JP2015107110A - 軟質培養容器 - Google Patents

Abstract

【課題】前処理や特殊な培養条件または培養基材を必要とすることなく接着培養または重層化が可能な培養容器を提供すること。【解決手段】底部と該底部の周縁から垂直に立ち上がる側壁部とを備え、該底部の側壁部が設けられている側の表面が改質処理されており、該底部が、軟質材料で形成されている、培養容器。【選択図】図１

Description

本発明は、軟質な材料で形成された培養容器に関する。

細胞培養においては、一般に、ガラス製または硬質な樹脂製の培養容器が用いられている。このような培養容器で細胞を接着培養するためには、細胞種によっては予め培養容器にフィブロネクチン、ポリリジン、ラミニン、コラーゲン等の細胞外マトリックスをコーティングしておく必要がある。

また、皮膚、角膜等の最表面を覆う上皮細胞は生体内では重層化した状態で存在しており、上皮組織を移植等する場合には細胞を重層化してから移植することが望まれている。細胞を重層化する方法としては、特殊な条件下で培養する方法や特殊な培養基材を用いて培養する方法等が提案されている（例えば、特許文献１）。

特許第４８７４５１４号

本発明は、従来の培養容器における上記課題を解決するためになされたものであり、その目的は、前処理や特殊な培養条件または培養基材を必要とすることなく、細胞の接着培養または重層化が可能な培養容器を提供することである。

本発明の培養容器は、底部と該底部の周縁から垂直に立ち上がる側壁部とを備え、該底部の側壁部が設けられている側の表面が改質処理されており、該底部が、軟質材料で形成されている。
１つの実施形態において、上記軟質材料のゴムＡ硬度は０〜９０である。１つの実施形態において、上記軟質材料のゴムＡ硬度は０〜５０である。
１つの実施形態において、上記軟質材料のヤング率は０より大きく５ＭＰａ以下である。１つの実施形態において、上記軟質材料のヤング率は０より大きく４ＭＰａ以下である。
１つの実施形態において、上記改質処理は、プラズマ処理、コロナ放電処理およびエキシマ処理からなる群から選択される。
１つの実施形態において、上記改質処理は、０．２Ｔｏｒｒ〜１．０Ｔｏｒｒの圧力下における酸素、二酸化炭素またはこれらの混合ガスのプラズマ処理である。１つの実施形態において、上記プラズマ処理におけるプラズマ出力は１０Ｗ〜６０Ｗであり、処理時間は３０秒〜５分である。
１つの実施形態において、上記底部を形成する材料は、シリコーンゴムまたは熱可塑性エラストマーである。
１つの実施形態において、上記底部を形成する材料は、有機溶媒耐性を有する。

本発明によれば、底部が軟質材料で形成され、かつ表面処理された培養容器を用いることにより、培養環境が生体内環境に近づくので、前処理や特殊な培養条件または培養基材を必要とすることなく接着培養または重層化が可能となる。

本発明の１つの実施形態における培養容器の概略斜視図である。 （ａ）は本発明の別の実施形態における培養容器の概略斜視図であり、（ｂ）はその概略平面図である。 各培養容器での細胞培養状態を示す位相差顕微鏡写真である。 各培養容器での細胞培養状態を示す位相差顕微鏡写真である。 培養容器５での細胞培養状態を示すレーザー共焦点顕微鏡による２Ｄ写真（ａ）と３Ｄ写真（ｂ）である。 培養容器５での細胞培養状態を示すレーザー共焦点顕微鏡による３Ｄ写真である。 培養日数に対する細胞数の変化を示すグラフである。 各培養容器での細胞培養状態を示す位相差顕微鏡写真である。 各培養容器での細胞培養状態を示す位相差顕微鏡写真である。 各培養容器でのタイトジャンクションの発現状態を示すレーザー共焦点顕微鏡写真である。 各培養容器での細胞培養状態を示す位相差顕微鏡写真である。 レーザー共焦点顕微鏡を用いて構築した、図１１の細胞培養状態に対応する３次元画像である。

［Ａ．培養容器］
図１は、本発明の１つの実施形態における培養容器の概略斜視図である。培養容器１００は、平面視正方形の有底枠形状に形成されており、底部１０と、底部１０の各辺から垂直に立ち上がる側壁部２０とを備える。底部１０と側壁部２０とによって規定される凹部に培養対象の細胞、培地等が添加されて培養が行なわれ得る。図示例においては、底部１０は、平面視正方形の平板状とされているが、これとは異なり、平面視円形等の任意の適切な形状であり得る。培養容器１００は、底部１０と側壁部２０とが別々に成形され、その後、接合されたものであってもよいが、培養時の作業性、生産性等の観点から、好ましくは底部１０と側壁部２０とが一体成形されてなる。

