CN218811793U - 一种悬滴培养板及悬滴培养装置 - Google Patents

一种悬滴培养板及悬滴培养装置 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种悬滴培养板及应用其的悬滴培养装置，所述悬滴培养板包括板体和至少一个贯穿所述板体的悬滴培养孔，所述悬滴培养孔包括液滴悬挂孔，和设置于所述液滴悬挂孔上方并与之连通的加液孔；其中，所述液滴悬挂孔的孔径自其上沿沿远离所述加液孔的方向逐渐增大。本申请提供的悬滴培养板具有更强的液滴悬挂能力。

Description

一种悬滴培养板及悬滴培养装置
技术领域
本申请属于细胞培养装置领域，具体涉及一种悬滴培养板及悬滴培养装置。
背景技术
3D细胞培养被证实相对于二维平面的细胞单层培养能够更好的模拟体内的生理环境，从而展现出更接近于机体实际的生理特征和行为，因此，3D细胞培养技术在药物研发、再生医学、疾病模型、精准医疗等领域获得越来越多的应用。目前3D细胞培养主要包括有支架 (scaffold-based)培养和无支架(scaffold-free)培养。其中，有支架培养体系需要使用天然的细胞胞外基质(ECM)或人造基质(如水凝胶等)作为培养细胞的支撑材料，细胞往往需要被包裹在支架材料中从而提供细胞生长的3D环境，这些基质往往成分复杂、价格昂贵，且长成的3D细胞培养物后续转移与处理不便。而无支架培养则无需利用这些基质材料，主要依靠细胞自身重力或一定外力使细胞相互团聚黏附进而形成3D的细胞培养物。在无支架培养中，基于低黏附底面或低黏附材料形成微孔进行细胞培养的方式，以及悬滴细胞培养的方式最为普遍。前者利用基底的低黏附特性使细胞无法贴壁生长而只能依靠细胞自身重力团聚和相互黏附从而形成细胞类球体，而后者依靠液滴倒置悬挂的方式使液滴中的细胞依靠重力下沉至悬滴底部的气液椭球界面形成团聚体。低黏附的方式能够同时进行较多数量的3D 细胞类球体的生成与培养，但往往需要对材料进行较复杂的化学修饰或昂贵器材以制造出具有低黏附特性的表面或形状，大大增加了进一步进行3D细胞培养的成本。悬滴细胞培养是最早的3D细胞培养方法(1907年by Ross Granville Harrison)，其初期的方法是，在培养板表面滴加细胞悬液后，将培养板倒置使液滴悬挂，借助重力作用促进细胞沉降团聚，进而获得具有三维结构的细胞类球体。这种方法操作简单，也无需依赖特殊器材，因此得到广泛使用。但其缺陷在于：(1)由于所能悬挂的液滴大小非常有限，不足以支撑较长时间和较多数量的细胞生长；(2)由于液滴倒置悬挂，操作过程中的震动、移动等易造成液滴坠落以及液滴悬挂面的铺展；(3)换液操作十分麻烦，需将培养板正置后进行操作，换液后再次翻转培养，除了容易造成液滴移位、滴落、混合等问题之外，还可能造成细胞及球体吸附在培养板表面进而贴壁而无法继续3D培养；(4)除此之外，由于悬滴位置无法固定且涉及翻转等操作，基本无法实现规模较大、通量较高的批量化或自动化培养，耗费大量的人力和时间；(5) 另外，由于液滴悬挂培养，不容易进行培养后单一细胞类球体的单独观察和回收。因此，后期的一些技术在这些方面对悬滴培养方法加以改进。其基本策略是通过引入通孔的方式实现细胞进样和换液操作的同时避免翻转过程，同时与96或384孔板相匹配以提升通量，从而满足自动化悬滴培养的操作要求，如美国3D Biomatrix公司的Perfecta 3DTMHanging Drop Plates。然而，Perfecta 3DTM悬滴培养板采用圆柱直形通孔，其悬滴能力十分有限，通常只能悬挂和维持10-20uL培养液滴，悬滴易滴落且需在较高换液频率下才能维持细胞球体的正常培养；另外，其悬滴培养板需独立配置，不能直接匹配常规培养孔板，培养板的制作难度也较大，成本较高。
基于上述问题，亟需提供一种新的具有更高液滴悬挂能力的悬滴培养板。
实用新型内容
本申请的目的在于提供一种悬滴培养板，其具有更强的悬挂液滴的能力。
本申请为解决上述技术问题，提出了如下技术方案：
本申请第一方面提供了一种悬滴培养板，包括板体和至少一个贯穿所述板体的悬滴培养孔，所述悬滴培养孔包括液滴悬挂孔，和设置于所述液滴悬挂孔上方并与之连通的加液孔；其中，所述液滴悬挂孔的孔径自所述液滴悬挂孔的上沿沿远离所述加液孔的方向逐渐增大。
