JP4911592B2 - エマルジョンの製造方法及びその製造装置 - Google Patents

Description

本発明は、エマルジョンの製造方法及びその製造装置に関するものである。

昨今、生物化学実験において、多くの実験を行うことが必要になっている。
従来は、例えば、マイクロチャンネルにおいて連続相中に分散相を作用させてＷ／Ｏ（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ）エマルジョンを作製することが研究されている（下記特許文献１参照）。
生物化学実験において、少量の試料で大量の実験を行うことは実験のコストや時間の問題を解決すると考えられる。その方法の一つとして本発明では、Ｗ／Ｏ（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ）エマルジョンの作製方法及びその装置に関して提案した。Ｗ／Ｏエマルジョンをアレイ状に並べ、各水滴の中で実験を行うことで、少量の試薬で大量の実験データを短時間で獲得することが可能となり、実験効率が向上すると考えられる。

そこで、本願発明者らは、一分子酸素活性検出に用いられるマイクロチャンバを作製することを提案した（下記特許文献２参照）。
このマイクロチャンバは、フェムトオーダーの体積の溶液又は試料液滴を封入することができ、第１の部材と窪みを有する第２の部材を貼り合わせることにより、窪みが容器部を形成する。
ＷＯ ０２／０６８１０４ Ａ１ 特開２００４−３０９４０５号公報

しかしながら、上記従来技術では、エマルジョン又はマイクロチャンバは提供できても、少量の試薬で大量の実験データを短時間で効率的に獲得するには難があった。
本発明は、上記状況に鑑みて、少量の試薬で大量の実験データを短時間で獲得することが可能となり、実験効率を向上させることができるエマルジョンの製造方法及びその製造装置を提供することを目的とする。

本発明は、上記目的を達成するために、
〔１〕エマルジョンの製造方法において、マイクロチャンバーが形成される下部型部材とこの下部型部材に対向して配置される蓋体と、前記下部型部材と前記蓋体との間に画成される通路とを用意し、前記通路に実験の対象となる物を含む水溶液を充填し、次いで前記通路に前記水溶液と混じらない流体を通して、前記水溶液を前記マイクロチャンバーのみに残し、エマルジョンを製造することを特徴とする。

〔２〕上記〔１〕記載のエマルジョンの製造方法において、前記下部型部材及び蓋体をＰＤＭＳで作製し、このＰＤＭＳを湿らせておくようにしたことを特徴とする。
〔３〕上記〔１〕記載のエマルジョンの製造方法において、前記水溶液と混じらない流体を流速１８〜２６ｍｍ／ｓでフラッシュさせることを特徴とする。
〔４〕エマルジョンの製造方法において、マイクロチャンバーが形成される下部型部材とこの下部型部材に対向して配置される蓋体と、前記下部型部材と前記蓋体との間に画成される通路とを用意し、前記通路にアルギン酸ナトリウム溶液を充填し、次いで前記通路をフルオロカーボンでフラッシュし、前記アルギン酸ナトリウム溶液を前記マイクロチャンバーのみに残し、次いでＣａＣｌ₂ 溶液で通路をフラッシュし、アルギン酸ゲルカプセルからなるエマルジョンを製造することを特徴とする。

〔５〕上記〔４〕記載のエマルジョンの製造方法において、前記下部型部材及び蓋体をＰＤＭＳで作製し、このＰＤＭＳを湿らせておくようにしたことを特徴とする。
〔６〕エマルジョンの製造装置において、マイクロチャンバーが形成される下部型部材と、この下部型部材に対向して配置される蓋体と、前記下部型部材と前記蓋体との間に画成される通路とを備え、前記通路に実験の対象となる物を含む水溶液を充填し、次いで前記通路に前記水溶液と混じらない流体を通して、前記水溶液を前記マイクロチャンバーのみに残し、エマルジョンを得ることを特徴とする。

〔７〕上記〔６〕記載のエマルジョンの製造装置において、前記下部型部材がＰＤＭＳであることを特徴とする。
〔８〕上記〔６〕又は〔７〕記載のエマルジョンの製造装置において、前記マイクロチャンバーの直径が１〜１０００μｍであることを特徴とする。
〔９〕上記〔６〕記載のエマルジョンの製造装置において、前記水溶液と混じらない流体がオイルであることを特徴とする。

