KR20210000552A - 공배양용 마이크로웰 어레이 용기, 그 용기를 이용한 세포 공배양방법 및 공배양을 위한 용기 세트 - Google Patents

Abstract

공배양용 마이크로웰 어레이 용기 및 그 용기를 이용한 세포 공배양방법, 공배양을 위한 용기 세트가 개시된다. 본 발명의 마이크로웰 어레이 용기의 마이크로웰은 배양액을 수용하는 수용-공간을 형성하는 수용부와, 상기 수용부의 상부에 깔때기 형상으로 배치된 깔때기부를 포함한다. 수용부의 수용-공간의 바닥에는 관통홀인 공배양홀이 형성된다. 깔때기부는 수용부에 기포가 갇힌 경우에 기포 주위로 세포를 모아 도우넛 모양의 세포 덩어리를 만들고, 도어넛 모양의 세포 덩어리는 기포를 눌러 자연스럽게 배출하기 때문에, 기포를 제거하기 위해 사용자의 다른 동작이 필요없다. 공배양홀은 세포가 배출하는 생화학 분자보다 크고 상기 세포 덩어리보다 작게 마련하여 세포 덩어리가 공배양홀을 통해 배출되지 않도록 한다.

Description

공배양용 마이크로웰 어레이 용기, 그 용기를 이용한 세포 공배양방법 및 공배양을 위한 용기 세트{Microwell Container for Co-Culturing of Cells, Cell Co-Culturing Method Using the Said Container, and Container-Set}

본 발명은 세포를 마이크로웰(Microwell) 어레이가 형성된 용기에 관한 것으로서 마이크로웰 내에서의 세포 배양을 위해 마이크로웰 내의 기포를 제거하는 작업을 할 필요가 없고, 공배양(Co-Culturing)하기 위해 종래처럼 투과막을 구비할 필요가 없는 마이크로웰 용기, 그 용기를 이용한 세포 공배양 방법 및 공배양을 위한 용기 세트에 관한 것이다.

바이오 분야 연구에서 기본이 되는 과정 중 하나는 일정한 조건하에서 세포를 키우는 세포 배양(Cell Culture)이다. 세포 배양에는 합성수지나 유리 용기에서 세포를 평면적으로 성장시키며 배양하는 2차원 배양방법과, 세포를 모든 방향에서 성장시켜 덩어리 형태로 배양하는 3차원 배양방법이 있다. 2차원 배양에 비해 3차원 배양이 실제 생체 내의 3차원 세포 환경을 모사하는 것이기 때문에 3차원 배양이 주목을 받고 있으며, 3차원 세포 배양을 위해 마이크로웰 어레이(Microwell Array)가 널리 사용된다.

마이크로웰 어레이는 다량의 균일한 3차원 세포 배양을 위해 개발되었으며 세포 생물학, 항암제 개발 및 재생치료와 같은 연구 분야에서 널리 사용된다. 마이크로웰 어레이는 반구 형상 또는 U자 형의 단면 형상의 오목한 미세한 웰(Well)이 일정한 간격으로 배치된 것으로서, 용기 자체는 단순한 플레이트 형상일 수도 있고, 그릇과 같은 형태일 수도 있다. 도 1을 참조하면, 마이크로웰 어레이 용기(100)는 복수 개의 마이크로웰(111)이 형성된 바닥판(110)과, 세포 배양액을 담을 수 있도록 바닥판(110)을 둘러싸는 측벽(130)으로 구성된 그릇 또는 접시 형태이다. 세포들이 마이크로웰(111) 내부에서 타원체나 공 모양으로 뭉치면서 배양하도록 마이크로웰(111)의 표면은 세포가 바닥에 부착하지 못하도록 표면처리가 되어 있다.

마이크로웰을 이용해 세포를 배양하기 위해, (1) 연구자는 세포가 포함된 배양액을 마이크로웰 용기에 파종한 다음, 배양 조건을 맞추어 일정한 시간동안 배양한다. (2) 배양 과정에서 세포들은 분열을 반복하면서 배양되고, (3) 세포들 중에서 마이크로웰로 유입된 세포들이 서로 뭉치면서 덩어리로 성장한다. 43) 배양이 끝나면, 연구자는 세포 덩어리를 용기로부터 채취한다.

종래의 마이크로웰(111)은 도 2와 같이 주로 반구 형상 또는 U자 형의 단면 형상인데, 그것은 세포를 수용하는 기능이 다른 형상에 비해서 우수하고 세포들도 마이크로웰(111) 내에서 타원체나 공의 형태로 성장하기 때문이다.