本申请第二方面提供了一种悬滴培养装置，其包括本申请第一方面提供的悬滴培养板和细胞培养板，所述细胞培养板包括底板和上盖，所述底板上设有若干底板孔，所述底板孔的底端封闭，所述悬滴培养板设置于所述底板和上盖之间，所述悬滴培养板上的悬滴培养孔与所述底板孔一一对应。
本申请的悬滴培养板中，液滴悬挂孔的孔径沿远离所述加液孔的方向逐渐增大，相比于现有的圆柱直形通孔，具有本申请的液滴悬挂孔具有更强的液滴悬挂能力，本申请的液滴悬挂孔可稳定悬挂的液滴体积最大可达50uL以上。
附图说明
图1为本申请的一种悬滴培养板的结构示意图。
图2为本申请实施例1的悬滴培养板的细胞球均一性培养实验结果图。
图3为本申请实施例1的悬滴培养板的不同起始数量细胞培养实验结果图。
图4A和图4B为采用本申请实施例1的悬滴培养板培养并原孔位回收的细胞球显微照片。
图5为本申请实施例1的悬滴培养板培养的细胞球荧光显微照片。
具体实施方式
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一种实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施方式。
定义
如本文所用，术语“一个”和“一种”以及“所述”和类似的指代物指示单数和复数，除非本文另外指明或上下文明显矛盾。
如本文所用，术语“约”、“基本上”和“类似于”是指在本领域普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，所述误差范围可部分取决于该值的测量或确定方式，或取决于测量系统的局限性。
本申请第一方面提供了一种悬滴培养板，如图1所示，其包括板体5和至少一个贯穿所述板体5的悬滴培养孔，所述悬滴培养孔包括液滴悬挂孔1，和设置于所述液滴悬挂孔1上方的加液孔2；其中，所述液滴悬挂孔1的孔径自其上沿沿远离所述加液孔2的方向逐渐增大。
本申请中所述液滴悬挂孔1和所述加液孔2的截面基本上呈圆形。所述截面是指所述液滴悬挂孔1或所述加液孔2被任一平行于所述液滴悬挂孔1底面的平面所截而得到的面。本申请中，所述液滴悬挂孔的上沿可以理解为所述液滴悬挂孔远离所述液滴悬挂孔底面的一端，或者靠近所述加样孔的一端。
发明人在研究中发现，由于本申请的所述液滴悬挂孔1的孔径自其上沿沿远离所述加液孔2的方向逐渐增大，其载液能力明显增强，当现有技术中的圆柱直形通孔的孔径与本申请的液滴悬挂孔的底面直径相同时，本申请的液滴悬挂孔可稳定悬挂的液滴体积显著大于圆柱形通孔的悬液体积。此外，由于本申请的悬滴培养板能够稳定悬挂更大体积的培养基，因此可实现细胞的长时间培养和较多数量细胞的培养；由于悬挂的液滴体积增大，可减少换液的次数，从而可以显著减少细胞培养过程中震动和移动造成的液滴坠落。
本申请中的板体5包括上表面3和下表面4，在一些实施方式中，所述加液孔2设置于上表面，所述液滴悬挂孔1设置于下表面，所述加液孔2与所述液滴悬挂孔1相连通，形成所述悬滴培养孔。采用本申请的悬滴培养板培养细胞时，培养基形成的液滴6悬挂于所述液滴悬挂孔1中，细胞球7包含于所述液滴6内。细胞培养时，通过加液孔2加入或吸出培养基，可避免翻转等操作，进而可以实现大规模、高通量培养。在一些实施方式中，所述板体 5的上表面3和下表面4平整，有利于其稳定放置在细胞培养板上。
在一些实施方式中，所述液滴悬挂孔1的形状为圆锥形、圆台形、球缺形、球台形、椭球缺形或椭球台形。发明人在研究中发现，当所述液滴悬挂孔的侧壁为直线型(例如圆锥形、圆台形)，更优选地，具有向内的平滑凹陷(例如球缺形、球台形、椭球缺形或椭球台形)，其载液能力进一步提高。本申请中所述“向内的”凹陷，可以理解为凹陷使得侧壁远离所述液滴悬挂孔底面，例如球缺形(如图1所示)、球台形、椭球缺形或椭球台形。可以理解的是，本申请中，所述圆台形可以理解为圆锥形被一个平行于底面的面所截而形成的形状；所述的球缺形可以理解为球体被一个面所截而形成的形状；所述球台形可以理解为球体被两个平行的面所截而形成的形状；所述椭球缺形可以理解为椭球体被一个平行于长轴或短轴的面所截而形成的形状；所述椭球台可以理解为椭球体被两个平行于长轴或短轴的面所截而形成的形状。
