JP2018174824A - マイクロパターンの表面を濡らす方法 - Google Patents

Abstract

【課題】凹部からなるマイクロパターン上に液体を流すことでその表面を濡らす際に凹部内に気泡が生じることを抑制する。【解決手段】容器（２０）は液体（３０）を保持するための凹部（２１）を備える。凹部（２１）は内底面（２２）を有する。内底面（２２）には複数のチャンバーからなるマイクロパターン（２５）が設けられている。凹部（２１）で構成される空間にマイクロパターン（２５）を覆う蓋体（２８）を設ける。蓋体（２８）の下面（２９）とマイクロパターン（２５）の間にある隙間に液体（３０）を行き渡らせる。これにより、隙間を液体（３０）で満たしながら、マイクロパターン（２５）の表面を濡らす。【選択図】図２

Description

本発明はマイクロパターンの表面を濡らす方法及びこれを応用した組み合わせ品に関する。

特許文献１及び２には凹状の窪みあるいはチャンバーを有する培養容器に培地を導入する方法が示されている。かかる方法では凹状の窪みの設けられた表面に細胞を含む培地を滴下したのち、細胞を培養容器内で培養する。このとき凹状の窪みに気泡が残存する。このためさらに培養容器に振動を加えることで気泡を除去する。

特許文献３の12頁の段落[0044]には、アレイと呼ばれる微小な穴に閉じ込められた気泡を取り除く方法が示されている。かかる方法には、アレイに水をスプレーすることや、アレイに音圧をかけることが含まれる。

特許文献４の6頁の段落[0028]には、マイクロ容器を構成する微細な突起への気泡の付着防止の方法が示されている。かかる方法では培養容器の表面を有機膜又は無機膜で被覆することで親水化又は疎水化する。

特開２０１５−０４３７５０号公報 特開２０１５−０４３７５１号公報 特開２００９−０９６９９２号公報 特開２００７−２２８８１８号公報 特開２００６−１９１８０９号公報

特許文献１及び２に示すように複数のチャンバーからなるマイクロパターン上に液体を流すことでその表面を液体で濡らす際には、チャンバーの中に気泡が生じやすい。特許文献１及び２に記載の方法は気泡の除去の工程を必須とする。特許文献３に記載の方法もこれに類する。

これに対して特許文献４に記載の方法は気泡の発生を抑止するための好適な膜の態様を示しているに過ぎない。したがって、実際に気泡の発生を防止するにはマイクロパターンと液体とを操作する際に特許文献１及び２に示すような工程上の工夫を要する。

本発明は複数のチャンバーからなるマイクロパターンの表面を濡らす方法を提供する。かかる方法では、マイクロパターン上に液体を流すことでその表面を濡らす際にチャンバー内に気泡が生じることを抑制することを課題とする。

［１］ 液体を保持するための凹部を備え、前記凹部が内底面を有し、前記内底面には複数のチャンバーからなるマイクロパターンが設けられている容器において、前記凹部で構成される空間に前記マイクロパターンを覆う蓋体を設け、
前記蓋体の下面と前記マイクロパターンの間にある隙間に前記液体を行き渡らせることで、前記隙間を前記液体で満たしながら、前記マイクロパターンの表面を濡らす方法。
［２］ 前記蓋体を設けた後、前記蓋体の下面に接するいずれかの箇所に対して液体を供給しながら、前記箇所を起点にして、前記隙間に前記液体を行き渡らせる、［１］の方法。
［３］ 前記チャンバーに内接する球の直径が５μｍ〜１０００μｍであり、
前記チャンバーの深さが５μｍ〜１０００μｍである、［１］又は［２］の方法。
［４］ 前記チャンバーの容積が０．０００１μｌ〜１０μｌである、［１］〜［３］のいずれかの方法。
［５］ 前記液体が、水または水溶液である、［１］〜［４］のいずれかの方法。
［６］ 前記蓋体の下面が前記凹部で構成される空間内に位置するように前記蓋体を設ける、［１］〜［５］のいずれかの方法。
［７］ 前記蓋体の下面が前記マイクロパターンに近接するように前記蓋体を設け、
ここで、前記蓋体の下面が前記内底面に対して０．１〜１．２ｍｍ離間するように前記隙間が形成されることで、前記液体が前記隙間に対して浸潤しながら前記隙間に行き渡ることを妨げない、［６］の方法。
［８］ 前記隙間において前記液体に働く毛管現象により前記液体を前記隙間に行き渡らせる、［１］〜［７］のいずれかの方法。
［９］ 前記内底面が水平になるように前記容器を設置して行い、
前記液体を凹部の上方又は側方より凹部内に注入することで、前記隙間に前記液体を供給する、［１］〜［８］のいずれかの方法。
［１０］ 前記マイクロパターンは各前記チャンバーを個別に仕切る壁を有し、
前記壁により前記チャンバーは隣り合う他のチャンバーと完全に分離されており、
前記チャンバーと前記壁とを覆うように前記蓋体を設ける、
［１］〜［９］のいずれかの方法。
［１１］ ［１］〜［１０］のいずれかの方法を利用して前記マイクロパターンの表面を濡らし、
前記蓋体を前記凹部から脱離させるとともに、前記マイクロパターンの表面を濡らすのには余剰となる前記液体を除去又は排出し、
前記表面が濡れている前記マイクロパターンに対して粒子を懸濁した培養液を注ぐことで前記凹部内に粒子を分配するところ、
前記液体には前記粒子が含まれていない、
方法。
［１２］ 前記容器は細胞培養容器であり、
前記粒子はそれぞれ１又は２以上の細胞からなる、
［１１］の方法。
［１３］ 液体を保持する凹部を備える容器と蓋体との組み合わせ品であって、
前記凹部は複数のチャンバーからなるマイクロパターンが設けられている内底面を有し、
前記蓋体は前記凹部で構成される空間に対して挿入と脱離が自在であり、
前記凹部で構成される空間に蓋体を設けた時、前記蓋体の下面と前記マイクロパターンの間にある隙間に前記液体を行き渡らせることで、前記隙間を前記液体で満たしながら、前記マイクロパターンの表面を濡らすことのできる、組み合わせ品。