〔１０〕上記〔９〕記載のエマルジョンの製造装置において、前記オイルが有機溶媒であることを特徴とする。
〔１１〕上記〔６〕記載のエマルジョンの製造装置において、前記実験の対象となる物が生体分子や細胞であることを特徴とする。

本発明によれば、少量の試薬で大量の実験データを短時間で獲得することが可能となり、実験効率を向上させることができる。

本発明のエマルジョンの製造装置は、マイクロチャンバーが形成される下部型部材と、この下部型部材に対向して配置される蓋体と、前記下部型部材と前記蓋体との間に画成される通路とを用意し、前記通路に実験の対象となる物を含む水溶液を充填し、次いで前記通路に前記水溶液と混じらない流体を通して、前記水溶液を前記マイクロチャンバーのみに残し、エマルジョンを製造する。

以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
図１は本発明にかかるエマルジョンアレイを作製するためのエマルジョン製造装置の模式図、図２はその下部型部材を示す斜視図、図３は本発明にかかるエマルジョンアレイの製作工程を示す図、図４はそれによって得られたエマルジョンアレイの平面図、図５はそのマイクロチャンバーの構造を示す断面図である。

まず、図１に示すように、下部型部材１と蓋体３を有し、下部型部材１と蓋体３によって画成される通路４が形成されており、液がその通路４を介して流される。
まず、図２に示すように、ＰＤＭＳからなる型部材１を用意し、このＰＤＭＳからなる下部型部材１にリソグラフィを用いてマイクロチャンバー（微小窪み部）２を形成させてなるエマルジョンアレイを作製する。

その下部型部材１の上部に所定高さを有する蓋体３を配置して、図３（ａ）に示すように、下部型部材１と蓋体３によって画成される通路４を形成するようにした。
その通路４に、図３（ｂ）に示すように、まず、生体分子や細胞などを含む水溶性溶液５を充填する。次いで、図３（ｃ）〜（ｄ）に示すように、その通路４の水溶性溶液５中に順次、水溶液と混じらない流体であるオイル６を入れると、図３（ｅ）に示すように、下部型部材１の複数のマイクロチャンバー２には水溶性溶液７′が残されて、遂には、図３（ｆ）に示すように、下部型部材１の複数のマイクロチャンバー２にオイル６中の水溶性溶液５（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ）からなるエマルジョン７を有するエマルジョンアレイが作製される。

図４にこのようにして生成されたエマルジョンアレイが示されており、複数のマイクロチャンバー２に水溶性溶液５（Ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｏｉｌ）からなるエマルジョン７が生成されている。
このように、フォトリソグラフィーを用いて作製したＰＤＭＳ〔ｐｏｌｙｄｉｍｅｔｈｙｌｓｉｌｏｘａｎｅ〕製の下部型部材には、通路４とマイクロチャンバー２を作製した。図５に示すように、通路４の深さは２０μｍとマイクロチャンバー２の直径は２０μｍ、マイクロチャンバー２の深さは２０μｍである。通路４を水溶性溶液５で満たした後、オイル〔有機溶媒（ｎ−ヘキサデカン）〕６を導入すると、オイル（有機溶媒）６が水溶性溶液５を押し出すが、マイクロチャンバー２内には水溶性溶液５がエマルジョン（液滴）７になって残るため、このＷ／Ｏエマルジョン７をマイクロチャンバー２と同じ位置に配置することができる。

なお、上記した水溶液と混じらない流体としてはオイルを示したが、空気などの気体を用いてフラッシュさせるようにしてもよい。
また、上記したマイクロチャンバーの直径は、１〜１０００μｍであってもよい。
更に、型部材としてはＰＤＭＳを示したが、これに代えて、リソグラフィを用いてマイクロチャンバーを形成できる材料、例えば、ＳＵ−８などのフォトレジスト、パリレン（ポリパラキシリレン）、アクリル樹脂などを用いることができる。

