CN103814125B - 粘附性细胞的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供用于能够通过与二维培养同样的培养方法在接近于生物体内的环境下评价粘附性细胞的方法及其用途。粘附性细胞的培养方法中，作为培养容器(10)，使用配置2个以上等效直径D为期望的球状体的直径的1倍～5倍且高度H为上述等效直径的0.3倍～5倍的培养空间(11)、并且表面的水接触角为45度以下的容器。在配置于培养容器(10)中的多个培养空间(11)分别培养粘附性细胞的球状体。

Description

粘附性细胞的培养方法
技术领域
本发明涉及通过与以往的二维培养(平面上的培养)同样的操作培养出不可能通过二维培养得到的均匀尺寸的粘附性细胞的球状体的方法。
背景技术
近年来，利用细胞培养技术培养的细胞开始用于药剂的药效试验、毒性试验。但是，对于通过以往的培养技术培养的细胞而言，细胞在二维方向上铺展，形成与在生物体内大大不同的形状。因此，存在不具有本来的细胞功能，不能反映药物在生物体内的行为的问题。
因此，近年来，模仿生物体内的组织形态的球状体培养方法开始受到关注。例如，公开了使96多孔板的底面呈漏斗状且在其中形成1个球状体的方法(专利文献1)。另外，可以列举：通过在培养底面上形成微细的蜂窝结构体而减弱细胞对机材的粘附性来形成球状体的方法(专利文献2)、使用外源性细胞聚集剂的方法(专利文献3)等。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本专利第2716646号公报
专利文献2：日本特开2002-335949号公报
专利文献3：日本特开2008-22743号公报
发明内容
发明所要解决的问题
但是，专利文献1的培养方法中，在一个容器内以悬浮的状态形成1个球状体。该方法中，更换培养基时细胞容易脱离，因此，存在更换培养基时操作繁琐的问题。此外，由于在一个容器内形成1个球状体，因此难以应用于例如6孔板、12孔板、24孔板、384孔板或者烧瓶形状的容器。
另外，专利文献2、3的培养方法能够应用于上述的培养板、烧瓶形状的容器，但另一方面，不能控制球状体的大小。因此，存在不能制作具有均匀直径的球状体的问题。
由此可见，以往的培养方法在市售的孔板、烧瓶形状的容器中的应用存在限度，或者即使能应用也难以控制球状体的直径。因此，要求能够应用于各种培养容器的形状、且通过控制球状体的大小能够培养具有均匀直径的粘附性细胞的球状体的新方法。
用于解决问题的方法
本发明的粘附性细胞的培养方法的一个方式中，作为培养容器，选择配置2个以上等效直径为期望的球状体的直径的1倍～5倍且高度为上述等效直径的0.3倍～5倍的培养空间、并且该培养空间表面的水接触角为45度以下的容器。在配置于选择的培养容器中的多个培养空间内分别培养粘附性细胞的球状体。通过使用形成有与要培养的球状体的尺寸相应的培养空间的培养容器，对培养的球状体的尺寸进行控制。由此，能够得到期望尺寸的球状体。
本发明的粘附性细胞的培养方法的一个方式中，优选培养空间的等效直径为100μm～5000μm的范围。此外，优选将相邻的培养空间隔开的壁的厚度为5μm～50μm的范围，优选将相邻的上述培养空间隔开的壁的上表面与侧面所成的角度为90度～135度的范围。
另外，优选在培养后的全部球状体中，有60%以上的球状体，其直径在培养后的球状体的直径的平均值的正负5%的范围内，优选球状体为癌细胞。
此外，优选培养容器为包含丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯类树脂、丙烯酸-苯乙烯类共聚树脂、聚碳酸酯类树脂、聚酯类树脂、聚乙烯醇类树脂、乙烯-乙烯醇类共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯类树脂和硅树脂中的1种或它们的组合的树脂成形品。
此外，优选培养空间的表面以通过玻璃处理或通过等离子体处理形成官能团而使水接触角为45度以下的方式进行了处理。
此外，优选对培养空间的表面实施了下述中的任何一项：包被有通过温度、光中的任何一种使亲水性和疏水性发生变化的聚合物；固定有抑制细胞粘附的亲水性聚合物链；固定有磷脂或磷脂-高分子复合物。
发明效果
通过本发明，能够通过与以往的二维培养同样的操作高密度地培养均匀尺寸的粘附性细胞的球状体。
附图说明
图1是表示本发明的实施方式的培养容器的构成例的图。
