WO2007114351A1 - 新規細胞培養方法、およびその方法を用いた細胞塊の生産および回収方法 - Google Patents

新規細胞培養方法、およびその方法を用いた細胞塊の生産および回収方法 Download PDF

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culture
cell
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cells
culture solution
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PCT/JP2007/057135
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French (fr)
Inventor
Fumiyuki Hattori
Keiichi Fukuda
Original Assignee
Asubio Pharma Co., Ltd.
Keio University
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0606—Pluripotent embryonic cells, e.g. embryonic stem cells [ES]

Definitions

  • the present invention relates to a method for efficiently producing a cell mass that is an aggregate of cells having high uniformity.
  • Non-patent Document 1 In order to express liver function and perform screening of therapeutic agents using the prepared cell mass, a cell group that is uniform in size and shape and properties, that is, a homogeneous cell mass population It is necessary to produce.
  • the three-dimensional culture can reflect the properties of solid cancer and can immediately evaluate the correct drug effect as a result rather than the two-dimensional culture.
  • Non-Patent Document 2 When screening for anticancer drugs using the produced cell mass using 3D culture, low noise and homogeneity between cell masses are required to obtain reliable results. It becomes.
  • embryonic stem cells also referred to as ES cells
  • ES cells embryonic stem cells
  • a cell development program called embryoid body starts and differentiates into various types of biological tissue cells while proliferating.
  • a homogeneous embryoid body can be prepared and used, so that it can be appropriately differentiated into desired cells, and efficient differentiation into desired cells can be achieved. It can be carried out.
  • the bacterial dish method is a method in which floating cells are stochastically brought into contact with each other by culturing cells in a plastic dish that has been treated so that the cells do not adhere, and a cell mass is gradually formed.
  • a uniform group of cell masses cannot be formed as a result of the uniform number of cells constituting one cell mass.
  • the swirl culture method is a modification of the bacterial dish method described above, and the swirl movement is performed when culturing the cells in a culture vessel with low cell adhesion. It is a method that attempts to make the size between cell clusters uniform by increasing the method over the Rudish method. Although this method is superior to the bacterial dish method in terms of homogeneity between cell masses, it still has problems in terms of homogeneity, and cell masses that can be produced per unit area in culture. Since the number is small, there is a problem in terms of industrial use where production efficiency is poor.
  • Bioreactor method (Non-patent Document 3) is a method in which a culture instrument is always rotated in a certain direction, similar to swirl culture method.
  • swirl culture method is different in that the rotation direction is vertical. It is different.
  • this method also has a low production efficiency because the number of cell clusters that can be produced per unit area in the culture that can be produced is small, as is the case with the swirling culture method. There is a problem in terms of industrial use.
  • a thickening agent such as methylcellulose is added to a cell suspension to suppress convection in the solution, and individual cells are separated and suspended to form cell masses by the growth of single cells. Is the method.
  • a difference in the environment tends to occur between the solution portion in contact with the outside air and the inside of the solution. It is difficult to form a homogeneous cell mass due to the difference in conditions.
  • the cell suspension is injected into a 96-well round bottom plate for cell culture that has been surface-treated so that the cells do not adhere, and the cells descend by their own weight to the bottom of the round bottom of each well.
  • This is a method of forming a cell mass.
  • an almost constant amount of cell suspension can be injected into each well, so that each cell can form a cell cluster based on a uniform initial cell count, and a relatively uniform group of cells.
  • a mass can be made.
  • problems in terms of efficiency for example, it is very difficult to recover the cell mass present at the bottom of the well without physically damaging it.
  • special treatment for inhibiting cell adhesion on the plate surface increases the cost and causes problems in terms of productivity.
  • Non-patent document 4 The encapsulation method (Non-patent document 4, Non-patent document 5) is characterized in that a plurality of cells are encapsulated in a gelled alginate capsule and the cells are grown in the gel to form a cell mass. This is the method.
  • drugs such as agarose alginate for encapsulating is essential, and it is necessary to confirm safety in order to use the prepared cell mass for therapeutic purposes.
  • the cells in each capsule proliferate to form a cell mass, the cell mass aggregates to form a cell mass. If it is low, there will be problems.
  • a cell suspension is attached to the lower surface of a planar support, and the cell suspension is held in a state of hanging from the lower surface of the planar support using surface tension.
  • This is a method for producing a cell mass utilizing the fact that cells descend by their own weight and naturally gather at the bottom of the solution (Non-patent Document 6). Therefore, by making the amount of cell suspension attached to the lower surface of the flat support constant, the initial number of cells for forming each cell mass can be reduced.
  • the culture conditions for producing the cell mass are not changed because it is relatively easy to make uniform and gas exchange with the outside air is performed on the solution surface where the cell mass exists. It is possible to keep the most uniform and immediately form the cell mass with the most uniform properties.
  • the hanging drop method can produce a homogeneous group of cell masses, but has a problem in terms of efficiency and productivity required for industrial use.
  • Non-Patent Document 1 Roberts RA and Soames AR., Fundam Appl Toxicol. 1993 21 (2): 149-158
  • Non-Patent Document 2 Mellor HR, et al., Br J Cancer. 2005 93 (3): 302-309
  • Non-Patent Document 3 Gerecht-Nir S, et al., Biotechnol Bioeng. 2004 86 (5): 493-502
  • Non-Patent Document 4 Magyar JP, et al "Ann N Y Acad Sci. 2001 944: 135-143
  • Non-Patent Document 5 Dang SM, et al., Methods Mol Biol. 2005; 290: 353-364
  • Non-Patent Document 6 Singla DK and Sob el BE, Biochem Biophys Res Commun. 2005 335 (3)
  • the present invention has been made in view of the problems of the conventional cell culturing method described above. It is an object of the present invention to provide a method for culturing cells that can be cultivated uniformly and in large quantities, and a method for easily and easily producing a group of cell masses having uniform shapes and properties such as size and shape.
  • the inventors of the present invention make a projecting portion of the culture solution at the lower open end of the structure having a cavity that is open at least at the lower end, and the cells in the projecting portion of the culture solution. It has been found that the above-mentioned problems can be solved by cultivating the present invention, and the present invention has been completed.
  • a culture solution containing cells is injected into the cavity of the structure having a cavity that is open at least at the lower end, and a part of the culture solution is obtained. Projecting downward from the open end, and culturing the cells at the projecting portion of the culture solution.
  • the other end of the cavity is closed, and the culture medium is injected into the cavity with the open end facing upward and a part of the culture medium is the open end. It is also possible to make the opening end face downward by making it protrude upward.
  • the other end of the cavity is open, and the culture medium is injected into the cavity from the open end on the other end side with the open end on the one end side facing down. After the injection of the culture solution, the open end on the other end side may be closed.
  • the other end of the cavity is open, and the culture solution is injected into the cavity by immersing the open end on the one end side in the culture solution, and opening on the other end side. You may make it carry out by attracting