다만, 마이크로웰(111)의 U자형 구조가 몇 가지 불편함을 만든다. 마이크로웰이 매우 미세한 크기의 U자형 구조이기 때문에, 배양액을 용기에 처음 파종하는 과정에서, 미세한 마이크로웰(111)을 채우고 있던 공기는 미처 빠져나오지 못하고 기포(v) 형태로 갇힌다. 마이크로웰(111)의 크기나 형태가 기포(v)를 가두기에도 적절하기 때문이다. 기포(v)가 배출되지 못하면 세포가 마이크로웰(111)로 들어갈 수 없기 때문에, 마이크로웰(111)을 이용한 3차원 배양 자체가 이루어지지 않는다. 세포 덩어리로 결합하지 못한다는 것은 배양액으로부터 회수할 수 없는 세포가 된다는 의미이므로, 결국은 유실된다. 이러한 문제를 해결하기 위해, 사용자들은 스포이드(Dropper)나 파이펫(Pipet) 등으로 배양액을 빨아올렸다가 다시 배출하는 소위 '파이펫팅(Pipetting)'을 수차례 반복하는데, 용기(100) 내의 배양액을 유동시킴으로써 마이크로웰(111)에 갇힌 기포를 제거하기 위한 것이다.

한편, 세포 공배양(Cell Co-Culture)은 배양액과 배양 조건을 공유하면서 두 개 이상의 다른 종류의 세포를 배양하여 성장시키는 방식이다. 두 개 종류의 세포가 직접 접촉하는 공배양과 두 종류의 세포가 서로 직접 접촉하지 않는 간접 접촉 방식의 공배양이 있다.

세포와 세포의 직접 접촉은 세포 자극(Stimulation), 유전자 경로(Gene Pathways)의 턴온/오프 및/또는 세포 분화(Cellular Differentiation) 등을 수반할 수 있다. 세포 간의 간접 접촉도 호르몬(Hormones), 시토카인(Cytokines), 엑소솜(Exosomes)과 같은 생화학 분자를 교환하면서 상호 간에 매우 중요한 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

간접 접촉 방식의 공배양의 경우에, 제1 용기에 제1 세포를 배양하고, 제2 용기에 제2 세포를 배양한 다음에, 서로 배양액을 공유하기 위해 제1 세포가 수용된 제1 용기를 제2 세포가 수용된 제2 용기에 담는다. 이때, 제1 용기를 트랜스웰(Transwell type) 또는 인서트(Insert)라고 부른다. 이때, 제1 용기의 바닥은 세포의 통과를 차단하되 시토카인 같은 생화학 분자를 통과시키는 투과막을 부착한다. 투과막은 보통 투명한 폴리에스테르 막(Polyester Membrane)을 사용한다. 투과막은 생화학 분자를 통과시켜 공배양을 가능하게 하지만 생화학 분자의 원할한 교환을 방해할 수밖에 없고 세포가 투과막에 붙어서 회수과정이 어렵다는 단점이 있다. 또한, 투과막이 부착된 용기는 제작공정도 까다롭다.

본 발명의 목적은 투과막을 대신해 마이크로웰 내에 관통홀(공배양 홀)을 뚫은 공배양용 마이크로웰 어레이 용기를 제안함에 있다. 출원인은 투과막을 이용하는 대신에 마이크로웰 내에 관통홀을 뚫는 방법을 생각했다. 관통홀을 통해 시토카인(Cytokines) 같은 생화학 분자들이 매우 빠르게 교환됨으로써 공배양이 매우 빠르고 효율적으로 진행되는 이점이 있다.

문제는 마이크로웰로 유입된 세포들이 미처 세포 덩어리로 성장하지도 못하고 관통홀을 통해 배출되는 것이었는데, 본 발명은 이러한 문제를 해겨한 것으로서 세포가 배양을 위해 마이크로웰로 유입될 때 관통홀보다 큰 덩어리 형태로 유입되도록 함으로써 공배양 과정에서 세포가 관통홀을 통해 배출되지 않도록 한 공배양용 마이크로웰 어레이 용기를 제안함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 파이펫팅을 하지 않더라도 배양액 내의 세포 덩어리가 마이크로웰을 차지하고 있는 기포를 밀어내고 용이하게 마이크로웰에 자리 잡을 수 있고 세포의 3차원 배양에도 유리한 마이크로웰 구조를 가지는 마이크로웰 어레이 용기를 제안함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로웰 어레이 용기를 포함한 공배양 용기 세트와 세포 공배양 방법을 제공함에 있다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 따른 마이크로웰 어레이 용기는, 배양액을 수용하기 위한 공간부를 형성하며, 상기 공간부의 바닥에 복수 개의 마이크로 웰(217)이 인접하게 배열되어 어레이(Array)를 형성되어 있다.

여기서, 상기 마이크로 웰(217)은 수용부(301)와 깔때기부(503)를 포함한다. 수용부(301)는 상기 배양액을 수용하는 수용-공간을 형성하고 상기 수용-공간의 바닥에 관통홀인 공배양홀(505)이 형성된다. 깔때기부(503)는 상기 수용부(501)의 상부에 깔때기 형상으로 형성되어, 상기 수용부(501)에 기포가 갇힌 경우에 상기 수용부(501a) 밖으로 돌출된 기포 주위로 세포를 모아 도우넛 모양의 세포 덩어리를 만든다. 상기 도어넛 모양의 세포 덩어리는 상기 기포를 눌러 자연스럽게 상기 수용부(501) 밖으로 배출하기 때문에, 기포를 제거하기 위해 사용자의 다른 동작이 필요없다.

또한, 상기 공배양홀(505)은 상기 세포가 배출하는 생화학 분자보다 크고 상기 세포 덩어리보다 작게 함으로써 도우넛 모양의 세포 덩어리가 상기 공배양홀을 통해 외부로 배출되지 않도록 해야 한다.