图2是图1所示的培养容器的沿II-II线的剖面图。
图3是说明在培养板的孔内形成有本实施方式的培养容器的构成例的示意图。
图4是表示在培养空间内培养球状体的状态的示意图。
图5A是表示培养空间的另一形状例的图。
图5B是表示培养空间的又一形状例的图。
图6A是表示培养空间的另一侧面的形状例的剖面图。
图6B是表示培养空间的又一侧面的形状例的剖面图。
图6C是表示培养空间的又一侧面的形状例的剖面图。
图7是表示实施例1的结果的照片。
图8是表示实施例2的结果的照片。
图9是表示比较例1的结果的照片。
图10是表示比较例2的结果的照片。
图11是表示实施例3的结果的照片。
具体实施方式
以下，参考附图对本发明的实施方式进行说明。但是，本发明并不限定于以下的实施方式。为了明确说明，以下的记载和附图进行了适当省略和简化。各附图中，对具有同一构成或功能的构成要素和相应部分赋予同一标号，并省略其说明。
图1中示出了本发明的实施方式的培养容器的构成例。图2中示出了沿图1的II-II线的剖面图。
培养容器10具有培养空间11、壁12和底部13。
培养空间11为由壁12和底部13分隔成的区域，成为培养细胞的三维空间区域(培养区域)。培养空间11也简称为“空间”或“微空间”。
壁12为分隔培养空间11的隔壁，也可以说是在培养容器10上形成凹凸图案的凸部。
底部13作为培养容器10的基板发挥功能，并且，配置培养空间11的一侧的表面成为培养区域(培养表面)的一部分。
图1、2中，关于培养容器10中的培养空间11，示出了等效直径D、高度H、壁12的宽度W(厚度)和底部13的厚度T。图1、2中，示出了底部13与壁12作为一体而制作的情况。
等效直径D是指与培养空间11内切的内切圆的直径。更详细而言，等效直径D是指与培养空间11的底部13平行的面的形状(正面的形状)的内切圆的直径，换言之，是指与培养空间11的高度H的方向垂直的面的形状的内切圆的直径。在培养空间11的正面的形状随着高度H而不同的情况下，将培养粘附性细胞的空间区域的最大值作为等效直径。
高度H为从培养空间11的底至壁12的上表面的长度，也可以说是培养空间11的深度。另外，在培养底面为平面的情况下，高度H与壁12的高度相同。壁12的宽度W也可以说是邻接的培养空间11之间的距离。
本发明人发现，通过使用具有多个等效直径D为期望的球状体的直径的1～5倍且高度H(深度)为等效直径D的0.3倍～5倍的培养空间11、并且该培养空间表面的水接触角为45度以下的培养容器10，在各培养空间11内培养粘附性细胞，能够培养均匀直径的粘附性细胞的球状体。因此，通过根据期望的球状体的大小来选择配置在培养容器10内的培养空间11的大小，能够控制培养的球状体的大小。
图3是说明在培养板的孔内形成有本实施方式的培养容器的构成例的示意图。培养板1中形成有多个孔21，相邻的孔21之间由分隔部22隔开。各孔21与培养容器10对应，包含多个培养空间11和壁12。
在各孔21内、换言之在培养容器10内，多个培养空间11如图1所示配置成阵列状。各孔21中所含的培养空间11的个数依赖于培养板上制作的孔21的个数(孔21的大小)和培养空间11以及壁12的大小。图3为用于说明构成而减少培养空间11的个数来表示的示意图，各孔21中所含的培养空间11的个数与实际不同。此外，图1、2中，示出了9个培养空间11。这是为了说明而表示的，并不与实际的培养容器10(孔21)中所含的培养空间11的个数对应。
参考图1～3，对用于形成期望的球状体的微米级的培养空间11的形状、大小的一例和培养表面的亲水化处理方法、培养方法进行详细说明。
关于培养空间11的等效直径，需要考虑到球状体的大小随细胞增殖而使其直径增大。在此重要的是，确保使球状体不与相邻的培养空间11的细胞接触的培养空间11。因此，培养空间11的等效直径D优选为期望的球状体的直径的1～5倍的范围，更优选为1.5～3倍的范围。
在本发明的培养方法的一个方式中，为了形成直径100μm的粘附性细胞的球状体，使用具有规则地配置有期望的球状体的直径的1～5倍的范围、即、等效直径D为100～500μm的范围且高度H为等效直径的0.3～5倍的范围的培养空间11的底部13的培养容器10。