  • a plurality of the cavity portions may be formed in the structure body, whereby a plurality of cells can be cultured simultaneously.
  • a method for producing a cell mass according to the present invention is characterized in that a cell mass is formed by culturing cells by the cell culturing method described above.
  • a part of the culture solution protruding downward from the open end on the one end side is brought into contact with a solution surface of another culture solution, whereby the cell mass is placed in the other culture solution. You may make it collect
  • FIG. 1 shows a state in which a culture solution (la) is injected into a structure (1) having a cavity (lb) having an opening at the lower end to project the culture solution.
  • a new method provided by the present invention by holding at (la) is shown.
  • FIG. 2 illustrates a method for producing a protruding portion (la ′) of a culture solution using the structure (1) shown in FIG.
  • FIG. 3 shows that both ends of the cavity (lc) of the structure (1) having the cavity are opened, and the culture solution (la) is injected into the cavity (lb) to inject the culture solution.
  • Fig. 4 shows another embodiment of the new method provided by the present invention that can be held in a protruding state (la ').
  • FIG. 4 exemplifies a method of sucking the culture solution (a) from the upper opening as a method for producing the protruding portion of the culture solution using the structure (1) shown in FIG. To do.
  • FIG. 5 is a schematic diagram of an application example of a culture plate (FIG. 5 (A)) and an enlarged view thereof (FIG. 5 ( B)).
  • Fig. 6 shows a schematic diagram of a method for recovering the prepared embryoid body, which is a cell cluster prepared in Example 2, in a solution.
  • Fig. 7 shows the relationship between the inner diameter of the well of the plate when using an existing plate and the appropriate amount of solution that can form a cell mass by constructing the raised portion of the culture medium. Show.
  • FIG. 8 shows a photomicrograph of the uniform embryoid body produced in Example 2.
  • FIG. 1 (A) and (B) a structure (1) used in the cell culture method of the present invention is schematically shown.
  • the structure (1) has a cavity (lb) into which a culture solution (la) containing cells is injected.
  • the structure (1) has an upside down cup of uniform diameter, one end of the cavity (lb) (ie, the lower end in Fig. 1) is open, and the other end (ie, the figure). 1 at the top) is closed.
  • FIG. (1) has a shape in which a cup whose diameter changes linearly is turned upside down, and this also has one end of the cavity (lb) open and the other end closed.
  • the closed side may have any shape, for example, as shown in FIGS. 1A and 1B, and may be rounded or rounded.
  • the volume of the cavity (lb) is determined in consideration of the type of cells to be cultured and the size of the cell mass to be finally produced.
  • the culture solution (la) containing the cells is such that a part (la ') of the culture solution protrudes downward from one end of the cavity, that is, the open end of the lower end. Being injected.
  • the structure (1) is arranged so that the open end of the cavity (lb) is on the upper side.
  • the culture medium (la) is injected into the cavity (lb) so that a part (la ′) protrudes upward from the open end of the cavity, that is, the structure (1) is introduced. It may be turned upside down.
  • the cells contained in the culture solution are self-weighted and are contained in the culture solution. Are gathered in the part (la ') protruding downward from the open end force, forming a cell mass.
  • the structure may not be a cup shape as shown in FIG. 1, but may be a cylindrical shape or a tube shape with both ends opened as shown in FIG. That is, in FIGS. 3A to 3C, the hollow portion (lc) of the cylindrical or tubular structure (1) is open at both the upper and lower ends.
  • the upper end of the structure (1) is connected to a culture solution supply source via a supply pipe and a flow rate control valve (not shown), The flow rate control valve is opened and a predetermined amount of the culture solution is supplied from the culture solution supply source into the cavity (lc) of the structure through the supply pipe.
  • the lower end of the culture solution is shown in FIG. As shown in (C), it is made to project below the lower open end of the cavity of the structure (la '). This can be achieved by adjusting the amount of air supplied to the upper part of the culture medium at the upper open end of the cavity.
  • the lower end of the structure is immersed in the culture medium a so that the lower open end of the cavity is closed with the culture medium.
  • Shown on top of structure (1) Connect a non-aspirating tube and suck air from the top of the cavity (lc), suck a predetermined amount of the culture medium (a) into the cavity (lc) of the structure, and then raise the structure (1) Make sure that the bottom edge of the lever is away from the culture surface.
  • a predetermined amount of the culture solution is stored in the structure, and a part of the culture solution is transferred from the lower end of the structure, that is, from the open end on the lower end side of the cavity. Since the cell clumps are made to protrude downward, and the cell clumps are formed at the protruding portions, the cell clumps have a uniform quality compared to conventional methods such as the hanging drop method, which creates a build-up force of the solution on the flat substrate. Can be produced efficiently.
  • the lower end is open, and the cell is formed at the lower open end of the structure having a hollow portion. It is necessary to make a protruding part of the suspension culture.
  • the cross section of the structure (1) that contains the solution containing the cell group introduces a solution in which cells are suspended in the structure, and a state in which the solution is raised from the lower open end of the structure is formed. As long as it is a thing, the shape is not limited.
  • the material of the structure may be any material used in the technical field, such as polypropylene, polystyrene, or silicon. Such a material is preferably a material that does not easily adhere to cells, or a material that has been subjected to a surface treatment that prevents cells from adhering.
  • cells are cultured to form a cell mass.
  • the number of cells contained in the culture solution ie, the sum of la and la ′
  • the cells to be cultured should be contained at a constant concentration in the culture medium, and the amount of the culture medium contained in the structure having the cavity portion should be constant. It is necessary to keep it.
  • the concentration of the cells contained in the culture solution and the amount of the culture solution contained in the structure having the cavity are determined by the growth rate of the cells, the size of the cell mass to be formed, and the number of days of culture for forming such a cell mass. Those skilled in the art can appropriately determine the conditions.
  • the culture method of the present invention can be used with any cell that attempts to form a cell mass, and there are no particular restrictions on the cells that can be applied. For example, it is particularly suitable for culturing cells that are desired to form cell clusters such as embryonic stem cells and hepatocytes. Yes.
  • FIG. 5 shows an embodiment in which a plurality of cavities are formed in one flat structure, thereby producing a large number of cell masses at once.
  • a cell culture plate having a high-density tool that is, a cavity, such as 384 tool or 1536 tool, which is commercially available as the structure (1)
  • 384 or 1536 cavities (lb) that is, wells 2 are formed on the plate (1) as a structure.
  • inject this plate (1) so that the open end of the well is on the upper side, and inject an amount of cell suspension culture so that the surface rises in each well (2).
  • the plate (1) is turned upside down as shown in the middle part of the figure (A), so that a part of the culture solution protrudes downward from the open end of the well, Cells in the culture solution (la) gather at the bottom of the protruding portion (la ′) of the culture solution to form a cell mass (the lower part of the figure (A)).
  • the productivity can be significantly improved as compared with the conventional hanging drop method, and the hanging drop method using stress as in the method of the present invention.
  • the contact area between the culture solution and the structure for culture is increased and the solution during the culture can be stabilized, a homogeneous cell mass can be easily produced in large quantities.
  • the cell mass formed in the protruding portion of the culture solution at the lower open end of the structure having a cavity using the above-described method is used as another culture solution.
  • a method of recovering the cell mass in the other culture solution by contacting with the solution surface is provided (FIG. 6).
  • the cell mass produced by the method of the present invention is not only very uniform in size (Fig. 8), but also cell mass produced using ES cells (embryoid body). It was also confirmed that homogeneous cardiomyocytes could be prepared from the above, and it was also confirmed that the prepared cell mass was homogeneous. Further, the method of the present invention makes it possible to produce a large number of protruding portions of the culture medium per unit area, which was impossible with the conventional method, and nevertheless, the protruding portion of the culture medium is nevertheless possible. It was shown that the work for preparing the part became quick and simple, and the efficiency and productivity of cell mass preparation were dramatically improved.
  • the amount of cell suspension to be attached to the flat support must be reduced. Therefore, the number of cell masses that can be produced per unit area was limited.
  • the amount of the solution in the structure having the protruding portion of the culture solution (the portion la ′ in FIG. 5 (B)) and the cavity portion (the portion la in FIG. 5 (B)). Can be set separately, so even if the size of the protruding portion of the culture solution is reduced, the amount of the solution in the structure having the cavity is increased, so that the culture for producing the cell mass can be performed. Therefore, it is possible to secure the necessary amount of culture medium.
  • the dispensing of the cell suspension culture solution into each structure having a cavity can be automated using a machine, and the production of the protruding portion of the culture solution has been greatly improved. Easy.
  • the culture method of the present invention also allows the cell mass to be cultured at the same time to exchange gas with the outside air on the surface of the protruding portion of the culture solution, so that the culture conditions can be easily kept constant.
  • the number of cells used to form each cell mass can be easily kept constant.
  • the surface tension generated between the lower open end and the protruding portion of the culture solution is between the flat surface used in the hanging drop method and the cell suspension adhering to the flat surface. Since it is much stronger than the surface tension that occurs, it has the advantage that the protruding portion of the culture solution at the open end is stable even if the plate into which the culture solution is injected is turned upside down.
  • a structure having a hollow portion having an inner diameter of the opening that is less than 20 ⁇ L of the appropriate amount of culture solution in the raised portion the culture contained in the structure is used.
  • the liquid can compensate for the shortage. Therefore, in the present invention, it is desirable to use a structure (culture device) having a cavity having a structure internal volume of 20 ⁇ L or more.
  • Example 1 Production of mouse ES cell-derived embryoid bodies using 384-well plates
  • a cell line called EB3 (Niwa H, et al., Nat Genet 2 000; 24: 372-376) was used as an ES cell, and a final concentration of 10% was immobilized (55 ° (C, 30 min) Dilute with urinary fetal serum-carrot-MEM culture medium (manufactured by Sigma) to a concentration of 75 ES cells / 35 ⁇ L.
  • the mouse ES cells prepared above were dispensed onto a commercially available 384 well plate for cell culture (manufactured by Greiner, model 788161; inner diameter of opening 3.0 mm), and the following method was used.
  • An embryoid body was prepared.
  • the nominal solution capacity of the 384-well plate used was 25 ⁇ L per well, but 35 ⁇ L was dispensed per tool to energize the solution surface. This dispensed 75 ES cells per tool.
  • the volume of solution required up to the horizontal surface of the opening was 28 ⁇ L, and the volume of solution required for the pumping was 7 ⁇ L.
  • a multi-channel pipette product number 4610070 manufactured by Theremo Labsystems or a dispensing machine (model LD-01) manufactured by Biotech Co., Ltd. was used.
  • a culture solution containing ES cells was dispensed, and the plate with the culture solution raised was turned over to create a protruding portion of the culture solution at the lower open end. While maintaining this state, the lid is covered and cultured in an incubator at 37 ° C and 5% CO (Fig. 5). ES cells were grown in minutes.
  • ES cells are fed at a rate of 24 per second, depending on the setting of the dispensing of the machine.
  • the containing culture solution could be dispensed onto the plate. From this, it became clear that the time required for producing the protruding portion of the culture solution can be greatly reduced as compared with the conventional hanging drop method. It was also possible to produce a large number of embryoid bodies of almost uniform size. From these, the present invention was able to provide a method capable of producing and collecting a cell mass rapidly and in large quantities with high efficiency that can be used industrially.
  • a commercially available 1536 well plate for cell culture was used, and the plate having each well was used as a structure having a cavity, and from the mouse ES cells using the method of the present invention.
  • the purpose of this study was to examine the number of cell masses that can be produced per plate unit area and the efficiency in producing a group of cell masses by producing embryoid bodies.
  • Example 1 an EB3 cell line was used as an ES cell, and a final concentration of 10% non-immobilized (55 ° C, 30 minutes) urine fetal serum was prepared a-MEM It was diluted with a culture solution (manufactured by Sigma) so that the number of ES cells was 75 cells / 12.4 ⁇ L.
  • mice ES cells prepared above were dispensed into a commercially available 1536 well plate for cell culture (manufactured by Genentix, model X1536 PS; opening inner diameter 1.83 mm), and the following method was followed.
  • An embryoid body was prepared.
  • the nominal solution allowance on the 1536 well plate used is 8 zL per tool Force 12.4 zL was dispensed per tool to energize the solution surface.
  • the amount of solution required up to the horizontal surface of the opening was 11 x L, and the amount of solution required for the pumping was 1.4. That is, 75 ES cells were dispensed per well.
  • Min For dispensing a dispensing machine (model LD-01) manufactured by Biotech Co., Ltd. was used.
  • Example 1 In the same manner as in Example 1, a culture medium containing ES cells was dispensed, and ES cells were cultured in the protruding portion at the lower end opening. A cell mass derived from ES cells, that is, an embryoid body was obtained. It was collected. The obtained embryoid bodies were in a substantially uniform size as in Example 1.
  • this example includes ES cells at a rate of 28 cells per second, depending on the setting of the dispensing of the machine.
  • the culture solution could be dispensed onto the plate. From this, it has been clarified that also in this example, the time required for producing the protruding portion of the culture solution can be greatly reduced as compared with the case of the conventional hanging drop method. It was also possible to produce a large number of embryoid bodies of almost uniform size. From these, the present invention has provided a method capable of producing and collecting a large amount of cell mass rapidly with high efficiency that can be used industrially.
  • Example 3 Inner diameter of each rare plate The correct amount of liquid needed to form the protruding portion of the roasting liquid?
  • the culture solution forms a protruding portion to produce a cell mass, and the culture solution falls even when the plate is turned upside down.
  • the time required for producing the protruding portion of the culture solution from the structure is greatly increased. It became clear that it could be reduced.
  • it was possible to easily and in large quantities produce embryoid bodies that were almost uniform in size and state and properties. That is, according to the present invention, it was possible to produce and collect a mass of cells rapidly and in large quantities with high efficiency that can be used industrially.

Abstract

　本発明の発明者らは、新規な細胞培養方法を開発し、大きさや性質が均一な細胞塊を、大量かつ簡便に生産する方法およびその回収方法を提供することを課題とする。 　本発明の発明者らは、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の下側開口端に培養液の突出部分を作り、その突出部分中で細胞を培養することにより、上述した課題を解決することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。本発明は、具体的には、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の下側開口端に培養液の突出部分を作り、その突出部分中で細胞を培養することを特徴とする、細胞の培養方法を提供する。本発明はまた、上記の細胞培養方法により細胞塊を形成することを特徴とする、細胞塊の作製方法もまた提供する。                                                                               

Description

明 細 書
新規細胞培養方法、およびその方法を用いた細胞塊の生産および回収 方法
技術分野
[0001] 本発明は、高い均一性を有する細胞の集合体である細胞塊を効率的に生産する 方法に関する。
背景技術
[0002] ある種の細胞、例えば肝細胞などでは、 2次元培養することにより、細胞の性質が生 体内での性質と異なった状態になるものが少なくない。例えば、これらの細胞により 生産されたタンパク質や細胞そのものを産業上利用する場合には、 2次元培養に比 ベて、生態組織に近い培養条件として、細胞の 3次元培養を行い、細胞塊を形成さ せることにより、生態組織中に存在した細胞の機能を発現させることができることが知 られている（非特許文献 1)。作製された細胞塊を用いて、例えば肝機能を発現させ、 治療剤のスクリーニング等を行うためには、大きさや形などの状態と性質が均一な、 すなわち均質な細胞塊の集団である細胞群を作製する必要がある。
[0003] また、抗癌剤等の作用を確認する簡便な系として、 2次元培養よりも、 3次元培養の 方が、固形癌の性質を反映しやすぐ結果としてより正しい薬効を評価することができ ることも知られてレ、る（非特許文献 2)。 3次元培養を行レ、作製された細胞塊を用いて 、抗癌剤等のスクリーニングを行う際には、ノイズの少なレ、、確実な結果を得るために は、用いる細胞塊間の均質性が必要となる。
[0004] さらに、胚性幹細胞（ES細胞ともいう）は、 2次元培養では分化を起こさないが、 3次 元培養にすることで、胚様体という細胞塊の形成を経て、発生分化のプログラムが始 動し、増殖しながら多種類の生体組織細胞に分化する。このような生体組織細胞へ の分化を行う際には、均質な胚様体を作製し、用いることにより、所望な細胞へ適切 に分化させることができ、所望な細胞への分化を効率的に行うことができる。
[0005] 上述のように、単に 3次元培養するだけでは、均質な、すなわち性質と大きさや形な どの状態が均一である細胞塊を得るという点で不十分であり、細胞塊を用いた産業 上の十分な効果を得ることができない。従って、均一な 3次元培養を行い、均質な一 群の細胞塊を得ることが重要である。
[0006] 従来、細胞塊を形成する方法としては、胚性幹細胞を分化させるための胚様体を 作製する目的で開発されたハンギングドロップ法、ノ クテリアルディッシュ法、旋回培 養法、バイオリアクター法、およびメチルセルロース法等、並びに肝細胞の性質を長 期に維持する目的で開発されたスフエア法、およびカプセル化法等が知られている。
[0007] 均質な一群の細胞塊を得るため、すなわち、大きさおよび形などの形態と性質が均 一な一群の細胞塊を得るためには、細胞培養開始時の細胞数 (以下、初期細胞数と いう）を一定にすることや、細胞塊を作製するための培養系における環境 (例えば培 養液成分、溶存ガス濃度等の培養条件)を、培養期間中一定に保つこと等が必要で ある。し力 ながら、既知の方法では、いずれも細胞塊を形成できるものの、作製され る細胞塊間の均一性が得られない点や、産業利用するために必要とされる効率性な レ、し生産性が得られなレ、点等の課題があった。
[0008] バクテリアルディッシュ法は、細胞が接着しないように処理されたプラスチック皿で 細胞を培養することにより、浮遊する細胞同士を確率論的に接触させ、次第に細胞 塊を形成させる方法である。し力しながら、この方法では、一つの細胞塊を構成する 細胞の数が均一でなぐ結果として均一な一群の細胞塊を形成できなレ、。
[0009] 旋回培養法は、上記バクテリアルディッシュ法の変法であって、細胞接着性の低い 培養容器で細胞を培養する際に旋回運動させることで、浮遊する細胞同士の接触機 会をバクテリアルディッシュ法よりも増大させて、細胞塊間の大きさを均一化しようとし た方法である。この方法においては、細胞塊間の均一性の点ではバクテリアルディッ シュ法よりも優れているものの、均一性の点でなお課題が残り、また、培養における単 位面積あたりに作製できる細胞塊の数が少ないため、生産効率が悪ぐ産業利用の 観点において課題がある。
[0010] バイオリアクター法 (非特許文献 3)は、旋回培養法と同様に、培養器具を常に一定 方向に回転させる方法であるが、その回転方向は垂直方向である点で旋回培養法と は相違している。し力 ながら、この方法もまた、旋回培養法と同様に、作製できる培 養における単位面積あたりに作製できる細胞塊の数は少なぐ生産効率が悪いため 、産業利用の観点において課題がある。
[0011] メチルセルロース法は、細胞懸濁液にメチルセルロースなどの増粘剤を加えて溶液 中の対流を抑制し、個々の細胞を分離浮遊培養することによって、単細胞の増殖に より細胞塊を形成する方法である。し力 ながら、細胞懸濁液中の粘度が高ぐ溶液 中の対流が抑制されているために、外気と接触している溶液部分と溶液内部との間 で環境に差異が生じやすく、その培養条件の差異のために均質な細胞塊を形成す ることが困難である。
[0012] スフヱァ法は、細胞が接着しないように表面処理した細胞培養用 96ゥヱル丸底プレ ートに細胞懸濁液を注入し、細胞が自重で各ゥエルの丸底の最下部に降下すること を利用し、細胞塊を形成する方法である。この方法では、各ゥエルにほぼ一定量の細 胞懸濁液を注入することができるため、各ゥエルで均一な初期細胞数に基づく細胞 塊を形成させることができ、比較的均一な一群の細胞塊を作製することができる。し かし、ゥエル底に存在する細胞塊を物理的に傷害することなく回収することは非常に 困難である等、効率性の点で課題がある。また、効率性を増大させるために、プレー ト表面に細胞の接着を阻害するための特殊な処理をするためには、コストが高くなり、 生産性の点で課題が生じる。
[0013] カプセル化法 (非特許文献 4、非特許文献 5)は、複数の細胞をゲル化したアルギン 酸のカプセルに封入し、細胞をゲル内で増殖させ、細胞塊を形成することを特徴とす る方法である。しかしながら、アルギン酸ゃァガロースなどカプセル化するための薬 剤の使用が不可欠であり、作製された細胞塊を治療目的に用いるためには安全性を 確認する必要がある。また、各カプセル中の複数の細胞は、それぞれ増殖して細胞 塊となった後に、細胞塊同士が集合してさらに細胞塊を形成するために、各カプセル 力 取り出された胚様体の均一性が低いとレ、う課題がある。
[0014] ハンギングドロップ法は、平面支持体の下面に細胞懸濁液を付着させ、表面張力 を利用して、細胞懸濁液が平面支持体の下面部から垂れ下がった状態で保持させ、 その垂れ下がった溶液の最下部に細胞が自重で降下し自然集合することを利用した 細胞塊の作製方法である（非特許文献 6)。そのため、平面支持体の下面に付着させ る細胞懸濁液量を一定にすることにより、各細胞塊を形成するための初期細胞数を 均一にすることが比較的容易にでき、細胞塊が存在する溶液面において外気とのガ ス交換が行われるために、上述した既存の方法の中では、細胞塊を作製するための 培養条件を最も均一に保ちやすぐその結果、最も均一な性質を持った細胞塊を形 成すること力 Sできる。
[0015] し力、しながら、この方法では、平面支持体の下面に溶液を垂れ下げるため、わずか な振動によって溶液が落下したり溶液が水平移動して溶液同士が融合してしまうた め、操作には細心の注意を要する。従って、平面支持体の下面に溶液を付着させる ところから細胞塊の回収まで常に水平を保つことが必須であるため、慎重に手作業 で行うことが必要であり、機械を用いた自動化による効率化および生産性を上げるこ とは困難である。また、溶液の落下ないし融合を抑制するためには、溶液間の間隙を 十分に取る必要があり、培養の単位面積あたりに作製できる細胞塊数には限界があ り、大量生産は困難である。また、溶液の落下ないし融合を抑制するために、平面支 持体に付着させる細胞懸濁液量を少なくすると、細胞塊を一定期間良好な状態で培 養するために少なくとも必要な培養液量、例えば ES細胞を用いた胚様体作製時の好 ましい培養液量である 20 し以上、を確保することが困難となる。以上のように、ハン ギングドロップ法は、均質な一群の細胞塊を作製することが可能であるが、産業利用 するために必要な効率性や生産性という点で課題があった。
非特許文献 1： Roberts RA and Soames AR., Fundam Appl Toxicol. 1993 21(2): 149- 158
非特許文献 2 : Mellor HR, et al., Br J Cancer. 2005 93(3): 302-309
非特許文献 3 : Gerecht-Nir S, et al. , Biotechnol Bioeng. 2004 86(5): 493-502 非特許文献 4 : Magyar JP, et al" Ann N Y Acad Sci. 2001 944: 135-143
非特許文献 5 : Dang SM, et al., Methods Mol Biol. 2005; 290: 353-364
非特許文献 6 : Singla DK and Sob el BE, Biochem Biophys Res Commun. 2005 335(3)
： 637-42
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0016] 本発明は、上記従来の細胞の培養方法の問題点に鑑み成されたものであり、細胞を 均一にかつ大量に培養可能な細胞の培養方法、並びに大きさや形などの形態およ び性質が均一な一群の細胞塊を、大量かつ簡便に生産する方法を提供することを 課題とする。
[0017] 本発明の発明者らは、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造 体の下側開口端に培養液の突出部分を作り、その培養液の突出部分中で細胞を培 養することにより、上述した課題を解決することができることを見いだし、本発明を完 成するに至った。
課題を解決するための手段
[0018] 本発明による細胞の培養方法は、少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有 する構造体の前記空洞部内に、細胞を含む培養液を注入し、前記培養液の一部を 前記開口端より下側に突出させ、前記培養液の前記突出部分で細胞を培養すること を特徴とする。
[0019] 上記本発明において、前記空洞部の他端が閉鎖しており、前記空洞部内への前 記培養液の注入を、前記開口端を上にしかつ前記培養液の一部が前記開口端より 上に突出させることによりおこなレ、、前記開口端を下側に向けるようにしてもよい。あ るいは、上記本発明において、前記空洞部の他端が開口しており、前記空洞部内へ の前記培養液の注入を、前記一端側の開口端を下にして他端側の開口端から行い 、前記培養液の注入後、前記他端側の開口端を閉鎖するようにしてもよい。あるいは 、上記本発明において、前記空洞部の他端が開口しており、前記空洞部内への前 記培養液の注入を、前記一端側の開口端を培養液に浸し、前記他端側の開口端か ら吸引することにより行うようにしてもよい。さらにまた、上記本発明において、前記空 洞部が前記構造体に複数形成されており、それによつて複数の細胞の培養を同時に できるようにしてもよい。
[0020] 本発明による細胞塊の製造方法は、上記細胞の培養方法により細胞を培養して細 胞塊を形成することを特徴とする。この細胞塊の製造方法において、前記一端側の 開口端より下側に突出した前記培養液の一部を別の培養液の溶液面に接触させる ことにより、細胞塊を前記別の培養液中に回収するようにしてもよい。
図面の簡単な説明 [0021] [図 1]図 1は、下側の一端が開口している空洞部（lb)を有する構造体（1)内に培養液 (la)を注入して培養液を突出させた状態（la )で保持することによる、本願発明が提 供する新しい方法を示す。
[図 2]図 2は、図 1に示す構造体（1)を使用して、培養液の突出部分（la')を作製する 方法を例示する。
[図 3]図 3は、空洞部を有する構造体（1)の空洞部（lc)の両端ともが開口し、該空洞 部（lb)内に培養液（la)を注入して培養液を突出させた状態（la')で保持することが できる、本願発明が提供する新しい方法の別の態様を示す。
[図 4]図 4は、図 3に示す構造体（1)を使用して、培養液の突出部分を作製する方法と して、上側開口部から培養液 (a)を吸引する方法を例示する。
[図 5]図 5は、本願発明が提供する培養方法の一例である、簡便な実施方法である、 培養プレートの応用例の模式図（図 5 (A) )およびその拡大図（図 5 (B) )を示す。
[図 6]図 6は、実施例 2に記載の、作製した細胞塊である胚様体を溶液中に回収す る方法の模式図を示す。
[図 7]図 7は、既存プレートを用いた場合の、プレートのゥエル内径と、培養液の盛り上 げ部分を構成し、細胞塊を作製することが可能である適正溶液量との関係を示す。
[図 8]図 8は、実施例 2で作製した均一な胚様体の顕微鏡写真を示す。
符号の説明
[0022] 1：空洞部を有する構造体； la :空洞部を有する構造体中の培養液； la：培養液の 突出部分; a :培養液； lb :—端が開口し他端が閉鎖した空洞部； lc :両端ともが開口 した空洞部； 2 :ウエノレ
発明の実施の形態
[0023] 以下図 1ないし図 3を参照して本発明の細胞の培養方法の原理について説明する。
[0024] 図 1 (A)および (B)において、本発明の細胞の培養方法に使用する構造体（1)が概 略的に示されている。この構造体（1)には中に細胞を含んだ培養液（la)が注入され る空洞部（lb)が形成されている。図 1 (A)において、構造体（1)は均一直径のカップ を上下反転した形状になっていて、空洞部（lb)の一端 (すなわち図 1で下端）は開口 し、その他端 (すなわち図 1で上端）は閉鎖している。また、図 1 (B)において、構造体 (1)は直径が直線状に変化するカップを上下反転した形状になっていて、これも空洞 部（lb)の一端は開口し他端は閉鎖している。この閉鎖された側の形状は、どのような 形状であってもよぐ例えば図 1 (A)および (B)に例示するように角があっても、丸みが あっても良い。この空洞部（lb)の容積は、培養すべき細胞の種類、最終的に製造す る細胞塊の大きさ等を考慮して決められる。
[0025] 空洞部（lb)内には、細胞を含んだ培養液（la)が、培養液の一部（la')が空洞の一 端すなわち下端の開口端より下側に突出するように、注入されている。空洞部に培養 液をこのように注入する方法として、図 2に示されるように、まず構造体（1)をその空洞 部（lb)の開口端が上側になるように配置し、その状態で、培養液（la)を、一部（la') が空洞部の開口端から上に突出するようにすなわち盛り上がるように、空洞部（lb)の 中に注入し、その後構造体（1)を上下反転してもよい。このようにすることによって構 造体の空洞部内への培養液の注入が容易になり、空洞部の大きさ (横断面積)を培 養液の粘性、表面張力を考慮して適切に決めることによって、構造体を反転しても培 養液を図 1に示される状態に保持することが可能である。
[0026] 培養液（la)を構造体（1)の空洞部（lb)内に図 1に示されるように保持させることによ り、培養液内に含まれた細胞は自重で培養液内を下に降下し、開口端力 下側に突 出した部分（la')内に集まり、細胞塊を形成する。
[0027] 構造体は図 1に示されるようなカップ形でなくても、図 3に示されるように、両端が開 口した筒形あるいは管形でもよい。すなわち、図 3 (A)ないし (C)において、筒形また は管形の構造体（1)の空洞部（lc)は上下両端とも開口している。このように両端が開 口した空洞部内に培養液を注入する方法としては、構造体（1)の上端に、いずれも 図示しない供給管、流量制御弁を介して培養液供給源に接続し、その流量制御弁を 開いて培養液供給源から供給管を介して構造体の空洞部（lc)内に所定量の培養液 を供給し、供給後、培養液の下端が、図 3 (A)ないし (C)に示されるように、構造体の 空洞部の下側の開口端より下に突出するようにさせる（la')。これは空洞部の上側開 口端力 培養液の上部に供給される空気の量を調整することにより可能である。
[0028] さらに、別の方法としては、図 4に示されるように、構造体の下端を、空洞部の下側 開口端が培養液で塞がれるように、培養液 aの中に浸し、構造体（1)の上端に図示し ない吸引管を接続して空洞部（lc)の上部から空気を吸引し、培養液 (a)を構造体の 空洞部（lc)内に所定量吸引し、その後構造体（1)を上昇させてその下端が培養液 の液面から離すようにしてもょレ、。
[0029] 上記のような本発明の方法によれば、構造体内に所定量の培養液を収容し、し力 その培養液の一部を構造体の下端すなわち空洞部の下端側の開口端より下に突出 させるようにし、その突出した部分で細胞塊をつくるので、平面基材に溶液の盛り上 力 Sりを作るハンギングドロップ法などの従来の方法と比較して、均一な品質の細胞塊 を効率的に作製することができる。
[0030] 本発明の方法で細胞を培養して細胞塊を効率的に作製するためには、少なくとも 下側の一端が開口してレ、る空洞部を有する構造体の下側開口端に細胞懸濁培養液 の突出部分を作ることが必要である。細胞群を含む溶液を収容する構造体（1)の断 面は、該構造体内に細胞が懸濁された溶液を導入し、該構造体の下側開口端から 溶液が盛り上がった状態が形成されるものである限り、その形状は限定されない。
[0031] 構造体の材質は、ポリプロピレン、ポリスチレン、シリコンなど、当該技術分野におい て使用されるどのようなものであってもよい。このような材質は、細胞が接着しにくい素 材もしくは、細胞が接着しにくい表面処理を施した素材であることが好ましい。
[0032] 次に、このような培養液の突出部分中で、細胞を培養して細胞塊を形成する。均一 な細胞塊を形成するためには、培養開始時に空洞部内に収容する培養液 (すなわち 、 laと la'の総和）中に含まれる細胞数を一定にすることが必要である。培養液中に含 まれる細胞数を一定にするためには、培養液中に培養対象である細胞を一定濃度 で含有させること、そして空洞部を有する構造体中に含まれる培養液量を一定に保 つことが必要である。培養液中に含まれる細胞の濃度と空洞部を有する構造体中に 含まれる培養液量は、細胞の増殖速度、形成させる細胞塊の大きさ、そのような細胞 塊を形成するための培養日数などの諸条件を勘案して、当業者が適宜決定すること ができる。
[0033] 本発明の培養方法は、細胞塊を形成しょうとするどのような細胞に対しても使用す ること力 Sでき、適用することができる細胞には特に制限は存在しなレ、。例えば、胚性 幹細胞、肝細胞などの細胞塊を形成することが望まれる細胞の培養に、特に適して いる。
[0034] 図 5において、一つの平板状の構造体に複数の空洞部を形成しそれによつて一度 に多数の細胞塊を製造する実施形態が示されている。この実施形態は、構造体（1) として市販されている 384ゥヱルもしくは 1536ゥヱルなどの高密度ゥヱルすなわち空洞 部を有する細胞培養用プレートを利用したものである。構造体であるプレート（1)には 、例えば 384個あるいは 1536個の空洞部（lb)すなわちゥエル 2が整列して形成されて いる。このプレート（1)を、図 5 (A)の上段に示されるように、ゥエルの開口端が上側に なるようにし、各ゥエル内（2)に表面が盛り上がる量の細胞懸濁培養液を注入し（la') 、その後、同図 (A)の中段に示されるようにプレート（1)を上下反転させることにより、 培養液の一部がゥエルの開口端より下側に突出した状態となり、培養液（la)中の細 胞は培養液の突出部分（la')の最下部に集まって細胞塊を形成する（同図 (A)下段 図示)。上述した方法を試験したところ、非常に高密度、小スペース、迅速かつ簡便 に細胞塊を大量に作製可能であることが示された。このようにこの実施形態によれば 、従来のハンギングドロップ法の場合と比較して、格段に生産性を向上させることがで き、また、本願発明の方法と同様に応力を利用したハンギングドロップ法よりも、培養 溶液と培養用構造体の接触面積が大きくなり、培養中の溶液が安定化できることから 、均質の細胞塊を大量かつ簡便に製造できる。
[0035] 本願発明においては、上記方法を用いて空洞部を有する構造体の下側開口端の 培養液の突出部分中で形成された細胞塊を、該培養液の突出部分を別の培養液の 溶液面に接触させることにより、細胞塊を前記別の培養液中に回収する方法を提供 する（図 6)。該培養液の突出部分を別の培養液の溶液面に接触させることにより、培 養液の突出部分に存在した細胞塊を自然に別の培養液中に移動、沈降させることが でき、非常に容易に細胞塊をプレートから回収することができる。
[0036] このように、本発明の方法により作製された細胞塊は、大きさが極めて均一であるだ けでなく（図 8)、 ES細胞を使用して作製した細胞塊 (胚様体)から均質な心筋細胞を 作製することができることも確認し、作製された細胞塊が均質であることもまた確認し た。また、本発明の方法では、従来法では不可能であった培養液の突出部分を単位 面積あたりに多く作製することが可能となり、またそれにもかかわらず培養液の突出 部分を作製する際の作業が迅速かつ簡便となり、細胞塊作製の効率性、および生産 性が飛躍的に向上することが示された。
[0037] すなわち、ハンギングドロップ法では、単位面積あたりにより多くの細胞塊を作製す るためには、平面支持体に付着させる細胞懸濁液量を少なくしなければならず、一 方で細胞塊を一定期間良好な状態で培養するために必要な培養液量を確保しなけ ればならなかったため、単位面積あたりに作製できる細胞塊数には限界があった。し 力、しながら、本発明の方法では、培養液の突出部分（図 5 (B)の la'の部分）と空洞部 を有する構造体内の溶液量（図 5 (B)の laの部分）とを別個に設定することが可能で あるため、培養液の突出部分のサイズを小さくしても、空洞部を有する構造体内の溶 液量を多くすることにより、細胞塊を作製するための培養において、必要な培養液量 を確保すること力 Sできる。
[0038] また、ハンギングドロップ法では、平面の基材の下側表面に細胞懸濁液を付着させ なければならないため、溶液付着の作業が煩雑であり、かつ時間や労力を必要とす るものであった。し力しながら、本発明の方法では、空洞部を有する各構造体への細 胞懸濁培養液の分注は機械を用いて自動化が可能であり、培養液の突出部分の作 製を飛躍的に容易にする。
[0039] さらに、本発明の培養方法はまた、同時に培養する各細胞塊が、培養液の突出部 分の表面で外気とガス交換を行うことができるため、培養条件を容易に一定に保つこ とができ、さらに各細胞塊を形成するために使用する細胞数を容易に一定に保つこ とができるという利点もまた有する。また、本願発明の方法では、下側開口端と培養 液の突出部分とのあいだで生じる表面張力が、ハンギングドロップ法の場合に使用さ れる平面と平面に付着している細胞懸濁液間に生じる表面張力よりも格段に強いた め、培養液を注入したプレートの上下を反転しても、開口端部分の培養液の突出部 分が安定であるという利点も有する。
[0040] 本願発明における培養容器の空洞部を有する構造体の内径と、培養液の突出部 分（図 5 (B)の la'の部分に相当）の培養液量との関係にっレ、ても検討した（図 7)。開 口部内径が 1.83 mm、 1.98 mm、 3.00 mmおよび 7.00 mmである場合、突出部分の培 養液の適正量は、それぞれ、 0.3〜1.5 ^レ 0.5〜2.0 ^レ 2.0〜20 x L、 20〜60 z Lで あった。図 7のグラフに基づいて、当業者であれば容易に突出部分の適正な培養液 量を決定することができる。例えば、マウス胚性幹細胞 100細胞を 2日間培養するため には、好ましくは 20 し以上の培養液が必要である。すなわち、本発明において、盛 り上げ部分の適正な培養液量が 20 μ Lに満たない開口部内径を有する空洞部を有 する構造体を使用する場合には、該構造内に収容される培養液によりその不足分を 補償すること力 Sできる。このことから、本発明においては、 20 x L以上の構造内容積を 有する空洞部を有する構造体 (培養器具)を用いることが望ましレ、。
実施例
[0041] 実施例 1 : 384穴のプレートを用いたマウス ES細胞由来胚様体の作製
本実施例においては、市販の細胞培養用 384ゥエルプレートを用い、各ゥエルを空 洞部を有する構造体として使用して、本発明の方法を使用して、マウス ES細胞から胚 様体を作製することにより、プレート単位面積あたりに作製できることの細胞塊数およ び一群の細胞塊の作成における効率性を調べることを目的として行った。
[0042] 本実施例では、 ES細胞として、 EB3と呼ばれる細胞株（Niwa H, et al., Nat Genet 2 000; 24: 372-376)を用い、最終濃度 10%の非動化（55°C、 30分)ゥシ胎児血清をカロ えたひ -MEM培養液（シグマ社製）で、 ES細胞数が 75個 /35 μ Lの濃度となるように希 釈した。
[0043] 次いで、市販品である細胞培養用 384ゥエルプレート（Greiner社製、型式 788161； 開口部内径 3.0 mm)に上記で調製したマウス ES細胞を分注し、以下の方法にしたが つて、胚様体を作製した。使用した 384ゥエルプレートにおける公称の溶液許容量は 1 ゥエルあたり 25 μ Lであるが、溶液面を盛り上げるために、 1ゥヱルあたり 35 μ Lを分注 した。これにより、 1ゥヱルあたり ES細胞 75個を分注した。この時、開口部水平面まで に要した溶液量は 28 μ Lであり、盛り上げに要した溶液量は 7 μ Lであった。分注には 、 Theremo Labsystems社製のマルチチャンネルピペット（製品番号 4610070)、または 、バイオテック株式会社製の分注機械 (型式 LD-01)を用いた。
[0044] ES細胞を含む培養液を分注し、培養液が盛り上がった状態のプレートを裏返して、 下側開口端に培養液の突出部分を作った。この状態を保ったまま、蓋をしてインキュ ベータ一内で 37°C、 5%CO条件下にて培養し（図 5)、前記下端側開口端の突出部 分中で ES細胞を増殖させた。培養開始後 1日後に、突出した培養液面が下になつて レ、る状態のプレートを清潔なピンセットなどで保持し、別の大型容器中に満たされた 最終濃度 10%の非動化（55°C、 30分）ゥシ胎児血清を加えた ct -MEM培養液 (シグマ 社)の表面に培養液の突出部分を接触させ、細胞塊を自重で大型容器中の培養液 内へ沈降させることにより、 ES細胞由来の細胞塊、すなわち胚様体を回収した（図 6) 。得られた胚様体は図 8に示すように、大きさがほぼ均一な状態であった。
[0045] 384穴のプレートおよびバイオテック株式会社製の分注機械を用いた場合には、機 械の分注等の設定にもよるが、本実施例では毎秒 24個の割合で ES細胞を含む培養 液をプレートに分注することができた。このことから、従来のハンギングドロップ法の場 合と比較して、培養液の突出部分を作製するために必要な時間を大幅に削減するこ とができることが明らかになった。また、大きさがほぼ均一な胚様体を大量に作製する こともできた。これらから、本発明により、産業的に利用可能な高い効率性で、細胞塊 を大量かつ迅速に生産および回収することができる方法を提供することができた。
[0046] 実施例 2： 1536穴プレートを用いたマウス ES細胞由夹胚様体の作製
本実施例においては、市販の細胞培養用 1536ゥエルプレートを用い、各ゥエルを有 するプレートを空洞部を有する構造体として使用して、本発明の方法を使用して、マ ウス ES細胞から胚様体を作製することにより、プレート単位面積あたりに作製できるこ との細胞塊数および一群の細胞塊の作成における効率性を調べることを目的として 行った。
[0047] 本実施例では、実施例 1と同様に ES細胞として EB3細胞株を用い、最終濃度 10% の非動化（55°C、 30分）ゥシ胎児血清をカ卩えた a -MEM培養液 (シグマ社製）で、 ES 細胞数が 75個 /12.4 μ Lの濃度となるように希釈した。
[0048] 次いで、市販品である細胞培養用 1536ゥエルプレート（Genentix社製、型式 X1536 PS ;開口部内径 1.83 mm)に上記で調製したマウス ES細胞を分注し、以下の方法にし たがって、胚様体を作製した。使用した 1536ゥエルプレートにおける公称の溶液許容 量は 1ゥヱルあたり 8 z Lである力 溶液面を盛り上げるために、 1ゥヱルあたり 12.4 z L を分注した。この時、開口部水平面までに要した溶液量は 11 x Lであり、盛り上げに 要した溶液量は 1.4かしであった。すなわち 1ゥエルあたり ES細胞 75個を分注した。分 注には、バイオテック株式会社製の分注機械 (型式 LD-01)を用いた。
[0049] 実施例 1と同様に、 ES細胞を含む培養液を分注して、下端側開口端の突出部分中 で ES細胞を培養し、 ES細胞に由来する細胞塊、すなわち胚様体を回収した。得られ た胚様体は実施例 1の場合と同様に、大きさがほぼ均一な状態であった。
[0050] 1536穴のプレートおよびバイオテック株式会社製の分注機械を用いた場合には、 機械の分注等の設定にもよるが、本実施例では毎秒 28個の割合で ES細胞を含む培 養液をプレートに分注することができた。このことから、本実施例においても、従来の ハンギングドロップ法の場合と比較して、培養液の突出部分を作製するために必要な 時間を大幅に削減することができることが明らかになった。また、大きさがほぼ均一な 胚様体を大量に作製することもできた。これらから、本発明により、産業的に利用可 能な高い効率性で、細胞塊を大量かつ迅速に生産および回収することができる方法 を提供することができた。
[0051] 実施例 3 :各稀プレート内径 焙着液の突出部分の形成に必要な谪正?容液量の檢
M
本実施例おいては、市販品である各種の細胞培養用プレートにおいて、細胞塊を 作製するために培養液が突出部分を形成し、かつプレートを上下反転しても培養液 が落下することのない、突出部分の形成に必要な適正溶液量と各種プレートの開口 部内径の関係につレ、て検討した。
[0052] 本実施例においては、実施例 1と同様に、最終濃度 10%の非動化（55°C、 30分)ゥ シ胎児血清を加えた α -MEM培養液 (シグマ社製）を用いた。
[0053] 本実施例では、市販品である細胞培養用プレートである Genentix社製の 1536ゥェ ノレ (X1536 PS ;内径 1.83 mm), Nunc社製の 384ゥヱル (164320)、 Greiner社製の 384ゥヱ ノレ (788161；内径 3.00 mm)、住友べークラィト社製の96ゥェル(MS-0096S ;内径7.00 m m)を用いた。なお、 Nunc社製の 384ゥヱル (164320)を用いた際には、ゥヱル (内径 3.00 mm)とゥヱル間にある小さいゥヱル (内径 1.98 mm)を利用した。各プレートのゥエルの 開口部内径は、各プレートのゥヱルを顕微鏡写真で撮影し、同時に撮影した顕微鏡 用のスケールを用いて、各プレートのゥエルの開口部の直径を計測することにより得 られた。 [0054] 次に、各プレートのゥエルに、様々な容量の培養液を分注し、培養液の溶液面が盛 り上がり、かつ培養液を分注したプレートを逆さまにしても培養液がこぼれることなく 下端側開口端において培養液の突出部分を形成し、細胞培養が可能であるような培 養液の突出部分の形成に必要な適正溶液量について検討した。
[0055] その結果を図 7に示した。ゥエルが溶液で完全に満たされた状態（ゥエル上面と溶液 の面が水平)から溶液をさらに盛り上げるために必要な溶液量のうち、突出部分の安 定性を判断した適正な溶液範囲の目安を示した。 1536ゥエルプレート（内径 1.83 mm )では、 0.3〜1.5 z L、好ましくは l z L、 384ゥエルプレート（内径 1.98 mm)では、 0.5〜 2 μ 好ましくは 1.5 z L、 384ゥエルプレート（内径 3.0 mm)では、 2〜20 L、好ましく は 15 x L、 96ゥエルプレート（内径 7.00mm)では、 10〜60 μ L、好ましくは 50 x Lの時に 、培養液の突出部分を下向きにした場合に安定して保持できることが分かった。 産業上の利用可能性
[0056] 本発明の方法により、従来のハンギングドロップ法の場合と比較して、構造体 (すな わち培養支持体)からの培養液の突出部分を作製するために必要な時間を大幅に 削減することができることが明らかになった。また、大きさなどの状態および性質がほ ぼ均一な、すなわち均質な胚様体を容易に、また大量に作製することもできた。すな わち、本発明により、産業的に利用可能な高い効率性で、細胞塊を大量かつ迅速に 生産および回収することができた。

Claims

請求の範囲
[1] 少なくとも下側の一端が開口している空洞部を有する構造体の前記空洞部内に、 細胞を含む培養液を注入し、
前記培養液の一部を前記開口端より下側に突出させ、
前記培養液の前記突出部分で細胞を培養することを特徴とする、細胞の培養方法
[2] 前記空洞部の他端が閉鎖しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前 記開口端を上にしかつ前記培養液の一部が前記開口端より上に突出させることによ りおこない、前記開口端を下側に向けることを特徴とする、請求項 1に記載の細胞の 培養方法。
[3] 前記空洞部の他端が開口しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前 記一端側の開口端を下にして他端側の開口端から行い、前記培養液の注入後前記 他端側の開口端を閉鎖することを特徴とする、請求項 1に記載の細胞の培養方法。
[4] 前記空洞部の他端が開口しており、前記空洞部内への前記培養液の注入を、前 記一端側の開口端を培養液に浸し、前記他端側の開口端から吸引することにより行 うことを特徴とする、請求項 1に記載の細胞の培養方法。
[5] 前記空洞部が前記構造体に複数形成されており、それによつて複数の細胞の培養 を同時にできることを特徴とする、請求項 1ないし 4のいずれかに記載の細胞の培養 方法。
[6] 請求項 1ないし 5のいずれかに記載の細胞の培養方法により細胞を培養して細胞塊 を形成することを特徴とする、細胞塊の製造方法。
[7] 請求項 1ないし 5のいずれかに記載の細胞の培養方法により胚性幹細胞を培養し て胚様体を形成することを特徴とする、細胞塊の製造方法。
[8] 前記一端側の開口端より下側に突出した前記培養液の一部を別の培養液の液面 に接触させることにより、細胞塊を前記別の培養液中に回収することを特徴とする、 請求項 6または 7に記載の細胞塊の製造方法。
[9] 請求項 1ないし 8のいずれかに記載の細胞の培養方法または細胞塊の製造方法に 使用する培養器具。
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Cited By (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010233456A (ja) * 2009-03-30 2010-10-21 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法
WO2010146802A1 (ja) * 2009-06-19 2010-12-23 株式会社ニコン 細胞塊の状態判別手法、この手法を用いた画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに細胞塊の製造方法
WO2011013319A1 (ja) * 2009-07-31 2011-02-03 株式会社ニコン 細胞塊の成熟判定手法、この手法を用いた画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに細胞塊の製造方法
JP2011036221A (ja) * 2009-08-18 2011-02-24 Stem Biomethod Corp 細胞収容装置
JP2013517809A (ja) * 2010-01-28 2013-05-20 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 懸滴装置、懸滴システム、および／または懸滴方法
US8588504B2 (en) 2009-06-12 2013-11-19 Nikon Corporation Technique for determining the state of a cell aggregation image processing program and image processing device using the technique, and method for producing a cell aggregation
JP2014093979A (ja) * 2012-11-09 2014-05-22 Japan Vilene Co Ltd 薬効評価方法
WO2014115799A1 (ja) * 2013-01-23 2014-07-31 東京エレクトロン株式会社 多能性幹細胞の継代培養方法
WO2015129263A1 (ja) * 2014-02-25 2015-09-03 株式会社クラレ スフェロイド作製用デバイス、スフェロイドの回収方法及び製造方法
WO2017115865A1 (ja) * 2015-12-29 2017-07-06 株式会社クラレ 幹細胞の凝集塊の集団の調製方法

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2008063135A1 (en) 2006-11-24 2008-05-29 Agency For Science, Technology And Research Apparatus for processing a sample in a liquid droplet and method of using the same
US9874501B2 (en) 2006-11-24 2018-01-23 Curiox Biosystems Pte Ltd. Use of chemically patterned substrate for liquid handling, chemical and biological reactions
WO2013114217A1 (en) 2012-02-05 2013-08-08 Curiox Biosystems Pte Ltd. Array plates and methods for making and using same
US10725020B2 (en) 2007-11-14 2020-07-28 Curiox Biosystems Pte Ltd. High throughput miniaturized assay system and methods
US9878328B2 (en) * 2010-07-23 2018-01-30 Curiox Biosystems Pte Ltd. Apparatus and method for multiple reactions in small volumes
JP6205101B2 (ja) * 2013-06-13 2017-09-27 学校法人立命館 細胞塊取得装置
US10545139B2 (en) 2015-06-16 2020-01-28 Curiox Biosystems Pte Ltd. Methods and devices for performing biological assays using magnetic components
WO2018185554A1 (en) 2017-04-05 2018-10-11 Curiox Biosystems Pte Ltd. Methods, devices, and apparatus for washing samples on array plates

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004084967A1 (ja) * 2003-03-25 2004-10-07 Anges Mg, Inc. 三次元マトリゲル層上における胚性幹細胞から血管特異的器官形成
JP2005253374A (ja) * 2004-03-12 2005-09-22 Chiba Univ 胚性幹細胞から目的の細胞を得る方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004245622A (ja) * 2003-02-12 2004-09-02 Pacific Ind Co Ltd 圧力センサ、送信機、及びタイヤ状態監視装置
US20080070303A1 (en) * 2005-11-21 2008-03-20 West Michael D Methods to accelerate the isolation of novel cell strains from pluripotent stem cells and cells obtained thereby

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004084967A1 (ja) * 2003-03-25 2004-10-07 Anges Mg, Inc. 三次元マトリゲル層上における胚性幹細胞から血管特異的器官形成
JP2005253374A (ja) * 2004-03-12 2005-09-22 Chiba Univ 胚性幹細胞から目的の細胞を得る方法

Non-Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DANG SM ET AL., METHODS MOL BIOL., vol. 290, 2005, pages 353 - 364
DESBAILLETS I. ET AL.: "Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis", EXPERIMENTAL PHYSIOLOGY, vol. 85, no. 6, 2000, pages 645 - 651, XP001055853 *
GERECHT-NIR S ET AL., BIOTECHNOL BIOENG., vol. 86, no. 5, 2004, pages 493 - 502
KELM J.M. ET AL.: "Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types", BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING, vol. 83, no. 2, 2003, pages 173 - 180, XP003018059 *
MAGYAR JP ET AL., ANN N Y ACAD SCI., vol. 944, 2001, pages 135 - 143
MELLOR HR ET AL., BR J CANCER., vol. 93, no. 3, 2005, pages 302 - 309
NIWA H ET AL., NAT GENET, vol. 24, 2000, pages 372 - 376
ROBERTS RA; SOAMES AR, FUNDAM APPL TOXICOL., vol. 21, no. 2, 1993, pages 149 - 158
SINGLA DK; SOBEL BE, BIOCHEM BIOPHYS RES COMMUN., vol. 335, no. 3, 2005, pages 637 - 42

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2010233456A (ja) * 2009-03-30 2010-10-21 Kitakyushu Foundation For The Advancement Of Industry Science & Technology 細胞集合体形成器具、細胞集合体培養器具、細胞集合体転写キット及び細胞集合体の培養方法
US8588504B2 (en) 2009-06-12 2013-11-19 Nikon Corporation Technique for determining the state of a cell aggregation image processing program and image processing device using the technique, and method for producing a cell aggregation
WO2010146802A1 (ja) * 2009-06-19 2010-12-23 株式会社ニコン 細胞塊の状態判別手法、この手法を用いた画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに細胞塊の製造方法
WO2011013319A1 (ja) * 2009-07-31 2011-02-03 株式会社ニコン 細胞塊の成熟判定手法、この手法を用いた画像処理プログラム及び画像処理装置、並びに細胞塊の製造方法
JP2011036221A (ja) * 2009-08-18 2011-02-24 Stem Biomethod Corp 細胞収容装置
JP2013517809A (ja) * 2010-01-28 2013-05-20 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 懸滴装置、懸滴システム、および／または懸滴方法
JP2014093979A (ja) * 2012-11-09 2014-05-22 Japan Vilene Co Ltd 薬効評価方法
WO2014115799A1 (ja) * 2013-01-23 2014-07-31 東京エレクトロン株式会社 多能性幹細胞の継代培養方法
WO2015129263A1 (ja) * 2014-02-25 2015-09-03 株式会社クラレ スフェロイド作製用デバイス、スフェロイドの回収方法及び製造方法
JPWO2015129263A1 (ja) * 2014-02-25 2017-03-30 株式会社クラレ スフェロイド作製用デバイス、スフェロイドの回収方法及び製造方法
US10683477B2 (en) 2014-02-25 2020-06-16 Corning Incorporated Spheroid-producing device, method for recovering spheroids, and method for producing spheroids
US11208625B2 (en) 2014-02-25 2021-12-28 Corning Incorporated Spheroid-producing device, method for recovering spheroids, and method for producing spheroids
WO2017115865A1 (ja) * 2015-12-29 2017-07-06 株式会社クラレ 幹細胞の凝集塊の集団の調製方法
JPWO2017115865A1 (ja) * 2015-12-29 2018-11-08 株式会社クラレ 幹細胞の凝集塊の集団の調製方法

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