WO2014196204A1

WO2014196204A1 - 培養容器及び培養方法

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Publication number: WO2014196204A1
Application number: PCT/JP2014/002993
Authority: WO
Inventors: 洋子江尻; 賢綾野; 直人福原; 英樹谷口; 貴則武部
Original assignee: 株式会社クラレ; 公立大学法人横浜市立大学
Priority date: 2013-06-07
Filing date: 2014-06-05
Publication date: 2014-12-11
Also published as: CA2914463C; US11473046B2; JPWO2014196204A1; EP3006553A4; EP3006553A1; ZA201509018B; US20160137962A1; BR112015030041B1; AU2020201221B2; JP2020000255A; JP2021129590A; EP3006553B1; JP6892486B2; US20240093134A1; CN105308170B; CN105308170A; AU2014276229A1; KR20160017036A; SG11201509870QA; KR102359408B1

Abstract

　均一な大きさのスフェロイドを高効率に作製し、容易に培地交換と回収とを実施するマイクロ空間構造を設計し、設計したマイクロ空間構造を有する培養容器を提供する。培養容器は、底部（１１）と開口部（１２）とからなる複数の凹み（１０）が配列している。底部（１１）が、半球状と円錐台とのいずれかの形状を有し、開口部（１２）が、底部（１１）との境界から凹み（１０）の端部までを囲むテーパ角１度以上２０度以下の壁で構成される。加えて、境界の相当直径が５０μｍ以上２ｍｍ以下であり、底部（１１）の底から端部までの深さが相当直径の０．６倍以上３倍以下であり、開口部（１２）を構成する壁が底部（１１）と連続する面を形成し、かつ、連続する面の傾斜が境界で変化する。

Description

培養容器及び培養方法

　本発明は、細胞の培養及びその回収に関するに関する。

　近年の細胞工学の発展に伴い、生体内の細胞周囲環境や形態を模倣してより生体内に近い機能をもつ細胞を取得する新たな培養方法が開発されている。このような方法で培養した細胞を治療や生体反応のシミュレーターとして使用する試みがなされるようになってきた。スポンジや繊維などで構成された培養担体を用いて培養する方法、培地中に細胞を浮遊させて自然にスフェロイドを形成させる浮遊培養、従来の培養容器（フラスコ等）に細胞非接着処理を施しスフェロイドを形成させる方法など様々な方法が開発されている。特にスフェロイド培養は細胞の相互作用を維持できる優れた方法であり、膵島細胞、肝細胞、幹細胞、ガン細胞など様々な細胞に応用されている。近年、スフェロイドの大きさに着目した研究がなされるように成っており、例えばガン細胞を使った医薬品スクリーニング試験では、スフェロイドの直径や体積を指標にしている（非特許文献１）。また、スフェロイドの大きさに依存して細胞の持つ機能が異なること（非特許文献２，３）が示されている。このようにスフェロイドを形成させる技術に加えて、スフェロイドの大きさをコントロールする技術が注目されるようになってきた。さらに、このように細胞の特異的な機能を再現できることから、人工臓器やバイオリアクターなどの分野において利用されることが期待されている。このような用途において、大量にスフェロイドを作製し回収する技術が重要となってくる。

　均一な直径のスフェロイドを作成する手段として、特許文献１に親水性膜を設けたＵ字ボトムを有する９６ＷＰに播種する細胞数の個数を変えることにより形成されるスフェロイドの大きさをコントロールする方法がある。しかし、培養面積あたりのスフェロイド数の数はすくなく、大量のスフェロイドを作製することは困難である。他の方法として、特許文献２－４に開示されている、マイクロ空間内でスフェロイドを形成する方法がある。

特開平８－１３１１５３号公報特開２０１０－８８３４７号公報国際公開第２０１２／０３６０１１号国際公開第２０１３／０４２３６０号

Juergen Friedrich1、他著、"Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach"、PROTOCOL、２００９年２月１２日（Published online）ｐｐ．３０９－３２４ Franziska Hirschhaeuser,他著、"Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again"、Journal of Biotechnology 148、２０１０年、ｐｐ．３-１５ C´ELINE LIU BAUWENS、他著、"Control of Human Embryonic Stem Cell Colony and Aggregate Size Heterogeneity Influences Differentiation Trajectories"、STEM CELL、２００８年、ｐｐ．２３００－２３１０

　しかしながら、特許文献１の培養方法は、培養の効率が極めて低く、大量培養を行う際のボトルネックになっている。また、特許文献２，３の培養方法は、単位面積当たりのスフェロイド形成効率は高いが、培地交換時にスフェロイドが空間内から離脱する恐れがある。このため、培地交換時に注意を要する。さらに、スフェロイドの離脱を防ぐためにスフェロイドの一部をマイクロ空間内に接着させる方法が検討されている（特許文献４）。しかし、細胞の接着性は各種細胞毎に異なるため、使用する細胞毎に表面処理方法を検討する必要があり実用性にかける。