図６は本発明の実施例を示すエマルジョンの製造装置（その１）の詳細図である。
下部型部材１には直径５μｍ、深さ７μｍのマイクロチャンバー２が形成されており、上部の蓋体３には深さ２０μｍ、幅１００μｍの通路４が形成されている。
この実施例において、例えば、オイルの流速とエマルジョンが生成される率とは図７のような関係にあり、オイルの流速が１８〜２６ｍｍ／ｓとある程度高くなるのが好ましい。なお、そのオイルの流速は、通路の親疎水性、溶液の種類、マイクロチャンバーの形状によっても変わる。

また、エマルジョンの寿命として留意すべきことは、図８に示すように、下部型部材としてのＰＤＭＳは水で湿らせた状態の型部材でないと、エマルジョンをマイクロチャンバー内に長時間保持することができない点に留意する。本発明では、ＰＤＭＳを十分水で湿らせておくことにより、エマルジョンをマイクロチャンバー内に１５時間は保持することができた。

図９は本発明の実施例を示すエマルジョン製造装置（その２）の模式図である。
この実施例では、側部型部材１１にマイクロチャンバー１２を形成し、側部型部材１１の側部に蓋体１３を設け、その側部型部材１１と蓋体１３との間に通路１４が形成されるような構造にした。
次に、上記のようにして生成されたエマルジョンのリリース方法について説明する。

図１０は本発明の第１参考例を示すレーザーによるエマルジョンのリリース方法の説明図（その１）である。
図１〜図６に示した下部型部材１にはマイクロチャンバー２が形成されており、図１０に示すように、そのマイクロチャンバー２内のエマルジョン７にレーザー２１を照射することにより、加熱により対流を生じさせて、マイクロチャンバー２内からエマルジョン７をリリースすることができる。

図１１は本発明の第１参考例を示すレーザーによるエマルジョンのリリース方法の説明図（その２）である。
この図において、マイクロチャンバー内のエマルジョン７の屈折率がｎ₁ 、その雰囲気の屈折率がｎ₂ の場合に、スポットレーザー２２を照射すると、光ピンセットにおいて、ｎ₁ ＜ｎ₂ の場合、スポットレーザー２２とエマルジョン７の間には斥力が働くので、エマルジョン７をマイクロチャンバー内からリリースすることができる。

図１２は本発明の第２参考例を示すレーザーによるエマルジョンのリリース方法の説明図である。
図９に示した側部型部材１１にはマイクロチャンバー１２が形成されており、そのマイクロチャンバー１２内にはエマルジョン３２が生成され、図１２に示すように、そのマイクロチャンバー１２の背後に機械的に操作可能なリリース機構３１を設けて、そのリリース機構３１の機械的操作により、マイクロチャンバー１２に保持されているエマルジョン３２をリリースするように構成してもよい。

この場合には、下部型部材にエマルジョンを生成する場合に比して、エマルジョンのリリースを容易に行うことができる。
上記した側部型部材を有するものにおいては、エマルジョンは側部型部材に形成されるので、側方からのレーザーの照射、又はリリース機構の機械的操作により、エマルジョンを容易にリリースできるともに上方からその観察を容易に行うことができる。

図１３は本発明の第２実施例を示すエマルジョン（ゲル）アレイを作製するためのエマルジョン製造装置の模式図、図１４はそのエマルジョン（ゲル）アレイの製作工程を示す図である。
図１３において、４１はＰＤＭＳからなる下部型部材、４２はその下部型部材４１に形成されるマイクロチャンバー、４３は蓋体、４４は下部型部材４１と蓋体４３によって画成される通路である。

そこで、下部型部材４１を配置し、上部に所定高さを有する蓋体４３を配置して、図１４（ａ）に示すように、下部型部材４１と蓋体４３によって画成される通路４４を形成するようにした。
その通路４４に、図１４（ｂ）に示すように、まず、アルギン酸ナトリウム溶液４５を充填する。５分後には、図１４（ｃ）に示すように、すべてのマイクロチャンバー４２内にアルギン酸ナトリウム溶液４５が満たされる。次に、図１４（ｄ）に示すように、フルオロカーボン（Ｃ₆ Ｆ₁₄）溶液４６で装置をフラッシュさせ、図１４（ｅ）に示すように、アルギン酸ナトリウム溶液４５のエマルジョン（ゲル）をマイクロチャンバー４２に残す。次に、図１４（ｆ）に示すように、ＣａＣｌ₂ 溶液４７で装置をフラッシングすることにより、装置からフルオロカーボン（Ｃ₆ Ｆ₁₄）溶液４６を取り除く。図１４（ｇ）に示すように、アルギン酸ナトリウム溶液４５にＣａイオン（Ｃａ²⁺）と作用してアルギン酸カルシウムゲル状のエマルジョン４８を得ることができる。