发明人发现，所述液滴悬挂孔1底面直径影响悬挂液滴的体积，本领域技术人员可根据需要的液滴体积选择合适的底面直径。发明人还发现，现有的圆柱形通孔，其底面直径通常不大于2mm，大于2mm即无法形成稳定的液滴，而本申请的液滴悬挂孔采用孔径沿远离所述加液孔2的方向逐渐增大，在底面直径大于2mm，仍能形成稳定的悬滴，从而获得更大的悬滴体积；更出人意料的是，当液滴悬挂孔1的侧壁具有向内的平滑凹陷(如采用球缺形、球台形、椭球缺形或椭球台形)时，其底面直径在达到5mm甚至更大时，仍能够稳定悬挂液滴，从而获得更大的悬滴体积。发明人还发现，底面直径越大，能够悬挂的液滴体积越大，但是当底面直径过大，例如大于5mm，其悬挂的液滴的球面弧度过大，会影响细胞的聚集效果，进而影响细胞球的球形形貌；底面直径过小，例如小于0.5mm，形成的悬滴太小，细胞球没有足够的生长空间；因此本申请的一些实施方式中，所述液滴悬挂孔1底面直径为 0.5-5mm；此外，为了可以与常用的细胞培养板96孔板匹配，液滴悬挂孔1的直径通常不大于4mm，否则过大的液滴容易粘在孔板的侧壁，因此在一些优选的实施方式中，所述液滴悬挂孔1底面直径为2-4mm。
在一些实施方式中，所述液滴悬挂孔1的高度为0.5-4mm，优选为1-4mm。发明人发现，液滴悬挂孔1的高度影响液滴悬挂孔的容量，当所述液滴悬挂孔底面直径D一定，所述液滴悬挂孔1的高度H与D满足0.4D≤H≤0.6D时，所述液滴悬挂孔悬挂液滴的体积更大。本申请中，所述“液滴悬挂孔的高度”可以理解为所述液滴悬挂孔与所述加液孔的连通处与所述液滴悬挂孔底面的距离。
在一些实施方式中，所述液滴悬挂孔为球缺形。发明人出人意料地发现，当不同形状的液滴悬挂孔具有相同的底面直径和相同的高度相同时，具有球缺形状的液滴悬挂孔可以稳定悬挂的液滴体积最大。
在一些实施方式中，所述球缺形的高H与球的半径R满足H＝0.25R～1.1R；优选的，H＝R，此时，所述球缺为半球形。发明人发现，在相同底面直径的情况下，半球形的液滴悬挂孔可以稳定悬挂的液滴体积最大。
发明人在研究中发现，加液孔的孔径越小，液滴悬挂孔悬挂液滴稳定性越强，不限于任何理论，发明人认为，这可能是由于小孔径的加液孔产生了虹吸现象，使得滴液更稳定地悬挂于液滴悬挂孔中；然而孔径过小，不利于换液操作；因此，在一些实施方式中，所述加液孔的孔径为0.5-2mm，优选为1-2mm。
加液孔的深度太大一方面会增加板体的厚度，另一方面加液孔深度太大不利于悬滴培养细胞换液，因此在一些实施方式中，所述加液孔的深度为0-2mm，优选为0.5-1mm。
本申请中，所述“加液孔的深度”可以理解为所述加液孔与所述液滴悬挂孔的连通处与所述板体的上表面间的距离。在一些实施方式中，所述加液孔为圆柱形，所述加液孔的深度可以理解为所述圆柱形的高。
在一些实施方式中，所述加液孔的孔径不小于所述加液孔的深度的一半。所述加液孔尺寸满足上述比例关系时，方便换液操作。
在一些实施方式中，所述加液孔的中心线与所述液滴悬挂孔的中心线重合。
在一些实施方式中，所述板体的厚度为0.5-6mm。
在一些实施方式中，所述板体可以为实心结构或者空心结构。
在一些实施方式中，所述板体的材料包括聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚碳酸酯(PC)、聚乙烯(PE)、聚酯(PET)、聚二甲基硅氧烷(PDMS)的至少一种，优选为PDMS。以所述材料制备的悬滴培养板可一次性使用，也可高温高压灭菌或酒精消毒后重复使用，制作及使用成本可大幅降低。
在一些实施方式中，所述悬滴培养孔直接形成于所述板体中。本申请的悬滴培养板结构简单，所述悬滴培养孔的加样孔和液滴悬挂孔直接形成于所述板体中，不需要其他结构形成或支撑所述液滴悬挂孔，加工工艺简单，生产成本低。
本申请第二方面提供了一种悬滴培养装置，其包括本申请第一方面所提供的悬滴培养板和细胞培养板，所述细胞培养板包括底板和上盖，所述底板上设有若干底板孔，所述底板孔的底端封闭，所述悬滴培养板设置于所述底板和上盖之间，所述悬滴培养板上的悬滴培养孔与所述底板孔一一对应，可实现悬滴培养装置的整体转移。在一些实施方式中，所述细胞培养板可以为96孔板或384孔板等，本领域技术人员可根据所述细胞培养板中底板孔的孔径选择悬滴培养板中液滴悬挂孔的尺寸。本申请的悬滴培养板可以直接放置于96孔板、384孔板等常用的细胞培养板上配套使用，无需专门的细胞培养板，操作简单，生产成本明显降低。