本発明の方法により、マイクロパターンを濡らすタイミングで気泡が生じること自体が抑制できる。したがって、生じた気泡を除去するために特別な工程を取り入れることや気泡が生じないようにマイクロパターンの表面の材質に制限を設けることを回避しやすくなる。

容器の斜視図及びマイクロパターンの拡大図である。 凹部及び蓋体の斜視図である。 凹部及び蓋体の断面図である。 隙間の断面図である。 マイクロパターンの断面図である。 比較実施形態１にかかるマイクロパターンの断面図である。 比較実施形態２にかかるマイクロパターンの断面図である。 実施形態２にかかるチャンバーの平面図及び断面図である。 実施形態３にかかる容器の平面図及び断面図である。 実施形態４にかかる容器の平面図である。 実施例１にかかる蓋体の平面図及び正面である。 実施例１にかかる蓋体及び容器の平面像である。 実施例１にかかる容器の平面像である。 実施例２にかかる蓋体及び容器の平面像である。 実施例２にかかる容器の平面像である。 実施例３にかかる蓋体及び容器の平面像である。 実施例３にかかる容器の平面像である。 比較例１にかかる容器の平面像である。 比較例２にかかる容器の平面像である。

以下図面を用いて説明するが、本発明はこれらの実施形態及び実施例に限定されない。図１には本実施形態にかかる容器２０が示されている。容器２０は凹部２１を含む複数の凹部を備える。凹部２１は液体を保持することができる。凹部２１は上面側に開口１９を有する。好ましい態様において凹部２１には開口１９以外に穴が開いていない。各凹部は凹部２１と同様に形成されている。凹部２１と他の凹部の形状は必ずしも一致していなくてもよい。

図１に示す凹部２１は内底面２２を有する。内底面２２は側壁面２３に囲まれている。なお凹部２１は時計皿のように側壁の無い凹部でもよい。内底面２２の一部又は全部にはマイクロパターン２５が設けられている。図中では内底面２２の全体にマイクロパターン２５が形成されている。図中にはさらにマイクロパターン２５の拡大図が示されている。

図１の拡大図に示すようにマイクロパターン２５はチャンバー２６ａ−ｃを含む複数のチャンバーからなる。これらのチャンバーはそれぞれマイクロ空間（micro room）を形成している。これらのチャンバーは内底面２２上に設けられている。これらのチャンバーが格子状に整列していることで、マイクロパターン２５が形成されている。図中では正方形を単位とする正方格子状にチャンバーが配置されている。

図１に示すマイクロパターン２５の表面は疎水性でもよく親水性でもよい。本実施形態においてマイクロパターン２５の表面とはチャンバー２６ａ−ｃの表面を含む。マイクロパターン２５の表面は処理されていてもよく、成形時のままでもよい。マイクロパターン２５の表面はコートされていてもよく、されていなくてもよい。

図１に示すチャンバー２６ａ−ｃの上面開口は円形である。チャンバー２６ａ−ｃの上面開口の形状は三角形、四角形、及びその他の多角形、円形及び楕円形並びにその他二次元形状とすることが出来る。

図１に示す容器２０は凹部２１と同様にマイクロパターンを有する凹部を、凹部２１を含めて１個以上有していればよい。かかる凹部の数は６、２４、９６、３８４、及びそれ以上の数でもよい。

図１に示す容器２０は樹脂成形品であることが好ましい。容器２０は、樹脂成形によって得られたマイクロパターン２５を内底面２２に貼り付けることで得てもよい。

容器を構成する樹脂はアクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のいずれかでもよい。樹脂はこれらの混合物でもよい。