실시 예에 따라, 마이크로웰 어레이 용기는 상기 수용부의 내면에 도포되어 상기 기포와 수용부 사이의 마찰력을 줄이는 친수성 소재의 코팅면을 더 포함하여 상기 수용부에 갇히는 기포가 상기 세포에 의해 미끄러져 나오게 할 수 있다.

다른 실시 예에 따라, 마이크로웰 어레이 용기는 외벽에 마련되어 공배양을 할 때 다른 용기에 걸칠 수 있는 돌기부를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 발명은 제1 세포와 제2 세포를 공배양할 때 사용하는 공배양 용기 세트를 제시한다. 본 발명의 용기 세트는 상기 마이크로웰 어레이 용기와 베이스 용기를 포함한다. 상기 베이스 용기는 상기 제2 세포를 배양하며, 공배양을 위해 상기 마이크로웰 어레이 용기를 수용할 수 있어야 한다.

본 발명의 다른 발명은 제1 세포와 제2 세포를 공배양하기 위한 방법을 제시한다. 본 발명의 방법은, (제1 세포를 배양하는 단계) 제1항 내지 제3항 중에서 선택된 어느 하나의 마이크로웰 어레이 용기에 제1 세포를 배양하기 위한 배양액을 부어 제1 세포를 배양하되, 상기 수용부에 도우넛 모양의 제1 세포 덩어리가 수용되는 단계와; (제2 세포를 배양하는 단계) 상기 마이크로웰 어레이 용기를 수용하는 베이스 용기에 상기 제2 세포를 배양하는 단계와; (공배양 시작) 상기 제 세포가 배양된 마이크로웰 어레이 용기를 상기 제2 세포가 배양된 베이스 용기에 장착하되, 상기 마이크로웰 어레이 용기를 상기 베이스 용기의 바닥면으로부터 이격시켜 배치하는 단계와; (공배양을 위한 배양액의 추가) 상기 마이크로웰 어레이 용기를 통해 배양액을 추가하여 상기 제1 세포 덩어리와 제2 세포가 상기 수용부의 공배양홀을 통해 배양액과 생화학 분자를 상호 교환하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 마이크로웰 용기는 생화학 분자를 교환하고 세포의 유출을 차단하는 공배양홀(관통홀)을 구비함으로써 투과막을 대체했다. 공배양홀을 통해 시토카인 같은 생화학 분자의 교환이 매우 빠르게 일어나서 공배양이 매우 빠르고 효율적으로 진행된다. 투과막이 없기 때문에, 배양된 세포가 투과막에 붙어서 회수가 어려워지는 문제도 발생하지 않는다. 또한, 본 발명의 용기는 투과막을 부착하는 공정이 없기 때문에 제작공정이 간단하다.

또한, 본 발명의 마이크로웰 어레이 용기는 배양액을 담고 일정한 시간이 지나면 다른 동작을 하지 않더라도 마이크로웰에 갇힌 기포를 제거할 수 있기 때문에 사용자들은 기포를 제거하기 위한 인위적인 파이펫팅을 할 필요가 없다. 한편, 배양액 내의 세포들은 기포를 제거한 때에 이미 상당한 크기의 세포 덩어리로 성장한 상태이므로, 기포를 제거하고 마이크로웰에 유입되는 세포 덩어리는 공배양홀을 통해 배출되지 않는다.

도 1은 종래의 마이크로웰 어레이 용기의 일 예를 도시한 사시도,
도 2는 종래의 마이크로웰 어레이 용기의 일 예를 도시한 단면도,
도 3은 본 발명의 일 실시 예에 따른 세포 공배양 용기 세트를 도시한 도면,
도 4는 도 3의 세포 공배양 용기 세트가 공배양 과정에서 결합된 상태를 도시한 도면,
도 5는 본 발명의 일 실시 예에 따른 마이크로웰 어레이 용기의 부분 단면도,
도 6은 본 발명의 일 실시 예에 따른 마이크로웰 어레이 용기에서의 세포 배양과정을 도시한 도면,
도 7은 본 발명의 마이크로웰 어레이 용기를 사용한 공배양 과정을 설명하는 도면, 그리고
도 8은 본 발명의 마이크로웰 용기의 마이크로웰 부분의 평면을 찍은 현미경 사진,

이하 도면을 참조하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

도 3 및 도 4를 참조하면, 본 발명의 세포 공배양 용기 세트(300)는 본 발명이 적용되는 마이크로웰 어레이 용기(310)와 베이스 용기(350)를 포함하며, 세포 공배양에 사용한다.

마이크로웰 어레이 용기(310)와 베이스 용기(350)에 각각 다른 종류의 세포를 배양한 다음 서로 공배양에 제공된다. 이하에서는 설명의 편리를 위해 공배양에 사용되는 서로 다른 종류의 두 개 세포를 구분할 필요가 있을 때는 '제1 세포'와 '제2 세포'라고 구분한다. 제1 세포(Cell 1)는 마이크로웰 어레이 용기(310)에서 배양되는 세포를 가르키고, 다른 종류의 제2 세포(Cell 2)는 베이스 용기(350)에서 배양되는 세포를 가르킨다.

