells, one or more beads trapping molecules, the balls being in particular of plastic material, one or more molecules;
  • step iii) is carried out after sedimentation of the samples, in particular cells, in the trapped microdroplets, in particular after formation of spheroids;
  • step iii) is carried out before sedimentation of the samples in the trapped microdroplets;
  • the method further comprises the step of:
  • the aqueous solution replacing the oil contains a biochemical solution
  • the biochemical solution preferably comprising at least one of one or more pH or salinity buffers, one or more nutrients, one or more growth factors, cytokines, a or antibodies, one or more antigens, one or more molecules, in particular of drug, one or more cells, lipids, carbohydrates, in particular in monomeric form or of polysaccharides, amino acids and / or proteins;
  • the trapping area is formed by a microfluidic chip comprising the surface tension traps
  • step i) consists of:
  • steps i) and ii) are performed simultaneously in the trapping area, performing the actions of:
  • step iii) consists of at least one of:
  • the oil contains a surfactant, the process preferably comprising a step of washing the surfactant prior to step iv);
  • the method comprises a step, prior to step i), of choosing the shape of the surface tension traps according to the desired shape of the microdroplets;
  • the trapping area and traps are chosen for:
  • the process comprises a step v) subsequent to step iii), and preferably subsequent to step iv), of thawing at least some of the gelled microdroplets in step iii);
  • the method comprises a step vi), subsequent to step v), consisting in discharging the degelified microdroplets and / or the samples contained in these degelified microdroplets outside the trapping zone;
  • the method comprises a step of applying a stimulus to the samples contained in at least a portion of the entrapped microgout, gelled or not;
  • the method comprises a step subsequent to step iii) of pushing out of the trapping zone the microdroplets around which the oil has not been gelled, to keep in the trapping area only the microdroplets around which the oil has been gelled.
  • the invention relates to a device for implementing a method as described above in all its combinations, comprising:
  • a trapping zone in particular a microfluidic chip, for trapping microdrops at predetermined locations
  • the gelation means may comprise a device for injecting a chemical agent into the trapping zone.
  • the device may further comprise means for de-thawing at least some of the gelled hydrogel microdroplets and / or a portion of the gelled oil.
  • the invention also relates to a product of gelled microdroplets, comprising a trapping area for microdroplets, in particular a microfluidic chip, and gelled microdroplets each including a sample, trapped in the trapping zone, the gelled microdroplets preferably being cryo-preserved .
  • the biochemical solution may contain cryo-protection agents (DMSO, glycerol, trehalose, etc.) to allow cryo-preservation of the samples.
  • cryo-protection agents DMSO, glycerol, trehalose, etc.
  • the gelled microdroplets may also be immersed in a fluid, preferably in an aqueous solution or in an oil, the fluid and microdrops being preferably cryo-preserved.
  • the invention also relates to a microdrop product, comprising a trapping zone, in particular a microfluidic chip, and microdrops each including a sample, trapped in the trapping zone, the microdroplets bathed in a gelled oil, the microdroplets and the microdroplet.
  • gelled oil being preferably cryo-preserved.
  • the samples may be mammalian cells, preferably mammalian cells excluding human cells, bacteria, yeasts or other cells used in bioprocesses, molecules, beads trapping molecules on the surface.
  • FIG. 1 schematically represents a microfluidic chip
  • FIG. 2 diagrammatically represents the microfluidic chip of FIG. 1, where traps are occupied by a hydrogel microdroplet containing samples
  • FIG. 3 diagrammatically represents the microfluidic chip of FIG. 1 containing a mixture of hydrogel and samples to be tested
  • FIGS. 4 to 6 schematically illustrate a means of evacuating a portion of the samples contained in hydrogel microdroplets trapped in a microfluidic chip, outside this microfluidic chip,
  • FIGS. 7 to 12 schematically illustrate examples of geometries of surface voltage traps and the forms of microdroplets that they make it possible to obtain
  • FIGS 13 to 15 schematically illustrate examples of sedimentation of samples in hydrogel microdroplets.
  • the invention relates to a method of handling hydrogel microdroplets including test samples.
  • the method essentially comprises three steps, all implemented in a single microfluidic system, the three steps of:
  • the aqueous solution is a hydrogel solution
  • the oil does not comprise a gelling agent and where the last step above is to gel at least a portion of the microdroplets trapped, without the oil being gelled.
  • the method can be continued by implementing different steps, depending on the test that is to be implemented, in particular.
  • the method may in particular be continued by a step consisting in replacing the oil around the gelled microdroplets with an aqueous solution, without moving the microdroplets of the surface tension traps.
  • the aqueous solution may contain a biochemical solution with at least one of nutrients, growth factors, antibodies, drug molecules and buffers of pH and / or salinity.
  • the method allows the control of the three-dimensional shape of hydrogel beads in a microfluidic channel and / or in surface tension traps, with for first application the encapsulation of cells in these microdroplets.
  • the encapsulation of the cells in the hydrogel allows their culture or analysis, while perfusing them with biochemical solutions, or by applying to them physical stimuli such as heat or light, for example.
  • Gel means a medium composed of a majority of liquid and containing molecules or particles that can be organized to give it a solid appearance, such as the absence of flow in its stable state. This solution can be handled in the liquid state and can then be “gelled” by chemical or physical means. Gelification can be reversible in some cases. When the liquid is water, it is called hydrogel.
  • the proposed microfluidic process comprises a first step of forming hydrogel microdroplets containing biological cells in an oil.
  • the microdrops (or microbeads) have a diameter of about one micrometer, in particular a diameter of between 10 and 1000 microns.
  • the hydrogel is, for example, an aqueous solution comprising a gelling agent.
  • the gelling agent is chosen by the user according to the application.
  • An example of a gelling agent that can be physically gelled is agarose, which is liquid at room temperature and gels at a low temperature.
  • a gelling agent that can be chemically gelled is, for example, alginate, which is liquid in solution and which gels when calcium ions Ca 2+ are added .
  • the biochemical and biomechanical properties of the hydrogel may allow anchor-sensitive cells to establish specific interactions with the thus-formed matrix. These interactions are essential for the survival of anchorage-dependent mammalian cells and participate in the regulation of their phenotype.
  • the nature of the matrix may, for example, make it possible to observe cell migration or proteolysis (digestion of the matrix by the cells).
  • agarose, Palginate, PEG-DA (Polyethylene glycol Diacrylate) but also gelatin, collagen type I or Matrigel ®.
  • hydrogels containing various proteins, glycoaminoglycans and other components of the extracellular matrix have demonstrated their ability to maintain viability, support proliferation and ability to migration, as well as to maintain the phenotype of some anchorage-dependent cell populations.
  • the gels can be combined, for example by adding microdrops. To each of the hydrogels mentioned is a specific gelation procedure.
  • hydrogels such as PEG-DA
  • may further be functionalized to allow cell survival and / or development by incorporating peptidomimetics eg hydrogels may be functionalized with RGD-type consensus sequences upon which certain cell types Mammals can establish specific interactions or PRCG [V / N] PD or HEXGHXXGXXH consensus sequences specific to metallo proteases) or the specific molecule sensor via the incorporation of antibodies or aptamers, for example in situ capture of cytokines secreted by encapsulated lymphocytes.
  • the mechanical properties of these hydrogels can also be modulated for different applications, for example by varying their degree of crosslinking and / or concentration.
  • All of these physicochemical properties may differ from one trap to another within the trapping area.
  • the introduction of a rigidity gradient within the trapped hydrogel microgout allows, for example, the controlled differentiation of stem cells into different cell types.
  • several hydrogels can coexist in the same microdrop following a mixture or the successive formation of several layers around the gelled heart in the trap.
  • the cells are mixed with the hydrogel, prior to the formation of the microdrops.
  • the mixture of the hydrogel and the cells can be made directly in the microfluidic device, before the formation of microdrops.
  • microdroplets After forming these microdroplets, the microdrops are transported from the zone where they were formed to the trapping zone by microchannels, driven by an oil flow and / or by slopes or rails. This routing has been found to aid in the formation of spheroids in microdrops.
  • the microdroplets are then trapped by surface tension traps placed in the trapping area, in particular in a microfluidic chip.
  • the trapping area (or microfluidic chip 10) is treated with a hydrophobic surface treatment and filled with an oil containing a surfactant.
  • surfactant allows the stabilization of microdrops and the reproducibility of their formation.
  • the surfactants also make it possible to prevent the microdroplets from coalescing if they come into contact during their transportation from the production device to traps in the trapping area.
  • the microfluidic chip 10, as illustrated in FIG. 1, is composed of a culture chamber, possibly several square centimeters, containing numerous surface tension traps organized in a table or matrix.
  • the surface tension traps 12 may have various shapes. For example, in the case of cylindrical traps, their diameter may range from a few tens of microns to several hundred depending on the desired application. For the encapsulation of single or individualized cells in microdrops, the diameter of the traps may be for example 50 microns, which corresponds to a density of about 5000 traps per square centimeter. For the study of large cell aggregates or spheroids, this diameter can increase to 250 microns, which corresponds to a trap density of about 250 traps per square centimeter. As illustrated in FIG. 1, the microdroplets 14 including the biological cells 16, formed outside the microfluidic chip 10, are entrained in the latter, for example by means of an oil flow illustrated by the arrow 18 so that some of these microdroplets are trapped in the surface tension traps 12.
  • hydrogel microdrops containing biological cells in an oil, without precise control of the hydrogel flow containing the biological cells in the oil. Indeed, only the microdroplets having adequate dimensions are subsequently trapped in the trapping area, so that the latter is occupied by microdroplets finally having a high homogeneity in size, shape and concentration of biological cells.
  • the trapping zone in particular a microfluidic chip 10, contains a hydrogel solution 20 containing biological cells 16.
  • the oil trapping zone is then injected into the trapping zone. injection is shown schematically by arrow 18), which pushes the hydrogel solution containing biological cells 16 to an exit of the trapping area.
  • the microdroplets then form directly at the level of the surface tension traps 12, by trapping the hydrogel in these traps of the microfluidic chip, until a configuration substantially identical to that illustrated in FIG. thus form by spontaneous division (or breakage) of the hydrogel solution containing the biological cells, on the surface tension traps.
  • the traps may be of very different shapes, in particular depending on the desired application, that is to say in particular depending on the shape of the trapped microgout sought.
  • the trap cavity can also be indifferently on the upper wall, bottom or one of the side walls of the trapping area, in particular the microfluidic chip.
  • FIGS. 7 to 12 illustrate possible forms of the surface tension traps 12 of the microfluidic chip 10 and the shape of the microdroplets 14 which can be obtained using these surface tension traps 12.
  • the shape of the trap 12 makes it possible to control the shape of the trapped microdroplets, according to the geometrical parameters of the microfluidic channel in which the trap 12 is formed, and the volume of the trapped microdroplets.
  • FIG. 7 schematically illustrates the parameters to be taken into account in order to determine the profile of the microdrop, namely the radius R of the microdrop confined in a channel containing a trap 12, the height h of this channel, less than the radius R of the microdrop in the channel, and the diameter d and the depth p of the trap 12.
  • the microdrop 14 When the trap 12 is cylindrical and has a diameter d greater than twice the height h of the channel, as illustrated in FIGS. 8 to 10, then the microdrop 14 returns as much as possible to the trap 12.
  • the microdrop 14 may or may not have a hemispherical cap, and have or not a flat portion, confined by the walls of the channel.
  • the volume of the microdrop 14 is greater than the volume of the trap 12. In this case, the microdrop 14 fills the trap 12 almost completely and has a flattened shape against the walls of the channel and the trap.
  • the microdrop 14 has a slightly smaller volume than that of the trap 12, while the microdrop 14 has two hemispherical caps and only scratches the walls of the channel. Finally, if the microdrop 14 has a much smaller volume than the volume of the trap 12, as illustrated in FIG. 10, then the microdrop 14 (or even several microdroplets 14) are entirely received in the trap 12.
  • the trap has a diameter d less than twice the height h of the channel.
  • the microdrop 14 remains essentially confined in the channel and has only a small hemispherical cap in the trap 12.
  • the trap 12 is conical and has a diameter d greater than twice the height h of the channel.
  • the microdrop 14 then marries the shape of the wall of the trap 12 to form a hemispherical cap in the trap 12.
  • the cells 16 sediment and settle statistically uniformly at the bottom of the microdrop 14. The cells can then be observed individually, and do not aggregate.
  • the microdrop 14 trapped in a trap 12 has a non-flat bottom, in particular a convex bottom, as illustrated in FIGS. 14 and 15, then the cells 16 meet the interface of the microdrop 12 during their sedimentation, and meet again have to slide along this interface.
  • the cells 16 focus thus at the bottom of the microdrop 14, and may eventually aggregate and form spheroids in the case of certain cells dependent on the anchor.
  • the microfluidic process proposed here comprises, after the entrapment of the microdroplets, a step of gelation of these microdrops.
  • the hydrogel contains, preferably is agarose.
  • the gelation of the microdroplets is then carried out by cooling the microfluidic chip.