底部１０のサイズおよび側壁２０の高さはそれぞれ、培養する細胞の種類、用途等に応じて任意の適切な値に設定される。底部１０および側壁２０の厚みもまた、培養する細胞の種類、用途等に応じて任意の適切な値に設定され得る。底部１０の厚みは、例えば０．１ｍｍ〜４ｍｍであり得る。側壁２０の厚みは、例えば１ｍｍ〜３０ｍｍであり得る。

底部１０の側壁部が設けられている側の表面（以下、単に「底部の表面」と称する）は改質処理されている。改質処理を行うことにより、細胞接着性が最適化される、細胞が重層化する等の効果が得られ得る。必要に応じて、側壁２０の内側表面も改質処理されていてもよい。改質処理後の表面の水接触角は、例えば６０度〜１００度であり得る。

上記改質処理の具体例としては、プラズマ処理（例えば、減圧プラズマ処理、大気圧プラズマ処理）、コロナ放電処理、エキシマ処理が挙げられる。好ましくはプラズマ処理である。プラズマ処理は、例えば、酸素、水素、窒素、大気、アルゴン、ヘリウム、アンモニア、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、エタン、プロパンまたはこれらの混合ガスのプラズマを用いて行われる。なかでも、酸素、二酸化炭素またはこれらの混合ガスのプラズマを用いることが好ましい。プラズマ処理時の圧力は、通常、０．２Ｔｏｒｒ〜１．０Ｔｏｒｒである。

プラズマ処理を施すための装置としては、高周波、低周波等の発振器を備えた真空チャンバーを用いることが好ましい。なかでも、高周波による処理が好ましく、通常１３．５６ＭＨｚのものが用いられる。出力は、好ましくは１０Ｗ〜６０Ｗである。処理時間は、好ましくは３０秒〜５分である。

底部１０の形成材料は、好ましくは０以上、より好ましくは１５以上、さらに好ましくは２０以上のゴムＡ硬度を有する。当該形成材料のゴムＡ硬度は、好ましくは９０以下、より好ましくは５０以下、さらに好ましくは４５以下、特に好ましくは４０以下である。このような硬度を有する材料を用いることにより、細胞外マトリックスをコーティングしなくても良好な接着培養が可能となる、特殊な培養条件や培養基材を用いなくても細胞の重層化が可能となる等の効果が得られ得る。ゴムＡ硬度が９０を超えると、十分な細胞増殖が得られない等の問題が生じ得る。なお、本明細書において、ゴムＡ硬度は、ＪＩＳ Ｋ６２５３−３に準拠して測定される値である。

底部１０の形成材料は、好ましくは０より大きい、より好ましくは０．００５ＭＰａ以上、さらに好ましくは０．０１ＭＰａ以上のヤング率を有する。当該形成材料のヤング率は、好ましくは５ＭＰａ以下、より好ましくは４ＭＰａ以下、さらに好ましくは３ＭＰａ以下である。このようなヤング率を有する材料を用いることにより、上記ゴムＡ硬度の場合と同様に、細胞外マトリックスをコーティングしなくても良好な接着培養が可能となる、特殊な培養条件や培養基材を用いなくても細胞の重層化が可能となる等の効果が得られ得る。ヤング率が５ＭＰａを超えると、十分な細胞増殖が得られない等の問題が生じ得る。なお、本明細書において、ヤング率は、ＪＩＳ Ｋ７１１３に準拠して測定される値である。

底部１０の形成材料は、好ましくは透明性が高く、かつ、自家蛍光を有さない。このような材料によれば、顕微鏡による直接観察が容易である。当該材料の全光透過率は、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上である。全光透過率は、ＪＩＳ Ｋ７３７５に準拠して求めることができる。また、レーザー共焦点顕微鏡観察における励起光（例えば、波長４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、５４３．５ｎｍ、６３８ｎｍ）に特異的な吸収を有さないことが好ましい。このような材料であれば、蛍光染色後の細胞観察に好適である。

また、底部１０の形成材料は、酸素透過性が高いことが好ましい。底部の酸素透過性が高い場合、三次元培養に有利である。当該材料の酸素透過量は、好ましくは３０〜５００×１０^−１１（ｃｍ^２/ｓｅｃ）・（ｍＬＯ_２/（ｍＬ×ｍｍＨg））である。酸素透過量は、ＪＩＳ Ｋ７１２−１に準拠して測定される。