공배양 과정에서, 마이크로웰 어레이 용기(310)가 소위 트랜스웰(Transwell type) 또는 인서트(Insert)가 된다. 도 4에서처럼 본 발명의 마이크로웰 어레이 용기(310)가 베이스 용기(350) 내에 수용되면서, 두 개 용기(310, 350)의 배양액이 상호 공유되고 하나의 배양조건에서 공배양이 진행된다. 이때, 마이크로웰 어레이 용기(310)의 제1 세포(Cell 1)에서 배출되는 생화학 분자와 베이스 용기(350)에서 배양된 제2 세포(Cell 2)에서 배출되는 생화학 분자는 아래에서 설명하는 마이크로웰(317)의 공배양홀(Co-Culture Hole)(505)을 통해 상호 수직방향으로 교환된다.

우선, 베이스 용기(350)는 본 발명의 마이크로웰 어레이 용기(310)를 수용할 수 있는 것이면, 종래에 알려진 어떠한 종류의 용기이어도 무방하다. 본 발명의 설명에서는 베이스 용기(350)가 세포의 2차원 배양용을 사용하였기 때문에 도 7의 (c)에 도시된 것처럼 세포가 베이스 용기(350)의 바닥면(351)을 따라 성장하여 얇은 막처럼 부착되었지만, 세포의 3차원 배양용 용기를 사용해도 무방하다.

마이크로웰 어레이 용기(310)는 제1 세포(Cell 1)의 3차원 배양에 사용된다. 마이크로웰 어레이 용기(310)는 상면이 개방된 공간부(319)를 형성하여 배양액(cf)을 수용한다. 도 3에 예시적으로 도시된 마이크로웰 어레이 용기(310)는 바닥(311)과 바닥(311)의 가장자리를 둘러싸는 측벽(313)으로 구현된 원통형이지만, 이에 한정되지 않고 배양액(cf)을 수용할 수 있는 그릇이나 컵의 형상이면 어떠한 모양이어도 무방하다. 한편, 마이크로웰 어레이 용기(310)는 바닥과 측벽을 구분하기 어려운 곡면 형태일 수도 있고, 바닥(311)에 수직인 측벽(313)이 아닐 수도 있다.

마이크로웰 어레이 용기(310)가 수용할 수 있는 배양액의 양은 공간부(319)의 크기로 결정된다. 배양액을 마이크로웰 어레이 용기(310)에 담을 때 파이펫 등으로 계량하기 때문에 필수적인 것은 아니지만, 실시 예에 따라서는 공간부(319)의 내면에 정량 또는 최대량을 지시하는 눈금이 표시될 수도 있다.

한편, 마이크로웰 어레이 용기(310)의 내면에는 기준 높이가 표시되거나 기준높이를 지시하는 '기준높이-지시부'가 마련될 수 있다. 여기서, 기준높이는 아래에서 설명하는 것처럼, 배양액을 마이크로웰 어레이 용기(310)에 담는 과정에서 마이크로웰(317)에 갇힌 기포가 자연스럽게 배출되는데, 기포가 배출된 후에도 마이크로웰(317)의 공배양홀(505)을 통해 배양액이 배출되지 않는 높이(이하, '기준 높이'라 함)로서, 실험적으로 구할 수 있다. 도 3의 마이크로웰 어레이 용기(310)는 마이크로웰 어레이(315)의 주위로 턱(321)이 마련되어 있는데, 이 턱(321)이 '기준높이-지시부'가 된다. 턱(321)의 높이가 기준 높이, 또는 배양액의 기준 양을 지시할 수 있다.

마이크로웰 어레이 용기(310)는 다양한 소재로 구현될 수 있으며, 배양 과정을 볼 수 있도록 투명한 소재로 구현되는 것이 좋다. 다만, 아래에서 설명하는 것처럼 마이크로웰(317)의 수용부(501) 내면은 친수성 소재로 코팅되는 것이 좋다.

마이크로웰 어레이 용기(310)의 바닥면(503a)에는 마이크로웰 어레이(315)가 형성되어 있다. 마이크로웰 어레이(315)는 복수 개의 마이크로웰(317)이 나란하게 배치된 것으로서, 배양된 세포들이 마이크로웰(317) 내에서 3차원으로 뭉쳐지면서 세포 덩어리가 된다.

공간부(319)의 내면에는 세포가 안착할 수 있는 평평한 부분이 없는 것이 좋다. 평평한 면에 안착한 세포들은 마이크로웰(317)로 들어가지 못하기 때문에 세포 덩어리로 성장하지 못하는데, 세포 덩어리로 성장하지 못한 세포들은 회수할 수 없기 때문이다. 그런 측면에서, 마이크로웰(317) 사이의 격벽 상부에는 평평한 부분이 없는 것이 좋다. 도 5 및 도 8의 예에서, 공간부(319)의 바닥면은 마이크로웰 어레이(315)가 배치되면서 전체가 경사면으로 구현되어 있다.