  • the hydrogel contains or, preferably, is alginate, it is possible to bring calcium ions Ca 2+ into the oil in which the microdots are immersed, or to pre-mix calcareous particles with the alginate and saturate in C0 2 the oil in which the microdroplets bathe. The alginate is thus acidified and calcium ions are released.
  • other gelling agents may be used, other means of gelation can be implemented.
  • this gelation step may be carried out at different times of the handling method.
  • the gelation can be done immediately after the trapping so as to freeze the cells in situ, in the microdrop, and not allow them to sediment. The cells can then be observed independently of one another.
  • the gelation is carried out after the sedimentation of the cells to form spheroids. This makes it possible to observe the behavior of the cells having formed a spheroid.
  • gelation of the microdroplets is implemented only after manipulation of the cells in a liquid medium, for example to extract certain cells - those in ungelled microdroplets - selectively. This may be useful for cells such as bacteria or erythrocytes and leucocytes, which are independent of anchorage.
  • aqueous solution containing in particular a biochemical solution comprising biochemical components such as nutrients, growth factors, antibodies, drugs or drug molecules, for example.
  • biochemical components such as nutrients, growth factors, antibodies, drugs or drug molecules, for example.
  • biochemical components diffuse into the gel and reach the cells. It is thus possible to study the reaction of cells, independent or in the form of spheroids, with these stimuli.
  • the hydrogel thus keeps the cells in a precise location, while allowing their infusion by an aqueous phase and having previously compartmentalized the biological sample during encapsulation of cells in microdrops.
  • the surfactant from the interfaces of microdrops.
  • the shell formed by the surfactants at the interface of the microdroplets can indeed be so effective that it prevents the aqueous phase, which is injected to replace the oil, to fill the micro fluidic chip, keeping the microdroplets gelled in their respective traps.
  • the arrival of the interface of the aqueous phase at a trap results in a force applied to the gelled microgout which can be removed from the trap if the hydrogel which composes it is sufficiently compressible. Therefore, it is preferable to promote coalescence by decreasing the concentration of surfactant at the interface.
  • the micro fluidic chip is perfused before injection of the aqueous phase with oil which, unlike the oil used previously, does not contain surfactant.
  • concentration of surfactant in the oil of the microfluidic chip decreases, which makes it possible to shift the surfactant adsorption balance at the interface towards the desorption.
  • concentrations of surfactant for example of the order of a few percent by weight, it is preferable to infuse the microfluidic chip with an amount of oil equivalent to 50 times the volume of the microfluidic chip. This ratio depends on the nature of the surfactant (s) and its affinity for both phases.
  • the shape of the traps can also be optimized to maintain the position of gelled microdroplets in the traps.
  • the height of the channel is greater than the radius of the trap, the entry of the microdrop into the trap will be minimal, resulting in a low trapping efficiency.
  • the microdrop when the channel height is smaller than the trap radius, the microdrop, provided it is large enough, penetrates strongly into the trap cavity, resulting in a high trapping efficiency. The microdrops remain in place regardless of the speed of the external flow.
  • the shape of the microdrop is very close to its shape in the channel while in the second case, it adopts locally the shape of the trap.
  • the gelling agent of the chosen hydrogel is reversible, it is possible to defrost the microdrops and then to evacuate their contents out of the microfluidic chip, as illustrated in FIGS. 4 to 6.
  • the microdroplets 14 are gelled agarose microdrops, for example. These microdroplets 14 of agarose are de-lined one by one by heating them locally (the heating being illustrated by flashes 21), in particular using an infra-red laser or electrodes. Heat liquefies agarose.
  • the phase surrounding the microdroplets 14 is aqueous
  • the content 16 of the degelified agarose mixes with the aqueous phase. It is then possible to entrain this content by the stream 22 of the aqueous phase, possibly to recover it. It is also possible to eliminate the cells considered as non-interesting microfluidic chip 10.
  • the shape and size of the trap are preferably chosen to allow the extraction of cells. For example, in the case where the cells must remain viable, the trap is sized large enough that the heating of the hydrogel does not induce the mechanisms of cell death does not induce the mechanisms of cell death.
  • the phase surrounding the microdrops is oily
  • an oil flow may be imposed to dislodge the liquid microdrop from the trap.
  • the shape and the force of the trap are preferably dimensioned so as to allow the extraction of the selected microdroplet only, and not others. This sizing depends in particular on the value of the surface tension between the aqueous phase and the oil, as well as the rigidity of the gel microdroplets and their shape inside the trap.
  • Another alternative is to maintain liquid microdrops for handling suspended cells, for example bacteria. Gelification is then carried out only for the selective extraction of microdrops. In this case, one can either gel all microdrops before extraction and apply the protocol described above, or on the contrary only gel microdrops that want to keep in the traps.
  • the process presented makes it possible, thanks to slight modifications, to be interested in very varied biological applications.
  • the device can of course also be modified by adjusting the height of the channel in the microfluidic chip and the geometry of the traps.
  • rapid gelation with low cell concentration makes it possible to individualize a few unique cells in each microdrop while trying to limit their direct interactions.
  • These cells may for example be bacteria, yeasts or mammalian cells.
  • a high concentration of cells with always rapid gelation allows to obtain a large number of cells always individualized but close to each other.
  • the cells may however be kept encapsulated for a long time in the liquid phase before gelation.
  • a low concentration of cells then makes it possible, for example, to study cells in suspension, independent of the anchoring, such as lymphocytes.
  • a high concentration of cells and a form of trapped microdroplets allowing the sedimentation of the cells makes it possible to put in contact the cells which will be able to be reorganized into spheroids.
  • the method can also make it possible to form spheroids directly in the chip in a controlled manner.
  • the volume of the microdroplets created can be controlled by the microdrop formation device upstream of the microfluidic chip. This volume is preferably adjusted so that the microdrops, once trapped, have a diameter equal to that of the trap and a spherical shape. To do this, the depth of the trap is preferably at least equal to its diameter. The fact that the diameter of the trapped microgout coincides with that of the trap makes it possible to ensure a high trapping efficiency.
  • the spherical shape promotes the formation of spheroids.
  • the microdrops preferably contain cells in suspension in an aqueous phase comprising or consisting of culture medium and hydrogel.
  • the external oil flow is stopped, which stops the recirculation within microdroplets and promotes sedimentation of the cells.
  • the spherical shape of the microdrops in the traps then induces a concentration of the cells at their lowest points until they come into contact. Keeping the chip at rest, under conditions favorable to the survival and proper metabolic function of the cells, especially in temperature, for a period ranging from several hours to several days, allows the reorganization of the concentrated cells at the bottom of the trapped microgout, as a spheroid.
  • the time required for the formation of spheroids may in particular depend on the cell type used and the composition of the hydrogel. For H4IIEC3 rat liver cells in a 1% mass agarose solution diluted in culture medium, this duration was found to be less than 24 hours. Of course, the hydrogel is kept liquid during the formation time of the spheroids.
  • the size of the spheroids is given by the number of cells encapsulated in each microdrop and therefore by the concentration of the cell solution injected into the microfluidic chip.
  • the distribution of the number of cells per microdroplet, and therefore that of the size of the spheroids formed, is very homogeneous provided that the cells are sufficiently individualized at the time of injection.
  • 98% of the traps were filled with a liquid agarose microdroplet which after 24 hours of incubation contained a well-reorganized spheroid.
  • the spheroids obtained in the micro fluidic chip can be kept in culture for several days.
  • spheroids of H4IIEC3 cells encapsulated in agarose can be cultured in the flea for a week without significantly impairing their viability while retaining strong functionality (in this example a strong and continuous albumin secretion).
  • the method presented here and the microfluidic chip obtained by implementing it, constitute an excellent tool for screening drugs.
  • the high efficiency of the formation process of these spheroids also makes it possible to create a large number from very limited samples. 500 spheroids of about 70 ⁇ in diameter can thus be formed with only 100,000 cells.
  • the cells that make up the spheroids can also be of different types to address themes of co-culture. These cell types can be homogeneously mixed in solution before injection into the chip or be arranged according to a certain structural organization, in several layers of successive hydrogels or simply by adhesion to the hydrogel after being perfused into the external aqueous phase.
  • fibroblasts and epithelial cells can be combined to form a skin model and to test the toxicity of cosmetic products, neurons and astrocytes to model the brain, or endothelial cells and smooth muscle cells as in the wall of the skin. blood vessel.
  • the method presented here achieves very advanced control of the microenvironment of cells in culture, it is also an excellent tool for the study of stem cell differentiation.
  • the encapsulated cells may indeed be subjected to a whole range of concentration of differentiating factors and, potentially at the same time, to a whole range of rigidity of the matrix, for example by adjusting the concentration of the hydrogel.
  • the method can be used to observe the embryonic development over time in interaction with the physicochemical factors of the external environment.
  • this method makes it possible to make a medical diagnosis based on the response of the cells to certain markers.
  • the cells are captured with a very low rate of losses.
  • the cells can then be subjected to known diagnostic tests for certain diseases, such as a characterization of a cancerous biopsy.
  • PCR polymerase chain reaction
  • FISH FISH method.
  • the expression of specific proteins can also be detected by labeling methods, for example by providing antibodies for immuno-labeling or for an enzyme immunoassay method ELIS A (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay). in situ.
  • the process described above offers the possibility of carrying out all the analysis and cell culture steps in a microfluidic chip, thanks to the gelation of the microdroplets following their trapping in the chip. This makes it possible to use much smaller volumes of reagents than for tests carried out in multiwell plates or in culture dishes. This also allows tracking of cell responses over time, following different stimuli.
  • hydrogel microdrops containing cells means for forming hydrogel microdrops containing cells, a trapping zone, in particular a microfluidic chip, for trapping the hydrogel microdroplets at predetermined locations, and
  • the gelation means comprise, for example, a device for injecting a chemical agent into the trapping zone and / or temperature control means, for example for cooling the microfluidic chip.
  • the device may also include means for de-thawing at least some of the gelled hydrogel microdroplets, for example a laser.
  • a gelled microdrop product comprising a microdrop trapping zone, in particular a microfluidic chip, and gelled microdroplets each including one or more cells trapped in the trapping zone, the microdroplets.
  • gelled are preferably cryopreserved.
  • Cells can be aggregated as clusters or spheroids.
  • the gelled microdroplets may be immersed in a fluid, preferably in an aqueous solution or in an oil, the fluid and microdrops being preferably cryo-preserved. This cryo-preservation allows in particular the maintenance of the cells under stable conditions for a long time, with a view to transporting them or storing them for later analysis.
  • the biological cells encapsulated in the microdroplets may be bacteria, yeasts, eukaryotic cells, mammalian cells, preferably mammalian cells excluding human cells, more preferably rat or other mammalian cells. , or human cells isolated from their natural environment.
  • samples used in addition to cells, may in particular also be molecules, functionalized plastic beads by coupling them to molecules.
  • the trapped microdroplets can be fused with other microdrops made by the aqueous solution stream.
  • the aqueous solution of which the microdrops are constituted may contain a biochemical solution, the biochemical solution preferably comprising at least one of lipids (fatty acids, etc.), carbohydrates (in monomeric form or polysaccharides, etc.). ), amino acids and proteins (growth factors, cytokines, antibodies, antigens etc.), as well as salinity and / or pH buffers.
  • the oil (or oily phase) surrounding the microdroplets may contain fluorinated oils (FC40 type) or water-immiscible photo-crosslinkable solutions (Norland Optical Adhesive type), which once polymerized to gel the oil and thus physically and selectively isolate microdrops. It is thus possible to partition, isolate in a more robust manner, the microdrops with respect to each other. This prevents two microdrops merge, causing a mixture of the samples they contain. This also makes it possible to store the samples in a sustainable manner, the risks of evaporation, in particular, microdroplets being greatly reduced due to the partitioning of the microdroplets by the gelled oil, which forms a solid compartment around the microdroplets.
  • FC40 type fluorinated oils
  • Norland Optical Adhesive type water-immiscible photo-crosslinkable solutions
  • the microdroplets around which the oil has not gelled can be pushed out of the trapping zone. To do this, it is possible to implement a flow of oil or another fluid in the trapping zone, the flow being sufficiently strong to drive the microdroplets. It is thus possible to keep in the trapping zone only the microdrops around which the oil has been gelled.
  • microdrops can be gelled even in the case where the oil is gelled.
  • the process may of course include in this case where a part of the oil is gelled, a subsequent step of degelling the gelled oil.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Clinical Laboratory Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)
  • Colloid Chemistry (AREA)