また、底部１０の形成材料は、有機溶媒耐性を有することが好ましい。培養細胞の顕微鏡観察においては、観察をより容易にする観点から、一般に観察に先立って染色が行われる。よって、底部が有機溶媒に耐性を有する材料で形成され、有機溶媒を含む染色液で変質しないことは、培養容器内での細胞の染色および観察に好適である。有機溶媒としては、細胞の染色に一般的に使用される有機溶媒が挙げられる。具体例としては、アセトン、ホルムアルデヒド、メタノール等が挙げられる。

底部１０の形成材料は、上記のような軟質性を有する限りにおいて任意の適切なエラストマーであり得る。例えば、シリコーンゴムまたは熱可塑性エラストマーが好ましく用いられる。

シリコーンゴムは、熱硬化型であり、耐熱性に優れるので、高温滅菌処理または高温加圧滅菌処理に供することが可能である。シリコーンゴムの具体例としては、ポリジメチルシロキサン、ポリメチルフェニルシロキサン、ポリメチルビニルシロキサンまたはこれらの共重合体をベースポリマーとするものが好ましく挙げられる。なかでも、ポリジメチルシロキサンをベースポリマーとするものが好ましい。有機溶媒耐性を有し、透明性に優れ、かつ、自家蛍光を有さないからである。また、タックが小さいので取扱い性に優れ得る。ベースポリマーと硬化剤とを含む市販のシリコーンゴム組成物を用いることにより種々の硬度のシリコーンゴムが得られ得る。また、ポリジメチルシロキサン等のベースポリマーの分子量、架橋度等を適切に調整することにより、所望の軟質性（例えば、ゴムＡ硬度、ヤング率）を有するシリコーンゴムが得られ得る。

熱可塑性エラストマーの具体例としては、ポリスチレン−ポリイソプレン−ポリスチレンブロック共重合体（ＳＩＳ）、ポリスチレン−ポリブタジエン−ポリスチレンブロック共重合体（ＳＢＳ）、ポリスチレン−ポリエチレン−ポリブチレン−ポリスチレン（ＳＥＢＳ）等のポリスチレン系熱可塑性エラストマー、ポリオレフィン系熱可塑性エラストマー、ポリエステル系熱可塑性エラストマー、ポリウレタン系熱可塑性エラストマー、１，２−ポリブタジエン系熱可塑性エラストマー、ポリ塩化ビニル系熱可塑性エラストマー等が挙げられる。なかでも、ポリスチレン系熱可塑性エラストマーが好ましく、ＳＥＢＳがより好ましい。有機溶媒耐性を有し、透明性に優れ、かつ、自家蛍光を有さないからである。また、タックが小さいので取扱い性に優れ得る。熱可塑性エラストマーは種々の硬度のものが市販されている。また、モノマーの種類、配合比等を適切に調整して重合することにより、所望の軟質性（例えば、ゴムＡ硬度、ヤング率）を有する熱可塑性エラストマーが得られ得る。

側壁部２０の形成材料としては、任意の適切な材料を用いることができる。当該材料は、培養容器の自立性を確保する観点からは、底部１０と同等以上の硬度を有することが好ましく、製造容易性の観点からは、底部１０と同じ材料であることがより好ましい。

上記では、本発明の１つの実施形態を説明してきたが、本発明はこれに限定されない。例えば、図２（ａ）は、本発明の別の実施形態における培養容器の概略斜視図であり、図２（ｂ）は、その概略平面図である。当該実施形態の培養容器は、以下に説明する点以外は上述した実施形態と基本的に同様である。

培養容器１００’は、平面視長方形の有底枠形状に形成されており、底部１０と、底部１０の各辺から垂直に立ち上がる側壁部２０ａ〜２０ｄと、側壁部を厚み方向に貫通するように各隅部に設けられた貫通孔３０ａ〜３０ｄとを備える。対向する一対の側壁部２０ａおよび２０ｃはほぼ同じ厚みの薄肉とされ、もう一対の側壁部２０ｂおよび２０ｄはほぼ同じ厚みの厚肉とされている。貫通孔３０ａ〜３０ｄはそれぞれ、平面視においてその外形線が長手方向に伸びる底部１０の辺の延長線と接する、または、交わる位置に設けられている。このような構成を有する培養容器１００’は、貫通孔３０ａ〜３０ｄを係合部として例えばＷＯ２００５／０８７９１３に記載されるような伸展装置に適用可能であるので、伸展培養に好適に用いられ得る。

