CN103608451A - 培养方法、成熟脂肪细胞群和药物筛选方法 - Google Patents
培养方法、成熟脂肪细胞群和药物筛选方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103608451A CN103608451A CN201280013520.5A CN201280013520A CN103608451A CN 103608451 A CN103608451 A CN 103608451A CN 201280013520 A CN201280013520 A CN 201280013520A CN 103608451 A CN103608451 A CN 103608451A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- wall
- cultural method
- adipocyte
- culture vessel
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
- C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/12—Well or multiwell plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/20—Material Coatings
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/22—Transparent or translucent parts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/33—Insulin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
- C12N2503/02—Drug screening
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
脂肪细胞的培养方法中,使接种的脂肪细胞粘附于培养底面(14)和配置于培养底面(14)的垂直方向的壁(12)的同时进行培养,在不使脂肪细胞浮游于培养液中的情形下,得到在细胞内生成球状且肥大化的脂肪滴的成熟脂肪细胞。该方法中,使用相对于培养底面(14)垂直地形成有壁(12)的培养容器(10)。在细胞或细胞的聚集块粘附于壁(12)和培养底面(14)这两处以上的位置的状态下,培养在细胞内具有球状且肥大的脂肪滴的球状的成熟脂肪细胞。藉此,得到与机体内近似形状的脂肪细胞。
Description
技术领域
本发明涉及脂肪细胞的培养,特别涉及以容易在试验等中利用的方式培养在细胞内具有球状脂肪滴的脂肪细胞的培养方法、成熟脂肪细胞群和药物筛选方法。
背景技术
近年来,逐渐明确脂肪组织不仅储藏・释放营养成分,而且是释放瘦蛋白等各种生理活性物质的重要器官。也逐渐被认识作为糖尿病或各种成人病的重要原因器官。因此,脂肪细胞作为供于上述疾病治疗的药物的标靶而受到研究。在这种药物的开发或筛选试验中,必须利用培养的脂肪细胞。
在机体内,脂肪组织内所含的成纤维细胞样的前体细胞或前脂肪细胞首先在细胞内形成微小的脂肪滴。接着,逐渐蓄积并肥大化的脂肪滴蓄积,形成球状的成熟的脂肪细胞(成熟脂肪细胞)。由前脂肪细胞分化为成熟脂肪细胞的过程在脂肪细胞组织的形成中是重要的,因而考察本过程中药剂的影响是有意义的。
例如,专利文献1中,公开了用于以单层细胞系、以更接近机体内的状态来培养并检验内脏脂肪细胞的培养基。但是,使用单层细胞系的单层培养法中,直至脂肪细胞成熟为止完全地进行分化诱导是困难的。具体地,在初期阶段使脂肪细胞粘附于烧瓶底面进行培养。由于脂肪细胞分化而使油滴蓄积并肥大化时,脂肪细胞的形态发生改变,成为圆形而浮起。因此,成熟脂肪细胞容易从烧瓶粘附面剥离,结果只观察到油滴在脂肪细胞内以多胞状蓄积的分化中间阶段的细胞。因此,长期的分化培养或直至最终分化为止的观察、或者只通过成熟脂肪细胞释放的生理活性物质等的实验是困难的。
作为解决上述问题的方法,专利文献2中公开了单胞性脂肪细胞的培养方法。脂肪细胞由于细胞质内所含的中性脂肪而在培养液中浮游。专利文献2的单胞性脂肪细胞的培养方法中,公开了利用下述方法的技术:该方法是相反地利用该浮游性,使脂肪细胞粘附于100%充满培养基的烧瓶的内侧上面(天花板(ceiling)面)来进行培养的方法(天花板培养)。使用该方法对单胞性脂肪细胞进行数天的天花板培养时,大部分的细胞的细胞质的一部分延伸或扩张,牢牢地粘附于烧瓶天花板面,形态改变为在大型脂肪滴的周边具有各种大小脂肪滴的成熟脂肪细胞。
此外,根据非专利文献1,2,对作为2个以上细胞的集合体的聚集块的大小进行了研究。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:国际公开第2007/125859号小册子
专利文献2:日本特开2000-83656号公报
非专利文献
非专利文献1:Rachel
Glicklis等著, "Modeling Mass Transfer in
Hepatocyte Spheroids via Cell Viability, Spheroid Size, and Hepatocellualr
Functions", Publised online in Wiley InterScience
(www.interscience.wiley.com), 23 April, 2004
非专利文献2 : Franziska Hirschhaeuser等著、"Multicelluar tumor spheroids: An underestimated
tool is catching up again", Jornal of Biotechnology 148, 2010, pp. 3-15。
发明内容
发明要解决的技术问题