Abstract

L'invention se rapporte à un procédé de manipulation dans un système micro fluidique de micro gouttes (14) incluant des échantillons (16), comprenant les étapes consistant à former dans une huile des micro gouttes (14) d'une solution aqueuse contenant un échantillon (16), au moins l'un parmi l'huile et la solution aqueuse contenant un échantillon (16) comprenant un agent gélifiant, piéger les micro gouttes (14) au moyen de pièges de tension de surface (12) prédisposés dans une zone de piégeage (10), et à gélifier au moins l'un parmi au moins une partie de l'huile dans la zone de piégeage et au moins une partie des microgouttes (14) piégées.

Description

PROCÉDÉ DE MANIPULATION DE MICROGOUTTES INCLUANT DES
ECHANTILLONS
La présente invention concerne un procédé microfluidique de manipulation d'échantillons, notamment biologiques, dans des microgouttes d'hydrogel. L'invention se rapporte également à un dispositif pour mettre en œuvre un tel procédé et à un produit d'échantillons obtenu en mettant en œuvre un tel procédé.
Il est connu de Guo, Rotem, Heyman, & Weitz, « Droplet microfluidics for high- throughput biological assays », Lab. Chip. 12 (2012), que les gouttes dans des systèmes microfluidiques (ou « microgouttes ») peuvent être utilisées pour contenir des réactions chimiques ou biologiques. Dans ces systèmes, le contenu de ces gouttes peut être testé en observant la fluorescence de la goutte quand elle passe devant un laser focalisé. Cependant, ces systèmes ne permettent pas d'observer l'évolution en fonction du temps du contenu de ces gouttes sans les extraire du dispositif microfluidique.
II est connu aussi, par exemple de Joensson, H. N. & Andersson Svahn, H.,
« Droplet microfluidics - a tool for single-cell analysis », Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 51, 12176-12192 (2012), d'étudier des cellules individualisées dans des microgouttes. Ces microgouttes forment en effet des compartiments bien définis qui permettent d'isoler des échantillons biologiques comme des cellules, par exemple. Ce document enseigne notamment que la localisation des populations de cellules encapsulées peut être contrôlée grâce à l'accumulation des gouttes dans des chambres de culture, dans des canaux allongés, ou encore dans des pièges statiques. Ce document enseigne encore que les cellules peuvent être encapsulées dans des hydrogels fonctionnalisés, entourés d'une phase huileuse.
Cependant, l'apport de nutriments ou de manières plus générales de molécules d'intérêt biologique pour les cellules dans de tels dispositifs s'avère limités et les méthodes mises en œuvre (par exemple par électro-fusion ou pico-injection) complexes. En conséquence, ces dispositifs présentent de nombreuses limites pour l'étude du comportement cellulaire, en particulier au niveau temporal.
Par ailleurs, il est connu de L. Yu, M. C.W. Chen and K. C. Cheung, « Droplet- based micro fluidic System for multicellular tumor spheroid formation and anticancer drug testing », Lab Chip (2010) un procédé pour manipuler des microgouttes d'hydrogel contenant des sphéroïdes multicellulaires. Selon ce procédé, des microbilles d'hydrogels incluant des cellules sont réalisées dans un premier système microfluidique. Elles sont ensuite récupérées et lavées dans un bain, avant d'être injectées dans un deuxième système microfluidique comprenant des pièges permettant de fixer les microgouttes.
Un tel procédé est cependant complexe, qui nécessite deux systèmes microfluidiques distincts et trois dispositifs au total. En outre, il ne permet pas d'observer les échantillons en continu. En particulier il ne permet pas d'observer les moments initiaux entre la formation des gouttes et leur capture.
Il existe donc un besoin pour un procédé de manipulation de microgouttes contenant des échantillons plus simple et permettant cependant une vaste gamme de tests sur les échantillons. Il existe également un besoin pour un procédé de manipulation de microgouttes permettant un tri plus efficace des microgouttes.
À cette fin, l'invention propose un procédé de manipulation dans un système microfluidique de microgouttes incluant des échantillons, comprenant les étapes consistant à :
i) former dans une huile des microgouttes d'une solution aqueuse contenant un échantillon, au moins l'un parmi l'huile et la solution aqueuse comprenant un agent gélifiant,
ii) piéger les microgouttes au moyen de pièges de tension de surface prédisposés dans une zone de piégeage, et
iii) gélifier au moins l'un parmi au moins une partie de l'huile dans la zone de piégeage et au moins une partie des microgouttes piégées.
Ainsi, selon l'invention, pour trier les microgouttes d'intérêt - c'est-à-dire les microgouttes qui contiennent des échantillons d'intérêt - ces microgouttes sont tout d'abord piégées dans des pièges de tension de surface (ou piège capillaire), puis certaines des microgouttes et/ou une partie de l'huile qui les entoure sont gélifiées. La gélification des microgouttes et/ou de l'huile qui les entoure facilite le tri en accentuant la force de piégeage des microgouttes dans les pièges. En d'autres termes, l'étape de gélification permet d'éviter que des microgouttes d'intérêt soient perdues.
En outre, cette gélification permet d'éviter que des microgouttes ne puissent fusionner, ce qui provoquerait un mélange des échantillons de ces microgouttes. Par piège de tension de surface, on entend un piège une zone du système microfluidique dont la géométrie, avec la tension interfaciale de la microgoutte, permet le maintien en position de la microgoutte.
Toutes les étapes du procédé sont réalisées dans un système microfluidique unique. Par système microfluidique, on entend un système dont les pièces sont fabriquées selon des procédés de micro fabrication. Un tel système présente des conduits dont au moins une dimension est typiquement inférieure au millimètre.
La forme de la microgoutte peut être contrôlée. Ce contrôle de la forme de la microgoutte peut être combiné avec le contrôle de l'instant de gélifïcation de la microgoutte ou d'une partie de l'huile l'entourant, pour donner accès à des applications différentes, notamment sur la manipulation de cellules.
Par cellules, on entend les cellules eucaryotes (par exemple cellules végétales, champignons, levures, cellules mammifères) et les cellules procaryotes (par exemple bactéries). Pour les cellules de mammifères, on distingue les cellules indépendantes à l'ancrage (par exemple certaines cellules de la lignée sanguine et les cellules tumorales hautement transformées) et les cellules dépendantes à l'ancrage (la majorité des autres types cellulaires), dont certains sous-types peuvent s'organiser sous forme de sphéroïdes. On entend par sphéroïdes, des structures multicellulaire organisées sous formes de micro-tissus dont les fonctionnalités sont similaires à celles de tissus dérivés d'organes.
Selon des modes de réalisation préférés, le procédé selon l'invention comporte une ou plusieurs des caractéristiques suivantes, prises seules ou en combinaison :
l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie de l'huile de la zone de piégeage, à l'exclusion des microgouttes ;
l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes, à l'exclusion de l'huile entourant les microgouttes dans la zone de piégeage ; l'échantillon est l'un parmi une ou des cellules, notamment un sphéroïde de cellules, un ou plusieurs billes piégeant des molécules, les billes étant notamment en matière plastique, une ou des molécules ;
l'étape iii) est réalisée après sédimentation des échantillons, notamment des cellules, dans les microgouttes piégées, en particulier après formation de sphéroïdes ; l'étape iii) est réalisée avant sédimentation des échantillons dans les microgouttes piégées ;
le procédé comprend en outre l'étape consistant à :
iv) remplacer l'huile entourant les microgouttes gélifiées par une solution aqueuse ;
la solution aqueuse remplaçant l'huile contient une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi un ou des tampons de pH ou de salinité, un ou des nutriments, un ou des facteurs de croissance, des cytokines, un ou des anticorps, un ou des antigènes, une ou des molécules, notamment de médicament, une ou des cellules, des lipides, des glucides, notamment sous forme monomérique ou de polysaccharides, des acides aminés et/ou des protéines ;
la zone de piégeage est formée par une puce microfluidique comprenant les pièges de tension de surface ;
l'étape i) consiste à :
a) injecter dans une zone, en amont de la zone de piégeage, une solution aqueuse contenant des échantillons et un agent gélifiant, le cas échéant, b) injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone en amont de la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons vers une sortie de la zone de piégeage, l'injection d'huile étant réalisée de manière à former des microgouttes contenant des échantillons, puis
c) déplacer les microgouttes jusqu'au niveau de la zone de piégeage et piéger les microgouttes dans la zone de piégeage ;
les étapes i) et ii) sont réalisées simultanément dans la zone de piégeage, en réalisant les actions consistant à :
- remplir la zone de piégeage de solution aqueuse contenant des échantillons et un agent gélifiant, le cas échéant, puis à
- injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons vers une sortie de la zone de piégeage, les pièges de tension de surface étant conformés pour permettre la cassure des microgouttes contenant des échantillons au niveau des pièges de tension de surface ;
l'étape iii) consiste en au moins l'un parmi :
refroidir ou chauffer des microgouttes et/ou l'huile,
- injecter une solution contenant un agent chimique de gélifïcation, soumettre les microgouttes et/ou l'huile à une lumière provoquant la gélifïcation, notamment une lumière UV.
l'huile contient un agent surfactant, le procédé comprenant de préférence une étape de lavage de l'agent surfactant avant l'étape iv) ;
- le procédé comprend une étape, préalable à l'étape i), de choix de la forme des pièges de tension de surface en fonction de la forme désirée des microgouttes ;
la zone de piégeage et les pièges sont choisis pour :
- former des microgouttes piégées avec un fond plat, ou
- former des microgouttes piégées avec un fond non-plat, notamment incurvé, de préférence convexe ;
le procédé comprend une étape v) postérieure à l'étape iii), et de préférence postérieure à l'étape iv), consistant à dégélifïer au moins certaines des microgouttes gélifiées à l'étape iii) ;
- le procédé comprend une étape vi), postérieure à l'étape v), consistant à évacuer les microgouttes dégélifiées et/ou les échantillons contenus dans ces microgouttes dégélifiées hors de la zone de piégeage ;
le procédé comprend une étape d'application d'un stimulus aux échantillons contenus dans au moins une partie des microgouttes piégées, gélifiées ou non ; et
le procédé comprend une étape postérieure à l'étape iii) consistant à pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée, pour ne garder dans la zone de piégeage que les microgouttes autour desquelles l'huile a été gélifiée.
Selon un autre aspect, l'invention se rapporte à un dispositif pour mettre en œuvre un procédé tel que décrit ci-avant dans toutes ses combinaisons, comprenant :
des moyens pour former des microgouttes contenant des échantillons, - une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes à des endroits prédéterminés, et
des moyens de gélifïcation d'une partie au moins des microgouttes piégées et/ou de l'huile.
Les moyens de gélifïcation peuvent comprendre un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage.
Le dispositif peut en outre comprendre des moyens de dégélifïer au moins certaines des microgouttes d'hydrogel gélifiées et/ou d'une partie de l'huile gélifiée.
L'invention vise également un produit de microgouttes gélifiées, comprenant une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce microfluidique, et des microgouttes gélifiées incluant chacune un échantillon, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes gélifiées étant de préférence cryo-préservées.
Pour ce faire, et en vue du stockage et/ou de la distribution de ce produit de microgouttes, la solution biochimique peut contenir des agents de cryo-protection (DMSO, glycérol, tréhalose etc.) pour permettre la cryo -préservation des échantillons.
Les microgouttes gélifiées peuvent également baigner dans un fluide, de préférence dans une solution aqueuse ou dans une huile, le fluide et les microgouttes étant de préférence cryo-préservées.
L'invention se rapporte aussi à un produit de microgouttes, comprenant une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, et des microgouttes incluant chacune un échantillon, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes baignant dans une huile gélifiée, les microgouttes et l'huile gélifiée étant de préférence cryo-préservées.
Les échantillons peuvent être des cellules de mammifères, de préférence des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, des bactéries, des levures ou d'autres cellules utilisées dans des bioprocédés, des molécules, des billes piégeant des molécules en surface.
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de mise en œuvre de l'invention, en regard des dessins ci-annexés sur lesquels :
La figure 1 représente schématiquement une puce microfluidique, - La figure 2 représente schématiquement la puce microfluidique de la figure 1 où des pièges sont occupés par une microgoutte d'hydrogel contenant des échantillons, La figure 3 représente schématiquement la puce microfluidique de la figure 1 contenant un mélange d'hydrogel et d'échantillons à tester,
Les figures 4 à 6 illustrent schématiquement un moyen d'évacuer une partie des échantillons contenus dans des microgouttes d'hydrogel piégées dans une puce microfluidique, hors de cette puce microfluidique,
Les figures 7 à 12 illustrent schématiquement des exemples de géométries de pièges à tension de surface et les formes de microgouttes qu'ils permettent d'obtenir, et
Les figures 13 à 15 illustrent schématiquement des exemples de sédimentation d'échantillons dans des microgouttes d'hydrogel.