また、図示しないが、本発明の培養容器は、上面を覆う蓋体を有していてもよい。

［Ｂ．培養容器の製造方法］
本発明の培養容器は、代表的には、対応するキャビティを有する金型を用いた射出成形、トランスファー成形等によって製造される。具体的には、熱可塑性エラストマーを用いる場合、ガラス転移温度よりも高い温度に加熱して軟化させ、射出圧を加えながら金型に充填し、固化（冷却）させることによって成形することができる。加熱温度および時間、固化温度および時間等は、熱可塑性エラストマーの種類等に応じて適切に設定され得る。

一方、シリコーンゴム等の熱硬化性エラストマーを用いる場合には、原料（例えば、シリコーンゴム組成物）を金型内に充填し、加熱により硬化させることによって成形することができる。硬化温度および時間等は、熱硬化性エラストマーの種類等に応じて適切に設定され得る。

また、底部と側壁部とを異なる材料で形成する場合は、二色成形やそれぞれの部材を接着することによって製造され得る。

上記のようにして製造された培養容器は、プラズマ処理（例えば、減圧プラズマ処理、大気圧プラズマ処理）、コロナ放電処理、エキシマ処理等の表面改質処理を経て個別にまたは複数個ずつ滅菌処理済の袋に収容され得る。プラズマ処理条件は、Ａ項に記載の通りである。金型から取り出された培養容器は、成形の際に高温処理を経ており、また、プラズマ処理には滅菌作用も期待できるので、プラズマ処理された培養容器は更なる滅菌処理を経ることなく、滅菌袋に収納され得る。必要に応じて、滅菌袋への収容前および／または収容後にエチレンオキサイドガスによるガス滅菌処理、紫外線、γ線またはＸ線等による放射線滅菌処理、高圧蒸気滅菌処理等を施してもよい。

［Ｃ．培養容器の用途］
本発明の培養容器は、細胞培養、組織培養等に用いられ得る。細胞培養の具体例としては、単層培養、重層化培養等の接着培養、浮遊培養、包埋培養が挙げられる。接着培養によれば、本発明の効果が好適に得られ得る。後述の実施例で示すとおり、本発明の培養容器は細胞外マトリックスをコーティングしなくても接着培養を行うことができるが、細胞外マトリックスをコーティングして接着培養を行ってもよい。培養に用いられる培地は、培養する細胞、組織等に応じて適切に選択され得る。

培養される細胞としては、目的等に応じて任意の適切な細胞が選択され得る。例えば、角膜上皮細胞、表皮角化細胞、口腔粘膜細胞、結膜上皮細胞等の上皮細胞、血管内皮細胞や角膜内皮細胞等の内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞等の筋細胞、骨芽細胞、繊維芽細胞、神経細胞、ハイブリドーマ、ＥＳ細胞、ｉＰＳ細胞、癌細胞が挙げられる。これらの細胞は、組織や器官から直接採取した初代細胞でも良く、あるいは、それらを継代培養したものでも良い。細胞の由来は、動物であってもよく、植物であってもよい。動物である場合、ヒト、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、ブタ、ヒツジ等に由来する細胞であり得る。本発明の培養容器は、足場依存性の増殖能を有する細胞の培養に好適である。

培養する細胞が上皮細胞、内皮細胞、筋細胞、繊維芽細胞、ハイブリドーマ、ＥＳ細胞、iＰＳ細胞、癌細胞等である場合、培養容器の底部の形成材料のゴムＡ硬度は、好ましくは０〜５０、より好ましくは１０〜４５、さらに好ましくは２０〜４０であり得る。この場合、底部の形成材料のヤング率は、好ましくは０より大きく４ＭＰａ以下、より好ましくは０．００５ＭＰａ〜４ＭＰａ、さらに好ましくは０．０１ＭＰａ〜３．５ＭＰａであり得る。また、培養する細胞が骨芽細胞等である場合、培養容器の底部の形成材料のゴムＡ硬度は、好ましくは２０〜７０、より好ましくは３０〜６０、さらに好ましくは３０〜５０であり得る。この場合、底部の形成材料のヤング率は、好ましくは０．１ＭＰａ〜４ＭＰａ、より好ましくは０．２ＭＰａ〜３．５ＭＰａ、さらに好ましくは０．３ＭＰａ〜３．３ＭＰａであり得る。さらに、培養する細胞が神経細胞の場合、培養容器の底部の形成材料のゴムＡ硬度は、好ましくは０〜５、より好ましくは０〜３であり得る。この場合、底部の形成材料のヤング率は、好ましくは０より大きく５ＭＰａ以下、より好ましくは０．００８ＭＰａ〜３ＭＰａ、さらに好ましくは０．０１ＭＰａ〜２ＭＰａであり得る。

以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。

≪ゴムＡ硬度の測定方法≫
実施例の培養容器の肉厚側壁部の中央領域（長さ：２５ｍｍ、幅：１０ｍｍ、厚み：１０ｍｍ）を作製し、測定サンプルとした。当該測定サンプルについて、デュロメータ タイプＡ（株式会社テフロック製、製品番号ＧＳ−７５３）を用いて、ＪＩＳ Ｋ６２５３−３に準拠して測定した。
≪ヤング率の測定方法≫
実施例の培養容器の肉厚側壁部の中央領域（長さ：２５ｍｍ、幅：１０ｍｍ、厚み：１０ｍｍ）を作製し、そこから所定形状の測定サンプルを切り出した。当該測定サンプルについて、引張試験機（株式会社島津製作所製、製品番号ＡＧ-ＩＳ ＭＳ型）を用いて、ＪＩＳ Ｋ７１１３に準拠して測定した。
≪有機溶媒耐性の評価方法≫
各培養容器の底部にアセトンを室温で３０分接触させた後、目視にて白濁が確認されない場合、有機溶媒耐性を有すると判断した。

［実施例１］
末端官能性のポリジメチルシロキサン（信越化学工業株式会社製、製品番号ＫＥ１６０６）をベースポリマーとし、ベースポリマー１００重量部に対して５重量部の硬化剤（ＣＡＴ−ＲＧ）を含むシリコーンゴム組成物を金型内に充填し、金型内で一次硬化させた後、成形品を取り出し、二次硬化として１５０℃で約３０分加熱することによって硬化を完結させた。硬化を完結させた培養容器の底部の表面に以下の条件でプラズマ処理を行って、図２に示すような培養容器１を得た。得られた培養容器１は、長さが約４０ｍｍ、幅が約２５ｍｍであり、底部の平面視形状が約２０ｍｍ×約２０ｍｍの略正方形であり、底部の厚みが約０．４ｍｍであった。また、培養容器１の形成材料のゴムＡ硬度は３０であり、ヤング率は１ＭＰａであった。
≪プラズマ処理条件≫
・ＲＦ電力（周波数１３．５６ＭＨｚ）：５０Ｗ
・プラズマ生成ガス：二酸化炭素
・プラズマ圧力：０．８Ｔｏｒｒ
・処理時間：３分

［実施例２］
２００℃に加熱して軟化させたスチレン系熱可塑性エラストマー（アロン化成株式会社製、製品番号ＡＲ−ＳＣ−１５）を、金型内に充填し、次いで、固化させることによって成形したこと以外は実施例１と同様にして、培養容器２を得た。得られた培養容器２の形成材料のゴムＡ硬度は１５であり、ヤング率は０．４ＭＰａであった。

［実施例３］
２００℃に加熱して軟化させたスチレン系熱可塑性エラストマー（アロン化成株式会社製、製品番号ＡＲ−ＳＣ−３０）を、金型内に充填し、次いで、固化させることによって成形したこと以外は実施例１と同様にして、培養容器３を得た。得られた培養容器３の形成材料のゴムＡ硬度は３０であり、ヤング率は０．９ＭＰａであった。

［実施例４］
２００℃に加熱して軟化させたスチレン系熱可塑性エラストマー（アロン化成株式会社製、製品番号ＡＲ−ＳＣ−４５）を、金型内に充填し、次いで、固化させることによって成形したこと以外は実施例１と同様にして、培養容器４を得た。得られた培養容器４の形成材料のゴムＡ硬度は４５であり、ヤング率は３．２ＭＰａであった。

［実施例５］
以下の条件でプラズマ処理を行ったこと以外は実施例１と同様にして、培養容器５を得た。得られた培養容器５の形成材料のゴムＡ硬度は３０であり、ヤング率は１ＭＰａであった。
≪プラズマ処理条件≫
・ＲＦ電力（周波数１３．５６ＭＨｚ）：５０Ｗ
・プラズマ生成ガス：酸素
・プラズマ圧力：０．８Ｔｏｒｒ
・処理時間：３分

［実施例６］
実施例５と同じ条件でプラズマ処理を行ったこと以外は実施例２と同様にして、培養容器６を得た。得られた培養容器６の形成材料のゴムＡ硬度は１５であり、ヤング率は０．４ＭＰａであった。

［実施例７］
実施例５と同じ条件でプラズマ処理を行ったこと以外は実施例３と同様にして、培養容器７を得た。得られた培養容器７の形成材料のゴムＡ硬度は３０であり、ヤング率は０．９ＭＰａであった。

［実施例８］
実施例５と同じ条件でプラズマ処理を行ったこと以外は実施例４と同様にして、培養容器８を得た。得られた培養容器８の形成材料のゴムＡ硬度は４５であり、ヤング率は３．２ＭＰａであった。

［実施例９］
２００℃に加熱して軟化させたスチレン系熱可塑性エラストマー（アロン化成株式会社製、製品番号ＡＲ−ＳＣ−５）を、金型内に充填し、次いで、固化させることによって成形したことおよびプラズマ処理を行わなかったこと以外は実施例１と同様にして、培養容器９を得た。得られた培養容器９の形成材料のゴムＡ硬度は５であり、ヤング率は０．０１ＭＰａであった。

［実施例１０］
２００℃に加熱して軟化させたスチレン系熱可塑性エラストマー（アロン化成株式会社製、製品番号ＡＲ−ＳＣ−０）を、金型内に充填し、次いで、固化させることによって成形したことおよびプラズマ処理を行わなかったこと以外は実施例１と同様にして、培養容器１０を得た。得られた培養容器１０の形成材料のゴムＡ硬度は０であり、ヤング率は０．００５ＭＰａであった。

［実施例１１］
低温灰化装置（京都電子計測社製、製品番号ＰＡ−１０２ ＡＴ）を用い、Ｏ_２ボンベを接続して、ガス圧 ０．８Ｔｏｒｒ、出力５０Ｗでプラズマ処理を３分間行ったこと以外は実施例１と同様にして、培養容器１１を得た。得られた培養容器１１の形成材料のゴムＡ硬度は３０であり、ヤング率は１ＭＰａであった。

［実施例１２］
実施例１１と同じ条件でプラズマ処理を３分間行ったこと以外は実施例２と同様にして、培養容器１２を得た。得られた培養容器１２の形成材料のゴムＡ硬度は１５であり、ヤング率は０．４ＭＰａであった。

［実施例１３］
実施例１１と同じ条件でプラズマ処理を３分間行ったこと以外は実施例３と同様にして、培養容器１３を得た。得られた培養容器１３の形成材料のゴムＡ硬度は３０であり、ヤング率は０．９ＭＰａであった。

［実施例１４］
実施例１１と同じ条件でプラズマ処理を３分間行ったこと以外は実施例４と同様にして、培養容器１４を得た。得られた培養容器１４の形成材料のゴムＡ硬度は４５であり、ヤング率は３．２ＭＰａであった。

［実施例１５］
２００℃に加熱して軟化させたスチレン系熱可塑性エラストマー（アロン化成株式会社製、製品番号ＡＲ−５３０１Ｊ）を、金型内に充填し、次いで、固化させることによって成形したこと、および、プラズマ処理において二酸化炭素の代わりに酸素を使用したこと以外は実施例１と同様にして、培養容器１５を得た。得られた培養容器１５の形成材料のゴムＡ硬度は４であり、ヤング率は０．０１ＭＰａであった。

得られた培養容器１〜１５の特性を表１に示す。

［試験例１］
上記実施例で得られた培養容器１〜４の各々に対して、ヒト角膜上皮細胞（ｈＴＣＥｐｉ細胞）を１×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で含む表皮角化細胞無血清培地（ロンザ社製、ＫＢＭ−２）を１．５ｍｌ添加し、５％ＣＯ_２存在下３７℃、湿度９５％インキュベーターで細胞培養を行った。培養開始から２日毎に培地交換を行った。培養開始日を０日目として、培養４日目における各培養容器での培養状態を示す顕微鏡写真を図３に示す。

図３に示されるとおり、培養容器１〜４によれば、細胞外マトリックスをコーティングすることなく、細胞の接着培養を好適に行うことができた。特に、ゴムＡ硬度が３０である培養容器１および培養容器３によれば、他の培養容器に比べて細胞の増殖が顕著に良好であった。

［試験例２］
培養容器５〜８およびポリスチレン製培養容器（ベクトンディッキンソン社製、製品番号「３５３０４３」、プラズマ処理済）を用いたこと以外は試験例１と同様にして、ヒト角膜上皮細胞（ｈＴＣＥｐｉ細胞）の培養を行った。培養開始日を０日目として、培養６日目における各培養容器での培養状態を示す顕微鏡写真、培養１２日目における培養容器５での培養状態を示す顕微鏡写真および培養３０日目における培養容器５での培養状態を示す顕微鏡写真をそれぞれ図４、図５および図６に示す。また、培養１日目、３日目および８日目における培養容器５における細胞数およびポリスチレン製培養容器における細胞数をフックスローゼンタール型血球計算盤を用いて計測した。結果を表２および図７に示す。

図４に示されるとおり、培養容器５〜８によれば、細胞外マトリックスをコーティングすることなく、細胞の接着培養を好適に行うことができた。特に、培養容器５〜７によれば、培養容器８に比べて細胞の増殖が良好であった。また、表２および図７に示されるとおり、培養容器５によれば、ポリスチレン製培養容器よりも有意に良好な細胞増殖が達成された（ｐ＜０．０５）。

図５（ａ）および図５（ｂ）はそれぞれ、レーザー共焦点顕微鏡で撮影した２Ｄ写真および３Ｄ写真である。各写真の矢印で示された箇所において、細胞が重層化していることが確認された。また、図６に示されるとおり、培養容器５のレーザー共焦点顕微鏡による３Ｄ観察においては、細胞が、基底層、中間層および最表層の３層に重層化していることが確認された。角膜組織は通常５層構造を有しており、上層になるほど細胞の面積が大きくなるが、培養容器５で培養された３層構造の培養細胞においても同様の傾向がみられた。

また、試験例１と試験例２とを比較すると、同じ材料で形成された培養容器であっても、酸素プラズマ処理を行った培養容器の方が細胞接着性が有意に良好であった。

［試験例３］
培養容器５およびポリスチレン製培養容器（ベクトンディッキンソン社製、製品番号「３５３０４３」、プラズマ処理済）に対して、マウス線維芽細胞（ＮＩＨ３Ｔ３株）を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で含む１０％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭ培地（シグマ社製）を１．５ｍｌ添加し、５％ＣＯ_２存在下３７℃インキュベーターで細胞培養を行った。培養開始から２日毎に培地交換を行った。培養開始日を０日目として、培養１日目および４日目における培養容器５での培養状態を示す顕微鏡写真および培養４日目におけるポリスチレン製培養容器での培養状態を示す顕微鏡写真を図８に示す。

図８に示されるとおり、培養容器５によれば、線維芽細胞がクラスターを形成しており、細胞が経時的に移動していることがわかる。一方、ポリスチレン製培養容器によれば、線維芽細胞が一様に広がって培養されており、このような移動は確認されなかった。このことから、培養容器５では、線維芽細胞の遊走能が維持されており、生体内に近い状態で培養されていることが示唆される。

［試験例４］
マウス骨芽細胞前駆細胞（ＭＣ３Ｔ３−Ｅ１細胞）をＧＩＢＣＯ社製のＲＰＭＩ１６４０培地（製品番号「ＲＰＭＩ１６４０」）に牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社製）を１０％添加して得られた培養液を用いて細胞培養用フラスコ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、製品番号「Ｔ−５０」）で培養した。セミコンフルエントになった後、０．０５％トリプシン−ＥＤＴＡ溶液（ＧＩＢＣＯ社製）を２ｍＬ添加し、３７℃で約３分間処理した。次いで、フラスコ底面を指ではじき、細胞を剥離させた。剥離された細胞を含む培養液をコニカルチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、１５ｍＬ容）に回収し、培養液を５ｍＬ添加して混和した。次いで、遠心分離（井内盛栄堂社製、製品番号「ＣＮ−１０４０」）して上清を捨て、回収された細胞を新鮮な培養液に懸濁した。血球計算盤による計測によって、細胞懸濁液の濃度を１．０×１０^５個／ｍＬに調整し、次いで、細胞懸濁液１．５ｍＬを培養容器１１〜１４に播種した。各培養容器を細胞培養用ディシュに挿入し、炭酸ガスインキュベータ（三洋電機社製、製品番号「ＭＣＯ−３４５」）で培養した。（３７℃、５％ＣＯ_２）。培養１日目に倒立位相差顕微鏡（ニコン社製、製品番号「ＤＩＡＰＨＯＴ ３００」）で観察し、写真撮影した（観察倍率１００倍）。撮影した写真を図９に示す。

図９に示されるとおり、培養容器１１〜１４によれば、骨芽細胞前駆細胞を好適に培養することができた。特に、ゴムＡ硬度が４５である培養容器１４によれば、他の培養容器に比べて細胞の増殖が顕著に良好であった。

［試験例５］
上記実施例で得られた培養容器５〜７および１５、ならびに、市販のカルチャースライド（ベクトンディッキンソン社製）の各々において、ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ−Ｔ細胞）を培養し、タイトジャンクション発現に対する影響を、関連タンパク質であるＺＯ−１のマウスモノクローナル抗体（ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびＡｌｅｘａ４８８標識抗マウスＩｇＧ抗体（ｉｎ ｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）による免疫染色によって確認した。培養条件は以下のとおりであった：ヒト角膜上皮細胞（ＨＣＥ−Ｔ細胞）を１．０×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度で含む５％牛胎仔血清含有ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＧＩＢＣＯ社製）を１．５ｍｌ添加し、５％ＣＯ２存在下３７℃インキュベーターで細胞培養を行った。培養開始から２日毎に培地交換を行った。
それぞれの培養容器における培養７日目のＺＯ−１発現率を表３に示す。また、タイトジャンクションの発現状態を示すレーザー共焦点顕微鏡写真を図１０に示す。なお、カルチャースライドはコラーゲンコートガラス製である。

表３および図１０から明らかなように、本発明の実施例で得られた培養容器６、７および１５は、市販のカルチャースライドに比べて格段に高いＺＯ−１発現率を示し、顕著なタイトジャンクションが認められた。さらに、培養容器６、７および１５の比較から明らかなように、ゴムＡ硬度およびヤング率が低いほど、ＺＯ−１およびタイトジャンクションの発現が顕著である。以上のように、本発明の実施例の培養容器は、所定の軟質度を有することにより、生体角膜に近似した細胞分化を誘導し得る可能性が示唆される。

［試験例６］
上記実施例で得られた培養容器５、７および１５、ならびに、市販のチャンバーカバー（松浪硝子社製の硬質培養容器）の各々において、試験例１と同様にしてヒト角膜上皮細胞（ｈＴＣＥｐｉ細胞）を培養した。培養１８日目における各培養容器での培養状態を示す位相差顕微鏡写真を図１１に示す。なお、チャンバーカバーにおいては培養１３日目にコンフルエントに達したので、図１１におけるチャンバーカバーの培養状態の写真は１３日目における培養状態を示している。さらに、レーザー共焦点顕微鏡を用いて構築した３次元画像を図１２に示す。

図１１および図１２から明らかなように、本発明の実施例で得られた培養容器７および１５は、半分程度の領域において細胞が２〜３層に重層化しているのが認められた。培養容器５は、一部の領域において細胞の重層化が認められたが、培養容器７および１５に比べて重層化された領域は少なかった。チャンバーカバーは、培養１３日目においてコンフルエントに達し、単層の細胞層が部分的に盛り上がるいわゆるドーム構造（図１１の矢印）が認められたが、重層化には至らなかった。以上のように、本発明の実施例の培養容器は、所定の軟質度を有することにより、従来の細胞培養容器よりも有効な細胞培養手段となり得る可能性が示唆される。

本発明の培養容器は、細胞培養、好ましくは細胞の接着培養に用いられる。

１００ 培養容器
１０ 底部
２０ 側壁部
３０ 貫通孔

Claims (10)

1. 底部と該底部の周縁から垂直に立ち上がる側壁部とを備え、
   該底部の側壁部が設けられている側の表面が改質処理されており、
   該底部が、軟質材料で形成されている、培養容器。
2. 前記軟質材料のゴムＡ硬度が０〜９０である、請求項１に記載の培養容器。
3. 前記軟質材料のヤング率が０より大きく５ＭＰａ以下である、請求項１または２に記載の培養容器。
4. 前記改質処理が、プラズマ処理、コロナ放電処理およびエキシマ処理からなる群から選択される、請求項１から３のいずれかに記載の培養容器。
5. 前記改質処理が、０．２Ｔｏｒｒ〜１．０Ｔｏｒｒの圧力下における酸素、二酸化炭素またはこれらの混合ガスのプラズマ処理である、請求項４に記載の培養容器。
6. 前記プラズマ処理におけるプラズマ出力が１０Ｗ〜６０Ｗであり、処理時間が３０秒〜５分である、請求項５に記載の培養容器。
7. 前記底部を形成する材料が、シリコーンゴムまたは熱可塑性エラストマーである、請求項１から６のいずれかに記載の培養容器。
8. 前記底部を形成する材料が、有機溶媒耐性を有する、請求項１から７のいずれかに記載の培養容器。
9. 前記軟質材料のゴムＡ硬度が０〜５０である、請求項１から８のいずれかに記載の培養容器。
10. 前記軟質材料のヤング率が０より大きく４ＭＰａ以下である、請求項１から９のいずれかに記載の培養容器。