図１５は本発明にかかるＰＤＭＳ装置を示す写真である。
ここでは、２個のＰＤＭＳが一緒にボンディングされたＰＤＭＳ装置が示されている。この装置は１０個のマイクロチャネル及び中央部分（１×１ｃｍ² ）マイクロチャンバーが配置されている。
図１６は本発明にかかるマイクロチャンバーを示す図である。

ここでは、マイクロチャンバー内に形成されるアルギン酸水溶カプセルのイメージ図を表している。そのアルギン酸水溶液へカルセイン（ｃａｌｃｅｉｎ）を付加して発光アルギン酸水溶カプセルを得る。この方法は、短時間で大量のアルギン酸水溶カプセルの製造が可能になる。マイクロチャンバーの直径は５μｍ、マイクロチャンバー間の間隔は５μｍである。

図１７は本発明にかかるエマルジョンの製造装置の断面図であり、シリンドリカルアルギン酸水溶カプセルはマイクロチャンバー内に見ることができる。エッジの近くを除くとカプセルは寸法がほとんど一定であることがわかる。
図１８は本発明にかかるカプセル内を大腸菌が泳ぐ様子を示す図である。
ここでは、ゲル化〔図１８（ａ）〜（ｆ）〕以前のマイクロチャンバー内に大腸菌がトラップされており、ＣａＣｌ₂ が導入されて約１０分後に、カプセルは完全なアルギン酸水溶液となり、そして大腸菌の動きは止まる〔図１８（ｆ）〕。

図１９は本発明にかかるサンプルにＥＤＴＡを含む場合と含まない場合の光（蛍光）の強度の変化を示す図である。
この図から明らかなように、サンプルに少しＥＤＴＡを含む場合には、サンプルにＥＤＴＡを含まない場合に比べて光の強度は減少することがわかる。
なお、上記実施例では、片側のみに下部型部材、側部型部材のマイクロチャンバーを有する場合について述べたが、両側に型部材を配置するようにしてもよい。また、蓋体の通路側にマイクロチャンバーを形成、つまり上部型部材とし、下部に蓋体を設けるようにしてもよい。上部型部材とする場合には、エマルジョンの作製時に通路への液体の流速をやや速めにすることが望ましい。また、この上部型部材とする場合には、マイクロチャンバーにおけるエマルジョンのリリース及び観察が容易になる。

また、本発明は上記実施例に限定されるものではなく、本発明の趣旨に基づき種々の変形が可能であり、これらを本発明の範囲から排除するものではない。

本発明のエマルジョンの製造方法及びその製造装置は、少量の試薬で大量の実験データを短時間で獲得することが可能となり、実験効率を向上させる実験装置として利用可能である。

本発明にかかるエマルジョンアレイを作製するためのエマルジョン製造装置の模式図である。 本発明にかかるエマルジョン製造装置の下部型部材を示す斜視図である。 本発明にかかるエマルジョンアレイの製作工程を示す図である。 本発明にかかるエマルジョンアレイの平面図である。 本発明にかかるマイクロチャンバーの構造を示す断面図である。 本発明の実施例を示すエマルジョンの製造装置（その１）の詳細図である。 本発明の実施例を示すエマルジョンの生成におけるオイルの流速とそれによるエマルジョンの生成率を示す図である。 本発明の実施例を示すＰＤＭＳの湿り度合いとエマルジョンの寿命の関係を示す図である。 本発明の実施例を示すエマルジョン製造装置（その２）の模式図である。 本発明の第１参考例を示すレーザーによるエマルジョンのリリース方法の説明図（その１）である。 本発明の第１参考例を示すレーザーによるエマルジョンのリリース方法の説明図（その２）である。 本発明の第２参考例を示すレーザーによるエマルジョンのリリース方法の説明図である。 本発明の第２実施例を示すエマルジョン（ゲル）アレイを作製するためのエマルジョン製造装置の模式図である。 本発明の第２実施例を示すエマルジョン（ゲル）アレイの製作工程を示す図である。 本発明にかかるＰＤＭＳ装置を示す写真である。 本発明にかかるマイクロチャンバーを示す図である。 本発明にかかるエマルジョンの製造装置の断面図である。 本発明にかかるカプセル内を大腸菌が泳ぐ様子を示す図である。 本発明にかかるサンプルにＥＤＴＡを含む場合と含まない場合の光（蛍光）の強度の変化を示す図である。

