WO2018042532A1 - 細胞培養容器 - Google Patents

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WO2018042532A1
WO2018042532A1 PCT/JP2016/075421 JP2016075421W WO2018042532A1 WO 2018042532 A1 WO2018042532 A1 WO 2018042532A1 JP 2016075421 W JP2016075421 W JP 2016075421W WO 2018042532 A1 WO2018042532 A1 WO 2018042532A1
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WO
WIPO (PCT)
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cell culture
styrene
thin film
resin
culture container
Prior art date
Application number
PCT/JP2016/075421
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English (en)
French (fr)
Inventor
康弘 横山
正樹 今安
Original Assignee
株式会社メニコン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
Application filed by 株式会社メニコン filed Critical 株式会社メニコン
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Priority to PCT/JP2016/075421 priority patent/WO2018042532A1/ja
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M3/00—Tissue, human, animal or plant cell, or virus culture apparatus

Definitions

  • the present invention relates to a cell culture container.
  • live cell imaging technology technology for continuously observing cells alive
  • state-of-the-art microscopes such as imaging cytometers, laser confocal microscopes, two-photon excitation laser microscopes, and ultrasonic microscopes
  • live cell imaging for example, when observing cells adhering to the bottom surface of a cell culture container as they are, an inverted microscope that can be observed from the bottom surface side of the container is preferably used.
  • the thickness of the bottom surface of the cell culture container is preferably thin from the viewpoint of obtaining an image with high resolution.
  • a normal cell culture vessel has a bottom surface with a thickness of about 1 mm.
  • a through-hole is provided on the bottom surface, and a thin glass plate (for example, 170 ⁇ m or less in thickness) is formed so as to cover the through-hole.
  • a cell culture container hereinafter, sometimes referred to as “glass bottom dish” or “film bottom dish” to which a resin film is attached has been proposed (Patent Document 1).
  • the present invention has been made in order to solve the above-described conventional problems, and a main object thereof is a cell culture container suitable for cell observation by an inverted microscope, which is free from the influence of an adhesive on cultured cells. Is to provide.
  • a cell culture comprising a container body having a bottom portion provided with a through hole, a wall portion rising from the bottom portion, and a thin film portion welded to the bottom portion so as to cover the through hole.
  • a container is provided.
  • the bottom part and the thin film part contain the same kind of synthetic resin, and the thickness of the thin film part is 10 ⁇ m or more and 170 ⁇ m or less.
  • the same kind of synthetic resin is a styrenic resin.
  • the thin film portion further includes a styrenic thermoplastic elastomer.
  • the styrenic thermoplastic elastomer comprises a styrene-butadiene-styrene block copolymer.
  • the blending ratio of the styrene resin and the styrene thermoplastic elastomer is 95: 5 to 50:50.
  • the bottom is provided with a projection protruding from the surface so as to surround the through hole, and the thin film portion is welded to the bottom using the projection as a weld. According to another situation of this invention, the manufacturing method of the said cell culture container is provided.
  • the manufacturing method includes forming the thin film portion in a state where the bottom portion provided with the through hole and the protrusion and the wall portion are integrally formed, and the resin film for forming the thin film portion is in contact with the protrusion. Welding a resin film to the bottom.
  • the bottom portion and the thin film portion contain the same type of synthetic resin, welding can be suitably performed even when the thickness of the thin film portion is very thin.
  • a cell culture container suitable for observing cells with an inverted microscope and having no influence of the adhesive on the cultured cells can be obtained.
  • FIG. 2 is a schematic plan view (a) of a container body of the cell culture container shown in FIG. 1 and a schematic cross-sectional view (b) taken along line AA. It is the schematic explaining the manufacturing method of the cell culture container by one embodiment of this invention. It is the image which observed the cell cultured with the cell culture container of the Example or the reference example using the inverted microscope. It is the image which observed the cell cultured with the cell culture container of an Example using the inverted microscope.
  • FIG. 1 is a schematic perspective view showing a cell culture container 10 in an opened state according to one embodiment of the present invention
  • FIG. 2 (a) is a container body of the cell culture container 10 shown in FIG.
  • FIG. 2B is a schematic cross-sectional view taken along line AA.
  • the cell culture container 10 includes a container body 100 and a lid 200.
  • the container body 100 includes a bottom part 110 provided with a through hole 112, a wall part 120 rising from the bottom part 110, and a thin film part 130 welded to the bottom part 110 so as to cover the through hole 112. More specifically, the bottom portion 110 includes protrusions 114a and 114b protruding downward so as to surround the through hole 112 in a ring shape from the surface thereof, and the protrusions 114a and 114b are provided. As a welded portion, the thin film portion 130 is welded to the bottom portion 110.
  • a space defined by the bottom part 110, the wall part 120, and the thin film part 130 is used as the cell culture compartment 150.
  • a region corresponding to the through hole 112 of the thin film portion 130 is a region suitable for observation with an inverted microscope.
  • the container body 100 has an opening at the upper end of the wall 120, and the lid 200 covers the opening of the container body 100, so that the cell culture container 10 is in a closed state.
  • the lid 200 includes a top plate portion 210, a peripheral portion 220 that hangs down from the periphery of the top plate portion 210, and a stacking convex portion 230 that rises from the peripheral edge of the top plate portion 210.
  • the wall part 120 has a thin part 122 and a thick part 124.
  • the thin portion 122 is a portion that overlaps the peripheral portion 220 when the container main body 100 is covered with the lid 200, and is formed with a substantially constant thickness.
  • the thick portion 124 is formed so that its thickness gradually increases upward so that the maximum outer diameter thereof is substantially the same as the outer diameter of the lid 200 (for example, ⁇ 2 mm).
  • the difference between the outer diameter of the lid 200 and the maximum outer diameter of the thick portion 124 is obtained while sufficiently ensuring the difference between the inner diameter of the lid 200 and the outer diameter of the thin portion 122.
  • the thick portion 124 is provided with a notch 126. By providing the notch portion 126, positioning becomes easy.
  • a thread bottom portion 140 that protrudes downward is provided on the periphery of the bottom portion 110.
  • the thin film portion 130 can be suitably protected.
  • the container body is formed in a substantially circular shape in plan view, but the shape of the container body is not particularly limited.
  • the container body may be rectangular in plan view.
  • the inner diameter of the container body can be appropriately set according to the purpose, and can be the same inner diameter (for example, 10 mm to 100 mm) as that of a commonly used cell culture dish.
  • the shape and diameter of the bottom are appropriately set according to the shape of the container body in plan view and the inner diameter.
  • the thickness of the bottom (if the thickness is not constant, the minimum thickness) may be, for example, 0.5 mm to 1.5 mm, preferably 0.6 mm to 1.3 mm. If it is the said thickness range, the intensity
  • the shape of the through hole provided in the bottom is not particularly limited, and may be any shape such as a circle and a rectangle.
  • the diameter of the through hole can be appropriately set according to the thickness of the thin film portion and a desired observation area.
  • the area of the through hole can be about 30% to 70% of the area of the bottom, and the diameter thereof can be, for example, 3 mm to 70 mm, preferably 5 mm to 40 mm.
  • the protruding height (before welding) of the protruding portion protruding from the surface of the bottom portion is, for example, 0.1 mm to 0.4 mm, preferably 0.15 mm to 0.3 mm, more preferably 0.18 mm to 0.22 mm. obtain.
  • the protrusion is melted and crushed as the welding progresses.
  • the protruding height of the protruding portion after welding can be, for example, 0.01 mm to 0.3 mm, preferably 0.05 mm to 0.25 mm. With such a protruding height, strong welding is possible, and since the thin film portion is disposed inward of the end portion of the yarn bottom, it is possible to prevent the thin film portion from being damaged during work. it can.
  • a projection part is normally formed so that it may protrude below a bottom part, you may protrude above. When the protruding portion protrudes upward from the bottom portion, the thin film portion is disposed on the upper surface of the bottom portion.