在一些实施方式中，所述悬滴培养板与所述细胞培养板可拆卸连接。
以下结合具体实施例对本申请的悬滴培养板进行详细说明。
实施例1一种悬滴培养板
本实施例中所采用的悬滴培养板为PDMS材料，液滴悬挂孔为半球形，底面半径约为 2.1mm，孔容量约为20μL，加液孔孔径1.5mm，深度约0.5mm。
实验例1液滴悬挂实验
采用本申请实施例1的悬滴培养板进行水滴悬挂实验，验证本申请的悬滴培养板稳定悬挂液滴的能力，结果显示，采用本申请的悬滴培养板稳定悬挂水滴的体积可达到50μL。
通常，由于细胞培养基中的成分丰富，往往比水具有更大的表面张力，因此当采用本申请的悬滴培养板悬挂培养基时，往往能得到比水滴更大的悬液体积。
细胞培养实验
实验例2细胞球均一性培养实验
采用本申请实施例1的悬滴培养板进行HepG2肝癌细胞球均一性培养实验。
细胞：HepG2肝癌细胞
培养基：含15％胎牛血清的DMEM培养基；
培养基悬挂体积：40μL；
起始细胞数量：4000个；
培养条件：5％CO2，37℃培养4天
从图2中可以看出，培养4天后，细胞生长状态良好；在不同液滴中，细胞生长情况均一。
实验例3不同起始数量细胞培养实验
采用本申请实施例1的悬滴培养板进行不同起始数量细胞培养实验。
细胞：HepG2肝癌细胞
培养基：含15％胎牛血清的DMEM培养基；
培养基悬挂体积：40μL；
起始细胞数量：800个、2000个、4000个、10000个、20000个；
培养条件：5％CO2，37℃培养7天，每2-3天，吸出7.5μL培养基，并补加10μL培养基。
图3显示了采用本申请的悬滴培养板培养不同起始数量的HepG2肝癌细胞7天后，细胞球生长状态，可以看出，初始细胞数量越多，7天后获得的细胞球直径越大，细胞生长状态良好，本申请的悬滴培养板培养细胞的初始浓度可以达到20000个/40μL。
实验例4HepG2肝癌细胞球原孔位回收实验
采用本申请实施例1的悬滴培养板进行HepG2肝癌细胞球原孔位回收实验。
细胞：HepG2肝癌细胞
培养基：含15％胎牛血清的DMEM培养基；
培养基悬挂体积：40μL；
起始细胞数量：10000个；
培养条件：5％CO2，37℃培养7天，每2-3天，吸出7.5μL培养基，并补加10μL培养基。
培养7天后，用移液枪在欲回收的孔位对应的加液孔加入20-50uL PBS溶液或培养基，使包含有细胞球的悬挂液滴从悬滴培养孔滴落至下方对应的培养孔中，随后进行显微镜观察，结果如图4A所示，图4B为采用尼康倒置显微镜对原孔位回收的细胞球拍摄的明场显微照片 (20倍物镜)。
从图4A中可以看出，所回收的细胞球形状完整，说明滴落过程产生的剪切和冲击对细胞球影响微小。从图4B中可以看出，采用本申请的悬滴培养板培养HepG2肝癌细胞球的直径可以达到375μm，显著大于现有悬滴培养板的细胞培养尺寸。
原孔位的回收方式可以实现选择性独立回收，不影响其他孔位悬滴。所回收的细胞球可进一步进行固定和染色成像观察，也可在原孔位中继续培养。
对回收的细胞球经多聚甲醛溶液固定后，用PhenoVue Cell Painting Kit进行染色，所用染料包含PhenoVue Fluor 555–WGA，PhenoVue Fluor 488-Concanavalin A，PhenoVue Fluor 568–Phalloidin，PhenoVue Hoechst 33342Nuclear stain，染色后的细胞球用Opera Phenix Plus High-Content Screening System进行高内涵成像，得到细胞球的荧光显微照片结果如图5所示。
从图5中可以看出，采用本申请的悬滴培养板培养HepG2肝癌细胞球球形均匀，整体结构致密。PhenoVue Hoechst 33342Nuclear stain染色细胞核，PhenoVue Fluor 555–WGA染色细胞膜，PhenoVue Fluor 488-Concanavalin A染色细胞内质网，PhenoVue Fluor568–Phalloidin 染色构成细胞骨架的肌动蛋白丝，从荧光显微照片中可明显看出，细胞球外层细胞状态良好，粘附紧密，符合肝实质肿瘤细胞球的结构特征及外层细胞增殖活跃的特征。
以上所述仅为本申请的较佳实施例，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请保护的范围之内。

Claims (20)

1.一种悬滴培养板，其特征在于，包括板体和至少一个贯穿所述板体的悬滴培养孔，所述悬滴培养孔包括液滴悬挂孔，和设置于所述液滴悬挂孔上方并与之连通的加液孔；其中，所述液滴悬挂孔的孔径沿远离所述加液孔的方向逐渐增大。
2.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述液滴悬挂孔的形状为圆锥形、圆台形、球缺形、球台形、椭球缺形或椭球台形。
3.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述液滴悬挂孔底面直径为0.5-5mm。
4.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述液滴悬挂孔底面直径为2-4mm。
5.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述液滴悬挂孔的高度为0.5-4mm。
6.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述液滴悬挂孔的高度为1-4mm。
7.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述液滴悬挂孔为球缺形。
8.根据权利要求7所述的悬滴培养板，其特征在于，所述球缺形的高H与球的半径R满足H＝0.25R～1.1R。
9.根据权利要求7所述的悬滴培养板，其特征在于，所述球缺形的高H与球的半径R满足H＝R。
10.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述加液孔的孔径为0.5-2mm。
11.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述加液孔的孔径为1-2mm。
12.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述加液孔的深度为0-2mm。
13.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述加液孔的深度为0.5-1mm。
14.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述加液孔的孔径不小于所述加液孔的深度的一半。
15.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述加液孔的中心线与所述液滴悬挂孔的中心线重合。
16.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述板体的厚度为0.5-6mm。
17.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述板体的材料包括PMMA、PS、PC、PE、PET、PDMS的至少一种。
18.根据权利要求1所述的悬滴培养板，其特征在于，所述悬滴培养孔直接形成于所述板体中。
19.一种悬滴培养装置，其特征在于，包括权利要求1-13中任一项所述的悬滴培养板和细胞培养板，所述细胞培养板包括底板和上盖，所述底板上设有若干底板孔，所述底板孔的底端封闭，所述悬滴培养板设置于所述底板和上盖之间，所述悬滴培养板上的悬滴培养孔与所述底板孔一一对应。
20.根据权利要求19所述的悬滴培养装置，其特征在于，所述悬滴培养板与所述细胞培养板可拆卸连接。
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