L'invention se rapporte à un procédé de manipulation de microgouttes d'hydrogel incluant des échantillons à tester.
Dans la suite, on s'intéresse plus particulièrement à des échantillons sous forme de cellules, mais d'autres types d'échantillons peuvent bien entendu être mis en œuvre.
Le procédé comprend essentiellement trois étapes, toutes mises en œuvre dans un unique système microfluidique, les trois étapes consistant à :
former dans une huile, des microgouttes de solution aqueuse, liquide, contenant une ou des cellules, l'huile et/ou la solution aqueuse comprenant un agent gélifiant,
- piéger les microgouttes, liquides, au moyen de pièges de tension de surface prédisposés dans une zone de piégeage, et
gélifier au moins l'un parmi l'huile et au moins une partie des microgouttes piégées.
Dans la suite, on s'intéresse plus particulièrement au cas où la solution aqueuse est une solution d'hydrogel, l'huile ne comprenant pas d'agent gélifiant et où la dernière étape ci-dessus consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes piégées, sans que l'huile ne soit elle gélifiée. Dans ce cas, suite aux trois étapes mentionnées ci-dessus, le procédé peut se poursuivre en mettant en œuvre différentes étapes, en fonction du test que l'on souhaite mettre en œuvre, notamment.
Le procédé peut notamment se poursuivre par une étape consistant à remplacer l'huile autour des microgouttes gélifiées, par une solution aqueuse, sans déplacer les microgouttes des pièges de tension de surface. La solution aqueuse peut contenir une solution biochimique avec au moins l'un parmi des nutriments, des facteurs de croissance, des anticorps, des molécules de médicament et des tampons de pH et/ou de salinité.
Selon un autre aspect, le procédé permet le contrôle de la forme tridimensionnelle de billes d'hydrogel dans un canal microfluidique et/ou dans des pièges de tension de surface, avec pour application première l'encapsulation de cellules dans ces microgouttes. Ainsi, selon la forme des microgouttes et la concentration de cellules par microgoutte, l'encapsulation des cellules dans de l'hydrogel permet leur culture ou leur analyse, tout en les perfusant avec des solutions biochimiques, ou en leur appliquant des stimuli physiques tels que de la chaleur ou de la lumière, par exemple.
Par gel, on entend un milieu composé d'une majorité de liquide et contenant des molécules ou des particules pouvant s'organiser pour lui conférer un aspect solide, comme par exemple l'absence d'écoulement à son état stable. Cette solution peut être manipulée à l'état liquide et peut ensuite être « gélifiée » par des moyens chimiques ou physiques. La gélifïcation peut être réversible dans certains cas. Quand le liquide est l'eau, on parle d'hydrogel.
Comme indiqué ci-avant, le procédé microfluidique proposé comporte une première étape de formation de microgouttes d'hydrogel contenant des cellules biologiques dans une huile.
Ici, les microgouttes (ou microbilles) présentent un diamètre de l'ordre du micromètre, notamment un diamètre compris entre 10 et 1000 micromètres.
L'hydrogel est par exemple une solution aqueuse comprenant un agent gélifiant. L'agent gélifiant est choisi par l'utilisateur en fonction de l'application. Un exemple d'agent gélifiant pouvant être gélifié de manière physique est l'agarose, liquide à température ambiante et qui gélifie à basse température. Un agent gélifiant pouvant être gélifié de manière chimique est par exemple l'alginate, liquide en solution et qui gélifie en cas d'apport d'ions calcium Ca2+.
Au niveau biologique, les propriétés biochimiques et biomécaniques de l'hydrogel peuvent permettre aux cellules sensibles à l'ancrage d'établir des interactions spécifiques avec la matrice ainsi formée. Ces interactions sont essentielles pour la survie des cellules mammifères dépendantes de l'ancrage et participent à la régulation de leur phénotype. La nature de la matrice peut par exemple permettre d'observer la migration cellulaire ou protéolyse (digestion de la matrice par les cellules). Des expériences particulièrement concluantes ont été menées avec de l'agarose, de Palginate, du PEG-DA (Polyéthylène glycol Diacrylate), mais aussi de la gélatine, du collagène de type I ou du Matrigel ®. Par exemple, les hydrogels contenant diverses protéines, glycoaminoglycans et autres composants de la matrice extracellulaire (par exemple le collagène de type I, la gélatine ou le Matrigel®) ont démontré leur capacité à maintenir la viabilité, à soutenir la prolifération et la capacité de migration, ainsi qu'à maintenir le phénotype de certaines populations de cellules dépendantes à l'ancrage. Il est à noter ici que les gels peuvent être combinés, par apport de microgouttes successives, par exemple. À chacun des hydrogels mentionnés correspond une procédure de gélifïcation spécifique. Certains hydrogels, tel le PEG-DA, peuvent en outre être fonctionnalisés pour permettre la survie et/ou le développement des cellules, en incorporant des peptidomimetiques (par exemple les hydrogels peuvent être fonctionnalisés avec des séquences consensus type RGD sur lesquelles certains types de cellules mammifères peuvent établirent des interactions spécifiques ou encore des séquences consensus PRCG[V/N]PD ou HEXGHXXGXXH spécifiques aux métallo protéases) ou le capteur de molécules spécifiques via l'incorporation d'anticorps ou d'aptamères, par exemple la capture in situ de cytokines sécrétées par des lymphocytes encapsulés. Les propriétés mécaniques de ces hydrogels peuvent aussi être modulées pour différentes applications, en faisant par exemple varier leur taux de réticulation et/ou leur concentration. L'ensemble de ces propriétés physico- chimiques peuvent être différentes d'un piège à l'autre au sein de la zone de piégeage. L'instauration d'un gradient de rigidité au sein des microgouttes d'hydrogels piégées permet par exemple la différenciation contrôlée de cellules souches en différents types cellulaires. Enfin, plusieurs hydrogels peuvent coexister dans une même microgoutte suite à un mélange ou à la formation successive de plusieurs couches autour du cœur gélifié dans le piège.
Les cellules sont mélangées à l'hydrogel, a priori avant la formation des microgouttes. Cependant, le mélange de l'hydrogel et des cellules peut être réalisé directement dans le dispositif microfluidique, avant la formation des microgouttes.
De nombreux procédés ont déjà été proposés pour former de telles microgouttes dans une phase mobile tel que de l'huile. On peut par exemple citer les exemples de procédé :
- procédé dit de « flow-focusing » décrit par exemple dans S.L. Anna, N.
Bontoux et H.A. Stone, « Formation of dispersions using 'Flow-Focusing' in microchannels », Appl. Phys. Lett. 82, 364 (2003), dont le contenu est intégré ici par référence,
procédé dit à « jonction en T » décrit par exemple dans « Dynamic pattern formation in a vesicle-generating microfluidic device » par T. Thorsen, R. W. Roberts, F. H. Arnold et S. R. Quake, Phys. Rev. Lett. 86, 4163-4166 (2001), dont le contenu est intégré ici par référence, ou bien
procédé dit « à gradient de confinement» décrit par exemple dans la demande FR-A-2 958 186, dont le contenu est intégré ici par référence. Ces procédés permettent de former des microgouttes de dimensions sensiblement égales.
Après formation de ces microgouttes, les microgouttes sont acheminées depuis la zone où elles ont été formées jusqu'à la zone de piégeage par des microcanaux, entraînées par un flux d'huile et/ou par des pentes ou des rails. Il a été constaté que cet acheminement aide à la formation de sphéroïdes dans les microgouttes. Les microgouttes sont ensuite piégées par des pièges de tension de surface disposés dans la zone de piégeage, notamment dans une puce micro fluidique. La zone de piégeage (ou la puce micro fluidique 10) est traitée par un traitement de surface hydrophobe, et remplie d'une huile contenant un surfactant. L'utilisation de surfactant permet la stabilisation des microgouttes et la reproductibilité de leur formation. Les surfactants permettent de plus d'empêcher la coalescence des microgouttes en cas de contact pendant leur acheminement du dispositif de production aux pièges de la zone de piégeage.
La puce micro fluidique 10, telle qu'illustrée sur la figure 1, est composée d'une chambre de culture, possiblement de plusieurs centimètres carrés, contenant de nombreux pièges de tension de surface organisés en tableau ou matrice. Les pièges de tension de surface 12 peuvent avoir des formes variées. Par exemple, dans le cas de pièges cylindriques, leur diamètre peut s'étendre de quelques dizaines de microns à plusieurs centaines en fonction de l'application souhaitée. Pour l'encapsulation de cellules uniques ou individualisées dans les microgouttes, le diamètre des pièges peut être par exemple de 50 microns, ce qui correspond à une densité d'environ 5000 pièges par centimètre carré. Pour l'étude de larges agrégats cellulaires ou de sphéroïdes, ce diamètre peut passer à 250 microns, ce qui correspond alors à une densité de pièges de l'ordre de 250 pièges par centimètre carré. Comme illustré à la figure 1, les microgouttes 14 incluant les cellules biologiques 16, formées à l'extérieur de la puce microfluidique 10, sont entraînées dans cette dernière, par exemple à l'aide d'un flux d'huile illustré par la flèche 18 de telle sorte que certaines de ces microgouttes sont piégées dans les pièges de tension de surface 12.
En variante cependant, il est proposé ici de former des microgouttes d'hydrogels contenant des cellules biologiques, dans une huile, sans contrôle précis de l'écoulement d'hydrogel contenant les cellules biologiques dans l'huile. En effet, seules les microgouttes présentant des dimensions adéquates sont par la suite piégées dans la zone de piégeage, de sorte que cette dernière est occupée par des microgouttes présentant finalement une grande homogénéité de dimension, de forme et de concentration en cellules biologiques.
Selon une autre variante, illustrée à la figure 3, la zone de piégeage, notamment une puce microfluidique 10, contient une solution d'hydrogel 20 contenant des cellules biologiques 16. On injecte alors dans la zone de piégeage de l'huile (l'injection est schématisée par la flèche 18), qui pousse la solution d'hydrogel 20 contenant des cellules biologiques 16 vers une sortie de la zone de piégeage. Les microgouttes se forment alors directement au niveau des pièges de tension de surface 12, par piégeage de l'hydrogel dans ces pièges de la puce microfluidique, ceci jusqu'à obtenir une configuration sensiblement identique à celle illustrée sur la figure 2. Les microgouttes se forment ainsi par division spontanée (ou cassure) de la solution d'hydrogel contenant les cellules biologiques, sur les pièges de tension de surface. Ici aussi, un contrôle précis des écoulements n'est pas nécessaire et il est même possible de pousser les seringues à la main, sans avoir recours à des instruments sophistiqués. Dans ce cas, on préfère des pièges de tension de surface profonds pour permettre la cassure des microgouttes (c'est-à-dire leur formation) au niveau des pièges de tension de surface. De tels pièges seront décrits ultérieurement.
II est à noter ici que les pièges peuvent être de formes très différentes, notamment en fonction de l'application recherchée, c'est-à-dire en particulier en fonction de la forme des microgouttes piégées recherchée. La cavité formant piège peut aussi se trouver indifféremment sur la paroi supérieure, inférieure ou une des parois latérales de la zone de piégeage, notamment de la puce microfluidique.
Les figures 7 à 12 illustrent des formes envisageables des pièges de tension de surface 12 de la puce microfluidique 10 et la forme des microgouttes 14 qui peut être obtenue à l'aide de ces pièges de tension de surface 12. En particulier, la forme du piège 12 permet de contrôler la forme des microgouttes piégées, selon les paramètres géométriques du canal microfluidique dans lequel est formé le piège 12, et le volume des microgouttes piégées. La figure 7 illustre schématiquement les paramètres à prendre en compte pour déterminer le profil de la microgoutte, à savoir le rayon R de la microgoutte confinée dans un canal contenant un piège 12, la hauteur h de ce canal, inférieure au rayon R de la microgoutte dans le canal, et le diamètre d et la profondeur p du piège 12.
Quand le piège 12 est cylindrique et a un diamètre d supérieur à deux fois la hauteur h du canal, comme illustré aux figures 8 à 10, alors la microgoutte 14 rentre autant que possible dans le piège 12. Selon les volumes relatifs du piège 12 et de la microgoutte 14, la microgoutte 14 peut présenter ou non une calotte hémisphérique, et avoir ou non une partie plate, confinée par les parois du canal. Ainsi, sur la figure 8, le volume de la microgoutte 14 est supérieur au volume du piège 12. Dans ce cas, la microgoutte 14 remplit presque totalement le piège 12 et présente une forme aplatie contre les parois du canal et du piège. Sur la figure 9, la microgoutte 14 présente un volume légèrement plus faible que celui du piège 12, alors la microgoutte 14 présente deux calottes hémisphériques et ne fait qu'effleurer les parois du canal. Enfin, si la microgoutte 14 présente un volume nettement plus faible que le volume du piège 12, comme cela est illustré sur la figure 10, alors la microgoutte 14 (voire plusieurs microgouttes 14) sont entièrement reçu dans le piège 12.
Dans le cas de la figure 11 , par contre, le piège a un diamètre d inférieur à deux fois la hauteur h du canal. Par suite, la microgoutte 14 reste essentiellement confinée dans le canal et ne présente qu'une petite calotte hémisphérique dans le piège 12.
Enfin, dans le cas de la figure 12, le piège 12 est conique et a un diamètre d supérieur à deux fois la hauteur h du canal. La microgoutte 14 épouse alors la forme de la paroi du piège 12 pour former une calotte hémisphérique dans le piège 12.