然而,在筛选试验中,是在相同条件下将要评价的药物的量、或浓度等作为变量,对其效果进行测定。因此,所使用的培养容器的材质、形状等也需要相同。作为培养容器,有塑料制培养皿、玻璃制培养皿、孔板(微板)等,孔板中有例如6孔、12孔、48孔、96孔、384孔的经规格化的孔板。进而,还开发了符合这种培养容器的规格的自动培养装置、自动分析装置、或能够同时测定多个样本的评价装置。因此,产业上需求使用与上述培养容器的规格同形状、同操作、并且从观察性的观点出发透明性高的培养容器的细胞培养方法。另一方面,专利文献2中由于是用天花板面来培养脂肪细胞,因而必需是与各种标准培养容器形态显著不同的培养容器。结果,存在不能将天花板培养中使用的培养容器在使用经规格化的孔板的分析装置和培养装置中利用的问题。或者,由于不能将天花板培养中所用的培养容器在使用经规格化的孔板的测定装置中利用,因而存在无法进行使用该测定装置的筛选试验的问题。
因此,本发明的目的在于提供:使用具有培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的培养容器,以容易在试验等中利用的方式培养脂肪细胞的细胞培养方法。即,其目的在于提供:使用可以与能够适用于一直来使用的培养、检查・评价装置的孔板(经规格化的孔板)等互换的培养容器来培养脂肪细胞的细胞培养方法。
用于解决技术问题的方法
本发明的脂肪细胞的培养方法的一个方式是脂肪细胞的培养方法,其特征在于,使接种的脂肪细胞粘附于培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的同时进行培养,在不使脂肪细胞浮游于培养液中的情形下,得到在细胞内生成球状且肥大化的脂肪滴的球状成熟脂肪细胞。培养方法中,使用相对于培养底面垂直地形成有壁的培养容器。在细胞1个、或者作为2个以上细胞的集合体的聚集块的一部分粘附在壁和培养底面的2处以上的位置的状态下,得到在细胞内具有球状脂肪滴、同时立体形状的脂肪滴肥大化的球状成熟脂肪细胞。
本发明的脂肪细胞的培养方法的一个方式中,优选前述脂肪滴的体积为0.5×103μm3~3×106μm3的范围,或前述脂肪滴的最小直径(短径)除以最大直径(长径)而得的值为0.4~1.0的范围。
对于本发明的作为2个以上细胞的集合体的聚集块的大小,若基于非专利文献1、2,为了将营养分和氧供给到直至凝集体的中心部、并使之存活,优选为距离与培养基粘附的最外层的距离为250μm以内的大小的凝集体。为了将孔内的细胞状态保持均一,凝集体更优选为均一的具有500μm以下的直径的球或半球状的凝集体。
优选通过对具有与前述培养底面垂直的壁的培养容器的表面进行等离子体处理、或包被无机物,来进行用于提高细胞粘附性蛋白(胶原等)的粘附性的亲水化处理,进而,优选在具有培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的培养容器的表面包被有以胶原或纤连蛋白为代表的细胞外基质,或者包被有合成物质。
发明效果
根据本发明,可以使用具有培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的培养容器,以容易用于试验等中的方式,特别是以能够与可适用于以往使用的培养、检查・评价装置的孔板等互换的形态,培养脂肪细胞。
附图说明
[图1] 示出本发明的实施方式的培养容器的构成的平面图。
[图2] 图1的培养容器的II-II截面图。
[图3A] 示出使用图1的培养容器培养细胞的状态的模式图。
[图3B] 示出在经分隔化的区域培养一个脂肪细胞的状况的图。
[图3C] 示出图3B的脂肪细胞肥大化的状态的图。
[图4] 示出本发明的实施方式的培养容器的其它构成的平面图。
[图5] 图4的培养容器的V-V截面图。
[图6A] 示出本发明的实施方式的培养容器的又一其它构成例的平面图。
[图6B] 从上方观察用图6A的培养容器培养脂肪细胞的状态的模式图。
[图6C] 图6B的VI-VI截面图。
[图7A] 示出本发明的实施方式的培养容器的又一其它构成例的平面图。
[图7B] 图7A的VII-VII截面图。
[图8] 示出本发明的实施方式的培养容器的又一其它构成的平面图。
[图9] 图8的培养容器的IX-IX截面图。
[图10] 是比较例1的分化20天后的细胞的40倍物镜的相差显微镜照片。
[图11] 是实施例1的分化20天后的细胞的40倍物镜的相差显微镜照片。
[图12] 是实施例2的分化20天后的细胞的40倍物镜的相差显微镜照片。
[图13A] 拍摄实施例2的进行了染色的细胞的切片图像(スライス画像)而得的照片(底部:Z轴方向 0μm)。
[图13B] 拍摄实施例2的进行了染色的细胞的切片图像而得的照片(Z轴方向 10μm)。
[图13C] 拍摄实施例2的进行了染色的细胞的切片图像而得的照片(Z轴方向 20μm)。
[图13D] 拍摄实施例2的进行了染色的细胞的切片图像而得的照片(Z轴方向 30μm)。
[图13E] 拍摄实施例2的进行了染色的细胞的切片图像而得的照片(Z轴方向 40μm)。
[图13F] 拍摄实施例2的进行了染色的细胞的切片图像而得的照片(Z轴方向 50μm)。
[图13G] 拍摄实施例2的进行了染色的细胞的切片图像而得的照片(上部:Z轴方向 60μm)。
具体实施方式
以下,参照附图对本发明的实施方式进行说明。但本发明并不限于以下实施方式。为了明确说明,以下的记载和附图适宜地进行了省略和简化。各附图中,对于具有相同构成或功能的构成要素以及相当部分,赋予相同的符号并省略其说明。
实施形态1
实施形态1中,使用具有培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的培养容器,以容易在试验等中利用的方式培养脂肪细胞的细胞培养方法如下所述实现。(1)在不使之浮游于培养液中的情形下,以与机体内存在的成熟脂肪细胞类似的形态培养脂肪细胞。即,以在细胞内具有球状且肥大化的脂肪滴的状态进行培养。(2)使用在试验等中容易利用的培养容器。
具体地,在机体内脂肪组织呈现出:球状脂肪滴在一个脂肪细胞的细胞膜内蓄积、多个球状脂肪细胞聚集的状态。本实施方式中,实现获得与这种机体内的脂肪细胞形状更接近的成熟脂肪细胞的细胞培养方法。例如,实验中使用的脂肪细胞由于粘附于板或烧瓶等的底部而生长,因而不是球体而是近似于二维的状态。此外,在成熟化阶段,即在细胞膜内存在的脂肪滴的体积比例变高时,由于脂肪滴的浮力,细胞从培养容器发生剥离,因而无法进行培养,难以得到成熟脂肪细胞。这样,由于脂肪细胞的形态差异大,因而存在原本在机体内脂肪细胞分泌的物质等与机体外不同的问题。因此,本实施形态中,通过在使脂肪细胞粘附于培养底面和垂直于培养底面的壁这两者的状态下进行培养,由此实现:在使脂肪细胞立体地且粘附于培养容器的状态下,获得与以往的培养方法相比更接近于球体的成熟脂肪细胞或细胞块。