  • the protrusion may be formed in a taper shape that decreases in diameter in the protruding direction.
  • the taper angle ⁇ is preferably 40 ° to 80 °, more preferably 50 ° to 70 °.
  • the width of the projection after welding (the width of the welded portion) is preferably 5 ⁇ m to 400 ⁇ m. If it is such a width
  • the number of the protrusions is, for example, 1 or more, preferably 2 to 3.
  • welding between the bottom and the thin film portion can be further strengthened.
  • the distance between them can be, for example, 1 mm to 5 mm, preferably 1 mm to 3 mm.
  • the bottom is formed using any suitable forming material.
  • the bottom forming material includes a synthetic resin.
  • a synthetic resin a styrene resin is preferably used.
  • Styrenic resins can be excellent in transparency, hardness, moldability, and the like. Moreover, since it is excellent in solvent resistance, it can be adapted to observation using an oil immersion lens.
  • the styrene resin can be obtained by polymerizing a monomer component containing a styrene monomer.
  • a styrene monomer aromatic vinyl monomers such as styrene, ⁇ -methyl styrene, o-methyl styrene, and p-methyl styrene can be used alone or in combination of two or more. Of these, styrene is preferably used.
  • the content of styrene in the styrenic monomer is preferably 90% by weight or more, more preferably 95% by weight or more, and further preferably 98% by weight to 100% by weight.
  • the content ratio of the styrenic monomer in the monomer component is preferably 80% by weight or more, more preferably 90% by weight or more, still more preferably 95% by weight or more, and even more preferably 98% by weight or more.
  • the monomer component may contain a copolymerization monomer other than the styrene monomer, if necessary.
  • the copolymerization monomer include vinyl cyanide monomers such as acrylonitrile and methacrylonitrile, (meth) acrylate monomers such as methyl (meth) acrylate, ethyl (meth) acrylate, and butyl (meth) acrylate, anhydrous Anhydride group-containing monomers such as maleic acid and itaconic anhydride, dicarboxylic imide group-containing monomers such as maleimide, N-methylmaleimide, N-phenylmaleimide and N-cyclohexylmaleimide, acrylic acid, methacrylic acid, maleic acid and itaconic acid And carboxyl group-containing monomers.
  • Examples of the polymerization method of the styrene resin include known styrene polymerization methods such as a bulk polymerization method, a solution polymerization method, a suspension polymerization method, and an emulsion polymerization method. In terms of quality and productivity, bulk polymerization and solution polymerization are preferable, and continuous polymerization is preferable.
  • the solvent for example, alkylbenzenes such as benzene, toluene, ethylbenzene and xylene, ketones such as acetone and methylethylketone, aliphatic hydrocarbons such as hexane and cyclohexane, and the like can be used.
  • a polymerization initiator and / or a chain transfer agent can be used as needed.
  • the weight average molecular weight (Mw) of the styrenic resin is preferably 10,000 to 1,200,000, more preferably 20,000 to 1,000,000, and further preferably 50,000 to 900,000. . If the weight average molecular weight is less than 10,000, the strength of the resulting synthetic resin film may be insufficient. On the other hand, if the weight average molecular weight exceeds 1,200,000, moldability or transparency may be lowered.
  • the polydispersity (Mw / Mn) of the styrenic resin is preferably 1.0 to 3.0, more preferably 1.0 to 2.5, and still more preferably 1.0 to 2.0. If the polydispersity is within the range, moldability can be improved.
  • the weight average molecular weight (Mw) and number average molecular weight (Mn) of the styrene resin are used in the polymerization reaction temperature, time, type and amount of polymerization initiator, type and amount of chain transfer agent, and polymerization reaction. It can be controlled by the type and amount of the solvent.
  • the weight average molecular weight (Mw) and number average molecular weight (Mn) of the styrenic resin can be calculated as polystyrene-reduced molecular weights, for example, using gel permeation chromatography (GPC) under the following conditions.
  • GPC model Shodex GPC-101 manufactured by Showa Denko KK Column: PLgel 10 ⁇ m MIXED-B manufactured by Polymer Laboratories
  • Mobile phase Tetrahydrofuran Sample concentration: 0.2% by mass
  • Temperature 40 ° C oven, 35 ° C inlet, 35 ° C detector Detector: Differential refractometer
  • the styrenic resin preferably has a flexural modulus of 1,700 MPa to 3,500 MPa.
  • the flexural modulus is preferably 1,800 MPa to 3,400 MPa. If the flexural modulus is in this range, breakage can be prevented.
  • the flexural modulus can be measured according to ISO178.
  • GPPS polystyrene
  • examples of commercially available polystyrenes include GPPS made by PS Japan and Toyo Styrene.
  • the material for forming the bottom part may contain any appropriate additive in addition to the synthetic resin, if necessary. Or the forming material of the said bottom part may contain only the said synthetic resin. By making the additive free, adverse effects on the cells due to the additive can be avoided.
  • the bottom part is produced by any appropriate molding method.
  • injection molding is preferably used.
  • the shape of the thin film portion is not particularly limited as long as the through hole is liquid-tightly covered.
  • the diameter of the thin film portion is set to be larger than the diameter of the through hole and smaller than the diameter of the bottom portion from the viewpoint of securing the welding allowance to the bottom portion.
  • the diameter of the thin film portion is about 110% to 200% of the diameter of the through hole, and can be set to be, for example, about 5 mm to 20 mm larger than the diameter of the through hole.
  • the thickness of the thin film portion is 170 ⁇ m or less, for example, 150 ⁇ m or less, for example, 120 ⁇ m or less, for example, 100 ⁇ m or less, or for example, 80 ⁇ m or less.
  • the thickness of the thin film portion is 10 ⁇ m or more, for example, 20 ⁇ m or more, or for example, 30 ⁇ m or more. If it is the said thickness range, a high magnification microscope observation can be performed suitably, ensuring the intensity
  • the thickness of the thin film portion is desirably about 50 ⁇ m from the viewpoint of ultrasonic conductivity.
  • the thin film portion is substantially constituted by a synthetic resin film welded to the bottom portion.
  • the synthetic resin film includes the same kind of synthetic resin as the synthetic resin contained in the bottom portion. Since the bottom part and the synthetic resin film contain the same kind of resin, the welding strength is improved, so that the synthetic resin film (thin film part) can be firmly bonded to the bottom part. Moreover, since it can weld with comparatively small energy, even if it is a thin synthetic resin film
  • the same kind of synthetic resin means not only the case where the resins are exactly the same, but also the case where the resins have a basic skeleton common to each other.
  • a resin (styrene resin) obtained by polymerizing a monomer component containing a predetermined amount or more (for example, 50% by weight or more) of a styrene monomer has a styrene monomer type, a composition of the monomer component, a molecular weight, and the like. Even if they are different, they are included in the concept of the same kind of resin.
  • the synthetic resin film and the bottom include a styrene resin as the same kind of synthetic resin.
  • the synthetic resin film preferably includes a styrene resin together with the bottom, and more preferably includes a blend copolymer of the styrene resin and a styrene thermoplastic elastomer.
  • a blend copolymer of a styrene resin and a styrene thermoplastic elastomer toughness can be imparted to the synthetic resin film.
  • the thickness is 170 ⁇ m or less, a synthetic resin film excellent in cell adhesion, transparency, hardness, impact resistance, moldability and the like can be obtained.
  • the styrenic resin contained in the synthetic resin film and the styrenic resin contained in the upper base are preferably resins obtained by polymerizing monomer components containing 80% by weight or more of a styrenic monomer, more preferably the same styrenic monomer Is a resin obtained by polymerizing a monomer component containing 50% by weight or more, more preferably a resin obtained by polymerizing a monomer component containing 80% by weight or more of the same styrenic monomer, and even more preferably of the same composition It is a resin obtained by polymerizing monomer components.