Par ailleurs, comme illustré sur la figure 13, si la microgoutte 14 piégée dans un piège 12 a un fond plat, les cellules 16 sédimentent et se déposent de manière statistiquement uniforme au fond de la microgoutte 14. Les cellules peuvent alors être observées individuellement, et ne s'agrègent pas. Au contraire, si la microgoutte 14 piégée dans un piège 12 a un fond non plat, notamment convexe, comme illustré sur les figures 14 et 15, alors les cellules 16 rencontrent l'interface de la microgoutte 12 lors de leur sédimentation, et se retrouvent obligées de glisser le long de cette interface. Les cellules 16 se concentrent ainsi au fond de la microgoutte 14, et peuvent éventuellement s'agréger et former des sphéroïdes dans le cas de certaines cellules dépendantes de l'ancrage.
Le procédé microfluidique proposé ici comprend, après le piégeage des microgouttes, une étape de gélifïcation de ces microgouttes.
Cette étape peut être réalisée de manières variées, en fonction notamment de l'agent gélifiant de l'hydrogel utilisé. Ainsi, selon un premier exemple, l'hydrogel contient, de préférence est de l'agarose. La gélifïcation des microgouttes est alors réalisée en refroidissant la puce microfluidique. Lorsque l'hydrogel contient ou, de préférence, est de l'alginate, il est possible d'amener des ions calcium Ca2+ dans l'huile dans laquelle baignent les microgouttes, ou bien de pré-mélanger des particules calcaires avec l'alginate et de saturer en C02 l'huile dans laquelle baignent les microgouttes. On acidifie ainsi l'alginate et on libère des ions calcium. Bien entendu, d'autres agents gélifiants pouvant être utilisés, d'autres moyens de gélifïcation peuvent être mis en œuvre.
Par ailleurs, en fonction de l'application recherchée, cette étape de gélifïcation peut être mise en œuvre à des instants différents du procédé de manipulation. En particulier, la gélifïcation peut se faire immédiatement après le piégeage de façon à figer les cellules sur place, dans la microgoutte, et ne pas leur permettre de sédimenter. On peut alors observer les cellules indépendamment les unes des autres. Alternativement, la gélifïcation est réalisée après la sédimentation des cellules pour former des sphéroïdes. Ceci permet d'observer le comportement des cellules ayant formé un sphéroïde. Selon une autre alternative, la gélifïcation des microgouttes n'est mise en œuvre qu'après des manipulations des cellules en milieu liquide, par exemple pour extraire certaines cellules - celles dans des microgouttes non gélifiées - de façon sélective. Ceci peut être utile pour des cellules comme des bactéries ou des érythrocytes et leucocytes, qui sont indépendantes de l'ancrage.
Après gélifïcation, il est possible de remplacer l'huile dans laquelle baignent les microgouttes par une solution aqueuse contenant notamment une solution biochimique comportant des composants biochimiques tels que des nutriments, des facteurs de croissance, des anticorps, des drogues ou des molécules de médicament, par exemples. Ces composants biochimiques diffusent dans le gel et atteignent les cellules. Il est ainsi possible d'étudier la réaction des cellules, indépendantes ou sous forme de sphéroïdes, à ces stimuli. L'hydrogel permet ainsi de maintenir les cellules dans un emplacement précis, tout en permettant leur perfusion par une phase aqueuse et en ayant préalablement compartimenté l'échantillon biologique lors de Pencapsulation des cellules dans des microgouttes.
Pour réaliser cette opération avec succès, il est préférable de chasser le surfactant des interfaces des microgouttes. La coque que forment les surfactants au niveau de l'interface des microgouttes peut en effet être si efficace qu'elle empêche la phase aqueuse, que l'on injecte pour remplacer l'huile, de remplir la puce micro fluidique, en conservant les microgouttes gélifiées dans leurs pièges respectifs. Comme la coalescence est combattue par la présence de surfactant, l'arrivée de l'interface de la phase aqueuse au niveau d'un piège résulte en une force appliquée sur la microgoutte gélifiée qui peut être chassée du piège si l'hydrogel qui la compose est suffisamment compressible. C'est pourquoi il est préférable de favoriser la coalescence en diminuant la concentration de surfactant au niveau de l'interface. Pour ce faire, la puce micro fluidique est perfusée avant injection de la phase aqueuse par de l'huile qui, à la différence de l'huile utilisée précédemment, ne contient pas de surfactant. La concentration de surfactant dans l'huile de la puce micro fluidique diminue, ce qui permet de déplacer l'équilibre d'adsorption de surfactant à l'interface vers la désorption. Pour des concentrations élevées de surfactant, par exemple de l'ordre de quelques pourcents en masse, il est préférable de perfuser la puce microfluidique avec une quantité d'huile équivalente à 50 fois le volume de la puce micro fluidique. Ce ratio dépend de la nature du ou des surfactants et de son/leur affinité pour les deux phases.
La forme des pièges peut également être optimisée pour assurer le maintien en position des microgouttes gélifiées dans les pièges. Ainsi, dans le cas d'un piège cylindrique suffisamment profond, si la hauteur du canal est plus grande que le rayon du piège, l'entrée de la microgoutte dans le piège va être minime, résultant en une faible efficacité de piégeage. Par suite, il existe une vitesse limite du flux extérieur au-delà de laquelle les microgouttes sont chassées des pièges. À l'inverse, quand la hauteur du canal est plus petite que le rayon du piège, la microgoutte, à condition qu'elle soit suffisamment grande, pénètre fortement dans la cavité du piège, résultant en une forte efficacité de piégeage. Les microgouttes restent en place indépendamment de la vitesse du flux extérieur. Dans le premier cas, la forme de la microgoutte est très proche de sa forme dans le canal alors que dans le deuxième cas, elle adopte localement la forme du piège. Lorsque l'agent gélifiant de l'hydrogel choisi est réversible, il est possible de dégélifïer les microgouttes puis d'évacuer leur contenu hors de la puce micro fluidique, comme illustré aux figures 4 à 6. Dans le cas de ces figures 4 à 6, les microgouttes 14 sont des microgouttes d'agarose gélifiées, par exemple. Ces microgouttes 14 d'agarose sont dégélifiées une par une en les chauffant localement (le chauffage étant illustré par les éclairs 21), notamment à l'aide d'un laser infra-rouge ou d'électrodes. La chaleur liquéfie l'agarose. Lorsque la phase entourant les microgouttes 14 est aqueuse, le contenu 16 de l'agarose dégélifïé se mélange avec la phase aqueuse. Il est alors possible d'entraîner ce contenu par le flux 22 de la phase aqueuse, éventuellement pour le récupérer. Il est également possible d'éliminer ainsi les cellules jugées non intéressantes de la puce microfluidique 10. De nouveau, la forme et la taille du piège sont de préférence choisies pour permettre l'extraction des cellules. Par exemple, dans le cas où les cellules doivent rester viables, le piège est dimensionné suffisamment grand pour que le chauffage de l'hydrogel n'induise pas les mécanismes de mort cellulaire n'induise pas les mécanismes de mort cellulaire.
Alternativement, lorsque la phase entourant les microgouttes est huileuse, un flux d'huile peut être imposé pour déloger la microgoutte liquide du piège. Dans ce cas, la forme et la force du piège sont de préférence dimensionnées de façon à permettre l'extraction de la microgoutte choisie uniquement, et non pas des autres. Ce dimensionnement dépend notamment de la valeur de la tension de surface entre la phase aqueuse et l'huile, ainsi que de la rigidité des microgouttes de gel et leur forme à l'intérieur du piège.
Une autre alternative est de maintenir les microgouttes liquides pour la manipulation de cellules en suspension, par exemple des bactéries. La gélifïcation est alors mise en œuvre uniquement pour l'extraction sélective des microgouttes. Dans ce cas, on peut soit gélifier toutes les microgouttes avant extraction et appliquer le protocole décrit ci- avant, soit au contraire gélifier uniquement les microgouttes qu'on souhaite conserver dans les pièges.
Le procédé présenté permet grâce à de légères modifications de s'intéresser à des applications biologiques très variées. Dans chaque cas, le dispositif peut bien sûr aussi être modifié en ajustant la hauteur du canal dans la puce microfluidique et la géométrie des pièges. Ainsi, par exemple, une gélifîcation rapide avec une faible concentration de cellules permet d'individualiser quelques cellules uniques dans chaque microgoutte en essayant de limiter leurs interactions directes. Ces cellules peuvent par exemple être des bactéries, des levures ou des cellules de mammifères.
Alternativement, une forte concentration en cellules avec toujours une gélifîcation rapide, permet d'obtenir un grand nombre de cellules toujours individualisées mais proches les unes des autres. On peut alors s'intéresser par exemple aux interactions entre cellules, possiblement en co-culture, via des sécrétions paracrines.
Les cellules peuvent cependant être maintenues encapsulées longtemps en phase liquide avant gélifîcation. Une faible concentration en cellules permet alors, par exemple, d'étudier des cellules en suspension, indépendantes de l'ancrage, comme les lymphocytes. Une forte concentration en cellules et une forme des microgouttes piégées permettant la sédimentation des cellules, permet de mettre en contact les cellules qui vont pouvoir se réorganiser en sphéroïdes.
Le procédé peut également permettre de former des sphéroïdes directement dans la puce de manière contrôlée. Le volume des microgouttes créées peut être contrôlé par le dispositif de formation de microgouttes en amont de la puce microfluidique. Ce volume est de préférence réglé de manière que les microgouttes, une fois piégées, aient un diamètre égal à celui du piège et une forme sphérique. Pour ce faire, la profondeur du piège est de préférence au moins égale à son diamètre. Le fait que le diamètre de la microgoutte piégée coïncide avec celui du piège, permet d'assurer une efficacité de piégeage importante. La forme sphérique favorise la formation de sphéroïdes. Pour cette application particulière, les microgouttes contiennent de préférence des cellules en suspension dans une phase aqueuse comprenant ou constituée de milieu de culture et d'hydrogel. Une fois les pièges remplis par une telle microgoutte, le flux d'huile extérieur est arrêté, ce qui stoppe les recirculations au sein des microgouttes et favorise la sédimentation des cellules. La forme sphérique des microgouttes dans les pièges induit alors une concentration des cellules en leur points le plus bas, jusqu'à ce qu'elles entrent en contact. Garder alors la puce au repos, dans des conditions favorables à la survie et au bon fonctionnement métabolique des cellules, notamment en température, pendant une durée allant de plusieurs heures à plusieurs jours, permet la réorganisation des cellules concentrées au fond de la microgoutte piégée, en sphéroïde. La durée nécessaire à la formation de sphéroïdes peut notamment dépendre du type cellulaire utilisé et de la composition de l'hydrogel. Pour des cellules hépatiques de rat H4IIEC3 dans une solution d'agarose à 1% en masse dilué dans du milieu de culture, il a été constaté que cette durée est inférieure à 24 heures. Bien entendu, l'hydrogel est maintenu liquide pendant le temps de formation des sphéroïdes.
Ce procédé permet de former rapidement un grand nombre de sphéroïdes de tailles très homogènes. En effet, la taille des sphéroïdes est donnée par le nombre de cellules encapsulées dans chaque microgoutte et donc par la concentration de la solution de cellules injectée dans la puce micro fluidique. La distribution du nombre de cellules par microgoutte, et donc celle de la taille des sphéroïdes formés, est très homogène à condition que les cellules soient suffisamment individualisées au moment de l'injection. En moyenne, dans les expériences menées par les inventeurs, 98% des pièges ont été remplis avec une microgoutte d'agarose liquide qui après 24 heures d'incubation contenait un sphéroïde bien réorganisé.
Les sphéroïdes obtenus dans la puce micro fluidique peuvent être gardés en culture plusieurs jours. Par exemple, des sphéroïdes de cellules H4IIEC3 encapsulés dans l'agarose peuvent être mis en culture dans la puce pendant une semaine sans altération significative de leur viabilité tout en conservant une fonctionnalité forte (dans cet exemple une sécrétion d'albumine forte et continue).
Le procédé présenté ici et la puce microfluidique obtenue en le mettant en œuvre, constituent un excellent outil de criblage de médicaments. On peut par exemple créer des sphéroïdes de cellules cancéreuses et observer si leur viabilité décroit au cours du temps en fonction de l'exposition à une molécule testée. En ajoutant à la puce un dispositif qui permet d'instaurer un gradient de concentration au sein de la chambre, ou bien en mettant en place des puces parallèles, on peut tester tout une gamme de concentrations dans un même système. La grande efficacité du procédé de formation de ces sphéroïdes permet aussi d'en créer un grand nombre à partir d'échantillons très limités. 500 sphéroïdes d'environ 70 μιη de diamètre peuvent ainsi être formés avec seulement 100 000 cellules.
Les cellules qui composent les sphéroïdes peuvent aussi être de différents types pour aborder des thématiques de co-culture. Ces types cellulaires peuvent être mélangés de manière homogène en solution avant l'injection dans la puce ou être agencés selon une certaine organisation structurelle, dans plusieurs couches d'hydrogels successives ou simplement par adhésion à l'hydrogel après avoir été perfusées dans la phase aqueuse externe. On peut par exemple associer des fîbroblastes et des cellules épithéliales pour former un modèle de peau et tester la toxicité de produits cosmétiques, des neurones et des astrocytes pour modéliser le cerveau, ou encore des cellules endothéliales et des cellules musculaires lisses comme dans la paroi des vaisseau sanguins.
Comme le procédé présenté ici permet d'atteindre un contrôle très poussé du microenvironnement des cellules en culture, il est aussi un excellent outil pour l'étude de la différenciation de cellules souches. Les cellules encapsulées peuvent en effet être soumises à toute une gamme de concentration de facteurs de différenciation et, potentiellement en même temps, à toute une gamme de rigidité de la matrice en jouant par exemple sur la concentration de l'hydrogel. De la même manière, le procédé peut être utilisé pour observer le développement embryonnaire au cours du temps en interaction avec les facteurs physicochimiques du milieu extérieur.