본 발명은 마이크로웰(317)에서 기포(v)의 배출을 용이하게 하는 형상을 제시한다. 도 5의 단면도를 참조하면, 본 발명의 마이크로웰(317)은 세포들을 수용하는 수용-공간을 형성하는 수용부(501)와, 수용부(501)의 상부에 마련된 깔때기부(503)를 포함한다. 깔때기부(503)는 수용부(501)의 상부에 마치 깔때기와 같은 공간을 형성하기 때문에, 마이크로웰(317)은 마치 수용부(501)의 위쪽에 깔때기가 부착된 형상이다. 깔때기부 입구(503a)는 수용부 입구(501a)보다 큰 단면적으로 구현됨으로써, 깔때기부(503)의 내면은 경사면으로 형성된다.

한편, 수용부와 깔때기부의 구분이 없이 전체가 동일한 경사면으로 되어, 마이크로웰의 수직단면의 형상이 역삼각형인 웰(Well)은 기포 자체가 갇히는 일이 생기지 않을 수도 있지만, 세포를 가두어 수용하는 성능도 그만큼 떨어져 배양된 세포를 유실할 가능성이 크다.

깔때기부 입구(503a)의 형상이나 수용부(501) 수용-공간의 수평방향 단면의 형상은 어떤 것이어도 무방하다. 예를 들어, 도 8은 마이크로웰(317)의 평면을 찍은 사진으로서, 깔때기부 입구(503a)의 형상은 육각형으로 하고, 수용부(501) 수용-공간의 수평방향 단면은 원형으로 구현되었다.

마이크로웰(317)로부터 기포를 더욱 쉽게 제거하기 위해서, 마이크로웰(317)을 구성하는 수용부(501)와 깔때기부(503)의 내면에는 친수성 소재 물질의 코팅면을 생성하는 것이 좋다. 친수성 물질이 기포와 수용부(501) 내벽 사이의 마찰력을 최소화시킴으로써 기포가 쉽게 배출되도록 한다. 코팅면은 1회용이어도 충분하다. 예를 들어, 플루로닉 에프(Pluronic F) 127 용액과 같은 친수성 코팅 물질을 사용할 수 있는데, 마이크로웰 어레이 용기(310)에 플루로닉 에프 127 용액을 하루 정도 담아 두면 마이크로웰(317)의 내면이 전부 코팅된다.

마이크로웰(317)의 수용부(501)의 수용-공간은 종래의 마이크로웰(111)처럼 수직한 단면의 형상이 반원또는 U자형인 공간으로 구현되어 배양액과 세포 덩어리를 수용할 수 있는 것이 좋다. 수용부(501)의 수용-공간 바닥에는 외부로 관통된 관통홀인 공배양홀(505)이 마련된다. 공배양홀(505)은 종래의 투과막을 대신하여 공배양 과정에서 생화학 분자가 이동하는 통로 역할을 한다.

도 5, 도 6 및 도 8의 마이크로웰(317)의 수용부(501)는 단면 형상이 U자형이고, 공배양홀(505)은 U자형 수용부(501)의 수용-공간의 바닥 중심에 마련되어 마치 U자형 수용부(501)의 바닥 가운데 부분을 잘라낸 듯한 모양이다.

공배양홀(505)은 물리적 막이 아니기 때문에 물질이 통과할 수 있어서, 배양액이나 세포 또는 세포에서 배출되는 생화학 분자 등이 공배양홀(505)을 통해 이동할 수 있다. 다만, 공배양 과정에서 배양액과 생화학 분자는 이동해야 하지만 세포가 이동하면 안 되기 때문에, 공배양홀(505)은 세포가 이동할 수 없는 크기로 결정되어야 한다. 본 발명은 세포가 통과할 수 없는 미세한 공배양 홀을 구현하는 대신에, 세포를 공배양홀(505)보다 큰 덩어리 형태로 미리 성장시킴으로써 세포 덩어리가 공배양홀(505)을 통해 배출되지 않도록 하는 방법을 제시한다. 본 발명에서 세포들은 기포가 제거되면서 공배양홀(505)이 개방되기 전에 도우넛 형태의 세포 덩어리로 성장한다. 따라서, 배양액과 생화학 분자는 이동할 수 있지만 세포 덩어리는 이동할 수 없는 크기의 공배양홀(505)은 용이하게 마련할 수 있다. 예를 들어, 실험에 의하면 대략 50㎛ ~ 300㎛ 직경의 공배양홀(505)이면 이러한 조건을 만족할 수 있다.

또한, 이러한 정도 크기의 공배양홀(505)은 아래 도 6의 과정을 통해 제1 세포(Cell 1)를 배양할 때, 공배양홀(505)에 걸쳐 생기는 장력에 의해 배양액이 외부로 유출되지 않는다. 이때 장력의 크기는 마이크로웰 어레이 용기(310)가 수용하는 배양액의 양에도 관련될 수 있으므로, 앞서 설명한 기준높이와 관련될 수 있다. 따라서 공배양홀(505)의 크기에 맞추어 기준높이 또는 턱(321)의 높이를 결정할 수 있다. 공배양홀(505)에 걸쳐 생기는 장력을 강화하기 위해, 도 5 및 도 6에서처럼 수용부(501)의 바닥면은 곡면(U자형 단면의 일부)인 것이 좋다.