  • styrenic thermoplastic elastomer examples include styrene-butadiene block copolymer (SBR), styrene-butadiene-styrene block copolymer (SBS), hydrogenated styrene-butadiene-styrene block copolymer (SEBS), and styrene- Examples include isoprene block-styrene block copolymer (SIS) and hydrogenated styrene-isoprene block-styrene block copolymer (SEPS). These may be used alone or in combination of two or more.
  • SBR styrene-butadiene block copolymer
  • SBS styrene-butadiene-styrene block copolymer
  • SEBS hydrogenated styrene-butadiene-styrene block copolymer
  • SEPS isoprene block-styrene block
  • SBS can be preferably used.
  • the styrene thermoplastic elastomer is distinguished from the styrene resin in that it has rubber elasticity (more specifically, a diene unit).
  • the mass ratio of styrene to butadiene (styrene / butadiene) in the SBS is preferably 95/5 to 5/95, more preferably 90/10 to 10/90.
  • the melt flow rate of the SBS (ISO 1133, MFR: 200 ° C., load 5.0 kg) is, for example, 0 to 25 g / 10 minutes, and preferably 2 to 20 g / 10 minutes.
  • a commercially available SBS can be used as the SBS.
  • SBS examples include Toughprene (registered trademark) series, Asaflex (registered trademark) series and Asaprene (registered trademark) series manufactured by Asahi Kasei Chemicals Corporation.
  • the blending ratio of the styrene resin to the styrene thermoplastic elastomer is preferably 95: 5 to 50:50, more preferably 95: 5 to 80:20, more preferably 95: 5 to 90:10.
  • the content ratio of the synthetic resin in the synthetic resin film (when the blend copolymer is included, the total content ratio of the styrene resin and the styrene thermoplastic elastomer) is, for example, 90% by weight or more, preferably 95% by weight to 100% by weight. %.
  • the synthetic resin film may contain any appropriate additive as necessary.
  • the synthetic resin film may be made of only the synthetic resin. By making the additive free, adverse effects on the cells due to the additive can be avoided.
  • the synthetic resin film can be manufactured by any appropriate manufacturing method. From the viewpoint of obtaining a synthetic resin film having a small thickness and excellent uniformity, a calendar molding method or an inflation molding method is preferably used.
  • the surface of the thin film part is subjected to surface modification treatment as necessary.
  • the modification treatment effects such as optimization of cell adhesion and stratification of cells can be obtained.
  • the water contact angle of the surface after the modification treatment may be 60 ° to 100 °, for example.
  • the modification treatment include plasma treatment (for example, reduced pressure plasma treatment, atmospheric pressure plasma treatment), corona discharge treatment, and excimer treatment.
  • Plasma treatment is preferred.
  • the plasma treatment is performed using, for example, plasma of oxygen, hydrogen, nitrogen, air, argon, helium, ammonia, carbon monoxide, carbon dioxide, methane, ethane, propane, or a mixed gas thereof. Among these, it is preferable to use plasma of oxygen, carbon dioxide, or a mixed gas thereof.
  • the pressure during the plasma treatment is usually 0.2 Torr to 1.0 Torr.
  • a vacuum chamber equipped with an oscillator of high frequency, low frequency or the like. Of these, high-frequency processing is preferable, and those with 13.56 MHz are usually used.
  • the output is preferably 10W to 60W.
  • the treatment time is preferably 30 seconds to 5 minutes.
  • the thin film portion preferably has high transparency.
  • the haze of the thin film portion is preferably 3 or less, more preferably 2 or less.
  • the haze can be measured according to JIS K 7136, ISO 14782, ISO 5725-1, 2, 3.
  • the height of the wall portion (height from the upper surface of the bottom portion) can be, for example, 5 mm to 25 mm.
  • arbitrary appropriate thickness can be employ
  • the thickness of the thin portion can be 0.5 mm to 1.5 mm. If it is the said thickness range, the intensity
  • the thickness of the thick part can be appropriately set according to the outer diameter of the lid.
  • the thickness of the yarn bottom may be 0.5 mm to 1.5 mm. Further, the height of the yarn bottom (height from the bottom surface of the bottom) may be, for example, 0.3 mm to 3 mm.
  • the wall portion and the yarn bottom portion are preferably integrally formed with the bottom portion using the same forming material as that of the bottom portion.
  • the wall portion and the yarn bottom portion can be integrally formed with the bottom portion using a forming material different from the forming material of the bottom portion.
  • integral molding means that the whole is molded in a mold and injection molded as one molded product.
  • the injection molding may be insert molding or two-color molding.
  • the shape and diameter of the top plate portion of the lid are appropriately set according to the shape of the container body in plan view and the outer diameter.
  • the height of the peripheral edge can be, for example, 3 mm to 20 mm. Further, the height of the stacking convex portion may be, for example, 0.3 mm to 2 mm.
  • the same description as that for the bottom portion forming material can be applied.
  • These are preferably integrally molded using the same forming material as the bottom forming material.
  • they can be integrally molded (typically insert molding or two-color molding) using two or more different forming materials.
  • a cell culture container according to one embodiment of the present invention may be a so-called “multi-well” type cell culture container including a plurality of cell culture compartments defined by a bottom part, a wall part, and a thin film part.
  • the number of wells can be, for example, 4 wells, 6 wells, 9 wells, 12 wells, 24 wells, 48 wells, 96 wells, and 384 wells.
  • the cell culture container of the present invention can be produced by any appropriate method.
  • the method for producing a cell culture container of the present invention includes integrally forming the bottom portion provided with the through hole and the protrusion and the wall, and forming the resin film for forming a thin film portion into the protrusion. Welding the resin film for forming a thin film part to the bottom part in a state of being in contact with the part.
  • ultrasonic welding for applying ultrasonic waves or thermal welding for applying heat is preferably mentioned. From the viewpoint of firmly welding while preventing unintended thermal denaturation of the resin film for forming a thin film portion, ultrasonic welding is more preferable.
  • FIG. 3 is a schematic diagram for explaining an example of the method for producing the cell culture container of the present invention using ultrasonic welding.
  • a bottom 110 provided with a through hole 112 and projections 114a and 114b and a wall 120 rising from the periphery of the bottom 110 are made of gold having a correspondingly shaped cavity. It is integrally molded by injection molding using a mold. Alternatively, a separately prepared member (bottom part or wall part) is placed in a mold, and a molding material for another member is injected into the mold and insert molding is performed, thereby integrally molding the bottom part and the wall part. May be.
  • FIG. 3A a bottom 110 provided with a through hole 112 and projections 114a and 114b and a wall 120 rising from the periphery of the bottom 110 are made of gold having a correspondingly shaped cavity. It is integrally molded by injection molding using a mold. Alternatively, a separately prepared member (bottom part or wall part) is placed in a mold, and a
  • the synthetic resin film 130 ′ for forming the thin film portion is placed on the work table 400, and the protrusions 114a and 114b are in contact with the synthetic resin film 130 ′.
  • the obtained molded product is placed.
  • an ultrasonic oscillating horn 300 that is a part of an ultrasonic welder is placed on the bottom 110 to pressurize and oscillate ultrasonic waves.
  • the protrusions 114a and 114b are melted and welded to the synthetic resin film 130 ', whereby the thin film portion 130 is formed.
  • the ultrasonic welding conditions can be appropriately set according to the type and thickness of the synthetic resin film. Ultrasonic welding can be performed, for example, by processing for about 1 second at a power of 1250 W and a frequency of 20 kHz.
  • the heating temperature and heating time for thermal welding can be appropriately set according to the type and thickness of the synthetic resin film for forming the thin film portion.
  • the heating temperature can be, for example, 180 ° C. to 240 ° C., preferably 190 ° C. to 230 ° C.
  • the heating time can be, for example, 0.1 seconds to 3 seconds.
  • Example 1 A cell culture vessel as shown in FIGS. 1 and 2 was obtained by the production method shown in FIGS. 3 (a) to 3 (c). Specifically, a bottom portion (inner diameter) provided with a through hole (diameter: about 20 mm) and two downward conical protrusions (height: about 0.2 mm, taper angle 60 ° in cross-sectional shape) by injection molding. : About 35 mm, thickness: about 1.2 mm) and a wall part rising from the periphery of the bottom (height: about 10 mm, thickness of the thin part: about 1.5 mm, maximum thickness of the thick part: about 3.5 mm) The yarn bottom (height: about 0.5 mm) was integrally molded.
  • GPPS manufactured by PS Japan, model number “679”
  • a blend copolymer of GPPS manufactured by Toyo Styrene Co., Ltd., model number “HRM14”
  • SBS manufactured by Asahi Kasei Chemicals Co., Ltd., product name “Asaflex 810”
  • the blending ratio of resin in the blend copolymer was 10: 1.
  • the obtained resin film was cut out into a circle (diameter: about 30 mm), placed on a work table, and the integrally molded product was stacked thereon. At this time, it arrange
  • ultrasonic welding (output: 1250 W, frequency: 20 kHz, time: 1 second) was performed by bringing an ultrasonic oscillating horn of an ultrasonic welder (manufactured by Branson, model number “2000Xdt”) into contact with the upper surface of the bottom.
  • the container main body which has the thin film part welded to the bottom part so that a through-hole might be covered.
  • the lid body was integrally molded by injection molding using the same forming material as that for the bottom and the like. Thereby, the cell culture container which consists of a container main body and a cover body was obtained.
  • Example 2 A cell culture vessel was obtained in the same manner as in Example 1 except that a blend copolymer of GPPS and SBS was formed into a 170 ⁇ m thick resin film and the resin film was welded to the bottom.
  • Cell culture was performed using the cell culture containers of the above Examples and Reference Examples. Specifically, mouse myoblasts (C2C12 cells) were suspended in a cell culture medium for proliferation (DMEM + 10% FBS) so as to be about 1.0 ⁇ 10 5 cells / mL. The obtained suspension was seeded in each culture vessel and cultured for 1 to 3 days in a carbon dioxide incubator (temperature: 37 ⁇ 1 ° C., CO 2 concentration: 5 ⁇ 0.1%). After confirming that the cells were semi-confluent by microscopic observation, the culture solution was replaced with a cell culture solution for differentiation (DMEM + 2% HS).
  • DMEM + 2% HS cell culture solution for differentiation
  • the cells were further cultured for 5 to 7 days while changing the cell culture medium for differentiation once every 2-3 days. Then, the culture solution was removed, the cultured cells were washed with 1.0 mL of PBS, and 4.0% formaldehyde was added with a Pasteur pipette. After leaving at room temperature for 10 minutes, the solution was gently removed. The cultured cells were washed again with 1.0 mL of PBS, then DAPI was added and nuclear staining was performed at room temperature for 10 minutes. The treated cells were observed from the bottom side of the culture vessel using an inverted laser confocal microscope. A UV laser was used for DAPI fluorescence observation by nuclear staining, and a differential interference mode (DIC) was used for cell outline observation. The magnification of the objective lens used was 10 times (dry), 20 times (dry), 40 times (dry), 63 times (oil immersion) or 100 times (oil immersion).
  • DIC differential interference mode
  • Table 1 shows the evaluation results of cell adhesion based on the observation results and the observation images.
  • the cell culture containers of Examples 1 and 2 showed good cell adhesiveness, and even when a 40 ⁇ objective lens was used, A high image was obtained.
  • the cell culture container of Example 1 obtained a high-resolution image even when a high-magnification objective lens of 63 times and 100 times was used.
  • the cell culture container of Reference Example 1 when an objective lens having a magnification of 20 times or more was used, an image having sufficient resolution could not be obtained.
  • the cell culture container of Reference Example 2 has insufficient cell adhesiveness, and when an objective lens having a magnification of 63 times or more was used, an image having sufficient resolution could not be obtained.
  • the cell culture container of the present invention can be suitably used in cell culture.

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Abstract

本発明は、倒立顕微鏡による細胞観察に適した細胞培養容器であって、培養細胞への接着剤の影響がない細胞培養容器を提供する。本発明の細胞培養容器１０は、貫通孔１１２が設けられた底部１１０と、底部１１０から立ち上がる壁部１２０と、貫通孔１１２を覆うように底部１１０に溶着された薄膜部１３０と、を有する容器本体１００を含む。底部１１０および薄膜部１３０が、同種の合成樹脂を含み、薄膜部１３０の厚みが、１０μｍ以上１７０μｍ以下である。

Description

細胞培養容器
　本発明は、細胞培養容器に関する。
　近年、イメージングサイトメーター、レーザー共焦点顕微鏡、二光子励起レーザー顕微鏡、超音波顕微鏡等の最新型顕微鏡を用いたライブセルイメージング技術（細胞を生きたまま連続して観察する技術）が普及してきている。ライブセルイメージングにおいて、例えば、細胞培養容器の底面に付着している細胞をそのまま観察する場合、容器の底面側から観察できる倒立顕微鏡が好ましく用いられる。倒立顕微鏡を用いた観察においては、解像度が高い画像を得る観点から、細胞培養容器の底面の厚みが薄いことが好ましい。
　通常の細胞培養容器は、１ｍｍ程度の厚みの底面を有するが、高解像度の観察を目的として、底面に貫通孔を設け、該貫通孔を覆うように薄い（例えば、厚み１７０μｍ以下）ガラス板または樹脂フィルムを取り付けた細胞培養容器（以下、それぞれを「ガラスボトムディッシュ」または「フィルムボトムディッシュ」と称する場合がある）が提案されている（特許文献１）。
　上記ガラスボトムディッシュまたはフィルムボトムディッシュによれば、高倍率かつ高解像度の観察が可能である一方で、ガラス板または樹脂フィルムの厚みが薄いことから容器全体を一体成形することが困難である。そのため、ガラス板または樹脂フィルムが接着剤を用いて貼着されており、培養細胞に対する接着剤の影響が懸念される。
実用新案登録第３１３９３５０号
　本発明は上記従来の課題を解決するためになされたものであり、その主たる目的は、倒立顕微鏡による細胞観察に適した細胞培養容器であって、培養細胞に対する接着剤の影響がない細胞培養容器を提供することにある。
　すなわち、本発明によれば、貫通孔が設けられた底部と、該底部から立ち上がる壁部と、該貫通孔を覆うように該底部に溶着された薄膜部と、を有する容器本体を含む細胞培養容器が提供される。該細胞培養容器においては、該底部および該薄膜部が、同種の合成樹脂を含み、該薄膜部の厚みが、１０μｍ以上１７０μｍ以下である。
　１つの実施形態において、上記同種の合成樹脂が、スチレン系樹脂である。
　１つの実施形態において、上記薄膜部が、スチレン系熱可塑性エラストマーをさらに含む。
　１つの実施形態において、上記スチレン系熱可塑性エラストマーが、スチレン－ブタジエン－スチレンブロック共重合体を含む。
　１つの実施形態において、上記スチレン系樹脂と上記スチレン系熱可塑性エラストマーとの配合比（スチレン系樹脂：スチレン系熱可塑性エラストマー）が９５：５～５０：５０である。
　１つの実施形態において、上記底部が、その表面から上記貫通孔を囲むように突出する突起部を備え、上記薄膜部が、該突起部を溶着部として上記底部に溶着されている。
　本発明の別の局面によれば、上記細胞培養容器の製造方法が提供される。該製造方法は、上記貫通孔および突起部が設けられた底部と上記壁部とを一体成形すること、および、薄膜部形成用樹脂膜を上記突起部に接触させた状態で、該薄膜部形成用樹脂膜を上記底部に溶着すること、を含む。
　本発明によれば、底部と薄膜部とが同種の合成樹脂を含むことから、薄膜部の厚みが非常に薄い場合であっても好適に溶着が行なわれ得る。その結果、倒立顕微鏡による細胞観察に適した細胞培養容器であって、培養細胞への接着剤の影響がない細胞培養容器が得られる。
本発明の１つの実施形態による細胞培養容器を開蓋状態で示す概略斜視図である。 図１に示す細胞培養容器の容器本体の概略平面図（ａ）と線Ａ－Ａに沿った概略断面図（ｂ）である。 本発明の１つの実施形態による細胞培養容器の製造方法を説明する概略図である。 実施例または参考例の細胞培養容器で培養された細胞を、倒立型顕微鏡を用いて観察した画像である。 実施例の細胞培養容器で培養された細胞を、倒立型顕微鏡を用いて観察した画像である。
Ａ．細胞培養容器
　図１は、本発明の１つの実施形態における細胞培養容器１０を開蓋状態で示す概略斜視図であり、図２（ａ）は、図１に示される細胞培養容器１０の容器本体１００の概略平面図であり、図２（ｂ）は、その線Ａ－Ａに沿った概略断面図である。図１に示されるとおり、細胞培養容器１０は、容器本体１００と蓋体２００とからなる。
　容器本体１００は、貫通孔１１２が設けられた底部１１０と、底部１１０から立ち上がる壁部１２０と、貫通孔１１２を覆うように底部１１０に溶着された薄膜部１３０と、を有する。より具体的には、底部１１０は、その表面から環状に、より具体的には貫通孔１１２を囲むように、下方に突出する突起部１１４ａおよび１１４ｂを備えており、該突起部１１４ａおよび１１４ｂを溶着部として、薄膜部１３０が底部１１０に溶着されている。
　容器本体１００においては、底部１１０と、壁部１２０と、薄膜部１３０によって規定される空間が細胞培養区画１５０とされる。薄膜部１３０の貫通孔１１２に対応する領域が、倒立型顕微鏡による観察に好適な領域である。
　容器本体１００は、壁部１２０の上端が開口とされており、蓋体２００が、容器本体１００の該開口を覆うことにより、細胞培養容器１０は閉蓋状態となる。蓋体２００は、天板部２１０と、天板部２１０の周縁から垂れ下がる周縁部２２０と、天板部２１０の周縁から立ち上がるスタッキング用凸部２３０とを有する。
　壁部１２０は、薄肉部１２２と、厚肉部１２４とを有する。薄肉部１２２は、容器本体１００が蓋体２００で覆われた際に周縁部２２０と重なる部分であり、略一定の厚みで形成されている。厚肉部１２４はその最大外径が、蓋体２００の外径と略同径（例えば、±２ｍｍ）となるように上方に向かって徐々に厚みが大きくなるように形成されている。このような構成とすることにより、蓋体２００の内径と薄肉部１２２の外径との差を十分に確保しつつ、蓋体２００の外径と厚肉部１２４の最大外径との差を小さくできる。その結果、細胞培養容器を開閉する際の操作性と閉蓋状態の細胞培養容器を移動させる際の操作性とを両立し得る。また、厚肉部１２４には、切欠け部１２６が設けられている。切欠け部１２６を設けることにより、位置決めが容易となる。
　底部１１０の周縁には、下方に突出する糸底部１４０が設けられている。糸底部１４０を設けることにより、薄膜部１３０が好適に保護され得る。
　上記図示例において、容器本体は、平面視略円形に形成されているが、容器本体の形状は、特に限定されない。例えば、容器本体は、平面視矩形であってもよい。容器本体の内径は、目的に応じて適切に設定され得、一般に用いられている細胞培養皿と同様の内径（例えば、１０ｍｍ～１００ｍｍ）とすることができる。
　上記底部の形状および径は、上記容器本体の平面視形状および内径に応じて適切に設定される。
　上記底部の厚み（厚みが一定でない場合は、その最小厚み）は、例えば０．５ｍｍ～１．５ｍｍ、好ましくは０．６ｍｍ～１．３ｍｍであり得る。当該厚み範囲であれば、細胞培養容器の底部としての強度を確保でき、また、溶着が好適に行われ得る。
　上記底部に設けられる貫通孔の形状は、特に制限されず、円形、矩形等の任意の形状であり得る。該貫通孔の径は、薄膜部の厚みや所望の観察面積に応じて適切に設定され得る。貫通孔の面積は、底部の面積の３０％～７０％程度とすることができ、その径は、例えば３ｍｍ～７０ｍｍ、好ましくは５ｍｍ～４０ｍｍであり得る。
　上記底部の表面から突出する突起部の突出高さ（溶着前）は、例えば０．１ｍｍ～０．４ｍｍ、好ましくは０．１５ｍｍ～０．３ｍｍ、より好ましくは０．１８ｍｍ～０．２２ｍｍであり得る。該突起部は、溶着の進行に伴って溶融し、押し潰される。溶着後の突起部の突出高さは、例えば０．０１ｍｍ～０．３ｍｍ、好ましくは０．０５ｍｍ～０．２５ｍｍであり得る。このような突出高さであれば、強固な溶着が可能となり、また、薄膜部が糸底部の末端部よりも内方に配置されることから、作業時に薄膜部が傷つくのを防止することができる。なお、突起部は、通常、底部の下方向に突出するように形成されるが、上方向に突出していてもよい。突起部が底部の上方向に突出する場合、薄膜部は、底部の上面に配置される。
　上記突起部は、突出方向に向かって縮径するテーパー状に形成され得る。テーパー状とすることにより、超音波溶着の際に、超音波を突起部に集中させることができ、結果として、薄膜部の所望でない収縮や変性を防止し得る。テーパー角θは、好ましくは４０°～８０°、より好ましくは５０°～７０°である。
　溶着された後の上記突起部の幅（溶着部の幅）は、好ましくは５μｍ～４００μｍである。このような幅であれば、薄膜部が底部に強固に接合されるので液漏れ等が防止される。
　上記突起部の数は、例えば１以上、好ましくは２～３である。突起部を複数設けることにより、底部と薄膜部との溶着をより強固にすることができる。突起部を複数設ける場合、その間隔は、例えば１ｍｍ～５ｍｍ、好ましくは１ｍｍ～３ｍｍであり得る。
　上記底部は、任意の適切な形成材料を用いて形成される。代表的には、底部の形成材料は、合成樹脂を含む。該合成樹脂としては、好ましくはスチレン系樹脂が用いられる。スチレン系樹脂は、透明性、硬度、成形性等に優れ得る。また、溶剤耐性にも優れるので油浸レンズを用いた観察にも適合し得る。
　上記スチレン系樹脂は、スチレン系モノマーを含むモノマー成分を重合して得ることができる。スチレン系モノマーとしては、スチレン、α－メチルスチレン、ｏ－メチルスチレン、ｐ－メチルスチレン等の芳香族ビニル系モノマーを単独でまたは２種以上組み合わせて用いることができる。なかでも、スチレンが好ましく用いられる。スチレン系モノマー中におけるスチレンの含有割合は、好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、さらに好ましくは９８重量％～１００重量％であり得る。
　上記モノマー成分中における上記スチレン系モノマーの含有割合は、好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、さらに好ましくは９５重量％以上、さらにより好ましくは９８重量％以上であり得る。
　上記モノマー成分は、必要に応じて、上記スチレン系モノマー以外の共重合モノマーを含み得る。該共重合モノマーとしては、アクリロニトリル、メタクリロニトリル等のシアン化ビニルモノマー、（メタ）アクリル酸メチル、（メタ）アクリル酸エチル、（メタ）アクリル酸ブチル等の（メタ）アクリル酸エステルモノマー、無水マレイン酸、無水イタコン酸等の無水物基含有モノマー、マレイミド、Ｎ－メチルマレイミド、Ｎ－フェニルマレイミド、Ｎ－シクロヘキシルマレイミド等のジカルボン酸イミド基含有モノマー、アクリル酸、メタクリル酸、マレイン酸、イタコン酸等のカルボキシル基含有モノマー等が挙げられる。
　上記スチレン系樹脂の重合方法としては、塊状重合法、溶液重合法、懸濁重合法、乳化重合法等公知のスチレン重合方法が挙げられる。品質面や生産性の面では、塊状重合法、溶液重合法が好ましく、連続重合であることが好ましい。溶媒としては、例えばベンゼン、トルエン、エチルベンゼンおよびキシレン等のアルキルベンゼン類やアセトン、メチルエチルケトン等のケトン類、ヘキサン、シクロヘキサン等の脂肪族炭化水素等が使用できる。また、重合時には、必要に応じて、重合開始剤および／または連鎖移動剤を使用することができる。
　上記スチレン系樹脂の重量平均分子量（Ｍｗ）は、好ましくは１０，０００～１，２００，０００、より好ましくは２０，０００～１，０００，０００、さらに好ましくは５０，０００～９００，０００である。重量平均分子量が１０，０００未満であると、得られる合成樹脂膜の強度が不十分となる場合がある。一方、重量平均分子量が１，２００，０００を超えると成形性または透明性が低下する場合がある。
　上記スチレン系樹脂の多分散度（Ｍｗ／Ｍｎ）は、好ましくは１．０～３．０、より好ましくは１．０～２．５、さらに好ましくは１．０～２．０である。多分散度が当該範囲内であれば、成形性が向上し得る。
　上記スチレン系樹脂の重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）は、重合反応の温度、時間、重合開始剤の種類および添加量、連鎖移動剤の種類および添加量、重合反応で使用する溶媒の種類および量等によって制御することができる。
　上記スチレン系樹脂の重量平均分子量（Ｍｗ）および数平均分子量（Ｍｎ）は、例えば、ゲルパーミエイションクロマトグラフィー（ＧＰＣ）を用いて、次の条件で測定し、ポリスチレン換算の分子量として算出され得る。
　　　ＧＰＣ機種：昭和電工株式会社製Ｓｈｏｄｅｘ　ＧＰＣ－１０１
　　　カラム：ポリマーラボラトリーズ社製　ＰＬｇｅｌ　１０μｍ　ＭＩＸＥＤ－Ｂ
　　　移動相：テトラヒドロフラン
　　　試料濃度：０．２質量％
　　　温度：オーブン４０℃、注入口３５℃、検出器３５℃
　　　検出器：示差屈折計
　上記スチレン系樹脂は、曲げ弾性率が１，７００ＭＰａ～３，５００ＭＰａであることが好ましい。曲げ弾性率は、好ましくは１，８００ＭＰａ～３，４００ＭＰａである。曲げ弾性率が当該範囲であれば、破損が防止され得る。曲げ弾性率は、ＩＳＯ１７８に準拠して測定され得る。
　１つの実施形態において、上記スチレン系樹脂として、市販のポリスチレン（ＧＰＰＳ）を用いることができる。市販のポリスチレンとしては、例えば、ＰＳジャパン社製、東洋スチレン社製等のＧＰＰＳが挙げられる。
　上記底部の形成材料は、必要に応じて、上記合成樹脂に加えて、任意の適切な添加剤を含んでいてもよい。あるいは、上記底部の形成材料は、上記合成樹脂のみを含むものであってもよい。添加剤フリーとすることにより、添加剤による細胞への悪影響を回避し得る。
　上記底部は、任意の適切な成形方法で作製される。該成形方法としては、射出成形が好ましく用いられる。
　上記薄膜部の形状は、貫通孔を液密に覆う限りにおいて、特に限定されない。薄膜部の径は、底部への溶着代を確保する観点から、貫通孔の径を超え底部の径未満に設定される。薄膜部の径は、貫通孔の径の１１０％～２００％程度であり、例えば、貫通孔の径よりも５ｍｍ～２０ｍｍ程度大きく設定され得る。
　上記薄膜部の厚みは、１７０μｍ以下であり、例えば１５０μｍ以下、また例えば１２０μｍ以下、また例えば１００μｍ以下、また例えば８０μｍ以下であり得る。一方、薄膜部の厚みは、１０μｍ以上であり、例えば２０μｍ以上、また例えば３０μｍ以上であり得る。当該厚み範囲であれば、細胞培養容器の底部としての強度を確保しつつ、高倍率の顕微鏡観察を好適に行うことができる。また、超音波顕微鏡を用いる場合には、超音波の伝導性の観点から、薄膜部の厚みは、５０μｍ程度であることが望ましい。なお、このように厚みの薄い薄膜部を備える細胞培養容器を、接着剤を用いることなく、実用可能な形態で提供することは、本発明の特徴の１つである。
　上記薄膜部は、実質的には、上記底部に溶着された合成樹脂膜によって構成されている。該合成樹脂膜は、上記底部に含まれる合成樹脂と同種の合成樹脂を含む。底部と合成樹脂膜とが同種の樹脂を含むことにより、溶着強度が向上するので、合成樹脂膜（薄膜部）を底部に強固に接合することができる。また、比較的小さいエネルギーで溶着することができるので、薄い合成樹脂膜であっても意図しない収縮や変性を防止することができる。ここで、「同種の合成樹脂」とは、樹脂同士が全く同一である場合だけでなく、樹脂同士が互いに共通する基本骨格を有する場合を含む意味である。したがって、例えば、スチレン系モノマーを所定量以上（例えば、５０重量％以上）含むモノマー成分を重合して得られる樹脂（スチレン系樹脂）は、スチレン系モノマーの種類やモノマー成分の組成、分子量等が異なる場合であっても同種の樹脂の概念に含まれる。
　好ましくは、上記合成樹脂膜および上記底部は、上記同種の合成樹脂として、スチレン系樹脂を含む。より具体的には、合成樹脂膜は、好ましくは上記底部とともにスチレン系樹脂を含み、より好ましくは該スチレン系樹脂とスチレン系熱可塑性エラストマーとのブレンドコポリマーを含む。スチレン系樹脂とスチレン系熱可塑性エラストマーとのブレンドコポリマーを含むことにより、合成樹脂膜に靱性を付与し得る。その結果、１７０μｍ以下の厚みであっても、細胞接着性、透明性、硬度、耐衝撃性、成形性等に優れる合成樹脂膜が得られ得る。
　上記合成樹脂膜に含まれるスチレン系樹脂については、上記底部に含まれるスチレン系樹脂と同様の説明が適用され得る。合成樹脂膜に含まれるスチレン系樹脂および上底部に含まれるスチレン系樹脂は、好ましくはスチレン系モノマーを８０重量％以上含むモノマー成分を重合して得られる樹脂であり、より好ましくは同じスチレン系モノマーを５０重量％以上含むモノマー成分を重合して得られる樹脂であり、さらに好ましくは同じスチレン系モノマーを８０重量％以上含むモノマー成分を重合して得られる樹脂であり、さらにより好ましくは同じ組成のモノマー成分を重合して得られる樹脂である。
　上記スチレン系熱可塑性エラストマーとしては、スチレン－ブタジエンブロック共重合体（ＳＢＲ）、スチレンーブタジエン－スチレンブロック共重合体（ＳＢＳ）、水素添加スチレン－ブタジエン－スチレンブロック共重合体（ＳＥＢＳ）、スチレン－イソプレンブロック－スチレンブロック共重合体（ＳＩＳ）、水素添加スチレン－イソプレンブロック－スチレンブロック共重合体（ＳＥＰＳ）等が挙げられる。これらは、単独でまたは２種以上組み合わせて用いられ得る。なかでも、スチレン系樹脂との相溶性に優れ、かつ、適度な靱性を付与し得ることから、ＳＢＳが好ましく用いられ得る。なお、スチレン系熱可塑性エラストマーは、ゴム弾性を有する点（より具体的には、ジエン単位を有している点）で上記スチレン系樹脂と区別される。
　上記ＳＢＳにおけるスチレンとブタジエンとの質量比（スチレン／ブタジエン）は、好ましくは９５／５～５／９５、より好ましくは９０／１０～１０／９０である。また、上記ＳＢＳのメルトフローレート（ＩＳＯ　１１３３、ＭＦＲ：２００℃、荷重５．０ｋｇ）は、例えば０～２５ｇ／１０分であり、好ましくは２～２０ｇ／１０分であり得る。
　１つの実施形態において、上記ＳＢＳとして、市販のＳＢＳを用いることができる。市販のＳＢＳとしては、旭化成ケミカルズ社製のタフプレン（登録商標）シリーズ、アサフレックス（登録商標）シリーズおよびアサプレン（登録商標）シリーズが挙げられる。
　上記スチレン系樹脂とスチレン系熱可塑性エラストマーとの配合比（スチレン系樹脂：スチレン系熱可塑性エラストマー（固形分重量比））は、好ましくは９５：５～５０：５０、より好ましくは９５：５～８０：２０、さらに好ましくは９５：５～９０：１０である。このような配合比とすることにより、細胞培養容器に所望される特性（透明性、細胞接着性、成形性、強度、耐衝撃性等）を充足する合成樹脂膜が得られ得る。
　上記合成樹脂膜における合成樹脂の含有割合（ブレンドコポリマーを含む場合は、スチレン系樹脂とスチレン系熱可塑性エラストマーとの合計の含有割合）は、例えば９０重量％以上、好ましくは９５重量％～１００重量％であり得る。
　上記合成樹脂膜は、必要に応じて、任意の適切な添加剤を含んでいてもよい。あるいは、上記合成樹脂膜は、上記合成樹脂のみからなるものであってもよい。添加剤フリーとすることにより、添加剤による細胞への悪影響を回避し得る。
　上記合成樹脂膜は、任意の適切な製造方法によって製造され得る。厚みが小さく、均一性に優れた合成樹脂膜を得る観点から、カレンダー成形法またはインフレーション成形法が好ましく用いられる。
　上記薄膜部の細胞培養区画側表面には、必要に応じて、表面改質処理が施される。改質処理により、細胞接着性が最適化される、細胞が重層化する等の効果が得られ得る。改質処理後の表面の水接触角は、例えば６０°～１００°であり得る。
　上記改質処理の具体例としては、プラズマ処理（例えば、減圧プラズマ処理、大気圧プラズマ処理）、コロナ放電処理、エキシマ処理が挙げられる。好ましくはプラズマ処理である。プラズマ処理は、例えば、酸素、水素、窒素、大気、アルゴン、ヘリウム、アンモニア、一酸化炭素、二酸化炭素、メタン、エタン、プロパンまたはこれらの混合ガスのプラズマを用いて行われる。なかでも、酸素、二酸化炭素またはこれらの混合ガスのプラズマを用いることが好ましい。プラズマ処理時の圧力は、通常、０．２Ｔｏｒｒ～１．０Ｔｏｒｒである。
　プラズマ処理を施すための装置としては、高周波、低周波等の発振器を備えた真空チャンバーを用いることが好ましい。なかでも、高周波による処理が好ましく、通常１３．５６ＭＨｚのものが用いられる。出力は、好ましくは１０Ｗ～６０Ｗである。処理時間は、好ましくは３０秒～５分である。
　上記薄膜部は、透明性が高いことが好ましい。薄膜部のヘイズは、好ましくは３以下、より好ましくは２以下である。ヘイズは、ＪＩＳ　Ｋ　７１３６、ＩＳＯ　１４７８２、ＩＳＯ　５７２５－１，２，３に準拠して測定され得る。
　上記壁部の高さ（底部の上面からの高さ）は、例えば５ｍｍ～２５ｍｍであり得る。また、壁部の厚みとしては、任意の適切な厚みが採用され得る。例えば、薄肉部の厚みは、０．５ｍｍ～１．５ｍｍであり得る。当該厚み範囲であれば、細胞培養容器の壁部としての強度を確保でき、また、成形が容易である。厚肉部の厚みは、蓋体の外径に応じて適切に設定され得る。
　上記糸底部の厚みは、０．５ｍｍ～１．５ｍｍであり得る。また、上記糸底部の高さは（底部の下面からの高さ）、例えば０．３ｍｍ～３ｍｍであり得る。
　上記壁部および糸底部の形成材料としては、底部の形成材料と同様の説明が適用できる。壁部および糸底部は、好ましくは底部の形成材料と同じ形成材料を用いて、底部と一体成形される。あるいは、壁部および糸底部は、底部の形成材料と異なる形成材料を用いて、底部と一体成形され得る。ここで一体成形とは、金型内で全体が成形され一つの成形品として射出成形されることを意味する。射出成形は、インサート成形または二色成形であってもよい。
　上記蓋体の天板部の形状および径は、上記容器本体の平面視形状および外径に応じて適切に設定される。周縁部の高さは、例えば３ｍｍ～２０ｍｍであり得る。また、スタッキング用凸部の高さは、例えば０．３ｍｍ～２ｍｍであり得る。
　上記天板部、周縁部およびスタッキング用凸部の形成材料としては、底部の形成材料と同様の説明が適用できる。これらは、好ましくは、底部の形成材料と同じ形成材料を用いて、一体成形される。あるいは、これらは、二種以上の異なる形成材料を用いて、一体成形（代表的には、インサート成形または二色成形）され得る。
　以上、本発明の１つの実施形態による細胞培養容器を説明してきたが、本発明は該実施形態に限定されない。例えば、本発明の別の実施形態による細胞培養容器は、底部と、壁部と、薄膜部によって規定される細胞培養区画を複数備える、いわゆる「マルチウェル」型の細胞培養容器であり得る。この場合、ウェルの数は、例えば、４ウェル、６ウェル、９ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェル、３８４ウェルとすることができる。
Ｂ．細胞培養容器の製造方法
　本発明の細胞培養容器は、任意の適切な方法によって製造され得る。１つの実施形態において、本発明の細胞培養容器の製造方法は、上記貫通孔および突起部が設けられた底部と上記壁部とを一体成形すること、および、薄膜部形成用樹脂膜を上記突起部に接触させた状態で、該薄膜部形成用樹脂膜を底部に溶着すること、を含む。
　上記溶着方法としては、例えば超音波を印加する超音波溶着または熱を印加する熱溶着が好ましく挙げられる。薄膜部形成用樹脂膜の意図しない熱変性を防止しつつ強固に溶着する観点からは、超音波溶着がより好ましい。
　図３は、超音波溶着を用いた本発明の細胞培養容器の製造方法の一例を説明する概略図である。まず、図３（ａ）に示すように、貫通孔１１２および突起部１１４ａ、１１４ｂが設けられた底部１１０と、底部１１０の周縁から立ち上がる壁部１２０とを、対応する形状の空洞部を有する金型を用いて射出成形することにより、一体成形する。あるいは、別途に作製した部材（底部または壁部）を金型内に配置し、該金型に他の部材の形成材料を注入してインサート成形することにより、底部と壁部とを一体成形してもよい。次いで、図３（ｂ）に示すように、作業台４００上に薄膜部形成用合成樹脂膜１３０’を載置し、その上に、突起部１１４ａ、１１４ｂが合成樹脂膜１３０’に接するように得られた成形品を載置する。次いで、図３（ｃ）に示すように、超音波溶着機の一部である超音波発振ホーン３００を底部１１０上に重ね、加圧および超音波の発振を行う。加圧状態で超音波を印加することにより、突起部１１４ａ、１１４ｂが溶融して、合成樹脂膜１３０’と溶着し、これにより、薄膜部１３０が形成される。
　上記超音波溶着の条件は、合成樹脂膜の種類、膜厚等に応じて適切に設定され得る。超音波溶着は、例えば、１２５０Ｗの出力および２０ｋＨｚの周波数で約１秒間処理することにより行われ得る。
　熱溶着を用いる場合、熱を印加する治具先端を突起部の形状に対応する形状（図示例では、環状）にすることにより、意図しない熱変性を防止することができる。熱溶着の加熱温度および加熱時間は、薄膜部形成用合成樹脂膜の種類、厚み等に応じて適切に設定され得る。加熱温度は、例えば１８０℃～２４０℃、好ましくは１９０℃～２３０℃であり得る。加熱時間は、例えば０．１秒～３秒であり得る。
　以下、実施例によって本発明を具体的に説明するが、本発明はこれら実施例によって限定されるものではない。
［実施例１］
　図３（ａ）～（ｃ）に示す製造方法によって、図１および２に示すような細胞培養容器を得た。
　具体的には、射出成形により、貫通孔（径：約２０ｍｍ）および２つの下向き円錐状の突起部（高さ：約０．２ｍｍ、断面形状のテーパー角６０°）が設けられた底部（内径：約３５ｍｍ、厚み：約１．２ｍｍ）と、底部の周縁から立ち上がる壁部（高さ：約１０ｍｍ、薄肉部の厚み：約１．５ｍｍ、厚肉部の最大厚み：約３．５ｍｍ）と、糸底部（高さ：約０．５ｍｍ）を、一体成形した。形成材料としては、ＧＰＰＳ（ＰＳジャパン社製、型番「６７９」）を用いた。
　一方、ＧＰＰＳ（東洋スチレン社製、型番「ＨＲＭ１４」）とＳＢＳ（旭化成ケミカルズ社製、製品名「アサフレックス８１０」）とのブレンドコポリマーをインフレーション成形によって厚み５０μｍの樹脂膜に成形した。該ブレンドコポリマーにおける樹脂の配合比（固形分重量、ＧＰＰＳ：ＳＢＳ）は、１０：１あった。
　得られた樹脂膜を円形（径：約３０ｍｍ）に切り抜き、作業台の上に配置し、その上に上記一体成型品を重ねた。このとき、一体成型品の底部に設けられた環状の突起部が樹脂膜に接触するように配置した。次いで、超音波溶着機（ブランソン社製、型番「２０００Ｘｄｔ」）の超音波発振ホーンを底部の上面に接触させて超音波溶着（出力：１２５０Ｗ、周波数：２０ｋＨｚ、時間：１秒）を行った。これにより、貫通孔を覆うように底部に溶着された薄膜部を有する容器本体を得た。次いで、底部等と同じ形成材料を用いた射出成形により蓋体を一体成形した。これにより、容器本体と蓋体とからなる細胞培養容器を得た。
［実施例２］
　ＧＰＰＳとＳＢＳとのブレンドコポリマーを厚み１７０μｍの樹脂膜に成形し、該樹脂膜を底部に溶着したこと以外は実施例１と同様にして、細胞培養容器を得た。
［参考例１］
　底部に貫通孔が設けられていない通常の細胞培養皿（ＢＤ社製、ポリスチレン製、底部の径：約３５ｍｍ、底部の厚み：約１．０ｍｍ）を用いた。
［参考例２］
　底面に貫通孔を設け、該貫通孔を覆うように該底面にガラス板を接着剤で貼着したガラスボトムディッシュ（エッペンドルフ社製、「Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ　Ｃｅｌｌ　Ｉｍａｇｉｎｇ　Ｄｉｓｈｅｓ」、ガラス板部以外ポリスチレン製、底部の径：約３５ｍｍ、ガラス板の厚み：１７０μｍ）を用いた。
≪細胞培養および顕微鏡観察≫
　上記実施例および参考例の細胞培養容器を用いて、細胞培養を行った。具体的には、マウス筋芽細胞（Ｃ２Ｃ１２細胞）を約１．０×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように増殖用細胞培養液（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）に懸濁した。得られた懸濁液を各培養容器に播種し、炭酸ガスインキュベーター内（温度：３７±１℃、ＣＯ２濃度：５±０．１％）で１～３日培養した。顕微鏡観察により、セミコンフルエントになっていることを確認後、培養液を分化用細胞培養液（ＤＭＥＭ＋２％ＨＳ）に置換した。その後、２～３日に１回分化用細胞培養液を交換しながら、さらに５～７日間培養した。
　次いで、培養液を除去して、培養細胞をＰＢＳ　１．０ｍＬで洗浄し、４．０％ホルムアルデヒドをパスツールピペットで添加した。室温で１０分間放置した後、静かに溶液を除去した。培養細胞をＰＢＳ　１．０ｍＬで再度洗浄し、次いで、ＤＡＰＩを添加して室温で１０分間核染色処理を行った。
　上記処理後の細胞を、倒立型レーザー共焦点顕微鏡を用いて培養容器の底面側から観察した。核染色によるＤＡＰＩの蛍光観察にはＵＶレーザーを用い、細胞の輪郭観察には微分干渉モード（ＤＩＣ）を用いた。用いた対物レンズの倍率は、１０倍（ドライ）、２０倍（ドライ）、４０倍（ドライ）、６３倍（油浸）または１００倍（油浸）であった。
　実施例および参考例の細胞培養容器で培養された細胞の観察画像をそれぞれ、図４および図５に示す。また、観察結果および観察画像に基づく細胞接着性の評価結果を表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　表１、図４および図５に示されるとおり、実施例１および２の細胞培養容器は、良好な細胞接着性を示し、かつ、４０倍の対物レンズを用いた場合であっても、解像度の高い画像が得られた。特に、実施例１の細胞培養容器は、６３倍および１００倍という高倍率の対物レンズを用いた場合であっても、解像度の高い画像が得られた。一方、参考例１の細胞培養容器によれば、２０倍以上の倍率の対物レンズを用いた場合には、十分な解像度を有する画像が得られなかった。また、参考例２の細胞培養容器では、細胞接着性が不十分であり、また、６３倍以上の倍率の対物レンズを用いた場合には、十分な解像度を有する画像が得られなかった。
　本発明の細胞培養容器は、細胞培養において好適に利用され得る。
１０　　　　　細胞培養容器
１００　　　　容器本体
１１０　　　　底部
１１２　　　　貫通孔
１１４　　　　突起部
１２０　　　　壁部
１３０　　　　薄膜部
２００　　　　蓋体

Claims (7)

  1. 　貫通孔が設けられた底部と、該底部から立ち上がる壁部と、該貫通孔を覆うように該底部に溶着された薄膜部と、を有する容器本体を含み、
    　該底部および該薄膜部が、同種の合成樹脂を含み、
    　該薄膜部の厚みが、１０μｍ以上１７０μｍ以下である、細胞培養容器。
  2. 　前記同種の合成樹脂が、スチレン系樹脂である、請求項１に記載の細胞培養容器。
  3. 　前記薄膜部が、スチレン系熱可塑性エラストマーをさらに含む、請求項２に記載の細胞培養容器。
  4. 　前記スチレン系熱可塑性エラストマーが、スチレン－ブタジエン－スチレンブロック共重合体を含む、請求項３に記載の細胞培養容器。
  5. 　前記スチレン系樹脂と前記スチレン系熱可塑性エラストマーとの配合比（スチレン系樹脂：スチレン系熱可塑性エラストマー）が９５：５～５０：５０である、請求項３または４に記載の細胞培養容器。
  6. 　前記底部が、その表面から前記貫通孔を囲むように突出する突起部を備え、
    　前記薄膜部が、該突起部を溶着部として前記底部に溶着されている、請求項１から５のいずれかに記載の細胞培養容器。
  7. 　請求項６に記載の細胞培養容器の製造方法であって、
    　前記貫通孔および突起部が設けられた底部と前記壁部とを一体成形すること、および
    　薄膜部形成用樹脂膜を前記突起部に接触させた状態で、該薄膜部形成用樹脂膜を前記底部に溶着すること、
    　を含む、製造方法。
     
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