１，４１ 下部型部材
２，１２，４２ マイクロチャンバー（微小窪み部）
３，１３，４３ 蓋体
４，１４，４４ 通路
５ 水溶性溶液
６ オイル
７，３２ エマルジョン
７′ 溜まった水溶性溶液
１１ 側部型部材
２１ レーザー
２２ スポットレーザー
３１ リリース機構
４５ アルギン酸ナトリウム溶液
４６ フルオロカーボン（Ｃ₆ Ｆ₁₄）液
４７ ＣａＣｌ₂ 溶液
４８ アルギン酸カルシウムゲル

Claims (11)

1. マイクロチャンバーが形成される下部型部材と該下部型部材に対向して配置される蓋体と、前記下部型部材と前記蓋体との間に画成される通路とを用意し、前記通路に実験の対象となる物を含む水溶液を充填し、次いで前記通路に前記水溶液と混じらない流体を通して、前記水溶液を前記マイクロチャンバーのみに残し、エマルジョンを製造することを特徴とするエマルジョンの製造方法。
2. 請求項１記載のエマルジョンの製造方法において、前記下部型部材及び蓋体をＰＤＭＳで作製し、該ＰＤＭＳを湿らせておくようにしたことを特徴とするエマルジョンの製造方法。
3. 請求項１記載のエマルジョンの製造方法において、前記水溶液と混じらない流体を流速１８〜２６ｍｍ／ｓでフラッシュさせることを特徴とするエマルジョンの製造方法。
4. マイクロチャンバーが形成される下部型部材と該下部型部材に対向して配置される蓋体と、前記下部型部材と前記蓋体との間に画成される通路とを用意し、前記通路にアルギン酸ナトリウム溶液を充填し、次いで前記通路をフルオロカーボンでフラッシュし、前記アルギン酸ナトリウム溶液を前記マイクロチャンバーのみに残し、次いでＣａＣｌ₂ 溶液で通路をフラッシュし、アルギン酸ゲルカプセルからなるエマルジョンを製造することを特徴とするエマルジョンの製造方法。
5. 請求項４記載のエマルジョンの製造方法において、前記下部型部材及び蓋体をＰＤＭＳで作製し、該ＰＤＭＳを湿らせておくようにしたことを特徴とするエマルジョンの製造方法。
6. （ａ）マイクロチャンバーが形成される下部型部材と、
   （ｂ）該下部型部材に対向して配置される蓋体と、
   （ｃ）前記下部型部材と前記蓋体との間に画成される通路とを備え、
   （ｄ）前記通路に実験の対象となる物を含む水溶液を充填し、次いで前記通路に前記水溶液と混じらない流体を通して、前記水溶液を前記マイクロチャンバーのみに残し、エマルジョンを得ることを特徴とするエマルジョンの製造装置。
7. 請求項６記載のエマルジョンの製造装置において、前記下部型部材がＰＤＭＳであることを特徴とするエマルジョンの製造装置。
8. 請求項６又は７記載のエマルジョンの製造装置において、前記マイクロチャンバーの直径が１〜１０００μｍであることを特徴とするエマルジョンの製造装置。
9. 請求項６記載のエマルジョンの製造装置において、前記水溶液と混じらない流体がオイルであることを特徴とするエマルジョンの製造装置。
10. 請求項９記載のエマルジョンの製造装置において、前記オイルが有機溶媒であることを特徴とするエマルジョンの製造装置。
11. 請求項６記載のエマルジョンの製造装置において、前記実験の対象となる物が生体分子や細胞であることを特徴とするエマルジョンの製造装置。