　本発明は、このような事情に鑑みてなされたものであり、均一な大きさのスフェロイドを高効率にまたは高効率かつ大量に作製することを可能とするため、培地交換と細胞回収とが容易に実施可能となるマイクロ空間構造を設計し、設計したマイクロ空間構造を有する培養容器及びそれを用いる培養方法を提供することを目的とする。

　本発明の一実施形態の係る培養容器の一態様は、底部と開口部とからなる複数の凹みが配列するものである。前記底部が、半球状と円錐台とのいずれかの形状を有し、前記開口部が、前記底部との境界から前記凹みの端部までを囲むテーパ角１度以上２０度以下の壁で構成される。加えて、前記境界の相当直径が５０μｍ以上２．５ｍｍ以下であり、前記底部の底から前記端部までの深さが前記相当直径の０．６倍以上３倍以下であり、前記開口部を構成する壁が前記底部と連続する面を形成し、かつ、前記連続する面の傾斜が前記境界で変化する。

　また、一実施形態の培養容器において、前記端部の形状が半球状、台形、または逆三角形のいずれかであることが好ましく、隣り合う二つの凹みの間が平坦であり、前記二つの凹みの距離が５μｍから５０μｍであることが好ましい。
　さらに、一実施形態の培養用において、前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることが好ましい。前記凹みへ、プラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれかまたはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により官能基を形成させて、水接触角が４５度以下になるように処理されたことが好ましい。
　前記凹みへ、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖が固定化されていることが好ましい。
　前記凹みへ、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体が固定化されていることが好ましい。
　前記凹みへ、プラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれかまたはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理した後、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、及び、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体のうちのいずれか一つのポリマーが固定化されている細胞非接着表面であることが好ましい。
　前記親水性のポリマー鎖がポリヒドロキシエチルメタクリレートであることが好ましく、前記ポリヒドロキシエチルメタクリレートの平均分子量が１０万以上であることがより好ましい。

　本発明の一実施形態の係る培養方法の一態様は、上述したいずれかの培養容器を用いる。そして、この培養方法は、総細胞数が、前記培養容器が有する前記凹みの数（Ｎ）以上であり、前記凹みが形成する空間の体積（Ｖ１）を播種する細胞の体積（Ｖ２）で割った値に前記凹みの数（Ｎ）を掛けた数以下である細胞を培地に分散させ、前記培地を前記培養容器に添加する。

　本発明の一実施形態の係る培養方法の一態様において、前記凹みが形成する空間１個につき１個のスフェロイドを形成させることが好ましく、前記空間にスフェロイドを形成させてスフェロイドを成長（増殖）させることがより好ましい。
　分化誘導させる場合は、前記空間にスフェロイドを形成させた状態で誘導することが好ましい。
　前記培養容器内に形成されたスフェロイドの総数の６０％以上が、平均スフェロイド直径のプラスマイナス５％の範囲内の直径であることが好ましい。
　前記培地を攪拌することで前記凹み内の細胞を回収することが好ましく、前記培地の攪拌が、前記培養容器を振とうして前記培地を攪拌すること、前記培地を吸引及び排出して前記培地を攪拌すること、前記培養容器に攪拌羽を設置し培地を攪拌すること、前記培養容器に攪拌子をいれ培地を攪拌すること、またはこれら組みあわせからなる方法のいずれかであることがより好ましい。
　前記培地を少なくとも１回以上交換し、交換する培地の割合が２０％以上であることが好ましい。
　本発明の一実施形態の係る培養方法の他の一態様は、上述したいずれかの培養容器を用いる。そして、培養方法は、以下の各工程を実施することにより細胞を播種、培養、培地交換、回収する。
ａ）培養容器に存在する凹みの数（ｎ）と同数以上、前記凹みの体積（Ｖ）を播種する細胞の体積（ｖ）で割った値に前記凹みの数（ｎ）を掛けた数以下の細胞数を培地に分散させ、前記培地を培養容器に添加する工程、
ｂ）１２時間以上前記培養容器内で前記細胞を培養してスフェロイドを形成させる工程、
ｃ）前記培地を２０％以上吸引した後、同量の新鮮な培地を注入する工程、
ｄ）前記ａ）からｃ）の工程を複数回行い、スフェロイドを成長させる工程、
ｅ）前記スフェロイドを所望の大きさに成長させた後、前記培地を攪拌して各凹み内の細胞を前記培地中に浮遊させる工程、及び
ｆ）前記培地ごと前記細胞を吸引機にて吸い取り前記細胞を回収する工程。

　本発明によれば、均一な大きさのスフェロイドを高効率かつ大量に作製することが可能な上、容易に培地交換と回収との実施を可能するマイクロ空間構造を設計し、設計したマイクロ空間構造を有する培養容器及びそれを用いる培養方法を提供することが可能となる。

一実施形態の培養容器の一例を示す図である。実施形態１の凹みを横から見た形状例を示す断面図である。実施形態１の凹みを上から見た形状例を示す図である。実施形態２の球形状の一部分を用いる凹みの形状例を示す図である。実施形態２の球形状の一部分を用いる凹みの他の形状例を示す図である。実施形態２の円錐台を用いる凹みの形状例を示す図である。実施形態２の凹みの他の形状例を示す図である。実施形態３の開口部の形状例を示す図である。実施形態３の開口部の他の形状例を示す図である。実施形態４の培養容器の構成例を示す図である。実施形態４の他の培養容器の構成例を示す図である。実施形態４のさらに他の培養容器の構成例を示す図である。実施例及び比較例の培地交換時のスフェロイドの残存率を示す図である。実施例及び比較例の培地交換前後のスフェロイドの画像を示す写真である。実施例の細胞を回収した前後の画像を示す写真である。実施例の培養容器から回収したスフェロイドの写真である。

　以下、実施形態について、図面を参照しながら説明する。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜、省略、及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素および相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。

　実施形態１．
＜培養容器＞
　図１は、一実施形態の培養容器の一例を示す図である。図１では、複数の培養容器１を有する培養プレート３の一部分を示す。図１の上段には、培養容器１の底に形成される複数の凹み１０の一部分を、培養プレート３の上からみた図を示す。培養容器１は、複数の凹み１０が配置される。複数の凹み１０は、培養容器１の製造や細胞培養の効率の観点から、規則的に配置されることが好ましい。培養容器１は例えば複数のウェルを有するウェルプレートの一つのウェルに相当する。言い換えると、ウェルプレートの各ウェルに複数の凹み１０が配置されることになる。
　ウェルプレートは、多数のくぼみ（穴またはウェル）のついた平板からなる実験・検査器具であり、各ウェルを試験管あるいはシャーレとして利用するものをいう。ウェルの数には例えば、６、２４、９６、３８４などがあり、それ以上の数のものもある。ウェルの底は平らなもの、丸いもののほか、細長いマイクロチューブを多数組み合わせた形式のもの（ディープウェルプレート）もある。
　また、凹み１０は、細胞を培養するための微小な空間であるマイクロ空間を形成することから、マイクロ容器ということもできる。

　図２、３は、実施形態１の凹みの形状例を示す図である。図２では、一つの凹み１０を横から見たときの断面図を示し、図３は、一つの凹み１０を上から見たときの図を示す。図３に示す凹み１０は、図１の上段の凹み１０の詳細な構成例となる。
　各凹み１０は、底部１１と開口部１２とから構成される。底部１１は、培養容器１の底になる部分であり、開口部１２は、底部１１の上部に配置される部分である。底部１１と開口部１２とが接する部分を境界と記載する。図２では、符号Ｒの矢印で示す長さの部分が境界の位置に対応する。また、図３では、境界の位置を２点破線で示している。ただし、底部１１と開口部１２とは連続した面で構成され、一体として製造される。

　図２，３では、培養容器１に形成される複数の凹み１０に関して、相当直径Ｒ、深さ（高さ）Ｄ、を示す。
　相当直径Ｒは、凹み１０の底部１１に内接する内接円の直径をいう。ここでは、底部１１と開口部１２との境界において内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｒは、境界における、凹み１０の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。
　深さＤは、底部１１の内側の底から凹み１０の上端までの長さである。凹みの１０の上端は、開口部１２の端部（上端）と同じである。深さＤは、凹み１０が形成する空間の深さである。言い換えると、底部１１が形成する空間の底から開口部１２が形成する空間の上端までの深さである。図２では凹み１０の深さＤに加え、底部１１の深さＤ１及び開口部１２の深さＤ２を示している。

　底部１１は、細胞を培養する空間（第１空間）を形成する。底部１１は、例えば、半球状の形状を有する。例えば、相当直径Ｒを直径とする球形を半分にした形状を用いることができる。底部１１の形状について半球状に限定されるものではない。他の具体例については実施形態２で説明する。
　開口部１２は、細胞の培養及び回収を補助するように働く空間（第２空間）を形成する。開口部１２は、底部１１との境界から凹み１０の端部（先端）までを囲むテーパ角が１度以上２０度以下の壁で構成される。開口部１２を構成する壁のテーパ角が５度以上１５度以下であることが好ましく、１０度がより好ましい。その理由は、テーパ角が小さすぎると回収する際に細胞が凹みから培地に移行できず、逆に大きすぎると培地交換中に細胞が離脱するからである。

　図２ではテーパ角を符号θ１、θ２で示す。図２，３に示す凹み１０の形状例では、テーパ角θ１、θ２は略同じ場合を示している。
　底部１１と開口部１２との境界は、相当直径Ｒが５０μｍ以上１ｍｍ以下となるように形成される。スフェロイドの中心部まで栄養を供給したい場合は相当直径５０μｍ以上５００μｍ以下が好ましく、より好ましくは１００μｍ以上５００μｍ以下が好ましい。その理由は、栄養分や酸素は拡散によってのみ細胞内に移行するが、中心部が壊死しない大きさは３００μｍといわれており（Efrem Curcio et al.,"Mass transfer and metabolic reactions in hepatocyte spheroids cultured in rotating wall gas-permeable membrane system", Biomaterials 28 (2007) 5487-5497)、その大きさ以上にならないようにするためには、上記直径が好ましい。
　逆にガン細胞のように細胞の中心部にネクローシスを作製したいような場合（Franziska Hirschhaeuser et al.,"Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again", Journal of Biotechnology 148 (2010) 3-15, Fig1）には、相当直径Ｒが４００μｍ以上２ｍｍ未満であることが好ましい。その理由は、上述したように３００μｍでは中心部まで栄養がいきわたりネクローシスを起こさない場合考えられるからである。よって３００μｍ以上の直径のスフェロイドを得るためには、４００μｍ以上なければならない。
　加えて、底部の底から端部までの深さＤが相当直径Ｒの０．６倍以上３倍以下となるように形成される。好ましくは、深さＤが相当直径Ｒ０．７倍以上１．２倍以下であり、より好ましくは、０、８～１倍である。

　また、培養容器１は、隣り合う二つの凹み１０の間が平坦であることが好ましい。例えば、二つの凹み１０の距離が５μｍから５０μｍの範囲であることが好ましい。その理由は、大量のスフェロイドを効率的に得るためには、単位面積あたりのスフェロイド数を多くし高密度で培養することが好ましいからである。そのためにはスフェロイドが形成されない壁の上面は小さいほどよい。ただし、テーパ角が小さい場合は壁が薄いと細胞播種時や培地交換時の振動により容易に亀裂が生じる可能性がある。そのため５μｍ以上であることが好ましい。このような観点から５～２０μｍが好ましい。
　これに対して、隣り合う二つの凹み１０が接触する場合であってもよい。例えば、二つの凹み１０の端部の一部分が接触し、開口部１２のテーパ角の斜面が接触して山形の形状となっていてもよい。

　上述した形状に加え、培養容器１は以下のように製造されることが好ましい。
　培養容器１が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることが好ましい。

　培養容器１が有する各凹み１０へ、プラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれかまたはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により官能基を形成させて、水接触角が４５度以下になるように処理されることが好ましい。
　加えて、各凹み１０へ、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖が固定化されていることが好ましい。親水性のポリマー鎖は、上述した水接触角が４５度以下になるように処理された各凹み１０へ固定化されることがより好ましい。
　さらに加えて、各凹み１０へ、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体が固定化されていることが好ましい。この固定化の処理は、上述した水接触角が４５度以下になるように処理された各凹み１０、親水性のポリマー鎖が固定化された各凹み１０、またはこれらを組合せた各凹み１０へ実施されることがより好ましい。

　さらに、各凹み１０へ、プラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれかまたはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理した後、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、及び、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体のうちのいずれか一つのポリマーが固定化されている細胞非接着表面であることが好ましい。この処理は、上述した各処理、または各処理の組合せた処理とともに実施されることがより好ましい。
　また、上述した親水性のポリマー鎖がポリヒドロキシエチルメタクリレートであることが好ましく、さらに、ポリヒドロキシエチルメタクリレートの平均分子量が１０万以上であることがより好ましい。

＜培養方法＞
　次に、図１乃至３に示す培養容器１を用いる細胞の培養方法について説明する。
　細胞の培養は次の各工程により実施する。
ａ）細胞を分散させた培地を培養容器１へ添加する工程
ｂ）細胞を培養する工程
ｃ）培地を交換する工程
ｄ）スフェロイドを成長させる工程
ｅ）スフェロイドを培地の中に浮遊させる工程
ｆ）細胞を回収する工程
　上述した各工程は、ａ）からｄ）が細胞を培養する工程（細胞培養工程）であり、ｅ）、ｆ）が細胞を回収する工程（細胞回収工程）と区分することもできる。
　ここで、スフェロイドは、細胞が多数凝集して細胞塊を形成し、３次元状態になったものである。

　以下に各工程について説明する。
ａ）細胞を分散させた培地を培養容器１へ添加する工程
　細胞を培養する準備を行う工程であり、培地に以下の総数の細胞を分散させ、培養容器１へ添加する。
　総細胞数の下限は、培養容器１に存在する凹み１０の数（ｎ）と同数以上とする。
　総細胞数の上限は、培養容器１が有する凹み１０の体積（Ｖ）を播種する細胞の体積（ｖ）で割った値に、凹みの数（ｎ）を掛けた数以下とする。記号を用いた数式で表すと、細胞総数の上限値＝Ｖ／ｖ×ｎ、と表すことができる。ここで、複数の凹み１０の体積（Ｖ）は同じであることを前提とする。異なる場合には平均値を用いる。
　培地は培養する細胞に応じて調整する。

ｂ）細胞を培養する工程
　培養容器１内で１２時間以上、細胞を培養し、スフェロイドを形成させる。培地に分散させた細胞は、培養容器１へ培地を添加すると、凹み１０へ取り込まれ、各凹み１０内で培養される。各凹み１０に細胞が１個取り込まれることが好ましく、底部１１が形成する空間に１個のスフェロイドが形成されることが好ましい。各凹み１０内では、細胞が凹み１０の底部１１内で増殖する。培養播種時に細胞が最低１個なければ、培養中に隣の凹み１０から細胞が移動することはないので、その凹み１０にスフェロイドは形成されない。スフェロイドを高密度に培養するためには、全ての凹み１０にスフェロイドが形成されることが好ましいことから、最低１個の細胞が凹み１０に存在することが好ましい。生産効率の観点から、初期の細胞数はできる限り少なくする一方で多くのスフェロイドを回収できることが好ましいため、凹み１０に存在する細胞数は少ないほどよい。そのため、１個の細胞が凹み１０に存在することが好ましい。
ｃ）培地を交換する工程
　培地交換では、培養容器１内の培地を２０％以上吸引した後、同量の新鮮な培地を注入する。培地交換は、細胞培養中少なくとも１回以上実施されることが好ましい。
ｄ）スフェロイドを成長させる工程
　上述したａ）からｃ）の工程を複数回行い、スフェロイドを成長させる。分化誘導させる場合は、凹み１０の底部１１が形成する空間において、スフェロイドが大きくならない状態まで成長させた後、分化誘導培地に交換して分化させることが好ましい。加えて、培養容器１内に形成されたスフェロイドの総数の６０％以上が、平均スフェロイド直径のプラスマイナス５％の範囲内の直径であることがより好ましい。

ｅ）スフェロイドを培地中に浮遊させる工程
　スフェロイドを所望の大きさに成長させた後、培養容器１の培地を攪拌して各凹み１１内で培養した細胞を培地中に浮遊させる。例えば、培地を攪拌することによって実施する。具体的には、培地の攪拌は、（１）培養容器１を振とうして培地を攪拌すること、（２）培地を吸引及び排出（ピペッティング操作）して培地を攪拌すること、（３）培養容器１に攪拌羽を設置し培地を攪拌すること、（４）培養容器１に攪拌子をいれ培地を攪拌すること、（５）上述した（１）から（４）の二つ以上を組合せて培地を攪拌すること、のうちのいずれかの方法を用いることができる。
ｆ）細胞を回収する工程
　培養容器１内の細胞含む培地を吸引機にて吸い取り、培地に浮遊させた細胞（スフェロイド）を回収する。

　以上説明したように、実施形態１では、細胞の播種、培地交換、回収を同じ容器で行うことができることに加えて、スフェロイドを回収可能な養容器に関して説明した。
　実施形態１の培養容器１を用いて細胞を培養することにより、底部１１に所望の大きさのスフェロイドを形成することができる。そして、培養したスフェロイドを効率よく回収することができる。具体的には、凹み１０が底部１１に加え、開口部１２を有することにより、培地交換では培地を吸い取るときに細胞が底部１１に接着または浮遊しているが離脱しない状態を維持しやすくし、底部１１からの細胞の離脱を抑制することが期待できる。一方、細胞の回収では、底部１１の培地を吸引及び排出するときに、開口部１２により培地の流れを生じやすくすることが期待できる。加えて、底部１１に半球状の形状を用いることにより、スフェロイドの形状、大きさを均一にすることに寄与することが期待できる。

　実施形態２．
　実施形態１では、底部１１が半球状の形状を有する構成例を説明したが、実施形態２では他の形状について説明する。底部は、球形状の一部分からなる形状、円錐台の形状、あるいは、線状から形成されている態様であってもよい。底部が線状とは、実質的な底部がなく、凹みが開口部のみから形成されている態様である。図４から図７に本実施形態の凹みの形状例を示す。図４から図７は、実施形態１の底部１１と異なる底部２１Ａ～２１Ｄを有する凹み２０Ａ～２０Ｄを示すが、開口部１２については実施形態１と同様の形状で実現できるため同じものを組み合わせた凹みの形状例を示す。

　図４，５は、実施形態１が底部１１に球を半分にした半球状を用いることに対して、底部に用いる半球形の形状が異なる例を示している。図４は、球形の半分よりさらに少ない部分を用いる底部２１Ａを示す。言い換えると、底部２１Ａが半球状の一部分を用いる場合である。図５は、底が半球形である筒型の形状を用いる底部２１Ｂを示す。図５に示す底部２１Ｂの形状の場合、筒の部分が長くなると細胞を回収するときに細胞が底部２１Ｂから培地へ浮遊しなくなるため、筒の部分の長さを調整することが好ましい。例えば、底部２１Ｂと開口部１２との深さ（高さ）が同じ割合（１：１）となるように構成することが好ましい。
　図６は、円錐台を用いる底部２１Ｃを示す。底部が平らである場合、光の屈折・干渉が軽減でき顕微鏡観察を行う際には有用である。
　図７は、底部２１Ｄが線状、言い換えると底部２１Ｄが空間を形成しない凹み２０Ｄの形状例を示す。凹み２０Ｄは、他の形状の培養容器に比べて細胞の培養・回収の効率は劣るものの、培養容器の製造工程が容易であるという利点がある。

　なお、本実施形態では上述した通り開口部１２を実施形態１と同様の形状で実現する場合を説明したが、これに限られるわけではない。
　本実施形態の培養容器を用いる細胞の培養方法は実施形態１と同様であるため説明を省略する。
　本実施形態の培養容器も実施形態１と同様の効果を奏することができる。

　実施形態３．
　上述した各実施形態では、開口部１２の形状を円形または略円形である態様を説明したが、他の形状の開口部を有する培養容器について説明する。開口部の端部の形状は、半球状、台形、または三逆三角形等の他の形状であってもよい。一方、開口部が底部と接する境界の形状（開口部の境界部分）は、底部の境界部分と同じ形状であることが必要である。図８，９は、実施形態１の開口部１２と異なる端部の形状を有する凹み３０Ａ、３０Ｂを表している。図８，９では、実施形態１と同じ底部１１を表しているが、実施形態２の底部２１Ａ～２１Ｄのいずれかと組み合わせることも可能であり、他の形状の底部であってもよい。底部及び開口部の形状は、その境界において斜面が連続して形成できる組合せであればよい。

　図８は、開口部３２Ａの端部が曲線を描く形状の一例を示している。図８は、凹み３０Ａを上から見た図であり、底部１１の端部を相当直径Ｒの円で示し、開口部３２Ａの外周を曲線で示している。開口部３２Ａの端部は左右及び上下が対称とならない曲線であるが、左右対称、または上下対称となるような形状であっても構わない。図９は、開口部３２Ｂの端部が矩形である例を示している。図９では、正方形の例を示しているが、他の多角形、曲線と直線との組合せであってもよい。図９は、凹み３０Ｂを上から見た図であり、底部１１の端部を相当直径Ｒの円で示し、開口部３２Ｂの外周を正方形の実線で示している。例えば、隣接する凹みとの間の空間の面積を調整するために端部の形状を変形させてもよい。開口部の端部の形状は細胞の浮遊を促進する役割を果たすことが必要であるため、テーパ角が重要となる。
　図８，９の形状例では、テーパ角は開口部３２Ａ、３２Ｂの形状に応じて異なる値となる。これは、開口部３２Ａ、３２Ｂの形状に応じて、壁を形成する斜面の傾斜が異なるからである。

　本実施形態で示した開口部の各形状は、実施形態１の底部１１または実施形態２で説明した底部の各形状と組合せることが可能である。加えて、上述した実施形態で示す底部以外の形状と組合せも可能であることは言うまでもない。
　本実施形態の培養容器を用いる細胞の培養方法は実施形態１と同様であるため説明を省略する。
　本実施形態の培養容器も実施形態１と同様の効果を奏することができる。

　実施形態４．
　図１では、一実施形態の培養容器１を培養プレート３（ウェルプレート）に配置した態様を説明した。一実施形態の培養容器１は、図１の培養プレート３以外の容器（器具）にも形成することができる。図１０から１２に実施形態４の培養容器の構成例を示す。図１０は、フラスコ形状の培養フラスコを用いる構成例を示す概略図である。図１１は、培養プレートの枠を用いる構成例を示す概略図である。図１２は、図１１に示す培養プレートをスタック形状にして用いる構成例を示す概略図である。

　図１０では、培養フラスコ４の底の面を培養面４Ａ（培養底面）とする。培養面４Ａは図１に示す培養容器１に相当するため、培養容器ということもできる。培養面４Ａは、図１の培養容器１と同様に、同じ培地を用いる単位となる。培養フラスコ４は、キャップ４Ｂを有する。培養面４Ａの面積は、用途に応じて設計すればよい。一般的な培養フラスコは、２５，７５，２２５ｃｍ^２がある。培養フラスコ４の培養面４Ａには、複数の凹み４０が形成される。例えば、培養フラスコ４の底の面のうち、網掛け部分を培養面４Ａとして設計し、培養面４Ａに複数の凹み４０を形成する。凹み４０の形状（底部及び開口部の形状）は、上記各実施形態のいずれであってもよい。
　図１１では、培養プレートの枠のみを用いる例である。図１では培養プレート３に培養容器１（ウェル）が形成されているが、図１１では培養プレート５の底の面を培養面５Ａ（培養底面）とする。培養面５Ａは、図１に示す培養容器１に相当するため、培養容器ということもできる。培養面５Ａは、同じ培地を用いる単位となる。培養面５Ａの構成例（概略断面図）を図１１の下段に示している。例えば、培養プレート５の底の面のうち、網掛け部分を培養面５Ａとして設計し、培養面５Ａに複数の凹み５０を形成する。図１１に示す凹み５０は、模式的に示したものであり、凹み５０の数、大きさい等は、用途に応じて設計されるものである。凹み５０の形状（底部及び開口部の形状）は、上記各実施形態のいずれであってもよい。
　図１２に、図１１に示す培養プレート５を複数積み上げて構成するセルスタック形態の構成例、言い換えると多段式の構成例を示す。より大面積化し閉鎖系で培養する場合には、セルスタック形態を用いるのが一般的である。図１２では、図１１に示す培養プレート５を積み上げた例を示したが、図１に示す培養プレート３を積み上げてもよい。図１２中、複数の培養容器を積み上げたものを収納し、培地を交換するための仕組みを提供する容器については、省略している。複数の培養プレートを収納する容器は、例えば、一般的なスタック形状の培養容器を用いることができる。ここでは説明を省略する。

　その他の実施形態．
　上記各実施形態では、底部と開口部との境界を培養容器の底と平行するようにあらわしているが、必ずしも底と平行でなくてもよい。例えば、境界が底に対して傾斜していてもよく、境界が曲線を描くように形成されていてもよい。底部１１においてスフェロイドが形成されるように十分な空間が形成できればよい。

［実施例］
　細胞凝集体の培養容器及び回収方法について、次の実施例、比較例の試験を行った。
（１）培養容器
　表１に示す培養容器を用いた。

　実施例の培養容器は、図１－３に示す凹み１０を有するウェル（培養容器１）を培養プレートに形成したものを作製した。
　表１中、マイクロ容器は、図１－３の凹み１０に相当し、マイクロ空間は、凹み１０（マイクロ空間）が形成する空間である。一ウェル当たりのマイクロ空間の数は、一ウェル当たりの凹みの数であるともいえる。

（２）培養方法
　後述する残存率及び回収率を画像解析により算出するため、GFPで蛍光標識した内胚葉細胞を用いた。この内胚葉細胞、血管内皮細胞とヒト間葉系幹細胞各々１０：５-１０：２の割合で混合し、内皮細胞培地キット-2：EGM-2 BulletKit（製品コード CC-3162：Lonza）で３０日間培養を行った。培地は２日に1回交換した。
（３）スフェロイド残存率の測定
　共焦点レーザ顕微鏡を用い、ウェル全体を観察、画像解析ソフトを用いてスフェロイドを認識させ、その数をカウントし、スフェロイド数とした。以下の式でスフェロイド残存率を計算した。
スフェロイド残存率（％）＝スフェロイド数×１００／マイクロ空間の数
　細胞播種後数時間後（ゼロ日）、いずれの培養容器も９０％以上のマイクロ空間でスフェロイド様の塊が形成されていた。培養１０日目、２０日目の培地交換後のスフェロイドの数をゼロ日目のスフェロイド数で其々割った値をスフェロイド残存率とした。
（４）回収方法
　培養終了後、ピペット（メーカ、型番）を用いて溶液を攪拌し、浮遊してきたスフェロイドを回収した。例えば、２４ウェルプレートでは５００μＬ～１ｍＬの培地が入っているので、最大１ｍＬの培地が吸引できるピペットを用いるのが適している。
（５）回収効率
　回収前後に共焦点レーザ顕微鏡で画像を取得した。

（６）結果
　図１３に培地交換時のスフェロイドの残存率を示す。縦軸にスフェロイドの残存率（Sphere Number）を、横軸に培養日数を示す。
　図１３では、培養開始から２０日までのデータを示す。図１３に示すように、実施例より比較例が大きく減少していることが示されている。２０日培養した後、実施例は、スフェロイドの残存率が６０％以上となり、比較例の１．５倍に向上した。

　図１４に、実施例及び比較例の培地交換前後のスフェロイドの画像を示す。図１４では、培養四日目、２回目の培地交換前後の培養容器内のスフェロイドの画像を示す。図１４の左側が実施例（Kuraray p-HEMA）、右側が比較例（Iwaki MPC）の写真である。また、上段に培地交換前、下段（矢印より下）に培地交換後の画像を示す。より詳細には、下段の画像は、培地交換前の状態から、培地の半量を交換する（半量交換）、二度の培地交換を実施した後を示す。
　画像中、白色に見える部分がスフェロイドである。培地交換前は全体にスフェロイドが確認される。培地交換後は、実施例では培地交換前後で大きな違いはなく、ほとんどのスフェロイドが残存しているが、比較例では約半分程度しか残存していない。

　図１５に、実施例の細胞を回収した前後の画像を示す。図１５中、左側（ＢＥＦＯＲＥ）は回収前の画像、右側（ＡＦＴＥＲ）は回収後の画像である。上段に培養容器全体の画像を、下段に培養容器の一部分を拡大した画像を示す。図１６に実施例の培養容器から回収した後のスフェロイドの写真を示す。
　黒色の円形のマイクロ容器（凹み）内の点状のものがスフェロイドである。回収後の画像には点状のものがなく、ほぼ１００％回収できている。また、図１６に示すように、回収後の細胞の形態は良好なスフェロイドの形をしており、回収操作によりスフェロイドが破壊されることはなかった。

　なお、本発明は上記に示す実施形態に限定されるものではない。本発明の範囲において、上記実施形態の各要素を、当業者であれば容易に考えうる内容に変更、追加、変換することが可能である。

　この出願は、２０１３年６月７日に出願された日本出願特願２０１３－１２０９１５を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。

１　培養容器
３、５　培養プレート
４Ａ、５Ａ　培養面
５　培養フラスコ
１０、２０Ａ～２０Ｄ、３０Ａ、３０Ｂ、４０、５０　凹み
１１、２１Ａ～２１Ｄ　底部
１２、３２Ａ、３２Ｂ　開口部

Claims

　底部と開口部とからなる複数の凹みが配列し、
　前記底部が、半球状と円錐台とのいずれかの形状を有し、
　前記開口部が、前記底部との境界から前記凹みの端部までを囲むテーパ角１度以上２０度以下の壁で構成され、
　前記境界の相当直径が５０μｍ以上２ｍｍ以下であり、前記底部の底から前記端部までの深さが前記相当直径の０．６倍以上３倍以下であり、
　前記開口部を構成する壁が前記底部と連続する面を形成し、かつ、前記連続する面の傾斜が前記境界で変化する培養容器。
　前記端部の形状が半球状、台形、または逆三角形のいずれかであることを特徴とする請求項１記載の培養容器。
　隣り合う二つの凹みの間が平坦であり、前記二つの凹みの距離が５μｍから５０μｍであることを特徴とする請求項１または２記載の培養容器。
　前記培養容器が、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の培養容器。
　前記凹みへ、プラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれかまたはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により官能基を形成させて、水接触角が４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１乃至４のいずれか一項に記載の培養容器。
　前記凹みへ、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の培養容器。
　前記凹みへ、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の培養容器。
　前記凹みへ、プラズマ処理、ガラスコート、コロナ放電、ＵＶオゾン処理のいいずれかまたはこれら組み合わせからなる表面改質処理方法により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理した後、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、及び、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体のうちのいずれか一つのポリマーが固定化されている細胞非接着表面であることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養容器。
　前記親水性のポリマー鎖がポリヒドロキシエチルメタクリレートであることを特徴とする請求項８記載の培養容器。
　前記ポリヒドロキシエチルメタクリレートの平均分子量が１０万以上であることを特徴とする請求項９記載の培養容器。
　前記請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の培養容器を用い、
　総細胞数が、前記培養容器が有する前記凹みの数Ｎ以上であり、前記凹みが形成する空間の体積Ｖ１を播種する細胞の体積Ｖ２で割った値に前記凹みの数Ｎを掛けた数以下である細胞を培地に分散させ、
　前記培地を前記培養容器に添加する培養方法。
　前記凹みが形成する空間１個につき１個のスフェロイドを形成させることを特徴とする請求項１１記載の培養方法。
　前記空間にスフェロイドを形成させてスフェロイドを成長させることを特徴とする請求項１２記載の培養方法。
　前記空間にスフェロイドを形成させて分化誘導することを特徴とする請求項１２または１３に記載の培養方法。
　前記培養容器内に形成されたスフェロイドの総数の６０％以上が、平均スフェロイド直径のプラスマイナス５％の範囲内の直径であることを特徴とする請求項１１乃至１４のいずれか一項に記載の培養方法。
　前記培地を攪拌することで前記凹み内の細胞を回収することを特徴とする請求項１１乃至１５のいずれか一項に記載の培養方法。
　前記培地の攪拌が、前記培養容器を振とうして前記培地を攪拌すること、前記培地を吸引及び排出して前記培地を攪拌すること、前記培養容器に攪拌羽を設置し培地を攪拌すること、前記培養容器に攪拌子をいれ培地を攪拌すること、またはこれら組みあわせからなる方法のいずれかであることを特徴とする請求項１６記載の培養方法。
　前記培地を少なくとも１回以上交換し、交換する培地の割合が２０％以上であることを特徴とする請求項１１乃至１７のいずれか一項に記載の培養方法。
　前記請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の培養容器を用い、
ａ）培養容器に存在する凹みの数ｎと同数以上、前記凹みの体積Ｖを播種する細胞の体積ｖで割った値に前記凹みの数ｎを掛けた数以下の細胞数を培地に分散させ、前記培地を培養容器に添加する工程、
ｂ）１２時間以上前記培養容器内で前記細胞を培養してスフェロイドを形成させる工程、
ｃ）前記培地を２０％以上吸引した後、同量の新鮮な培地を注入する工程、
ｄ）前記ａ）からｃ）の工程を複数回行い、スフェロイドを成長させる工程、
ｅ）前記スフェロイドを所望の大きさに成長させた後、前記培地を攪拌して各凹み内の細胞を前記培地の中に浮遊させる工程、及び
ｆ）前記培地ごと前記細胞を吸引機にて吸い取り前記細胞を回収する工程、
を実施することにより細胞を播種、培養、培地交換、回収する培養方法。