마이크로웰 어레이 용기(310)는 베이스 용기(350)의 벽에 걸칠 수 있는 돌기부(323)를 더 포함할 수 있다. 마이크로웰 어레이 용기(310)가 공배양을 위해 베이스 용기(350) 내에 배치될 때, 마이크로웰 어레이 용기(310)가 베이스 용기(350)의 바닥면(351)에 닿아서는 안 된다. 베이스 용기(350)의 바닥면(351)에 제2 세포(Cell 2)가 배양되고 있기 때문이다. 따라서, 공배양을 위해 마이크로웰 어레이 용기(310)를 베이스 용기(350)에 장착할 때, 두 개 용기를 이격시키기 위한 구조가 필요하다.

예를 들어, 도 3의 마이크로웰 어레이 용기(310)는 베이스 용기(350)의 벽에 걸칠 수 있는 돌기부(323)를 포함하고 베이스 용기(350)보다 작은 높이로 구현한 예이다. 다른 방법으로, 베이스 용기(350)의 내벽에 마이크로웰 어레이 용기(310)의 위치를 고정하기 위한 지지부(미도시)를 마련할 수도 있다. 베이스 용기(350)의 지지부(미도시) 형태에 따라서는, 베이스 용기(350)의 지지부(미도시)와 결합하는 돌기가 마이크로웰 어레이 용기(310)의 외벽에 마련될 수도 있다.

마이크로웰 어레이 용기를 이용한 제1 세포의 배양 (도 6)

공배양을 위해, 마이크로웰 어레이 용기(310)와 베이스 용기(350)에는 공배양에 사용될 제1 세포와 제2 세포를 나누어 각각 우선 배양해야 한다. 이하에서는, 마이크로웰 어레이 용기(310)를 이용하여 배양액을 파종하고 제1 세포(Cell 1)를 배양하는 방법을 도 3 내지 도 6을 참조하여 설명한다.

<마이크로웰 어레이 용기의 준비: 도 6의 (a)>

우선, 마이크로웰 어레이 용기(310)를 준비한다. 앞서 설명한 것처럼, 배양액(cf)을 마이크로웰 어레이 용기(310)에 담기 전에, 마이크로웰 어레이 용기(310)에 친수성 물질의 용액을 담아 마이크로웰(317)의 내벽에 친수성 물질을 코팅하는 것이 좋다.

아직 배양액을 마이크로웰 어레이 용기(310)에 붓지 않은 상태이므로, 마이크로웰(317)은 공기로 채워져 있다.

<배양액의 파종: 도 6의 (b)>

사용자는 스포이드나 파이펫 등을 이용하여 마이크로웰 어레이 용기(310)에 배양액(cf)을 붓는다. 배양액(cf)에는 배양 대상이 되는 제1 세포(Cell 1)들이 포함되어 있다. 배양액을 반드시 기준높이에 맞추어 턱(321)까지 담을 필요는 없다. 기준높이 이상을 부어도 무방하고 기준높이 이하로 부어도 좋다.

배양액(cf)이 공급될 때, 마이크로웰(317) 내에 있는 공기는 미처 빠져나오지 못하고 기포(v1)형태로 갇힌다. 기포(v1)의 상부는 수용부 입구(501a) 밖으로 돌출되어 있다. 마이크로웰(317)의 중앙에 공배양홀(505)이 뚫려 있지만, 수용부(501)에 기포(v1)가 차서 공배양홀(505)을 막기 때문에 배양액(cf)이 외부로 배출되지 않는다. 연구자가 마이크로웰 어레이 용기(310)를 들고 있거나 공중에 띄워 둔 상태를 유지해도 좋고, 테이블 등에 올려놓아도 마찬가지다.

<기포의 제거: 도 4의 (c)>

배양액(cf)내의 제1 세포(Cell 1)들은 계속 분열하면서 증식한다. 배양액(cf)을 마이크로웰 어레이 용기(310)에 파종한 다음에 마이크로웰 어레이 용기(310)를 일정한 시간 이상 가만히 두면, 제1 세포(Cell 1)들은 중력에 의해 천천히 깔때기부(503)로 내려앉는 다음, 깔때기부(503)의 경사면을 따라 수용부(501)로 모인다. 수용부(501)는 기포(v)가 자리하고 있기 때문에, 제1 세포(Cell 1)들은 수용부 입구(501a) 근처에 모이면서 기포(v1)의 가장자리를 따라 도우넛(Donut) 형태로 쌓인다.

모여진 제1 세포(Cell 1)들은 하나의 덩어리로 응집하여 공 모양으로 뭉치는 과정을 진행한다. 기포(v1)의 상부 가장자리에 쌓이는 제1 세포(Cell 1)들도 서로 응집하여, 처음에는 기포(v)를 둘러싸는 도우넛 형상의 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)가 되지만 계속 서로를 끌어당겨 공 모양으로 뭉쳐지는 과정을 진행한다. 이 공 모양으로 응집하는 과정에서 도우넛 형상의 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)는 기포(v1)의 상부를 조이면서 기포(v1)의 형태를 변형시킨다.