进而实现:在能够适用于试验等例如筛选试验或药物开发中所利用的培养容器或观察用器具(显微镜等)的状态下培养脂肪细胞。例如,使得可通过使用现有的能用于显微镜观察的透明材质的塑料,在不将细胞转移至其它容器的情形下,使用供培养的容器进行观察。
在下述说明中,首先对实施方式1的培养容器进行说明,然后对细胞培养方法进行说明。
1.培养容器
图1是示出本实施方式的培养容器的构成的平面图,图2是图1的II-II截面图。如图1所示,培养容器10具备与培养底面14垂直的壁(以下,有时也适宜地将垂直的壁称为“壁”)12。使脂肪细胞粘附于培养底面14和壁12来进行培养。因此,培养底面14和壁12的交点附近成为细胞培养位置。培养容器10优选具备多个能够粘附脂肪细胞的细胞培养位置。这里,培养底面14(培养面)意指培养细胞的空间中作为底部的部分(培养空间中的底部)。
图1中,在培养容器10中,培养底面14具有被垂直地形成的壁12分隔化的区域(培养区域)11。相对的壁12的距离(对向的壁间的距离)a、壁12的宽度b、高度c示于图1。由该分隔化的区域11和壁12所形成的空间成为细胞培养位置(进行培养的空间)。
垂直于培养底面14而形成的壁12的形状没有特别限制。例如,可以是连续的壁,也可以是非连续的壁。此外,该壁的形状可以为平面,也可以为弯曲。进而,还可以是多边形、圆柱状,该形状只要是与培养底面14垂直则没有特别限定。为了再现脂肪细胞的功能,优选培养容器10具有被壁12分隔化的区域11,以使1个~数十个蓄积有脂肪滴的细胞能够在一定的位置存在。
相对的壁12的距离a优选为70μm~300μm。壁12的宽度b没有特别限定,为了使细胞不粘附于壁12的上方,优选为20μm以下,更优选为15μm以下。
壁12的高度c只要使得被壁12分隔化的区域11中培养的细胞不会越过壁12而移动至相邻的区域(被壁12分隔化的区域11)即可,优选为50μm~500μm。例如,在形成当量直径70μm的具有脂肪滴的脂肪细胞时,壁12的高度c优选为50μm~150μm。此外,例如在形成当量直径150μm的脂肪细胞时,优选为50μm~300μm。
与培养底面14垂直的壁12只要实质上相对于培养底面14垂直即可。例如,培养底面14与壁12所成的角(所成角为脂肪细胞粘附的经分隔化的区域11与相对侧的角度)可以为88°至90°、或85°至90°。
培养底面14与壁12所成的角度必须是使细胞不越过的角度,因而从侧面的上部起50%以上的部分优选为80°~90°、特别优选为85°~90°。
图3A是示出使用图1的培养容器培养细胞的状态的模式图。图3A是从侧面透视培养容器进行观察的图。用培养基8将培养容器10充满。示出了在被壁12分隔化的区域11中,脂肪细胞9形成细胞块而被培养的状况。图3A至3C中,与图1,2相同地,相对的壁的距离示为a,壁12的宽度示为b,高度示为c。此时,形成细胞块的脂肪细胞之中,任一脂肪细胞可粘附于培养底面14,同一脂肪细胞或其它任一脂肪细胞可粘附于壁12。换而言之,作为细胞块整体,可以与培养底面14和壁粘附。
图3B示出一个脂肪细胞9在经分隔化的区域11中、在与一侧的壁12和培养底面14这两个位置粘附的状态下发生肥大化的状态。图3C示出脂肪细胞在与构成培养区域的多个壁和培养底面14这三处以上的位置粘附的状态下发生肥大化的状态。如此,在经分隔化的培养区域中培养1个脂肪细胞时,1个脂肪细胞可以与培养底面14和壁12的2处以上位置粘附。
应予说明,如图4和图5所示,在被壁12分隔化的区域11中,相对于培养底面14垂直地形成的壁12可以是非连续的。非连续的壁12和壁12之间的宽度d可以是使培养细胞无法从最初被接种的经分隔化的区域11移动至相邻的区域(经分隔化的区域11)的程度。例如,培养细胞的当量直径若为20μm,则优选为5~15μm。这里,图4是示出本实施方式的其它培养容器的构成的平面图,图5是图4的V-V截面图。
培养面上所形成的壁12可以是图6A那样的形状。图6B是从上方观察脂肪细胞9粘附于壁12的状态的图,图6C是示出图6B的VI-VI截面的图。图6B,图6C中,示出一个脂肪细胞粘附于左侧的壁12,由多个脂肪细胞9形成的细胞块粘附于右侧的壁12的例子。
进而,对于形成在培养面上的壁12,如图7A,图7B所示,也可以是连续的壁12从培养面的一端形成至另一端的情形。图7B是示出图7A的VII-VII截面的图。
壁12并不限于附图所示的形状。壁12优选为脂肪细胞容易粘附于壁12的侧壁的形状。
此外,如图8和图9所示,本实施方式的培养容器可以具有含培养面的块区(スポット),该培养面具有规定数目的多个与培养底面垂直的壁12。这里,图8是示出本实施方式的又一其它细胞培养部的构成的平面图,图9是图8的IX-IX截面图。图8和图9中,示出使用了图1和图2所示的具有与培养底面垂直的壁的容器的结构的例子。图8中,示出多个侧壁24与被垂直于培养底面的壁12分隔化的区域11规则地排列的块区23。侧壁24的高度e只要是能够使培养液或反应液等上清液不干燥而保持的容量即可,可以适宜设定。通过具有侧壁24,还可以在各块区23使用不同的培养基。此外,图8和图9中,示出了具有侧壁24的构成例,但也可以是不具有侧壁24的构成。
作为制作与培养底面垂直的壁的方法,没有特别限定,可举出例如:使用模具的转印成形、三维光造形、精密机械切削、湿式蚀刻、干式蚀刻、激光加工、放电加工等方法。优选考虑培养容器的用途、所要求的加工精度、成本等而对这些制造方法进行适宜选择。
作为使用模具进行转印成形的方法的具体例,可举出以金属结构体为模具通过树脂成形形成具有与培养面垂直的壁的凹凸结构的方法。该方法能够以高转印率在树脂中再现金属结构体的形状,此外由于使用通用的树脂材料可以降低材料成本,因而优选。这种使用金属结构体的模具的方法的成本低,在能够满足高尺寸精度的方面优异。
作为上述金属结构体的制造方法,可举出例如:在由光刻法制作的抗蚀图案或由三维光造形制作的树脂图案上的镀覆处理、精密机械切削、湿式蚀刻、干式蚀刻、激光加工、放电加工等。可以考虑用途、所要求的加工精度、成本等而适宜选择。
作为使用上述中得到的金属结构体作为模具在树脂上成形凹凸结构的方法,可举出例如:注射成形、加压成形、单体浇铸成形、溶剂浇铸成形、热压花成形、利用挤出成形的辊转印等方法。从生产率和模具转印性观点出发,优选采用注射成形。