例如，对培养作为粘附性细胞的癌细胞的情况进行了研究。根据非专利文献1(Juergen Friedrich等著、“Spheroid-based drug screed:considerations and pracitical approach”、Nature Protocols vol.4No.32009、pp309-324)，在将粘附性细胞用于药物的筛选的情况下，增殖的癌细胞中小的为200μm，最大的球状体尺寸根据来源的器官各不相同，也有增殖到1000μm以上的情况。此外，在500μm～600μm的球状体中观察到与生物体内的肿瘤中特征性的肿瘤中心发生的继发性细胞死亡类似的现象。因此，培养空间11的等效直径优选为200μm～4000μm的范围，更优选为500μm～3000μm的范围。
关于培养空间11的高度H，本发明的培养空间11使用比一般的培养方法中使用得空间更深的空间。具体而言，一般的培养方法中，粘附性细胞通过增强与培养空间11的表面的细胞粘附性而增殖、维持。该培养方法中，为了提高氨基酸、氧的供给性，不在如本实施方式这样的、培养空间11的等效直径D为期望的球状体的直径的1～5倍的范围且高度H为等效直径D的0.3～5倍的范围的深空间内培养。
另一方面，本发明中，为了如后所述抑制细胞粘附性，需要设计能够供给氨基酸、氧等且球状体不脱离的最佳高度H。关于培养空间11，研究了各种高度H、等效直径D，结果发现，培养空间11的高度H的最佳范围为培养空间11的等效直径D的0.3倍～5倍的范围，更优选为0.5～2倍的范围。其理由之一在于，培养空间11的高度H只要在更换培养基时球状体不从培养空间11脱离即可，并且，为了充分进行培养基中所含的氨基酸、氧供给营养成分，空间的深度越浅越优选。
壁12的宽度W为将培养空间11与邻接的培养空间11隔开的壁12的厚度。因此，为了防止壁12的上表面上的细胞增殖且使细胞容易进入培养空间11内，壁12的宽度W为5～50μm的范围即可，优选为1个以下细胞体的大小、即5～30μm的范围，更优选为5～10μm的范围。此外，从同样的观点出发，优选壁12的上表面与培养空间11的侧面所成的角θ为90～135度的范围，更优选为90度～120度的范围。
图4中示出了表示在培养空间11内培养球状体的状态的示意图。图4中，使用图2所示的剖面图，将球状体9用○记号表示。球状体9在多个培养空间11内分别进行培养。
在图3所示的培养板1中培养的情况下，对每个孔21进行培养条件的设定、培养基的更换等。因此，由于各孔21中能够形成多个培养空间11，因而能够在相同条件下培养多个球状体。此外，可以使用孔板培养球状体，因此，能够利用以往的细胞培养中使用的装置等。
将球状体9的直径DSP设为值dsp(dsp为正的数值)时，培养空间11的等效直径D为值dsp～值dsp的5倍的范围(dsp≤D≤5dsp)。另外，培养空间11的高度H为值dsp的0.3倍～值dsp的25倍(5×5)的范围(0.3dsp≤H≤25dsp)。
培养空间11的形状(正面的形状)或与底部13平行的面的形状不限定于图1所示的形状，例如，可以为图5A～5B所示的形状，也可以为其他形状(椭圆、菱形等)。为了形成更高密度且具有均匀直径的球状体，优选为左右对称结构。
培养空间11的侧面的形状不限定于图2所示的圆柱状，例如，可以为图6A～6C所示的形状。
作为构成培养容器10的材料，从丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯类树脂、丙烯酸-苯乙烯类共聚树脂、聚碳酸酯类树脂、聚酯类树脂、聚乙烯醇类树脂、乙烯-乙烯醇类共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯类树脂和硅树脂中的1种或它们的组合中选择。
从观察性的观点出发，培养容器10的底部13的厚度T优选为1mm以下。但是，只要不妨碍使用显微镜观察，也可以为1mm以上，不对底部13的厚度T进行限定。通过确保培养容器的底部13的观察性，能够直接使用培养板来观察培养的球状体。
接着对培养表面的特性进行说明。对于培养表面，为了在各培养空间11内装入培养基，另外，在使用包被溶液的情况下，该溶液如果不进入培养空间11内则不能包被表面，因此，优选使水接触角为45度以下。更优选为0度～20度的范围。另外，水接触角的值以在与培养容器10相同的条件下制作不形成培养空间11和壁12的凹凸图案的平板并测定而得到的值为前提。
关于以阵列状配置培养空间11的表面，该表面的疏水性高、水接触角超过45度时，即润湿性低的情况下，添加培养基或包被溶液时，气泡容易进入空间内，有时产生不能培养细胞的空间。因此，需要以使水接触角为45度以下的方式进行亲水化。作为亲水化的方法，可以列举：蒸镀SiO2的方法、进行等离子体处理的方法。