かかる樹脂で形成されたマイクロパターンでは、表面が親水化されていることが好ましい。親水化の方法としては、プラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれかまたはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法、または、親水性のポリマー鎖、リン脂質およびリン脂質・高分子複合体のうちのいずれか一つを被覆する方法が好ましい。

前記親水性のポリマー鎖がポリヒドロキシエチルメタクリレートであることが好ましく、前記ポリヒドロキシエチルメタクリレートの平均分子量が１０万以上であることがより好ましい。

図２には凹部２１及び本実施形態で用いる蓋体２８が示されている。容器２０において、蓋体２８を凹部２１で構成される空間内に設ける。ここで内底面２２が水平になるように容器２０を設置する。

図２に示す蓋体２８は下面２９を有する。下面２９が凹部２１で構成される空間内に位置するようにする。これにより、蓋体２８は内底面２２上に形成されているマイクロパターン２５を覆う。

図２に示す蓋体２８は特に制限されないが、好ましくは非透液性である。蓋体２８は液体３０に対する溶解性がないことが好ましい。液体３０が水または水溶液である場合、蓋体２８は樹脂成形品であることが好ましい。樹脂としては上述の容器を構成する樹脂と同様のものが使用できる。蓋体２８は柔軟性を有していてもよく、また剛性を有していてもよい。

図２に示すピペット３１の先を開口１９より凹部２１内に挿入する。ピペット３１には液体３０が蓄えられている。液体３０はマイクロパターン２５の表面を濡らすための液体である。液体３０は水又は水溶液であることが好ましい。液体３０は凹部２１の上方から注入される。ピペット３１は例示であり、液体を連続的に供給可能な他のいかなる分注装置も利用できる。

図３に示すように下面２９が内底面２２に近接するよう蓋体２８が設置される。下面２９に接するいずれかの箇所を液体供給のための起点３３とする。ここで下面２９に接する箇所とは空間的な位置を指す。起点３３より下面２９と内底面２２との間にある隙間に液体３０を供給する。図は巨視的であり図中に隙間は示されていない。かかる隙間を図４に拡大して示す。

図４には隙間３５の断面が示されている。隙間３５は下面２９とマイクロパターン２５の表面との間にある。起点３３は隙間３５の端の一部分である。ピペット３１の先端は起点３３の近傍に届いている。起点３３は下面２９に接している。起点３３は下面２９の縁に接している。起点３３はマイクロパターン２５にも接している。蓋体２８を設けた後、ピペット３１は起点３３に対して連続的に液体３０を供給する。

図４に示す起点３３は隙間３５に液体３０を行き渡らせるための起点である。ピペット３１から吐出された液体３０は次々と隙間３５に進入する。液体３０は隙間３５を満たす。液体３０が隙間３５内を進行することで、マイクロパターン２５の表面は液体３０によって濡れていく。同時に下面２９も液体３０によって濡れていく。

図４に示す液体３０はチャンバー２６ａ−ｃを順番に満たすように所定の速度Ｖ１で進行する。チャンバー２６ａ−ｃで囲まれる空間の立体形状は半球である。またチャンバー２６ａとチャンバー２６ｂとの間には壁２７ａが設けられている。チャンバー２６ｂとチャンバー２６ｃとの間には壁２７ｂが設けられている。その他のチャンバーとチャンバーとの間において同様である。これらの壁はチャンバーを仕切る壁である。

図４に示す液体３０が進行すると、チャンバー２６ａ−ｃ及び隙間３５から空気が追い出される。したがって隙間３５を挟んで起点３３の反対側には空気の脱出口が設けられていることが好ましい。図４に示すように蓋体２８は単にマイクロパターン２５を覆っているだけであるため、蓋体２８の縁から自然に空気が脱出していく。

図２に戻る。供給された液体３０は蓋体２８の下の微細な隙間中を拡がって行く。一態様において、液体３０が隙間に対して浸潤しながら隙間に行き渡ることを妨げない程度に、下面２９は内底面２２に対して近接している。下面２９は内底面２２に対し好ましくは０．１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．１〜２ｍｍ、さらに好ましくは０．１〜１．２ｍｍ、特に好ましくは０．７ｍｍ離間する。離間の大きさはチャンバーの深さより大きくてもよい。離間の大きさはチャンバーの深さの１．２５〜１．７５倍又は１．７５倍〜２．５倍でもよい。

図２に示すように液体３０を隙間に行き渡らせることでマイクロパターン２５の表面全体を濡らす。上述の通り液体３０の供給作業と液体３０を行き渡らせる作業は同時に行われる。その後、蓋体２８を凹部２１から脱離させる。