作为构成培养容器的材料,只要具有自支持性则没有特别限制,可举出例如:合成树脂、硅、玻璃等。从成本方面或显微镜观察的细胞可见性的观点出发,优选以透明的合成树脂作为材料。作为透明的合成树脂,可举出例如:聚甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸甲酯-苯乙烯共聚物等丙烯酸系树脂、聚苯乙烯、丙烯酸・苯乙烯系共聚树脂等苯乙烯系树脂、环烯烃等烯烃系树脂、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乳酸、聚乙醇酸等酯系树脂、聚二甲基硅氧烷等有机硅系树脂、聚碳酸酯树脂、聚酯系树脂、聚乙烯醇系树脂、乙烯・乙烯醇系共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯系树脂、硅树脂等。这种树脂中,在不损害透明性的范围内还可以含有着色剂、扩散剂、增粘剂等各种添加剂。
对于培养容器,为了提高容器表面的亲水性、机体适合性、细胞亲和性等,可以对培养表面(培养底面14、壁12的侧壁、壁12的上面)进行表面处理,配置具有官能团的改质层和/或包被层。作为设置上述改质层的方法,只要不是丧失自支持性的方法或引起100μm以上的极端表面皲裂的方法则没有特别限制,可举出例如:药品处理、溶剂处理、利用表面接枝聚合的接枝聚合物的导入等化学性处理,电晕放电、臭氧处理、等离子体处理等物理性处理等方法。此外,作为设置包被层的方法,没有特别限制,可举出例如:溅射、蒸镀等干式包被,无机材料包被、聚合包被等湿式包被等方法。为了在不混入气泡的情形下向被培养底面14与壁12的侧壁的边界部分或壁12所围住的空间、相邻的壁12的间隙中注入培养液,理想的是赋予亲水性,作为形成均一的亲水性膜的方法,优选无机蒸镀。
此外,考虑细胞亲和性时,更优选包被例如胶原、纤连蛋白、层连蛋白等细胞亲和性蛋白。为了均匀地包被胶原水溶液等,优选在形成上述亲水性膜后进行包被。由于理想的是模拟机体内环境而在细胞外基质表面进行培养,因而特别优选在如上所述配置均匀的亲水性无机膜后,配置由适于培养细胞的细胞外基质构成的有机膜。
上述各表面处理可以各自单独进行,也可以根据需要适宜组合来进行。
除此之外,还优选具有与培养底面14垂直的壁的培养容器的底部是透明的。这是因为,在培养脂肪细胞后对培养的脂肪细胞进行显微镜观察时,可以直接使用培养容器。藉此,变得不必将培养的脂肪细胞转移至能够进行显微镜观察的容器等中。因此,实现试验等的步骤的简化、时间的缩短。除此之外,可以防止在将培养的脂肪细胞转移至其他容器中时产生的该脂肪细胞的损伤。
2.细胞培养方法
本实施方式中,作为具有与培养底面14垂直的壁12的培养容器10,使用上述图1的形状。在使脂肪细胞粘附于培养底面14与壁12的状态下进行培养。通过该培养方法,得到在细胞内具有球状脂肪滴的立体形状的成熟脂肪细胞。这里,立体是指球状脂肪滴蓄积的球状的形态、即、更接近机体内的脂肪细胞的形状。
本说明书中,在说明细胞培养方法时使用下述术语。
术语“脂肪细胞”是在细胞内具有脂肪滴的细胞。脂肪细胞是来源于动物的成纤维细胞的细胞,且以在细胞质内蓄积脂肪的方式分化而形成脂肪组织。脂肪细胞分类为单胞性脂肪细胞(白色脂肪细胞)和多胞性脂肪细胞(褐色脂肪细胞)。单胞性脂肪细胞是存在有大型脂肪滴、且核或细胞器被压迫至边缘的储藏型的细胞。多胞性脂肪细胞是大量存在小型或中型的脂肪滴、且细胞器发达的代谢型的细胞。
脂肪细胞包括由骨髓基质细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞分化得到的细胞。这里所说的骨髓基质细胞是指存在于骨髄中的形成网孔结构的组织。间充质干细胞是指存在于骨细胞、脂肪细胞等的间充质组织的干细胞,是指能够分化为间充质(脂肪细胞、骨等)细胞的细胞。间充质干细胞可以从骨髄、脂肪组织中分离。是由属于作为动物生长初期阶段的胚泡期的胚的一部分的内部细胞块制作的干细胞细胞株。在机体外,理论上可以在保留分化为所有组织的分化多能性的同时,基本无限地增殖。诱导多能性干细胞是万能细胞的一种,是可与胚胎干细胞相同地增殖并分化为各种细胞的细胞。iPS细胞可由皮肤细胞等制作。
术语“脂肪滴”是存在于细胞质内的脂肪的小滴,可见于向脂肪细胞分化的过程等中。随着细胞成熟,该小滴结合、并逐渐形成大的球状的脂肪滴。
术语“成熟脂肪细胞”是指蓄积有脂肪滴的脂肪细胞。成熟脂肪细胞中,由于只要是形成有脂肪滴的细胞则不管脂肪滴的大小,因而包括含有肥大化脂肪滴的脂肪细胞、和含有小于肥大化脂肪滴的脂肪滴的脂肪细胞。例如,本说明书中,微小脂肪滴是说小于0.5×103μm3的脂肪滴,是指由前脂肪细胞最终形成分化的肥大化成熟细胞之前的脂肪细胞。本说明书中,作为要培养的脂肪细胞,包括蓄积有微小脂肪滴的成熟脂肪细胞。培养这种蓄积有微小脂肪滴的成熟脂肪细胞,得到蓄积有肥大化脂肪滴的成熟脂肪细胞。
术语“分化”是指较其所得细胞型进一步分化的细胞型的产生。因此,本术语包含部分分化和终末分化的细胞型。
术语“分化诱导”是指在生物的产生分化中,特定的组织或化学物质自然或人为地引起其它组织、细胞的分化。引起分化诱导的物质称为“分化诱导物质”。
术语“粘附培养”是指使细胞粘附于培养容器进行培养。
术语“传代培养”是指在细胞培养中,将细胞的一部分转移至新培养容器,再次进行培养。
细胞培养方法中,使用具有与培养底面14垂直的壁12的培养面,例如,如上所述的具有被壁12分隔化的区域11那样的三维形状的培养面。使脂肪细胞成为粘附于培养底面14和壁12的侧面的状态,进行培养。因此,即使细胞的分化进行、脂肪滴变大,也抑制细胞从培养面剥离而浮起。除此之外,还使细胞的形状成为立体形状。这样,通过使细胞粘附于经分隔化的区域11进行培养,得到在细胞内具有球状脂肪滴的立体形状的成熟脂肪细胞。
该细胞培养方法中,例如,可以不用像专利文献2所公开那样粘附于培养容器(烧瓶)的天花板面进行培养,例如,可以在孔板上培养细胞。
本实施方式的细胞培养方法中,脂肪细胞(成熟脂肪细胞)、细胞培养方法的步骤等可以具有下述特征。
对于由培养得到的肥大化的成熟脂肪细胞,优选直径为20μm~180μm的球状脂肪滴、即、脂肪滴的体积为4×103μm3~3×106μm3的范围,并且脂肪滴的最小直径(短径)除以最大直径(长径)所得的值(演算值)为0.4~1.0的范围。