此外，为了提高球状体的形成率，优选抑制细胞粘附性。为了抑制细胞粘附性，可以使用水接触角为45度以下、优选为40度以下、更优选为20度以下的表面。关于抑制细胞粘附性与水接触角的关系，例如，记载在非专利文献1(Y Ikada著、“Surface modification of polymersfor medical applications”、Biomaterials1994,vol.15No.10,pp725-736)中。
作为使水接触角为45度以下的方法，可以列举：在培养底面上蒸镀玻璃的方法、使用等离子体处理法在表面上形成官能团的方法。可以使用通过等离子体处理等在表面上形成官能团或包被能够利用光或温度控制亲水/疏水性的聚合物的方法。此外，可以包被磷脂-高分子复合物。也可以在进行上述的表面处理后，固定聚乙二醇、磷脂-高分子复合物等亲水性聚合物。
实施例
以下，对本发明的细胞培养方法的实施例进行说明，但本发明不限定于这些实施例。
[实施例1、2、比较例1]
1.培养容器的制作
对于实施例1、2和比较例1，作为图1、2所示的规则地排列有培养空间11的培养容器10，通过光刻法制作以下的等效直径D、宽度W和高度H的图案，进行电镀Ni，得到具有对应的凹凸形状的模具。
·实施例1：D=100μm、W=20μm、H=50μm(H/D=0.5)
·实施例2：D=200μm、W=20μm、H=100μm(H/D=0.5)
·比较例1：D=200μm、W=20μm、H=50μm(H/D=0.25)
实施例1、2、比较例1中，使用该模具，通过热压成形在聚苯乙烯上进行凹凸图案形状的转印，制作上述尺寸的树脂基材。制作通过真空蒸镀在该树脂基材表面上形成了100nm的二氧化硅膜的薄膜，通过激光熔敷法将薄膜粘贴在聚苯乙烯制的无底面的24孔板上后，进行γ射线灭菌。这样，制作了形成有在各孔中具有多个培养空间11的培养容器10的24孔的培养板。
比较例2使用市售(Becton,Dickinson and Company制、ファルコン(注册商标))的γ射线灭菌完毕的平面状的24孔培养板。比较例2为以平面状进行培养的以往的二维培养。
全部培养板的水接触角均为45度以下。水接触角使用自动接触角测定装置OCA20(英弘精机株式会社制)测定。对于实施例1、2和比较例1的培养板，在相同条件下制作不具有形成培养空间11的凹凸图案的平板状板并测定水接触角。对于比较例2，通过目视可以明确地确认水接触角为45度以下。
2.细胞培养和观察
在全部培养板的孔中加入300μL1体积%MPC溶液，在4℃下放置24小时后，使用吸液器吸取溶液，使用完全干燥后的培养板。
细胞使用人HT29结肠癌(DSファーマバイオメディカル公司)细胞。
使用培养烧瓶(CORNIGN公司制)，在37℃、5体积%CO2温箱内增殖至预定的细胞数。培养基使用含有10体积%胎牛血清(FBS：FetalBovine Serum)的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium，达尔伯克氏改良伊格尔培养基)(SIGMA公司制)培养基。使用培养烧瓶(CORNIGN公司制)，在5体积%CO2温箱内增殖至预定的细胞数。使用0.25体积%胰蛋白酶溶液将增殖后的细胞从培养底面剥离，通过离心分离法回收细胞。将回收的细胞放入含有10体积%胎牛血清的DMEM培养液中，以使细胞浓度为500000个/cm2的方式接种细胞。然后，将细胞在37℃、5体积%CO2温箱内培养24小时。
细胞培养后，使用倒置显微镜进行观察。
对于观察结果，使用以下的计算式计算球状体形成率(A)、球状体直径平均值(DAv)和球状体直径的平均值±5%的直径的球状体的比例(B)。将计算结果示于表1。
·球状体形成率A(%)=
(球状体的个数)×100/(使用倒置显微镜观察到的1个视野的空间的个数)
·球状体直径平均DAv(μm)=
(各球状体的直径的合计值)/(全部球状体的个数)
·球状体直径的平均值±5%的直径的球状体的比例B(%)=
(平均值±5%的直径的球状体的个数)×100/(全部球状体的个数)
表1
图7～10中示出了使用倒置显微镜拍摄在实施例、比较例的条件下培养的球状体而得到的照片。
[实施例3]
1.培养容器的制作
作为图1、2所示的规则地排列有培养空间11的培养容器10，通过光刻法制作以下的等效直径D、宽度W和高度H的图案，进行电镀Ni，得到具有对应的凹凸形状的模具。