本実施形態において隙間の用語は絶対的に空間が存在していることを表すものとする。すなわち隙間の用語には、図４に示すように液体の進行を妨げない程度に蓋体とマイクロパターンとの間に空間を有することを意味する。なお、液体３０の供給前において蓋体とマイクロパターンが接しており隙間を有していなくとも、液体３０の供給により液体が行き渡る過程で蓋体とマイクロパターンの間に隙間を形成する場合も隙間を有する態様に含まれる。

図４に示す隙間３５の高さは好ましくは０．１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．１〜２ｍｍ、さらに好ましくは０．１〜１．２ｍｍ、特に好ましくは０．７ｍｍである。隙間３５の高さはチャンバーの深さより大きくてもよい。隙間３５の高さはチャンバーの深さの１．２５〜１．７５倍又は１．７５倍〜２．５倍でもよい。

図４に示すように液体３０を隙間３５に行き渡らせる際、一態様において液体３０に働く毛管現象により液体３０を隙間３５に行き渡らせる。このとき、下面２９は内底面２２に対して近接しているが、完全には接していない。例えば下面２９に脚を設けることで、意図的に下面２９と内底面２２との間の距離を保ちながら、毛管現象を利用してもよい。下面２９に脚を設ける場合、脚の長さは、好ましくは０．１〜１０ｍｍ、より好ましくは０．１〜２ｍｍ、さらに好ましくは０．１〜１．２ｍｍ、特に好ましくは０．７ｍｍである。脚の長さのチャンバーの深さより大きくてもよい。脚の長さはチャンバーの深さの１．２５〜１．７５倍又は１．７５倍〜２．５倍でもよい。

図５には蓋体による覆いから解放されたマイクロパターン２５が示されている。上述の通り蓋体は非透液性であることが好ましい。蓋体が非透液性である場合、液体３０は蓋体に吸収されることなくマイクロパターン２５の表面に残される。ここで液体３０のうち余剰液３４を除去又は排出してもよい。余剰液３４はマイクロパターン２５の表面を濡らしたままとするには余剰となる液体である。

図５に示すように表面が濡れているマイクロパターン２５に対して、粒子を懸濁した液体を注ぐ。これにより、チャンバー２６ａ−ｃ及びその他のチャンバーに対して粒子を分配する。各チャンバーでは気泡の形成が抑制されているので、各チャンバーに均等な数の粒子を分配するのに適する。また粒子の分配されないチャンバーの発生が防止される。

図５に示す余剰液３４を予め取り除いておくことで、粒子を懸濁するための液体に対して混ざり込む液体３０の量を減らすことが出来る。一連の作業は余剰液３４と粒子を懸濁した液体との交換と考えることもできる。

なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。一態様において図２及び３に示すように蓋体２８の縁より液体３０を供給する。他の態様において蓋体２８の中央に孔３２を設けてかかる孔より液体３０を供給してもよい。この場合、液体３０はマイクロパターン２５の中心から外縁に向かってマイクロパターン２５の表面を進行する。このためマイクロパターン２５の全体を効率よく濡らすことが出来る。

一態様において、図２及び３に示すように液体３０は凹部２１の上方から注入される。側壁面２３に孔を設けてもよい。かかる孔を通じて起点３３に液体３０を供給してもよい。これにより、液体３０は凹部２１の側方から注入することができる。

本実施形態の他の態様は容器と蓋体との組み合わせ品又は容器と蓋体とを組み合わせてなるキットである。組み合わせ品は図２に示すように容器２０と蓋体２８とを備える。蓋体２８は凹部２１で構成される空間に対して挿入と脱離が自在である。凹部２１で構成される空間に蓋体２８を設けた時、図３に示すように起点３３より液体を供給できる。図４に示すように隙間３５に液体３０を行き渡らせることができる。このため、隙間３５を液体３０で満たすことができる。

以下の実施形態及び比較実施形態では、容器を細胞培養容器として用いる。また粒子としては細胞を用いる。粒子は１個の細胞からなっていてもよい。粒子は細胞塊でもよい。以下では細胞塊は２個以上の細胞からなるものを指す。粒子を懸濁するための液体として培養液を用いる。以下では主として、細胞を容器に播種する前にマイクロパターンを濡らすことについて説明する。用いられる蓋体や容器は細胞毒性のない材料で形成されることが好ましい。パイロジェンフリーであることが好ましい。エンドトキシンフリーであることが好ましい。

［実施形態１]
図１〜図５に示すようにマイクロパターン２５の表面を液体３０で濡らす。液体３０は水とする。液体３０は生理食塩水又は培養液でもよい。生理食塩水は緩衝液でもよい。凹部２１、蓋体２８、液体３０、ピペット３１はいずれもパイロジェンフリーであることが好ましい。これらはいずれもエンドトキシンフリーであることが好ましい。

図５に示すように水で濡らしたマイクロパターン２５上に培養液に懸濁した細胞を播種する。チャンバー２６ａ−ｃ及びその他チャンバー内で細胞を培養する。細胞は哺乳動物細胞でもよい。哺乳動物細胞はＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞及びその他の幹細胞のいずれかでもよい。哺乳動物はヒトでもよい。