细胞培养方法有时包括:用具有与培养底面14垂直的壁12的培养容器使脂肪细胞增殖后进行分化诱导的构成。进行分化诱导的构成是指由用于增殖的培养基交换为含有分化诱导因子的培养基来进行培养的过程。具体地,包括用含有胰岛素的培养基进行培养的步骤(物质)。
此外,在要培养的脂肪细胞为2层以上时,具体地,在脂肪细胞完全覆盖培养底面14、增殖的空间消失、脂肪细胞为层状时,从90%以上的汇合状态开始分化诱导。
细胞的接种密度只要是细胞能够存活或增殖的数目即可,优选以0.1×104个/cm2~10×104个/cm2的密度接种,并增殖直至达到90%汇合,使用分化诱导培养基进行分化诱导后,进行分化诱导步骤。此外,对于分化的并且不增殖的细胞,优选以10×104个/cm2~1×106个/cm2进行接种。
通过上述细胞培养方法,得到在细胞内具有球状脂肪滴的立体形状的成熟细胞。这使得可以近似于与机体内相同地一个脂肪细胞以球体存在、并且该球体的细胞聚集的状态。藉此,可以提供与机体内的形状近似的脂肪细胞。进而,通过使用如上所述具有与培养底面14垂直的壁12的培养容器10,可以提供:能够使用与细胞通常所利用的孔板、培养皿等相同形状的容器,并且不用进行天花板培养或在凝胶内进行培养的凝胶培养等复杂操作,来培养成熟脂肪细胞的方法。此外,通过该培养方法,可以提供适于药剂筛选等的成熟脂肪细胞群。
进而,使得可提供能够培养大量分泌脂联素的成熟脂肪细胞的方法,该脂联素是脂肪细胞所特异性地产生的细胞因子之一。
实施例
[实施例1-3、比较例1]
1.培养容器
作为形成有与培养底面垂直的壁的培养面,将具有上述图1,2所示的培养面的1cm×1cm的膜粘贴于孔板形状的培养容器的底面,培养株化前脂肪细胞(3T3-L1)。
实施例以该膜的部分作为培养面,比较例以没有膜的平坦部分作为培养面。
1-1.实施例1和2
作为实施例1和2中使用的具有与培养底面14垂直的壁12的培养面,准备下述具有经分隔化的区域11的2种膜。实施例1中,图1的距离a为200μm、图2的高度c为50μm,实施例2中,图1的距离a为200μm、图2的高度c为100μm。
1-2.比较例1
比较例1以1cm×1cm的膜以外的平坦部分作为培养面。
2.细胞培养和观察
2-1.实施例1和2
将株化前脂肪细胞(3T3-L1)用25cm2 烧瓶进行传代培养,达到70%汇合时,将细胞接种至各孔。
这里,汇合是指细胞所占的面积与培养面整体的比例。例如,使用具有25cm2的面积的烧瓶时,若细胞占该面积的50%时,则称为50%汇合。70%汇合是指培养面整体的70%被细胞覆盖的状态。这里,单纯地称“达到汇合”而未记载数值时,是指达到90%以上的汇合。
以0.145~1.16×104个/cm2的密度接种细胞。
对于培养液,在达到汇合为止,使用D-MEM(Gibco-Invitrogen, #11965-084 或 #12100-046)+10% 小牛血清(Donor
Calf Serum) (Tissue Culture Biologicals, #301D)+抗生素-抗真菌剂
(Gibco-Invitrogen, #15240-062),以2天1次的频率更换培养液。
在细胞达到汇合后,改变为分化诱导培养基,开始分化诱导。将开始分化诱导的那一天作为分化诱导0天。对于分化诱导培养基,在分化诱导第0~2天,使用D-MEM+10% 胎牛血清(BioWest, #S1820)+抗生素-抗真菌剂+0.25 μM 地塞米松 (Nacalai, #11107-51)+0.5
mM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(Nacalai,
#19624-31)+4 μg/ml 优泌林(Humulin) R (Eli Lilly Japan, 100 U/ml, #HI0210)。在分化诱导第2天~第4天,使用D-MEM +10% 胎牛血清+抗生素-抗真菌剂 +4 μg/ml 优泌林 R。从分化诱导第4天以后起,使用D-MEM +10% 胎牛血清+抗生素-抗真菌剂。
将细胞接种于各孔中后,分化20天培养,使用倒立显微镜进行观察。实施例2中,除了倒立显微镜观察之外,在分化诱导第31天,在不将细胞固定而存活的状态下用2.5μM Bodipy493/503对脂肪滴进行荧光染色,用1μg/ml Hoechst33342对细胞核进行荧光染色。使用共聚焦激光显微镜,拍摄该实施了荧光染色的细胞的Z轴(高度)方向切片图像序列(细胞染色的切片图像序列)。
细胞染色中使用的荧光染色具备以下特征。荧光色素与光接触时电子被激发。但是,电子会返回至稳定的场所。在返回时会释放能量而返回原状,但由于损失能量,因而释放的能量作为比由光获得的能量小的能量释放。Bodipy493/503是选择性地溶入中性脂肪的荧光色素,吸收蓝色的光并释放绿色的光。Hoechst33342是DNA选择性地结合的荧光色素,吸收紫色(UV)的光并释放蓝色的光。拍摄的图像的黑白画面中,绿色部分变为白色。
2-1.比较例1
实施例1、2的平板部分。因此,除了培养底面不同以外,为完全相同的条件。
接种细胞后进行分化诱导第20天,与实施例1,2相同地使用倒立显微镜进行观察。
3.结果
3-1.分化20天后的细胞
参照实施例1-3、或比较例1的各自条件下培养的分化20天后的细胞的照片,说明培养結果。
・比较例1
图10示出对比较例1的分化20天后的细胞进行拍照得到的照片。图10中,用圆围住的部分是一个细胞。图10中,用圆围住的细胞的脂肪滴为50μm左右的大小。由于含有多个大脂肪滴,因而细胞未形成球状。
・实施例1
图11示出对实施例1的分化20天后的细胞进行拍照得到的照片。图11中,用圆围住的部分是一个细胞。对于四边形围住的部分,细胞聚集形成群体。在分化20天后,观察到细胞在经分隔化的区域的中央附近聚集。
分化经过20天为止的观察中,细胞不仅存在于微型容器的中央附近,而且还存在于壁(侧壁)附近,占满底部。但是,当细胞不断成熟时,细胞不断聚集于微型容器的中央附近。图11的40倍的照片中,由于脂肪滴重叠可见,因而观察到一个一个的细胞集中在中央附近形成块。这推测是自组织性地形成了细胞凝集体。
除此之外,一个细胞的大小有较比较例1小的倾向。这推测是由于实施例1中不仅细胞的体积不小,而且细胞形态不扁平而形成球状的缘故。
・实施例2
图12示出对实施例2的分化20天后的细胞进行拍照得到的照片。图12中,对于用四边形围住的部分,一个细胞聚集于微型容器的中央附近,形成脂肪细胞的块。