D=200μm、W=200μm、H=100μm(H/D=0.5)
实施例3中，除了使用该模具和96孔板以外，通过与实施例1、2同样的方法制作培养板，得到96孔的培养板。
2.细胞培养和观察
对全部培养板的孔的培养表面进行微波等离子体处理后，使用磷酸缓冲液清洗，然后，使用0.01体积%的MPC溶液进行包被。在洁净工作台内在室温下放置24小时，使MPC溶液干燥。
细胞使用HepG2。
培养基使用含有10体积%胎牛血清的DMEM培养液。培养方法与实施例1、2相同。
图11中示出了实施例3的结果。如图11的照片所示，在培养HepG2的情况下，也观察到培养容器10内形成了球状体。
另外，本发明不限于上述实施方式，可以在不脱离主旨的范围内适当变更。
本申请要求以2011年9月20日提出的日本申请特愿2011-204796号为基础的优先权，将其公开的全部内容引入本说明书中。
标号说明
1培养板
9球状体
10培养容器
11培养空间
12壁
13底部
21孔
22分隔部

Claims (13)

1.一种粘附性细胞的培养方法，使用配置2个以上等效直径为期望的球状体的直径的1倍～5倍且高度为所述等效直径的0.3倍～5倍的培养空间、并且该培养空间表面的水接触角为45度以下的培养容器，在多个培养空间培养粘附性细胞的球状体，将相邻的所述培养空间隔开的壁的厚度为5μm～50μm的范围。
2.如权利要求1所述的培养方法，其中，所述培养空间的等效直径为100μm～5000μm的范围。
3.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，将相邻的所述培养空间隔开的壁的上表面与侧面所成的角度为90度～135度的范围。
4.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，在培养后的全部球状体中，有60％以上的球状体，其直径在培养后的球状体的直径的平均值的正负5％的范围内。
5.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述球状体为癌细胞。
6.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述培养容器为包含丙烯酸类树脂、聚乳酸、聚乙醇酸、苯乙烯类树脂、丙烯酸-苯乙烯类共聚树脂、聚碳酸酯类树脂、聚酯类树脂、聚乙烯醇类树脂、乙烯-乙烯醇类共聚树脂、热塑性弹性体、氯乙烯类树脂和硅树脂中的1种或它们的组合的树脂成形品。
7.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述培养空间的表面以通过玻璃处理使水接触角为45度以下的方式进行了处理。
8.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述培养空间的表面以通过等离子体处理形成官能团而使水接触角为45度以下的方式进行了处理。
9.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述培养空间的表面上包被有通过温度、光中的任何一种使亲水性和疏水性发生变化的聚合物。
10.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述培养空间的表面上固定有抑制细胞粘附的亲水性聚合物链。
11.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，所述培养空间的表面上固定有磷脂或磷脂-高分子复合物。
12.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，以通过玻璃处理使水接触角为45度以下的方式对所述培养空间的表面进行处理后，将通过温度、光中的任何一种使亲水性和疏水性发生变化的聚合物、抑制细胞粘附的亲水性聚合物链、以及磷脂或磷脂-高分子复合物中的任何一种聚合物固定在所述培养容器的表面上。
13.如权利要求1或2所述的培养方法，其特征在于，以通过等离子体处理形成官能团而使水接触角为45度以下的方式对所述培养空间的表面进行处理后，将通过温度、光中的任何一种使亲水性和疏水性发生变化的聚合物、抑制细胞粘附的亲水性聚合物链、以及磷脂或磷脂-高分子复合物中的任何一种聚合物固定在所述培养容器的表面上。
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