なお本実施形態１では図４に示す壁２７ａ及びｂを初めとする壁にはスリットや連通孔が設けられていない。ここで言うスリットや連通孔とは例えばチャンバーとチャンバーとの間を連結するものである。またチャンバー２６ａ−ｃを含む各チャンバーにはチャンバー外に通じるその他の孔は設けられていない。以下、上述のスリットや連通孔やその他の孔のことを逃げ孔という。

［比較実施形態１]
図６には比較実施形態１にかかるマイクロパターン２５の断面が示されている。比較実施形態１では蓋体を用いない点が実施形態１と異なる。この場合、液体３０はマイクロパターン２５の表面に触れながら進行する。しかしながら液体３０の表面張力により、液体３０はチャンバー２６ａを完全に満たすことなく、次のチャンバー２６ｂ及びｃに向かう。チャンバー２６ａ内には空気が取り残される。

図６に示すように、壁２７ａ及びｂを初めとする壁には、上述の逃げ孔が設けられていない点は実施形態１と同様である。したがって取り残された空気には逃げ場がない。空気はチャンバー２６ａ内に密閉されることで、気泡として残存するようになる。

これに対して、実施形態１では、図４に示すように蓋体２８がマイクロパターン２５を覆うように設置されている。したがって、蓋体２８は液体３０を上側から押さえつけるように拘束する。蓋体２８は液体３０によって浮き上がらない程度に重いことが好ましい。

液体３０が上方で拘束されるため、下方のチャンバー２６ａ−ｃ内に次々と液体３０が入り込む。液体３０はこれらのチャンバー２６ａ−ｃを満たす。本実施形態１の方法によりこれらのチャンバー内に気泡が生成することが抑制される。

また、壁２７ａ及びｂに逃げ孔が設けられていたとしても、それだけで全ての空気を逃し得るわけではない。したがって、本実施形態１の方法は逃げ孔のあるマイクロパターンにおいてもチャンバー内に気泡を生成することを抑制するのに役立つ。

［比較実施形態２]
図７には比較実施形態２にかかるマイクロパターン２５の断面が示されている。比較実施形態２では液体３０が速度Ｖ２で進行する点が比較実施形態１と異なる。速度Ｖ２は速度Ｖ１よりも小さい。液体３０はゆっくりと進むので表面張力の働きが不十分となる。このためチャンバー２６ａにも液体３０が進入する。このため、実施形態１と同様に液体３０はチャンバー２６ａを満たす。また気泡が生成することが抑制される。

しかしながら、比較実施形態２にかかる方法では、実施形態１にかかる方法よりも液体３０の進行の速度が小さい。したがって、比較実施形態２ではマイクロパターン２５中の所望の面積を濡らすのに実施形態１よりも時間を要する。また図４に示すピペット３１のような分注装置によって液体３０を低速度で供給するのは、それ自体が技術的に困難な場合がある。

[実施形態２]
図８には実施形態２にかかるチャンバー３６が示されている。本実施形態２では、図４に示すチャンバー２６ａ−ｃ及びその他のチャンバーの代わりにチャンバー３６を用いる。上段の平面図に示されるように。チャンバー３６は底部３７と側部３８とを有する。側部３８は底部３７を取り囲む。下段の断面図に示すように。側部３８はチャンバー３６の開口部をなしている。

図４に示す仮想球３９は側部３８と底部３７との境界においてチャンバー３６に内接する。仮想球３９の直径は、内径Ｃで表される。内径Ｃは５μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、５０μｍ以上５００μｍ以下がより好ましく、１００μｍ以上５００μｍ以下が特に好ましい。かかる内径Ｃを有するチャンバー３６は、スフェロイドの中心部と外界との物質の交換が容易となる。

図８に示すチャンバー３６の深さＤは５μｍ〜１０００μｍが好ましい。底部３７は半球状であることが好ましい。このとき、底部３７の深さＤ１は内径Ｃの１／２である。側部３８の深さＤ２はＤとＤ１の差である。

図８に示す側部３８はテーパを有する。テーパの角度θ（theta）はチャンバー３６の中心軸に対して１度以上２０度以下が好ましく、５度以上１５度以下がより好ましく、１０度が特に好ましい。テーパ角を１度以上とすることで細胞を回収することが容易となる。テーパ角を２０度以下とすることで培養液を交換する際に細胞がチャンバーから離脱しにくくなる。

このようにマイクロパターンが側部と底部からなる二段構成を有していても、実施形態１に示す方法と同様にマイクロパターンを濡らすことができる。

[実施形態３]
図９には実施形態３にかかる容器４０が示されている。図９の下段の断面図に示すように容器４０はウェル形状となっている凹部４１を備える。凹部４１は複数である。上段の平面図に示すように凹部４１は側壁４２で仕切られている。