3-2.细胞染色的切片图像
图13A-13G中示出实施例2的进行细胞染色拍照得到的切片图像序列的照片。照片中的右下示出的标尺表示30μm的长度。固定X轴和Y轴,使Z轴方向移动,从上方对染色的细胞拍照。图13A为底部的细胞的照片,依次向上方的细胞移动,图13G为上部的细胞。图13A-13G中,白色可见的部分是脂肪滴。图13A-13G中,在左上、左下和右上可见的虚线状的斜线是微型容器的壁。
图13C(Z=20μm)的箭头所示的细胞中,细胞质被一个脂肪滴所占据,X-Y平面中的直径判断为20μm。与之相对,在Z轴方向的观察中,图13B(Z=10μm)至图13D(Z=30μm)中清楚可见,但图13A(Z=0μm)和图13E(Z=40μm)中模糊。
图13D(Z=30μm)的箭头所示的细胞也是细胞质被一个脂肪滴所占据,X-Y平面中的直径判断为30μm。与之相对,在Z轴方向的观察中,图13C(Z=20μm)至图13E(Z=40μm)中清楚可见,但图13A(Z=0μm)和图13F(Z=50μm)中模糊。
任意细胞在Z轴方向的直径均推测为20~40μm。直径如上所述为20~30μm,因而实施例2的形成了细胞凝集体的细胞的脂肪滴、细胞的形态为球状。
本申请基于2011年3月16日在日本申请的日本申请特愿2011-057770主张优先权,其公开内容在这里全部并入本文。
符号说明
7 培养皿或孔板
8 培养基
9 细胞
10 培养容器
11 经分隔化的区域
12 壁
13 开口部
14 培养底面
23 块区
24 块区的侧壁
Claims (23)
1.脂肪细胞的培养方法,其特征在于,使用具有培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的培养容器,使要培养的脂肪细胞与所述培养底面和所述壁粘附,在不浮游于培养液中的情形下,得到球状且肥大化的脂肪滴蓄积的球状成熟脂肪细胞。
2.权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述要培养的脂肪细胞具有小于0.5×103μm3的脂肪滴。
3.权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述要培养的脂肪细胞是由骨髓基质细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导多能性干细胞分化得到的脂肪细胞。
4.权利要求1所述的培养方法,其特征在于,所述要培养的脂肪细胞是前脂肪细胞。
5.权利要求4所述的培养方法,其包括使所述前脂肪细胞增殖至形成90%汇合状态后,进行分化诱导的步骤。
6.权利要求5所述的培养方法,其中,所述分化诱导步骤包括:(1)用含有地塞米松、胰岛素的培养基进行培养后,(2)用不含地塞米松、但含胰岛素的培养基进行培养,(3)用不含胰岛素、地塞米松的培养基进行培养的步骤。
7.权利要求1至6中任一项所述的培养方法,其具有:以0.1×104个/cm2~1×106个/cm2的接种密度对所述培养容器接种细胞的步骤。
8.权利要求1至7中任一项所述的培养方法,其特征在于,所述培养容器中,配置于培养底面的垂直方向的壁的高度为10μm~500μm。
9.权利要求1至8中任一项所述的培养方法,所述培养容器中,配置于培养底面的垂直方向的壁是连续的。
10.权利要求1至8中任一项所述的培养方法,所述培养容器中,配置于培养底面的垂直方向的壁是不连续的。
11.权利要求1至10中任一项所述的培养方法,其特征在于,所述培养容器中,形成有被配置于培养底面的所述垂直方向的壁分隔化的区域。
12.权利要求11所述的培养方法,其特征在于,所述分隔化的区域是规则地排列的。
13.权利要求1至12中任一项所述的培养方法,其中,所述培养容器中,配置于培养底面的垂直方向的任意1个壁与该壁相对的其它壁的最近距离为10μm以上。
14.权利要求11或12所述的培养方法,其中,所述分隔化的区域的底面积的内接圆的直径是侧壁高度的0.1倍~4倍的范围。
15.权利要求1至14中任一项所述的培养方法,其中,球状的肥大化的脂肪滴的体积为0.5×103μm3~3×106μm3。
16.权利要求1至15中任一项所述的培养方法,其中,脂肪滴的最小直径(短径)除以最大直径(长径)而得的值为0.4~1.0。
17.权利要求1至16中任一项所述的培养方法,其特征在于,所述培养容器的底面是透明的。
18.权利要求1至16中任一项所述的培养方法,其特征在于,所述培养容器中,具有极性官能团的培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁。
19.权利要求17的培养方法,其中,所述培养容器中,在培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的表面包被有无机物。
20.权利要求17至19中任一项所述的培养方法,其中,所述培养容器中,在培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的表面包被有以胶原、纤连蛋白为代表的细胞外基质。
21.权利要求17至19中任一项所述的培养方法,其中,所述培养容器中,在培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的表面包被有合成物质。
22.成熟脂肪细胞群,其包含在具有多个包含培养底面和配置于培养底面的垂直方向的壁的细胞培养位置的培养容器中,在粘附于所述培养底面和垂直地配置于所述培养底面的壁、并在不浮游于培养液中的情形下培养得到的球状且肥大化为0.5×103μm3~3×106μm3的体积的脂肪滴蓄积的多个成熟脂肪细胞。
23.药物筛选方法,其中,使药物作用于权利要求21所述的成熟脂肪细胞群的成熟脂肪细胞,试验该药物对脂肪组织的影响。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011057770 | 2011-03-16 | ||
JP2011-057770 | 2011-03-16 | ||
PCT/JP2012/001872 WO2012124353A1 (ja) | 2011-03-16 | 2012-03-16 | 培養方法、成熟脂肪細胞群及び薬物スクリーニング方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103608451A true CN103608451A (zh) | 2014-02-26 |