Dans le cas de cellules primaires, issues d'un patient, ce procédé permet de faire un diagnostic médical basé sur la réponse des cellules à certains marqueurs. Dans ce cas, les cellules sont capturées avec un très faible taux de pertes. On peut alors soumettre les cellules à des tests connus de diagnostic de certaines maladies, comme une caractérisation d'une biopsie cancéreuse. Par exemple, on peut tester la présence d'une mutation dans le génome des cellules encapsulée, par exemple par réactions en chaîne par polymérase (PCR, pour l'anglais « Polymérase Chain Reaction ») in situ, ou par la méthode FISH. On peut encore détecter l'expression de protéines spécifiques par des méthodes de marquages, par exemple en apportant des anticorps pour l'immuno -marquage ou pour une méthode immuno- enzymatique ELIS A (de l'anglais « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ») in situ.
Le procédé décrit ci-avant offre la possibilité d'effectuer toutes les étapes d'analyse et de culture de cellules dans une puce micro fluidique, grâce à la gélifïcation des microgouttes suite à leur piégeage dans la puce. Ceci permet d'utiliser des volumes de réactifs beaucoup moins importants que pour des tests réalisés en plaques multi-puits ou en boîtes de cultures. Ceci permet également de suivre les réponses de cellules au cours du temps, suite à différents stimuli.
Le procédé décrit ci-avant peut être mis en œuvre facilement dans un dispositif comprenant :
des moyens pour former des microgouttes d'hydrogel contenant des cellules, - une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes d'hydrogel à des endroits prédéterminés, et
des moyens de gélifïcation d'une partie au moins des microgouttes piégées. Les moyens de gélifïcation comprennent par exemple un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage et/ou des moyens de régulation de la température, par exemple pour refroidir la puce microfluidique.
Le dispositif peut également comprendre des moyens de dégélifïer au moins certaines des microgouttes d'hydrogel gélifiées, par exemple un laser.
Le procédé décrit ci-avant permet également de réaliser un produit de microgouttes gélifiées, comprenant une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce microfluidique, et des microgouttes gélifiées incluant chacune une ou des cellules, piégées dans la zone de piégeage, les microgouttes gélifiées étant de préférence cryo- préservées. Les cellules peuvent être agrégées sous forme d'amas ou de sphéroïdes. Les microgouttes gélifiées peuvent baigner dans un fluide, de préférence dans une solution aqueuse ou dans une huile, le fluide et les microgouttes étant de préférence cryo-préservés. Cette cryo-préservation permet notamment le maintien des cellules dans des conditions stables durant une longue période, en vue de les transporter ou de les stocker pour une analyse ultérieure.
Les cellules biologiques encapsulées dans les microgouttes peuvent être des bactéries, des levures, des cellules eucaryotes, des cellules de mammifères, de préférence des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, de préférence encore des cellules de rat ou d'autres mammifères, ou des cellules humaines isolées de leur environnement naturel.
Bien entendu, l'invention ne se limite pas aux seuls exemples décrits ci-avant mais est, au contraire, susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art, dans le cadre du jeu de revendications ci-joint.
En particulier, les échantillons mis en œuvre, outre des cellules, peuvent notamment être également des molécules, des billes de plastiques fonctionnalisées en les couplant à des molécules.
Par ailleurs, les microgouttes piégées peuvent être fusionnées avec d'autres microgouttes apportées par le flux de solution aqueuse. Également, la solution aqueuse dont sont constituées les microgouttes, peut contenir une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi des lipides (acides gras, etc.), des glucides (sous forme monomérique ou de polysaccharides etc.), des acides aminés et protéines (facteurs de croissances, cytokines, anticorps, antigènes etc.), ainsi que des tampons de salinité et/ou de pH.
Enfin, selon une variante, l'huile (ou phase huileuse) entourant les microgouttes peut contenir des huiles fluorées (type FC40) ou encore des solutions photo-réticulables non miscibles à l'eau (type Norland Optical Adhesive), qui, une fois polymérisées permettent de gélifier l'huile et d'ainsi isoler physiquement et sélectivement les microgouttes. On peut ainsi cloisonner, isoler de manière plus robuste, les microgouttes les unes par rapport aux autres. Ceci permet d'éviter que deux microgouttes ne fusionnent, provoquant un mélange des échantillons qu'elles contiennent. Ceci permet également de stocker de manière durable les échantillons, les risques d'évaporation, notamment, des microgouttes étant fortement diminués du fait du cloisonnement des microgouttes par l'huile gélifiée, qui forme un compartiment solide autour des microgouttes.
Une fois qu'une partie de l'huile a été gélifiée, on peut pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée. Pour ce faire, on peut mettre en œuvre un flux d'huile ou d'un autre fluide dans la zone de piégeage, le flux étant suffisamment fort pour entraîner les microgouttes. On peut ainsi ne garder dans la zone de piégeage que les microgouttes autour desquelles l'huile a été gélifiée.
Il est à noter ici que des microgouttes peuvent être gélifiées même dans le cas où l'huile est gélifiée. En outre, le procédé peut bien entendu comporter dans ce cas où une partie de l'huile est gélifiée, une étape postérieure de dégélification de l'huile gélifiée.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de manipulation dans un système micro fluidique de microgouttes (14) incluant des échantillons (16), comprenant les étapes consistant à :
i) former dans une huile des microgouttes (14) d'une solution aqueuse contenant un échantillon (16), au moins l'un parmi l'huile et la solution aqueuse contenant un échantillon (16) comprenant un agent gélifiant,
ii) piéger les microgouttes (14) au moyen de pièges de tension de surface (12) prédisposés dans une zone de piégeage (10), et
iii) gélifier au moins l'un parmi au moins une partie de l'huile dans la zone de piégeage et au moins une partie des microgouttes (14) piégées.
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie de l'huile dans la zone de piégeage.
3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape iii) consiste à gélifier au moins une partie des microgouttes.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel l'échantillon (16) est l'un parmi une ou des cellules, notamment un sphéroïde de cellules, un ou plusieurs billes piégeant des molécules, les billes étant notamment en matière plastique, une ou des molécules.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape iii) est réalisée après sédimentation des échantillons (16), notamment des cellules, dans les microgouttes (14) piégées, en particulier après formation de sphéroïdes.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel l'étape iii) est réalisée avant sédimentation des échantillons (16) dans les microgouttes (14) piégées.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes en combinaison avec la revendication 3, comprenant en outre l'étape consistant à : iv) remplacer l'huile entourant les microgouttes (14) gélifiées par une solution aqueuse.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel la solution aqueuse remplaçant l'huile contient une solution biochimique, la solution biochimique comportant de préférence au moins l'un parmi un ou des tampons de pH ou de salinité, un ou des nutriments, un ou des facteurs de croissance, des cytokines, un ou des anticorps, un ou des antigènes, une ou des molécules, notamment de médicament, une ou des cellules, des lipides, des glucides, notamment sous forme monomérique ou de polysaccharides, des acides aminés et/ou des protéines.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la zone de piégeage est formée par une puce micro fluidique (10) comprenant les pièges de tension de surface (12).
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape i) consiste à :
a) injecter dans une zone, en amont de la zone de piégeage (10), une solution aqueuse contenant des échantillons (16) et un agent gélifiant, le cas échéant, b) injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone en amont de la zone de piégeage pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons (16) vers une sortie de la zone de piégeage (10), l'injection d'huile étant réalisée de manière à former des micro gouttes (14) contenant des échantillons (16), puis
c) déplacer les microgouttes (14) jusqu'au niveau de la zone de piégeage (10) et piéger les microgouttes (14) dans la zone de piégeage (10).
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans lequel les étapes i) et ii) sont réalisées simultanément dans la zone de piégeage (10), en réalisant les actions consistant à :
- remplir la zone de piégeage (10) de solution aqueuse contenant des échantillons (16) et un agent gélifiant, le cas échéant, puis à injecter de l'huile, contenant un agent gélifiant, le cas échéant, dans la zone de piégeage (10) pour pousser la solution aqueuse contenant des échantillons (16) vers une sortie de la zone de piégeage (10), les pièges de tension de surface (12) étant conformés pour permettre la cassure des microgouttes (14) contenant des échantillons (16) au niveau des pièges de tension de surface
(12).
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape iii) consiste en au moins l'un parmi :
- refroidir ou chauffer des microgouttes (14) et/ou l'huile,
injecter une solution contenant un agent chimique de gélification dans la zone de piégeage,
soumettre les microgouttes (14) et/ou l'huile à une lumière provoquant la gélification, notamment une lumière UV.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'huile contient un agent surfactant, le procédé comprenant de préférence une étape de lavage de l'agent surfactant avant l'étape iv).
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape, préalable à l'étape i), de choix de la forme des pièges de tension de surface (12) en fonction de la forme désirée des microgouttes (14).
15. Procédé selon la revendication 14, dans lequel la zone de piégeage et les pièges sont choisis pour :
former des microgouttes (14) piégées avec un fond plat, ou former des microgouttes (14) piégées avec un fond non-plat, notamment incurvé, de préférence convexe.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes en combinaison avec la revendication 1 ou 3, comprenant une étape v) postérieure à l'étape iii), et de préférence postérieure à l'étape iv), consistant à dégélifïer au moins certaines des microgouttes (14) gélifiées à l'étape iii).
17. Procédé selon la revendication 16, comprenant une étape vi), postérieure à l'étape v), consistant à évacuer les microgouttes (14) dégélifïées et/ou les échantillons (16) contenus dans ces microgouttes (14) dégélifiées hors de la zone de piégeage (10).
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant une étape d'application d'un stimulus aux échantillons (16) contenus dans au moins une partie des microgouttes (14) piégées, gélifiées ou non.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes en combinaison avec la revendication 1 ou 2, comprenant une étape postérieure à l'étape iii) consistant à pousser hors de la zone de piégeage les microgouttes autour desquelles l'huile n'a pas été gélifiée.
20. Dispositif pour mettre en œuvre un procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant :
des moyens pour former des microgouttes (14) contenant des échantillons (16),
- une zone de piégeage, notamment une puce microfluidique, pour piéger les microgouttes (14) à des endroits prédéterminés, et
des moyens de gélifïcation d'une partie au moins des microgouttes (14) piégées et/ou de l'huile.
21. Dispositif selon la revendication 20, dans lequel les moyens de gélifïcation comprennent un dispositif d'injection d'un agent chimique dans la zone de piégeage (10).
22. Dispositif selon la revendication 21, comprenant en outre des moyens de dégélifïer au moins certaines des microgouttes (14) d'hydrogel gélifiées et/ou d'une partie de l'huile gélifiée.
23. Produit de microgouttes gélifiées, comprenant une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce micro fiuidique (10), et des microgouttes (14) gélifiées incluant chacune un échantillon (16), piégées dans la zone de piégeage (10), les microgouttes (14) gélifiées étant de préférence cryo-préservées.
24. Produit selon la revendication 23, dans lequel les microgouttes gélifiées baignent dans un fluide, de préférence dans une solution aqueuse ou dans une huile, le fluide et les microgouttes (14) étant de préférence cryo-préservées.
25. Produit de microgouttes, comprenant une zone de piégeage de microgouttes, en particulier une puce micro fiuidique (10), et des microgouttes (14) incluant chacune un échantillon (16), piégées dans la zone de piégeage (10), les microgouttes (14) baignant dans une huile gélifiée, les microgouttes (14) et l'huile gélifiée étant de préférence cry- préservées.
26. Produit selon l'une des revendication 23 à 25, dans lequel les échantillons (16) sont des cellules de mammifères, de préférence des cellules de mammifères à l'exclusion de cellules humaines, des bactéries, des levures ou d'autres cellules utilisées dans des bioprocédés, des molécules, des billes piégeant des molécules en surface.
EP14796828.3A 2014-10-17 2014-10-17 Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons Active EP3206791B1 (fr)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/FR2014/052655 WO2016059302A1 (fr) 2014-10-17 2014-10-17 Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EP3206791A1 true EP3206791A1 (fr) 2017-08-23
EP3206791B1 EP3206791B1 (fr) 2020-12-09

Family

ID=51897384

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP14796828.3A Active EP3206791B1 (fr) 2014-10-17 2014-10-17 Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons

Country Status (6)

Country Link
US (1) US10710077B2 (fr)
EP (1) EP3206791B1 (fr)
JP (1) JP2017537772A (fr)
CN (1) CN107109319B (fr)
ES (1) ES2856733T3 (fr)
WO (1) WO2016059302A1 (fr)

Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3206791B1 (fr) * 2014-10-17 2020-12-09 Ecole Polytechnique Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons
KR102334118B1 (ko) * 2015-04-22 2021-12-01 버클리 라잇츠, 인크. 마이크로유체 디바이스 상에서의 세포들의 동결 및 보관
US11352661B2 (en) 2016-07-12 2022-06-07 Northeastern University Single cell fluorescence in situ hybridization in microfluidic droplets
FR3056927B1 (fr) * 2016-09-30 2021-07-09 Ecole Polytech Procede microfluidique de manipulation de microgouttes
US11131673B2 (en) 2017-04-27 2021-09-28 Northeastern University Live single-cell bioassay in microdroplets
CN110997900B (zh) * 2017-07-14 2024-06-14 多伦多大学管理委员会 用于快速产生用于化合物筛选的类器官/球状体的微流体平台
JP2019062832A (ja) * 2017-10-02 2019-04-25 国立大学法人京都大学 スフェロイドを製造するためのデバイス、スフェロイドの製造及び回収方法
CA3092482A1 (fr) * 2018-03-02 2019-09-06 Quantumcyte, Inc. Procedes, compositions et dispositifs pour isoler et analyser l'expression de regions d'interet a partir d'un tissu
DE102018204624A1 (de) * 2018-03-27 2019-10-02 Robert Bosch Gmbh Verfahren und mikrofluidische Vorrichtung zur Aliquotierung einer Probenflüssigkeit unter Verwendung einer Versiegelungsflüssigkeit, Verfahren zum Herstellen einer mikrofluidischen Vorrichtung und mikrofluidisches System
WO2020094827A1 (fr) 2018-11-09 2020-05-14 Eth Zurich Concentrateur de gouttelettes microfluidiques
EP3921081A4 (fr) 2019-02-04 2022-11-30 Illumina Inc Générateurs de gouttelettes microfluidiques
FR3098128B1 (fr) * 2019-07-05 2023-11-17 Commissariat Energie Atomique Dispositif microfluidique comportant une microgoutte présentant une matrice sol-gel.
CN110982882B (zh) * 2019-12-20 2023-06-20 南通大学 用于单细胞固定-隔离并原位核酸扩增的微流控芯片及其应用
CN111019805B (zh) * 2019-12-20 2023-01-24 南通大学 用于单细胞固定并原位进行医学分析的微流控芯片装置及其应用
CN112774748B (zh) * 2021-01-22 2023-02-17 中国科学院上海微系统与信息技术研究所 一种微坑锚定液滴阵列芯片及液滴生成方法和应用
CN115138402A (zh) * 2021-03-31 2022-10-04 中国科学院深圳先进技术研究院 一种能够设置化学浓度梯度的微流控芯片及其制备方法和应用
US20240318134A1 (en) * 2021-07-22 2024-09-26 Institut Pasteur In vitro generation of organized 3d cell structures including head-trunk embryo-like structures, using epigenetic remodeling factors-microfluidic platform suitable for their generation
EP4219685A1 (fr) * 2022-01-31 2023-08-02 Institut Pasteur Production in vitro de structures cellulaires 3d organisées comprenant des structures embryonnaires tête-tronc, utilisant des facteurs de remodelage épigénétique - plateforme microfluidique appropriée pour leur production
CN113617403A (zh) * 2021-08-05 2021-11-09 上海交通大学 一种新型单细胞western blot的微流控芯片

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2290731A1 (fr) * 1999-11-26 2001-05-26 D. Jed Harrison Appareil et methode de piegeage de reactifs en forme de perles, dans le cadre d'un systeme d'analyse de microfluides
US6432290B1 (en) * 1999-11-26 2002-08-13 The Governors Of The University Of Alberta Apparatus and method for trapping bead based reagents within microfluidic analysis systems
US20030049320A1 (en) * 2000-12-18 2003-03-13 Wockhardt Limited Novel in-situ forming controlled release microcarrier delivery system
JP2007075094A (ja) 2005-09-15 2007-03-29 Minoru Seki 流路内ゲル作製のための構造および方法
US20140193807A1 (en) * 2006-04-18 2014-07-10 Advanced Liquid Logic, Inc. Bead manipulation techniques
US8637317B2 (en) * 2006-04-18 2014-01-28 Advanced Liquid Logic, Inc. Method of washing beads
JP4911592B2 (ja) * 2006-11-01 2012-04-04 財団法人生産技術研究奨励会 エマルジョンの製造方法及びその製造装置
JP2008245612A (ja) * 2007-03-30 2008-10-16 Hitachi Ltd 試料調製法および装置
US20100233693A1 (en) * 2007-04-16 2010-09-16 On-O-ity, Inc Methods for diagnosing, prognosing, or theranosing a condition using rare cells
US9409177B2 (en) * 2008-03-21 2016-08-09 Lawrence Livermore National Security, Llc Chip-based device for parallel sorting, amplification, detection, and identification of nucleic acid subsequences
WO2010080978A2 (fr) * 2009-01-08 2010-07-15 The General Hospital Corporation Appauvrissement préalable en leucocytes dans des échantillons de sang total avant capture des constituants du sang total
FR2958186A1 (fr) 2010-03-30 2011-10-07 Ecole Polytech Dispositif de formation de gouttes dans un circuit microfluide.
WO2012016136A2 (fr) * 2010-07-30 2012-02-02 The General Hospital Corporation Structures à l'échelle microscopique et nanoscopique pour la manipulation des particules
JP5700419B2 (ja) * 2011-02-21 2015-04-15 国立大学法人 千葉大学 ハイドロゲル基材の作製方法および細胞集塊の形成方法
CN103084225B (zh) * 2011-10-27 2015-02-04 中国科学院大连化学物理研究所 一种高通量微凝胶固定方法及其专用微流控芯片
PL398979A1 (pl) * 2012-04-25 2013-10-28 Scope Fluidics Spólka Z Ograniczona Odpowiedzialnoscia Urzadzenie mikroprzeplywowe i uklad mikroprzeplywowy obejmujacy jedno lub wiecej urzadzen mikroprzeplywowych
CA2881783A1 (fr) * 2012-08-13 2014-02-20 The Regents Of The University Of California Procedes et systemes de detection de composants biologiques
US20180250686A2 (en) * 2013-08-30 2018-09-06 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Apparatus and method for manipulation of discrete polarizable objects and phases
EP3160654A4 (fr) * 2014-06-27 2017-11-15 The Regents of The University of California Tri activé par pcr (pas)
EP3206791B1 (fr) * 2014-10-17 2020-12-09 Ecole Polytechnique Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons

Also Published As

Publication number Publication date
EP3206791B1 (fr) 2020-12-09
ES2856733T3 (es) 2021-09-28
JP2017537772A (ja) 2017-12-21
US20170252744A1 (en) 2017-09-07
CN107109319B (zh) 2020-11-27
WO2016059302A1 (fr) 2016-04-21
US10710077B2 (en) 2020-07-14
CN107109319A (zh) 2017-08-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3206791B1 (fr) Procédé de manipulation de microgouttes incluant des échantillons
Teixeira et al. Emerging biotechnology applications of aqueous two‐phase systems
Leoni et al. Nanoporous biocapsules for the encapsulation of insulinoma cells: biotransport and biocompatibility considerations
Song et al. All-aqueous electrosprayed emulsion for templated fabrication of cytocompatible microcapsules
EP2119503B1 (fr) Système microfluidique et procédé pour le tri d'amas de cellules et pour leur encapsulation en continu suite à leur tri
WO2018060471A1 (fr) Procede microfluidique de manipulation de microgouttes
US20190212332A1 (en) MlCRO-SCREENING AND SORTING APPARATUS, PROCESS, AND PRODUCTS
FI131135B1 (en) MICROFLUIDIC CELL CULTURE DEVICE AND METHOD FOR CELL CULTURE
US20190282510A1 (en) Method of encapsulating cells using a microfluidic encapsulation device
FR3027678A1 (fr) Procede de detection d'organismes dans un echantillon dilue
Steinacher et al. Monodisperse selectively permeable hydrogel capsules made from single emulsion drops
Thiele Polymer Material Design by Microfluidics Inspired by Cell Biology and Cell‐Free Biotechnology
Nuss et al. Microfluidic trap-and-release system for lab-on-a-chip-based studies on giant vesicles
JP7135049B2 (ja) サンプルを含むマイクロ液滴を取り扱うための方法
EP3712244B1 (fr) Procédé d'enrichissement en gaz et simultanément de déplacement d'un fluide et système pour le contrôle de l'environnement cellulaire sur une plaque de culture cellulaire multipuits correspondant
TWI588256B (zh) 單細胞擷取與培養之裝置與方法
US20230257732A1 (en) Degradable hollow shell particles for high-throughput screening and sorting of cells
Ivanov et al. Polymeric Microreactors with pH-Controlled Spatial Localization of Cascade Reactions
JP6238208B2 (ja) 細胞展開用マイクロチャンバーチップ
US9926551B2 (en) Encapsulating device and encapsulating method for encapsulating a sample in a polymer capsule
KR102360763B1 (ko) 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드 제조용 미세유체소자 및 이를 이용한 세포가 캡슐화된 알지네이트 비드의 제조방법
EP4440735A1 (fr) Microcapsule et procédés de fabrication et d'utilisation de celle-ci
Deveney Methods and Materials to Generate Antibody Repertoire Libraries
FR3088719A1 (fr) Procede de preparation d'un echantillon a analyser obtenu a partir de matrice alimentaire
Takeuchi Microfluidics for Biofabrication

Legal Events

Date Code Title Description
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE INTERNATIONAL PUBLICATION HAS BEEN MADE

PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: REQUEST FOR EXAMINATION WAS MADE

17P Request for examination filed

Effective date: 20170517

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

AX Request for extension of the european patent

Extension state: BA ME

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
RIN1 Information on inventor provided before grant (corrected)

Inventor name: SART, SEBASTIEN

Inventor name: TOMASI, RAPHAEL

Inventor name: AMSELEM, GABRIEL

Inventor name: BAROUD, CHARLES

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: EXAMINATION IS IN PROGRESS

17Q First examination report despatched

Effective date: 20180731

GRAJ Information related to disapproval of communication of intention to grant by the applicant or resumption of examination proceedings by the epo deleted

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSDIGR1

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

GRAP Despatch of communication of intention to grant a patent

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR1

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: GRANT OF PATENT IS INTENDED

INTG Intention to grant announced

Effective date: 20200518

GRAS Grant fee paid

Free format text: ORIGINAL CODE: EPIDOSNIGR3

GRAA (expected) grant

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009210

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE PATENT HAS BEEN GRANTED

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: B1

Designated state(s): AL AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MK MT NL NO PL PT RO RS SE SI SK SM TR

REG Reference to a national code

Ref country code: GB

Ref legal event code: FG4D

Free format text: NOT ENGLISH

REG Reference to a national code

Ref country code: AT

Ref legal event code: REF

Ref document number: 1342847

Country of ref document: AT

Kind code of ref document: T

Effective date: 20201215

Ref country code: CH

Ref legal event code: EP

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R096

Ref document number: 602014073219

Country of ref document: DE

REG Reference to a national code

Ref country code: IE

Ref legal event code: FG4D

Free format text: LANGUAGE OF EP DOCUMENT: FRENCH

REG Reference to a national code

Ref country code: NL

Ref legal event code: FP

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20210310

Ref country code: NO

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20210309

Ref country code: FI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: RS

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LV

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: SE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: BG

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20210309

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: HR

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

REG Reference to a national code

Ref country code: LT

Ref legal event code: MG9D

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: PT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20210409

Ref country code: RO

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: SK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: SM

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: CZ

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: EE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: PL

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

REG Reference to a national code

Ref country code: DE

Ref legal event code: R097

Ref document number: 602014073219

Country of ref document: DE

REG Reference to a national code

Ref country code: AT

Ref legal event code: UEP

Ref document number: 1342847

Country of ref document: AT

Kind code of ref document: T

Effective date: 20201209

REG Reference to a national code

Ref country code: ES

Ref legal event code: FG2A

Ref document number: 2856733

Country of ref document: ES

Kind code of ref document: T3

Effective date: 20210928

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IS

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20210409

PLBE No opposition filed within time limit

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009261

STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: NO OPPOSITION FILED WITHIN TIME LIMIT

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: AL

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

26N No opposition filed

Effective date: 20210910

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: DK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

Ref country code: SI

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IS

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20210409

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: MC

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: LU

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20211017

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IE

Free format text: LAPSE BECAUSE OF NON-PAYMENT OF DUE FEES

Effective date: 20211017

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: HU

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT; INVALID AB INITIO

Effective date: 20141017

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: CY

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: NL

Payment date: 20231019

Year of fee payment: 10

Ref country code: FR

Payment date: 20230927

Year of fee payment: 10

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: GB

Payment date: 20231020

Year of fee payment: 10

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: ES

Payment date: 20231227

Year of fee payment: 10

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: IT

Payment date: 20231026

Year of fee payment: 10

Ref country code: DE

Payment date: 20231020

Year of fee payment: 10

Ref country code: CH

Payment date: 20231102

Year of fee payment: 10

Ref country code: AT

Payment date: 20231020

Year of fee payment: 10

PGFP Annual fee paid to national office [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: BE

Payment date: 20231019

Year of fee payment: 10

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: MK

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209

PG25 Lapsed in a contracting state [announced via postgrant information from national office to epo]

Ref country code: MT

Free format text: LAPSE BECAUSE OF FAILURE TO SUBMIT A TRANSLATION OF THE DESCRIPTION OR TO PAY THE FEE WITHIN THE PRESCRIBED TIME-LIMIT

Effective date: 20201209