図９に示すように側壁４２は側壁面４３を有する。凹部４１の内底面はマイクロパターン４５を有する。側壁面４３はマイクロパターン４５を取り囲む。マイクロパターン４５は正方格子状に配列されたチャンバー４６を備える。図中では３６個のチャンバーが示されているが、チャンバーの数は限定されない。

図９に示すマイクロパターンは壁４７を有する。チャンバー４６は壁４７により形成されている。壁４７は各チャンバーを個別に仕切る。壁４７によりチャンバー４６は隣り合う他のチャンバーと完全に分離されている。蓋体をマイクロパターン４５上に設ける際は、チャンバー４６と壁４７とを覆うように蓋体を設ける。蓋体は側壁４２を覆う必要はない。チャンバーを仕切る壁の態様は他の実施形態及び実施例においても適用できる。

図９のチャンバー４６を平面視すると正方形である。チャンバー４６の断面は長方形である。チャンバー４６で取り囲まれる空間は四角柱形状を有する。チャンバー４６は例えば幅５０〜４００μｍ、好ましくは１００〜２００μｍ；奥行き５０〜４００μｍ、好ましくは１００〜２００μｍ；深さ５０〜４００μｍ、好ましくは１００〜２００μｍとすることができる。

このようにマイクロパターンが四角柱形状のチャンバーを有していても、実施形態１に示す方法と同様にマイクロパターンを濡らすことができる。

図４に戻る。チャンバーの立体形状について補足する。図４、図８及び図９に示したようにチャンバーに囲まれる空間の立体形状は制限されない。図４に示すチャンバー２６ａ−ｃは半球状であった。チャンバーに囲まれる空間の垂直断面において、空間の輪郭は任意の角度の円弧又は楕円弧からなっていてもよい。空間の立体形状は深くなるほど細くなる逆さ錐体でもよい。図９に示すように空間の立体形状は角柱又は円柱でもよい。角柱又は円柱は深くなるほど細くなるようにテーパ設けられていてもよい。空間の立体形状は図８に示すようにこれらの立体形状の一部を互いに組み合わせることで構成されていてもよい。いずれの場合もチャンバーの深さは５μｍ〜１０００μｍが好ましく、５０μｍ〜５００μｍがより好ましい。チャンバーで囲まれる空間に内接する仮想球の直径は５μｍ以上１０００μｍ以下が好ましく、５０μｍ〜５００μｍがより好ましい。チャンバーの容積は好ましくは０．０００１μｌ〜１０μｌ、より好ましくは０．０００５μｌ〜１μｌ、より好ましくは０．００１μｌ〜０．５μｌ、さらに好ましくは０．０４μｌとすることができる。

[実施形態４]
図１０には実施形態４にかかる容器５０が示されている。容器５０を平面視した時、容器５０の全面に渡って、一つの凹部５１が形成されている。凹部５１は内底面５２を有する。内底面５２は側壁面５３に囲まれている。なお凹部２１は時計皿のように側壁の無い凹部でもよい。内底面２２の中央にマイクロパターン２５が設けられている。図中にはさらにマイクロパターン２５の拡大図が示されている。

このように一の凹部が容器の全体に渡って形成されていても、実施形態１に示す方法と同様にマイクロパターンを濡らすことができる。

［先行技術との対比］
特許文献５には空間構造と呼ばれるマイクロパターンを有する培養プレートが記載されている。特許文献５の段落[0052]-[0056]では、空間構造に細胞を配置するとともに空間構造を培養液で浸す。さらに培養プレートの上に他のプレートを重ね合わせる。これにより空間構造を取り囲む流路を形成する。その後、培養プレートに設けられた貫通孔を通じて流路内に培養液を循環させる。

これに対して上記実施形態では、図５に示すように予め液体３０でマイクロパターン２５の表面を濡らしておく。好ましい態様において液体３０には細胞が含まれていない。さらに細胞をマイクロパターン上に播種するために蓋体を凹部から脱離させている。

一方先行技術では細胞を含む懸濁液を直接マイクロパターン上に添加する。したがって、気泡の発生は抑制できない。また気泡が細胞を押しのけることでチャンバーすなわち空間構造内に細胞が配置されない可能性がある。細胞を無生物の粒子に置き換えた場合でも同様である。

なお、本発明は上記実施形態及び下記実施例に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。一態様において濡らしたマイクロパターンを細胞培養に用いるものとした。他の態様において濡らしたマイクロパターンは細胞以外の材料からなる粒子の処理や保持の用途に用いてもよい。かかる粒子にはウィルス等の無生物や、抗体及びその担体などが含まれる。粒子は化学的な処理によって意図的に殺した細胞でもよい。化学的な処理には化学固定を含む。かかる粒子の材料はこれらの医学や生物学の分野の材料に限定されない。

［実施例１］
実施形態１にならい、実際に容器と蓋体を用いてマイクロパターンの表面を濡らすことを試みた。

蓋体として図１１に示す蓋体５８を用いた。蓋体５８は板５５及び３個の脚５６ａ−ｃを備える。平面視した板５５は直径３４ｍｍの円形である。板５５の円形形状から弓形形状が切り抜かれている。このように板５５は弓形形状の切欠き部分５７を有している。脚５６ａ−ｃは板５５の下面に取り付けられている。脚５６ａ−ｃは蓋体５８の周縁部に等間隔に配置されている。

図１１に示す蓋体５８を内底面２２上に設置する。脚５６ａ−ｃの下面は内底面２２に対して接している。板５５の下面のうち脚５６ａ−ｃの設けられていない部分が内底面２２に対して離間する。隙間の高さは脚５６ａ−ｃの高さＧで調節できる。本実施例ではＧ＝０．５ｍｍとした。蓋体５８は５ｍｍ厚のアクリル樹脂板を切削加工後に研磨することで作製した。脚５６ａ−ｃはかかる切削加工により形成した。

容器として６ウェルプレート（クラレ、RB500 400 NA）を用いた。図１２には平面視で撮影した蓋体及び容器が示されている。図１２に示すようにウェルプレートは凹部となるウェルを有する。各ウェルの内底面にはマイクロパターンが形成されている。マイクロパターンは実施形態２にならったチャンバーを有する。RBはチャンバーの底部がカップ型の丸い表面を有すること（round bottom type）を表す。チャンバーの開口部の直径は５００μｍ、深さは４００μｍである。NAは細胞非接着性の表面（non-adherent surface）を表す。チャンバーの表面が細胞非接着性であることは、プラズマ処理による親水化処理後にポリヒドロキシエチルメタクリレートが被覆した表面処理がなされていることによる。

図１２に示すようにウェルの内底面に上述の蓋体を載置した。切欠き部分から露出したマイクロパターン上の一点を、白抜き矢印で表す起点Ｓｔとした。起点Ｓｔを注入位置として、２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を５秒間かけて注入した。ＰＢＳの注入は大気下で行なった。ＰＢＳは蓋体の下面とウェルの内底面との間の隙間に潜り込むように浸透した。

図１３には平面視で撮影した容器が示されている。一部を除きマイクロパターン上には気泡は生じなかった。蓋体の下面に生じた隙間に行き渡らせる様にＰＢＳを注入することでチャンバーの奥まで濡らすことが出来た。図中には３つの小さな矢印が示されている。これらの矢印で示す明るい部分は気泡の生じた部分である。気泡の生じた部分は専ら脚で覆われた部分であった。脚で覆われた部分を除いて考えた際、マイクロチャンバーの９０％以上を濡らすことができた。

［実施例２］
図１４には平面視で撮影した蓋体及び容器が示されている。脚の高さＧを０．７ｍｍとした以外は実施例１と同じ条件で注入を行った。起点Ｓｔを注入位置として、２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を注入した。図１５には平面視で撮影した容器が示されている。図に示すように脚で覆われた部分以外は気泡が生じにくく、チャンバーの奥まで濡らすことが出来た。脚で覆われた部分を除いて考えた際、マイクロチャンバーの９０％以上を濡らすことができた。

［実施例３］
図１６には平面視で撮影した蓋体及び容器が示されている。脚の高さＧを１．０ｍｍとした以外は実施例１と同じ条件で注入を行った。起点Ｓｔを注入位置として、２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）を注入した。図１７には平面視で撮影した容器が示されている。図に示すように脚で覆われた部分以外は気泡が生じにくく、チャンバーの奥まで濡らすことが出来た。脚で覆われた部分を除いて考えた際、マイクロチャンバーの８５％以上を濡らすことができた。

［比較例１］
図１８には平面視で撮影した容器が示されている。比較実施形態１にならい、ウェルの内底面にＰＢＳを注入した。蓋体を用いなかったこと及び４ｍｌのＰＢＳを１０秒間かけて注入したこと以外は実施例１と同じ条件で注入を行った。ＰＢＳはウェルの内底面の周縁部に回り込んでいった。これは表面張力によるものと考えられる。ＰＢＳが回り込みきって起点Ｓｔの反対側まで到達した後、ＰＢＳは勢いよくウェルの中央部に向かって流れた。このためウェルの内底面の中央部には気泡が生じた。かかる部分ではマイクロパターン上のチャンバーの奥まで濡らすことが出来なかった。脚で覆われた部分を除いて考えた際、濡らすことができたマイクロチャンバーは６５％以下であった。