기포(v1)가 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)에 의해 일정한 수준 이상으로 조여지면서 변형되면, 기포(v1)는 수용부(501)로부터 탈출한다. 실시 예에 따라, 수용부(501)의 내면에 친수성 물질이 코팅되었다면, 기포(v)와 수용부(501) 내면 사이의 마찰력이 줄어 더욱 쉽게 기포(v1)가 탈출할 수 있다. 도 6에서 일부 기포(v2)는 이미 수용부(501)로부터 탈출된 상태를 도시하고 있다. 기포(v2)가 수용부(501)로부터 탈출하면, 도 8의 사진처럼 수용부(501)에는 배양액(cf)과 도어넛 모양의 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)가 유입된다. 도우넛 모양의 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)는 공배양홀(505)보다 크기 때문에, 공배양홀(505)을 통해 외부로 유출되지 않는다. 다시 말해, 본 발명에서는, 기포(v1, v2)가 제거되면서 공배양홀(505)이 개방될 때는, 이미 제1 세포(Cell 1)들이 세포 덩어리 형태로 성장된 상태가 되어 수용부(501)로 유입된다. 이러한 특징으로 공배양홀(505)을 만들어도 세포 덩어리가 외부로 배출될 위험이 없다.

수용부(501)에 도어넛 모양의 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)가 유입된 후에는, 배양액 내의 더 많은 제1 세포(Cell 1)들이 계속 수용부(501)로 유입되면서 도우넛 모양의 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)와 결합한다. 필요에 따라, 배양액을 추가하고 더 오랜 시간동안 세포를 배양할 수 있다.

마이크로웰(317)의 기포(v1, v2)는 상당히 긴 시간동안 천천히 제거되기 때문에, 기포가 제거되기 전이라도 마이크로웰 어레이 용기(310)를 세포 배양에 적합한 환경 조건에 둠으로써 세포의 배양을 시작할 수 있다. 예를 들어, 마이크로웰 어레이 용기(310)를 인큐베이터(Incubator, 미도시)에 넣고 배양을 시작하면, 인큐베이터 내에서 세포들에 의해 기포가 자연스럽게 제거된다.

도우넛 모양의 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)는 시간이 경과함에 따라 공이나 타원체(Spheroid) 모양으로 바뀔 수 있다.

이상의 방법으로 본 발명의 마이크로웰 어레이 용기(300)를 이용한 배양액의 파종 및 기포 제거가 수행된다. 따라서 종래처럼, 마이크로웰에 갇힌 기포를 제거하기 위해 연구자가 따로 파이펫팅을 할 필요가 없다. 공배양홀(505)이 있어도, 배양된 세포가 외부로 배출되지 않는다.

마이크로웰 어레이 용기를 이용한 세포 공배양 (도 7)

공배양을 위해, 마이크로웰 어레이 용기(310)와 베이스 용기(350)에는 공배양에 사용될 제1 세포와 제2 세포를 나누어 각각 우선 배양해야 한다.

<마이크로웰 어레이 용기를 이용한 제1 세포 배양: 도 7의 (a)>

도 6의 방법을 이용하여 제1 세포(Cell 1)를 마이크로웰 어레이 용기(310)에서 3차원 배양한다. 마이크로웰 어레이 용기(310)의 마이크로웰(317)에는 배양된 제1 세포덩어리(Cell 1 Clump)가 유입되어 있다. 이때, 기포(v1, v2)가 제거되는 과정에서 제1 세포(Cell 1)들은 이미 도우넛 형태의 세포 덩어리로 성장한 상태로 수용부(501)에 유입된다는 점이 중요하다.

<베이스 용기를 이용한 제2 세포 배양: 도 7의 (b)>

또한, 베이스 용기(350)에 제2 세포(Cell 2)들을 2차원 배양하여 준비한다. 베이스 용기(350)에서 배양된 세포들은 바닥면(351)에서 2차원적(평면적)으로 성장하면서 배양된다.

<공배양 시작 : 도 7의 (c)>

제1 세포(Cell 1)가 배양된 마이크로웰 어레이 용기(310)를 제2 세포(Cell 2)가 배양된 베이스 용기(350)에 넣는다. 베이스 용기(350)의 바닥면(351)에 제2 세포(Cell 2)가 배양되어 있기 때문에, 마이크로웰 어레이 용기(310)의 바닥은 베이스 용기(350)의 바닥면(351)로부터 이격되어 있어야 한다. 도 4의 실시 예와 같이, 마이크로웰 어레이 용기(310)의 돌기부(323)가 베이스 용기(350)에 걸침으로써 마이크로웰 어레이 용기(310)는 베이스 용기(350)의 바닥면(351)로부터 이격된 상태로 그 위치가 고정된다.

<공배양을 위한 배양액의 추가 : 도 7의 (d)>

마이크로웰 어레이 용기(310)를 베이스 용기(350)에 장착한 후에, 마이크로웰 어레이 용기(310)를 통해 배양액(cf)을 추가한다. 배양액(cf)은 마이크로웰 어레이 용기(310)의 마이크로웰(317)마다 마련된 공배양홀(505)을 통해 베이스 용기(350)로 유입된다. 따라서 베이스 용기(350)에도 배양액(cf)이 채워지면써, 마이크로웰 어레이 용기(310)와 베이스 용기(350)는 배양액(cf)을 상호 공유하게 된다. 이후에, 제1 세포덩어리(Cell 1 Spheroid)에서 배양액(cf)으로 배출되는 생화학 분자의 일부는 공배양홀(505)을 통해 베이스 용기(350) 쪽으로 이동하게 되고, 마찬가지로 제2 세포(Cell 2)들에서 배양액(cf)으로 배출되는 생화학 분자의 일부도 공배양홀(505)을 통해 마이크로웰(317)의 수용부(501) 내부로 이동하면서 상호 교류하게 된다. 서로 다른 세포들에서 배출되는 생화학 분자들에 의해 제1 세포와 제2 세포의 배양이 영향을 받으면서 공배양이 수행된다.

공배양은 종래와 같은 투과막(Membrane)이 없이 공배양홀(505)을 통해 직접 이루어진다. 따라서 생화학 분자의 교환이 매우 빠르게 일어나서 공배양 과정이 매우 빠르고 효율적으로 진행된다. 그뿐만 아니라, 배양된 세포가 투과막에 붙어서 회수가 어려워지거나 불가능한 문제도 발생하지 않는다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시 예에 대하여 도시하고 설명하였지만, 본 발명은 상술한 특정의 실시 예에 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변형실시가 가능한 것은 물론이고, 이러한 변형실시들은 본 발명의 기술적 사상이나 전망으로부터 개별적으로 이해되어서는 안 될 것이다.

300: 세포 공배양 용기 세트
310: 마이크로웰 어레이 용기
311: 바닥 313: 측벽
315: 마이크로웰 어레이
317: 마이크로웰 319: 공간부
321: 턱 323: 돌기부
350: 베이스 용기
351: 베이스 용기의 바닥면
501: 수용부 501a: 수용부 입구
503: 깔때기부 503a: 깔때기부 입구
505: 공배양 홀 v1, v2: 기포
cf: 배양액

Claims (5)

1. 마이크로웰 어레이 용기에 있어서,
   배양액을 수용하기 위한 공간부를 형성하며, 상기 공간부의 바닥에 복수 개의 마이크로웰(317)이 인접하게 배열되어 어레이(Array)를 형성되고,
   상기 마이크로웰(317)은,
   상기 배양액을 수용하는 수용-공간을 형성하고 상기 수용-공간의 바닥에 관통홀인 공배양홀(505)이 형성된 수용부(501); 및
   상기 수용부(501)의 상부에 깔때기 형상으로 형성되어, 상기 수용부(501)에 기포가 갇힌 경우에 상기 수용부(501a) 밖으로 돌출된 기포 주위로 세포를 모아 도우넛 모양의 세포 덩어리를 만드는 깔때기부(503)를 포함하여 상기 도어넛 모양의 세포 덩어리가 상기 기포를 눌러 상기 수용부(501) 밖으로 배출하며,
   상기 공배양홀(505)은 상기 세포가 배출하는 생화학 분자보다 크고 상기 세포 덩어리보다 작은 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이 용기.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 수용부의 내면에 도포되어 상기 기포와 수용부 사이의 마찰력을 줄이는 친수성 소재의 코팅면을 더 포함하여 상기 수용부에 갇히는 기포가 상기 세포에 의해 미끄러져 나오게 하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이 용기.
   
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   외벽에 마련되어 다른 용기에 걸칠 수 있는 돌기부를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 마이크로웰 어레이 용기.
   
4. 제1 세포와 제2 세포를 공배양하기 위한 공배양 용기 세트로서,
   상기 제1 세포를 3차원 배양하는 제1항 내지 제3항 중에서 선택된 어느 하나의 마이크로웰 어레이 용기; 및
   상기 제2 세포를 배양하며, 상기 마이크로웰 어레이 용기를 수용하는 베이스 용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 공배양 용기 세트.
   
5. 제1 세포와 제2 세포를 공배양하기 위한 방법에 있어서,
   (제1 세포를 배양하는 단계) 제1항 내지 제3항 중에서 선택된 어느 하나의 마이크로웰 어레이 용기에 제1 세포를 배양하기 위한 배양액을 부어 제1 세포를 배양하되, 상기 수용부에 도우넛 모양의 제1 세포 덩어리가 수용되는 단계;
   (제2 세포를 배양하는 단계) 상기 마이크로웰 어레이 용기를 수용하는 베이스 용기에 상기 제2 세포를 배양하는 단계;
   (공배양 시작) 상기 제 세포가 배양된 마이크로웰 어레이 용기를 상기 제2 세포가 배양된 베이스 용기에 장착하되, 상기 마이크로웰 어레이 용기를 상기 베이스 용기의 바닥면으로부터 이격시켜 배치하는 단계; 및
   (공배양을 위한 배양액의 추가) 상기 마이크로웰 어레이 용기를 통해 배양액을 추가하여, 상기 제1 세포 덩어리와 제2 세포가 상기 수용부의 공배양홀을 통해 배양액과 생화학 분자를 상호 교환하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세포 공배양방법.
   
   
   
   
   

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