Family
ID=46830434
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201280013520.5A Pending CN103608451A (zh) | 2011-03-16 | 2012-03-16 | 培养方法、成熟脂肪细胞群和药物筛选方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20140065659A1 (zh) |
EP (1) | EP2687594A4 (zh) |
JP (1) | JP6021802B2 (zh) |
KR (3) | KR20140009459A (zh) |
CN (1) | CN103608451A (zh) |
WO (1) | WO2012124353A1 (zh) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107922923A (zh) * | 2015-07-23 | 2018-04-17 | 韩国化学研究院 | 脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法 |
CN109294975A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-02-01 | 山东华思生物科技有限公司 | 一种干细胞药物筛选方法 |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP6145257B2 (ja) * | 2012-10-18 | 2017-06-07 | 株式会社クラレ | エストロゲン活性を評価する方法 |
US9238090B1 (en) | 2014-12-24 | 2016-01-19 | Fettech, Llc | Tissue-based compositions |
JP2016131500A (ja) * | 2015-01-15 | 2016-07-25 | 学校法人 中央大学 | 細胞縦断面観察用の顕微鏡観察用部材及び細胞観察方法 |
JP2018085978A (ja) * | 2016-11-30 | 2018-06-07 | 旭硝子株式会社 | 培養容器 |
CN110295110A (zh) * | 2019-06-26 | 2019-10-01 | 吴威 | 一种增加人体脂肪细胞存活数量的设备 |
CN114807004B (zh) * | 2021-01-21 | 2024-02-06 | 中国科学院理化技术研究所 | 一种三维细胞生长支架及其制备方法 |
WO2023089732A1 (ja) * | 2021-11-18 | 2023-05-25 | 日本電信電話株式会社 | 微生物観察用デバイス |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101679933A (zh) * | 2007-06-18 | 2010-03-24 | 可乐丽股份有限公司 | 细胞培养容器和细胞培养方法 |
US20100331216A1 (en) * | 2008-02-06 | 2010-12-30 | National University Corporation Nagoya University | Cell culture method |
Family Cites Families (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP5055611B2 (ja) | 1998-09-09 | 2012-10-24 | 学校法人日本大学 | 前駆脂肪細胞株 |
CN1671836B (zh) * | 2002-06-18 | 2012-02-08 | 卫材R&D管理有限公司 | 用于基因治疗的原代培养脂肪细胞 |
WO2007004469A1 (ja) * | 2005-07-04 | 2007-01-11 | Osaka University | 前脂肪細胞の成熟脂肪細胞への分化培養方法、ならびにその分化過程に影響する物質のスクリーニング |
US20090233326A1 (en) | 2006-04-24 | 2009-09-17 | Inokuchi Jin-Ichi | Method for induction of the differentiation of visceral fat cell |
-
2012
- 2012-03-16 WO PCT/JP2012/001872 patent/WO2012124353A1/ja active Application Filing
- 2012-03-16 KR KR1020137026508A patent/KR20140009459A/ko not_active Application Discontinuation
- 2012-03-16 KR KR1020187037546A patent/KR20190002732A/ko active Search and Examination
- 2012-03-16 JP JP2013504581A patent/JP6021802B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2012-03-16 EP EP12757775.7A patent/EP2687594A4/en not_active Withdrawn
- 2012-03-16 CN CN201280013520.5A patent/CN103608451A/zh active Pending
- 2012-03-16 US US14/005,508 patent/US20140065659A1/en not_active Abandoned