［比較例２］
図１９には平面視で撮影した容器が示されている。比較実施形態２にならい、ウェルの内底面にＰＢＳを注入した。４ｍｌのＰＢＳを９０秒間かけて注入したこと以外は比較例１と同じ条件で注入を行った。ＰＢＳはウェルの内底面の周縁部に回り込んでいった。回り込む速度は比較例１より遅かった。このためウェルの内底面の中央部に生じる気泡は抑制できた。しかしながら、矢印で示す部分は勢いよくＰＢＳが流れたため気泡が生じた。かかる部分ではマイクロパターン上のチャンバーの奥まで濡らすことが出来なかった。脚で覆われた部分を除いて考えた際、濡らすことができたマイクロチャンバーは８５％以上であったが、ＰＢＳの注入作業には時間がかかってしまった。

１９ 開口、 ２０ 容器、 ２１ 凹部、 ２２ 内底面、 ２３ 側壁面、 ２５ マイクロパターン、 ２６ａ−ｃ チャンバー、 ２７ａ−ｂ 壁、 ２８ 蓋体、 ２９ 下面、 ３０ 液体、 ３１ ピペット、 ３２ 孔、 ３３ 起点、 ３４ 余剰液、 ３５ 隙間、 ３６ チャンバー、 ３７ 底部、 ３８ 側部、 ３９ 仮想球、 ４０ 容器、 ４１ 凹部、 ４２ 側壁、 ４３ 側壁面、 ４５ マイクロパターン、 ４６ チャンバー、 ４７ 壁、 ５０ 容器、 ５１ 凹部、 ５２ 内底面、 ５３ 側壁面、５５ 板、 ５６ａ−ｃ 脚、 ５７、切欠き部分、 ５８ 蓋体、 ５９ 下面、 Ｃ 内径、 Ｄ 深さ、 Ｄ１−２ 深さ、 Ｇ 高さ、 Ｓｔ 起点、 Ｖ１−２ 速度、 θ（theta） 角度

Claims (13)

1. 液体を保持するための凹部を備え、前記凹部が内底面を有し、前記内底面には複数のチャンバーからなるマイクロパターンが設けられている容器において、前記凹部で構成される空間に前記マイクロパターンを覆う蓋体を設け、
   前記蓋体の下面と前記マイクロパターンの間にある隙間に前記液体を行き渡らせることで、前記隙間を前記液体で満たしながら、前記マイクロパターンの表面を濡らす方法。
2. 前記蓋体を設けた後、前記蓋体の下面に接するいずれかの箇所に対して液体を供給しながら、前記箇所を起点にして、前記隙間に前記液体を行き渡らせる、請求項１に記載の方法。
3. 前記チャンバーに内接する球の直径が５μｍ〜１０００μｍであり、
   前記チャンバーの深さが５μｍ〜１０００μｍである、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記チャンバーの容積が０．０００１μｌ〜１０μｌである、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
5. 前記液体が、水または水溶液である、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. 前記蓋体の下面が前記凹部で構成される空間内に位置するように前記蓋体を設ける、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. 前記蓋体の下面が前記マイクロパターンに近接するように前記蓋体を設け、
   ここで、前記蓋体の下面が前記内底面に対して０．１〜１．２ｍｍ離間するように前記隙間が形成されることで、前記液体が前記隙間に対して浸潤しながら前記隙間に行き渡ることを妨げない、請求項６に記載の方法。
8. 前記隙間において前記液体に働く毛管現象により前記液体を前記隙間に行き渡らせる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記凹部の内底面が水平になるように前記容器を設置して行い、
   前記液体を前記凹部の上方又は側方より凹部内に注入することで、前記隙間に前記液体を供給する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
10. 前記マイクロパターンは各前記チャンバーを個別に仕切る壁を有し、
    前記壁により前記チャンバーは隣り合う他のチャンバーと完全に分離されており、
    前記チャンバーと前記壁とを覆うように前記蓋体を設ける、
    請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
11. 請求項１〜１０のいずれかに記載の方法を利用して前記マイクロパターンの表面を濡らし、
    前記蓋体を前記凹部から脱離させるとともに、前記マイクロパターンの表面を濡らすのには余剰となる前記液体を除去又は排出し、
    前記表面が濡れている前記マイクロパターンに対して粒子を懸濁した培養液を注ぐことで前記凹部内に粒子を分配するところ、
    前記液体には前記粒子が含まれていない、
    方法。
12. 前記容器は細胞培養容器であり、
    前記粒子はそれぞれ１又は２以上の細胞からなる、
    請求項１１に記載の方法。
13. 液体を保持する凹部を備える容器と蓋体との組み合わせ品であって、
    前記凹部は複数のチャンバーからなるマイクロパターンが設けられている内底面を有し、
    前記蓋体は前記凹部で構成される空間に対して挿入と脱離が自在であり、
    前記凹部で構成される空間に蓋体を設けた時、前記蓋体の下面と前記マイクロパターンの間にある隙間に前記液体を行き渡らせることで、前記隙間を前記液体で満たしながら、前記マイクロパターンの表面を濡らすことのできる、組み合わせ品。