- 2012-03-16 KR KR1020207005061A patent/KR20200021108A/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN101679933A (zh) * | 2007-06-18 | 2010-03-24 | 可乐丽股份有限公司 | 细胞培养容器和细胞培养方法 |
US20100331216A1 (en) * | 2008-02-06 | 2010-12-30 | National University Corporation Nagoya University | Cell culture method |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
ANNA KATHARINA SEITZ ET AL.: "2-D and 3-D adipocyte cell culture-promising tools for basic research and approaches towards clinical therapies", 《UNIVERSITAT REGENSBURG》, 31 December 2010 (2010-12-31) * |
MASAFUMI NAGAYAMA ET AL.: "Temporal and spatial variations of lipid droplets during adipocyte division and differentiation", 《JOURNAL OF LIPID RESEARCH》 * |
卢慧玲等: "促酰化蛋白(ASP)诱导3T3-L1前脂肪细胞分化", 《中国生物化学与分子生物学报》, vol. 20, no. 3, 30 June 2004 (2004-06-30), pages 383 - 386 * |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN107922923A (zh) * | 2015-07-23 | 2018-04-17 | 韩国化学研究院 | 脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法 |
CN107922923B (zh) * | 2015-07-23 | 2021-08-03 | 韩国化学研究院 | 脂肪细胞与巨噬细胞的三维共培养方法 |
CN109294975A (zh) * | 2018-10-23 | 2019-02-01 | 山东华思生物科技有限公司 | 一种干细胞药物筛选方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20140009459A (ko) | 2014-01-22 |
KR20190002732A (ko) | 2019-01-08 |
US20140065659A1 (en) | 2014-03-06 |
KR20200021108A (ko) | 2020-02-27 |
WO2012124353A1 (ja) | 2012-09-20 |
EP2687594A4 (en) | 2014-11-12 |
JPWO2012124353A1 (ja) | 2014-07-17 |
JP6021802B2 (ja) | 2016-11-09 |
EP2687594A1 (en) | 2014-01-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103608451A (zh) | 培养方法、成熟脂肪细胞群和药物筛选方法 | |
JP7219303B2 (ja) | 培養方法 | |
JP5676265B2 (ja) | 細胞保存方法、及び細胞輸送方法 | |
JP5578779B2 (ja) | スフェロイド培養方法及びスフェロイド培養容器 | |
JP5607535B2 (ja) | 細胞培養キット、スクリーニング方法、及び細胞培養キットの製造方法 | |
CN103814125B (zh) | 粘附性细胞的培养方法 | |
Bruzewicz et al. | Fabrication of a modular tissue construct in a microfluidic chip | |
Liu et al. | A review of manufacturing capabilities of cell spheroid generation technologies and future development | |
US8415157B2 (en) | Cell culture container and cell culture method | |
KR20130030309A (ko) | 세포 배양 방법 및 스크리닝 방법 | |
CN106554937B (zh) | 一种肝细胞的体外三维培养方法 | |
JPWO2008130025A1 (ja) | 肝細胞培養容器及び肝細胞培養方法 | |
Sun et al. | A superhydrophobic chip integrated with an array of medium reservoirs for long-term hanging drop spheroid culture | |
JP5940758B2 (ja) | 細胞培養方法 | |
US20210292707A1 (en) | Method for the culturing of cells | |
JP2010200679A (ja) | 細胞培養容器、細胞培養方法、および細胞評価方法 | |
JP7219891B2 (ja) | 細胞培養用積層体、医療器具および医療器具の使用方法 | |
Payande | Development of Microfluidic 3D Cell Culture with a Nanocellulose-Based Scaffold for Spheroid Formation as a Potential Tool for Drug Screening |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20140226 |
|
RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |