KR20220139402A - 세포 배양 기판, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

세포 배양 기판, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포 배양을 위한 기판을 제공한다. 기판을 포함하는 시스템, 및 기판을 사용하고 제조하는 방법이 또한 본원에 개시되어 있다.

Description

세포 배양 기판, 이의 제조방법 및 용도
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 12월 31일에 출원된 미국 가특허출원 제63/132,934호 및 2021년 10월 5일에 출원된 미국 가특허 출원 제63/252,268호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함되어 있다.
3D 스페로이드(spheroid) 모델에 대한 관심은 기초 과학에서 종양 생물학, 신경 퇴행성 질병 및 약물 독성에 관한 연구를 포함한 전임상 약물 발견 응용에 이르기까지 연구자들 사이에서 증가하고 있다. 3차원(3D) 세포 배양 방법은 복잡한 조직 또는 종양 모델을 생성하는 데 점점 더 많이 사용된다.
시장에서 사용 가능한 3D 세포 배양 방법 및 제품을 사용하여 형성된 스페로이드에는 많은 변형이 있으며, 이는 판독에 영향을 미칠 수 있다. 예를 들어, ULA(Ultra Low Attachment) 판 및 방울(hanging drop) 방법을 포함하는, 3D 세포 배양에 널리 사용되는 비접착 기술은 적합하지 않은 것으로 입증되었는데, 왜냐하면, 이러한 방법은 일반적으로 세포 응집을 통해 스페로이드를 생성하기 때문이다. 이러한 스페로이드는 일반적으로 원래의 이질성을 유지하고 다양한 특성을 가진 여러 세포를 보유하므로 세포 이질성에 대한 더 나은 이해가 필요하다. 수만 개의 세포가 스페로이드(즉, 구형의 덩어리)로 응집되면, 영양분 및 산소 침투가 부족하여 광범위한 중심 괴사 코어가 몇 시간에 걸쳐 형성되어 세포 증식을 방해할 수 있다. 확장된 중심 괴사는 실제 암에서 드문 현상이다.
대안적으로, Matrigel은 오르가노이드(organoid) 형성과 같은 조직 기반 세포 성장을 위해 일반적으로 사용되는 내장형 기판이다. 그러나 초점이 맞지 않고, 비효율적인 화합물 확산, 및 샘플 분리의 어려움으로 인해 생체 외 3D 스페로이드 기반 응용에 대한 이것의 응용이 제한된다.
스페로이드 형성을 표준화하는 것은 균일한 3D 세포 배양을 생성하고 스페로이드 기반 분석 및 약물 스크리닝에서 재현 가능한 결과를 얻는 데 중요하다. 따라서, 단일 세포 유래 스페로이드를 안정적으로 형성할 수 있는 새로운 세포 배양 시스템 및 제조방법의 개발이 필요하다.
본 발명은 세포 배양에 사용하기 위한 세포 배양 기판(substrate)(이하 "기판"이라 함)을 제공한다. 본원에 제공된 기판은 고분자전해질 다층 및 흡수성 폴리머로 코팅된 엘라스토머 멤브레인을 포함한다. 본 명세서에 기재된 코팅은 수화 보존에 유리하다. 주위 온도에서 장기간 보관하여 발생하는 바람직하지 않은 표면 균열로부터 세포 배양 기판을 방지할 수 있다. 또한, 기판을 포함하는 세포 배양 시스템이 제공된다. 기판 및 이러한 것을 포함하는 세포 배양 시스템을 제조하는 방법 및 용도도 제공된다.
따라서, 본 발명의 일 측면은 고분자전해질 다층, 흡수성 폴리머, 및 엘라스토머 멤브레인을 포함하는 다층 멤브레인 형태의 기판을 제공하며, 상기 흡수성 폴리머는 상기 엘라스토머 멤브레인의 상부에 적층되고, 상기 고분자전해질 다층은 흡수성 폴리머 상부에 적층된다. 흡수성 폴리머와 직접 접촉하는 고분자전해질은 다중양이온 또는 다중음이온일 수 있다. 기판의 최외각층은 다중양이온 또는 다중음이온일 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 엘라스토머는 실리콘 엘라스토머이다. 바람직한 실시양태에서, 실리콘 엘라스토머는 폴리디메틸실록산(PDMS)이다.
적합한 흡수성 폴리머에는 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), PEG-아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리-L-락티드(PLLA), 폴리-D-락티드(PDLA), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(PLDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PL-co-GA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(p-HEMA) 및 이들의 유도체가 포함되지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PVA, PEG, PVP, PEI, PMMA 또는 이들의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PVA이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PEG 또는 PEGMA, PEGDMA 또는 PEGDA와 같은 PEG-아크릴레이트이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PLA 또는 PLLA, PDLA 또는 PLDLLA와 같은 유도체이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PGA 또는 PLGA와 같은 유도체이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PMAA 또는 pHEMA와 같은 유도체이다.
특정 실시양태에서, 흡수성 폴리머의 부피는 표면 코팅의 총 부피의 0.01 내지 10%이다.
본 명세서에 기재된 고분자전해질 다층은 양이온성 고분자전해질("다중양이온(polycation)"으로 지칭됨) 및 음이온성(추가하였음)고분자전해질("다중음이온(polyanion)"으로 지칭됨)을 포함하는 적어도 하나의 층 쌍("이중층"으로 지칭됨)을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중양이온은 폴리(아미노산)이다. 일부 실시양태에서, 다중음이온은 폴리(아미노산)이다. 일부 실시양태에서, 다중양이온 및 다중음이온은 폴리(아미노산)이다. 본원에 기재된 폴리(아미노산)은 L 및/또는 D 아미노산 형태를 포함할 수 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 고분자전해질 다층은 층별 조립(assembly)을 통해 대안적인 방식으로 다중양이온 및 다중음이온을 적층함으로써 형성될 수 있다.
일부 실시양태에서, (다중양이온/다중음이온)n의 화학식을 갖는 전해질 다층은 다중양이온 및 다중음이온의 n 이중층을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 30 범위의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위에 있다.
일부 실시양태에서, 다중음이온(다중양이온/다중음이온)n의 화학식을 갖는 전해질 다층은 다중음이온의 n+1 층 및 다중양이온의 n 층을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 30 범위의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위에 있다.
일부 실시양태에서, 다중양이온(다중음이온/다중양이온)n의 화학식을 갖는 전해질 다층은 다중양이온의 n+1 층 및 다중음이온의 n 층을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 30 범위의 정수이다. 일부 실시양태에서, n은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위에 있다.
일부 실시양태에서, 다중양이온은 폴리(L-리신)(PLL), 폴리(L-아르기닌)(PLA), 폴리(L-오르니틴)(PLO), 폴리(L-히스티딘)(PLH), 또는 이들의 조합이다. 바람직한 실시양태에서, 다중양이온은 PLL이다.
바람직한 실시양태에서, 다중음이온은 폴리(L-글루탐산)(PLGA), 폴리(L-아스파르트산)(PLAA), 또는 이들의 조합이다. 바람직한 실시양태에서, 다중음이온은 PLGA이다.
일부 실시양태에서, 상기 고분자전해질 다층은 PLL/PLGA, PLL/PLAA, PLA/PLGA, PLA/PLAA, PLO/PLGA, PLO/PLAA, PLH/PLGA, PLH/PLAA 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 다중양이온/다중음이온의 적어도 하나의 층 쌍(즉, 이중층)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중층은 PLL 및 PLGA의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중층은 PLO 및 PLGA의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중층은 PLH 및 PLGA의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중층은 PLA 및 PLGA의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중층은 PLL 및 PLAA의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중층은 PLO 및 PLAA의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중층은 PLH 및 PLAA의 조합을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 이중층은 PLA 및 PLAA의 조합을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 전해질 다층은 30nm 내지 30㎛ 범위의 두께를 가질 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면 코팅은 100nm 내지 20㎛ 범위의 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표면 코팅은 200, 400, 600 또는 800nm의 두께를 갖는다. 일부 실시양태에서, 표면 코팅은 1, 5, 10, 15 또는 20㎛의 두께를 갖는다.
통상적인 배양 방법과 비교하여, 본 개시내용의 표면 코팅은 종양 세포, 만능 및 다능 줄기(pluripotent and multipotent stem) 및 전구 세포, 조혈모 세포 및 면역 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 세포에 대해 개선된 증식 속도를 제공한다. 또한, 높은 보수성(water retention)을 갖는 표면 코팅은 주위 온도(확인필요함)에서 장기간 보관으로 인한 탈수로 인해 발생하는 바람직하지 않은 표면 균열로부터 표면 코팅을 방지하는 이점을 제공한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 개시내용의 기판을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법은 (a) 지지체를 제공하는 단계; (b) 지지체의 표면에 엘라스토머를 도포하는 단계; (c) 흡수성 폴리머를 엘라스토머에 도포하는 단계; (d) 다중양이온 및 다중음이온의 층을 교대로 흡수성 폴리머 상에 순차적으로 적층시켜 다층 멤브레인을 형성하는 단계; 및 (e) 지지체로부터 다층 멤브레인을 박리하여 기판을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 엘라스토머는 PDMS이다. 일부 실시양태에서, PDMS는 소수성 표면을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은, (a) 소수성 표면을 갖는 PDMS 멤브레인을 제공하는 단계; (b) PDMS의 소수성 표면을 처리로 개질시키는 단계; (c) PDMS의 개질된 표면에 흡수성 폴리머를 도포하는 단계; 및 (d) 고분자전해질의 층을 교대로 흡수성 폴리머 상에 순차적으로 적층시켜 코팅된 PDMS 멤브레인을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 처리는 플라즈마 처리, 코로나 방전 또는 UV 오존 처리이다. 일부 실시양태에서, PDMS의 소수성 표면은 처리 후에 조사되거나 친수화된다. 일부 실시양태에서, PDMS 표면은 PDMS의 개질된 표면에 흡수성 폴리머를 도포한 후 친수화 된다. 일부 실시양태에서, PDMS의 소수성 표면은 PDMS의 개질된 표면에 PVA를 도포한 후 친수성 표면으로 전환된다.
일부 실시양태에서, PDMS의 소수성 표면은 하이드로실릴화에 의해 개질된다. 일부 실시양태에서, 하이드로실릴화는 백금-촉매화된 하이드로실릴화이다. 일부 실시양태에서, PDMS 표면은 PEG-아크릴레이트를 표면-개질된 PDMS에 도포한 후 친수화 된다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머(예를 들어, PEG 또는 PEG-아크릴레이트)는 PDMS 표면에 공유 결합(즉, 접합)된다. 흡수성 폴리머 및 엘라스토머의 가교결합을 용이하게 하기 위해 가교제가 사용될 수 있다. 예시적인 가교제는 말레산, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 부탄알(부티르알데히드), 붕산나트륨, 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, PDMS는 가교결합이 없다.
본원에 기재된 지지체는 임의의 적절한 물질로 만들어질 수 있다. 예시적인 물질은 금속, 유리 및 이산화규소를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에서, 지지체는 유리 또는 실리콘 웨이퍼로 만들어진다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 표면이 본 개시내용의 기판으로 코팅된 세포 배양 물품을 제공한다. 예시적인 세포 배양 물품은 세포 배양 접시, 6, 12, 96, 384 및 1536 웰 플레이트와 같은 단일 및 다중 웰 플레이트와 같은 세포 배양 플레이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 개시내용의 세포 배양 물품을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 시스템은 세포를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 시스템은 배양 배지를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 세포 배양 시스템은 세포, 특히 단일 세포 또는 저밀도 세포(예를 들어, 1 밀리리터에서 1000 미만의 존재비를 갖는 세포)의 효율적이고 확장 가능한 증식을 3D로 가능하게 하여, 시장의 현재 플랫폼(예를 들어, Ultra Low Attachment(ULA) 플레이트, Hanging-Drop)에서 형성되지 않는 어려운 세포 유형에서 3D 세포 배양을 형성하는 것을 가능하게 만든다.
본 명세서에 개시된 바와 같이, 고분자전해질 다층 및 배양 배지의 하나 이상의 파라미터는 세포에 대한 하나 이상의 미세환경 선택 기준에 기초하여 사용자에 의해 선택될 수 있다.
본 명세서에 개시된 세포 배양 시스템은 세포 부착 및 성장 뿐만 아니라 배양된 세포(예를 들어, 3D 세포 배양, 조직 및 기관)의 생존 가능한 수확을 가능하게 한다. 생존 가능한 세포를 수확할 수 없다는 것은 현재 시장에 나와 있는 플랫폼의 심각한 단점이며, 생산 능력을 위한 충분한 수의 세포를 구축하고 유지하는 데 어려움이 있다. 본 개시내용의 실시양태의 한 측면에 따르면, 80% 내지 100% 생존 가능, 또는 약 85% 내지 약 99% 생존 가능, 또는 약 90% 내지 약 99% 생존 가능을 포함하는, 세포 배양 시스템으로부터 생존 가능한 세포를 수확하는 것이 가능하다. 예를 들어, 수확된 세포 중 80% 이상은 생존 가능하고, 85% 이상은 생존 가능하며, 90% 이상은 생존 가능하고, 91% 이상은 생존 가능하며, 92% 이상은 생존 가능하고, 93% 이상은 생존 가능하며, 94% 이상은 생존 가능하고, 95% 이상은 생존 가능하고, 96% 이상은 생존 가능하고, 97% 이상은 생존 가능하고, 98% 이상은 생존 가능하거나 또는 99% 이상은 생존 가능하다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포 분리 효소, 예를 들어, 트립신, TrypLE 또는 Accutase를 사용하여 세포 배양 표면으로부터 방출될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 세포는 세포 분리 효소를 사용하지 않고 세포 배양 표면으로부터 방출될 수 있다.
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 명세서에 개시된 기판을 사용하여 세포를 배양하는 방법, 및 선택적으로 세포를 수확하는 방법을 제공한다. 세포를 배양하는 방법은 (a) 본 발명의 기판을 제공하는 단계; (b) 기판에 세포를 시딩(seeding)하는 단계; (c) 적절한 조건하에 세포를 배양하는 단계; 및 (d) 선택적으로 배양된 세포를 수확하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 배양된 세포(즉, 세포 생성물)는 스페로이드와 같은 3D 세포 배양물이다. 일부 실시양태에서, 본원에서 생성된 스페로이드는 기판에 부착된다. 일부 실시양태에서, 본원에서 생성된 스페로이드는 기판에 반부착된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 단일 세포 증식을 통해 단일 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 기판은 세포 배양 물품에 수용된다. 임의의 적합한 물품이 예시적인 실시양태의 방법에 사용될 수 있다. 배양된 세포(예를 들어, 배양 및 수확된 세포)는 분석 및 특성화, 약물 스크리닝, 단일 세포 유래 클론 분리, 세포 은행 생성 및 동물 모델 생성과 같은 다양한 응용에 사용될 수 있다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 세포는 살아있는 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조직 세포, 면역 세포, 내피 세포, 줄기 세포, 상피 세포, 간엽 세포, 중피 세포, 종양 세포 또는 종양 관련 세포이다.
본원에 기재된 바와 같이, 세포를 배양하는 것은 세포를 유지 및/또는 증식시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포를 배양하는 것은 세포를 유지하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포를 배양하는 것은 세포를 증식시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포를 배양하는 것은 세포를 분화(differentiation)시키는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포는 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함하는 간엽 줄기 세포(MSC) 또는 만능 줄기 세포(PSC)와 같은 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 종양 세포이고, 배양된 세포는 종양 스페로이드이다. 종양 스페로이드는 세포주, 종양 조직 또는 액체 생체검사(biopsy)에서 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 종양 스페로이드는 암 환자로부터 수득된 혈액 샘플로부터 분리된(isolated) 순환 종양 세포(CTC)로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 혈액 샘플은 전혈이다. 혈액 샘플은 액체 생체검사로 수득할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 암 환자는 전이성 암을 갖는 인간 암 환자이다. 일부 실시양태에서, 혈액 샘플은 치료 전, 치료 중 및/또는 치료 후에 암 환자로부터 수득된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 기판은 예를 들어 피부에 부착된 패치로서 사용될 수 있다. 본원에서 생성된 배양된 세포는 세포 치료에 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, (a) 본 발명의 기판을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공하는 단계; (b) 샘플로부터 세포(예를 들어, 종양 세포 및/또는 종양 관련 세포)를 분리하여 분리된 세포를 제공하는 단계; (c) 분리된 세포를 기판에 시딩하는 단계; 및 (d) 하나 이상의 스페로이드를 생성하기에 충분한 시간 동안 적합한 배지 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 시험관 내에서 단일세포 유래 스페로이드를 제조하는 방법을 제공하고, 여기서 하나 이상의 스페로이드는 단일 세포 유래이다.
본 개시내용의 또 다른 측면은 각각이 유전적으로 동일한 균질한 세포 집단으로 구성된 단일 세포 유래 클론을 분리하는 방법을 제공한다.
도 1a는 본 개시내용의 기판의 실시양태의 측단면도이다. 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머(101)(예를 들어, PDMS)상에 적층된다. 101 및 102는 가교결합되지 않는다. 301은 다중음이온이다. 302는 다중양이온이다. 103은 301 및 302의 4개의 이중층을 포함하는 고분자전해질 다층의 실시양태이다. 최외각층은 301이다.
도 1b는 본 개시내용의 기판의 실시양태의 측단면도이다. 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머(101)(예를 들어, PDMS)상에 적층된다. 101 및 102는 가교결합된다. 301은 다중음이온이다. 302는 다중양이온이다. 103은 301 및 302의 4개의 이중층을 포함하는 고분자전해질 다층의 실시양태이다. 최외각층은 301이다.

도 2a는 본 개시내용의 기판의 실시양태의 측단면도이다. 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머(101)(예를 들어, PDMS)상에 적층된다. 101 및 102는 가교결합되지 않는다. 301은 다중음이온이다. 302는 다중양이온이다. 103은 302의 5개 층과 301의 4개 층을 포함하는 고분자전해질 다층의 실시양태이다. 최외각층은 302이다.
도 2b는 본 개시내용의 기판의 실시양태의 측단면도이다. 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머(101)(예를 들어, PDMS)상에 적층된다. 101 및 102는 가교결합된다. 301은 다중음이온이다. 302는 다중양이온이다. 103은 302의 5개 층과 301의 4개 층을 포함하는 고분자전해질 다층의 실시양태이다. 최외각층은 302이다.
도 3a는 본 개시내용의 기판의 실시양태의 측단면도이다. 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머(101)(예를 들어, PDMS)상에 적층된다. 101 및 102는 가교결합되지 않는다. 301은 다중음이온이다. 302는 다중양이온이다. 103은 301 및 302의 4개의 이중층을 포함하는 고분자전해질 다층의 실시양태이다. 최외각층은 302이다.
도 3b는 본 개시내용의 기판의 실시양태의 측단면도이다. 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머(101)(예를 들어, PDMS)상에 적층된다. 101 및 102는 가교결합된다. 301은 다중음이온이다. 302는 다중양이온이다. 103은 301 및 302의 4개의 이중층을 포함하는 고분자전해질 다층의 실시양태이다. 최외각층은 302이다.

도 4a는 본 개시내용의 기판의 실시양태의 측단면도이다. 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머(101)(예를 들어, PDMS)상에 적층된다. 101 및 102는 가교결합되지 않는다. 301은 다중음이온이다. 302는 다중양이온이다. 103은 301의 5개 층과 302의 4개 층을 포함하는 고분자전해질 다층의 실시양태이다. 최외각층은 301이다.
도 4b는 본 개시내용의 기판의 실시양태의 측단면도이다. 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머(101)(예를 들어, PDMS)상에 적층된다. 101 및 102는 가교결합된다. 301은 다중음이온이다. 302는 다중양이온이다. 103은 301의 5개 층과 302의 4개 층을 포함하는 고분자전해질 다층의 실시양태이다. 최외각층은 301이다.

도 5는 세포 배양 물품(202)의 예시적인 실시양태를 도시한다. 201은 엘라스토머(예를 들어, PDMS)(101), 흡수성 폴리머(102) 및 고분자전해질 다층(103)을 포함하는 기판(104)을 수용하기 위한 세포 배양 물품의 웰이다. 104는 세포 배양 물품(202)의 201에 삽입될 수 있다. 202는 세포 배양을 위한 6, 12, 24, 96 이상의 웰 플레이트로서 간주될 수 있다.
도 6은 PDMS의 표면 개질의 반응 도식을 나타낸다. 제1 단계는 PDMS 표면 상에 SiH 기를 도입하는 것이다(PDMS-SiH). 제2 단계는 PEG-PDMS 접합체의 형성을 포함한다.
도 7은 완전한 DMEM 배지가 공급된 암 세포의 성장 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7일에 본 발명의 기판 상에서 배양된 HCT116 결장직장암 세포의 시간 경과 현미경 관찰을 나타낸다(10x 대물렌즈에서 Leica DMI6000B 시간 경과 현미경으로 촬영한 이미지).
도 8A 내지 8C는 4, 7 및 14일 동안 다양한 배양 플레이트 상에서 HCT116 결장직장암 세포의 생체외 배양 결과를 보여준다. (A) 조직 배양 플레이트(TCP), (B) PVA/PDMS 코팅된 표면을 포함하는 배양 플레이트, 및 (C) (PLL/PLGA)15/PVA/PDMS 코팅된 표면을 포함하는 배양 플레이트. 세포는 TCP 및 PVA/PDMS 코팅된 표면에 부착되는 반면 세포는 (PLL/PLGA)15/PVA/PDMS 코팅된 표면상에서 스페로이드를 형성한다.
도 9A 내지 9D는 환자 유래 임상 샘플의 생체외 배양 결과를 보여준다: (A) 조직 배양 플레이트(TCP)에서 2주 동안 성장한 바늘 생체검사로부터의 유방암 세포, (B) 2주 동안 본 발명의 기판 상에서 성장한 바늘 생체검사로부터의 유방암 세포, (C) 2주 동안 본 발명의 기판 상에서 성장한 종양 조직으로부터의 요로상피암 세포, (D) 2주 동안 본 발명의 기판 상에서 성장한 종양 조직으로부터의 결장직장암 세포.
도 10은 본 발명의 기판 상에서 2주 동안 성장시킨 환자 유래 정상 샘플의 유방 세포 및 결장직장 세포 및 환자 유래 종양 샘플의 유방암 세포 및 결장직장암 세포의 생체외 배양 결과를 나타낸다.
본 발명은 세포 배양, 특히 3D 세포 배양에 유용한 기판에 관한 것이다. 기판은 매우 균일한 3D 세포 배양의 형성을 유도할 수 있는 표면 코팅을 포함하고, 임의의 다른 낮은 부착 표면에서는 형성되지 않았던 어려운 일차 세포 유형상에 3D 세포 배양을 형성할 수 있게 한다. 본원에 개시된 기판은 다양한 구성의 임의의 적합한 세포 배양 물품에 대해 구성가능하고, 가요성이며, 적응가능하다.
본 발명의 기판
본 개시내용은 세포 배양 물품을 코팅하거나 세포를 배양하는데 사용하기 위한 기판을 제공한다. 본 명세서에 개시된 기판은 고분자전해질의 하나 이상의 이중층을 포함하는 고분자전해질 다층, 흡수성 폴리머, 및 엘라스토머 멤브레인(예를 들어, PDMS)을 포함한다. 일부 예에서, 기판은 도 1에 예시된 바와 같다. 도 1에 도시된 바와 같이, 104는 세포 배양 플레이트(202)의 웰(201) 내에 적층된 본 발명의 예시적인 기판을 나타낸다. 고분자전해질 다층(103)은 흡수성 폴리머(102)의 상부에 적층된다. 엘라스토머 멤브레인(101)은 웰 표면(201)의 상부에 직접 적층되는 반면, 흡수성 폴리머(102)는 엘라스토머 멤브레인(101)의 상부에 적층된다.
1) 엘라스토머
본 명세서에 개시된 기판은 지지체로서 엘라스토머 멤브레인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 엘라스토머는 실리콘 엘라스토머이다. 본 명세서에 기재된 실리콘 엘라스토머는 친수성 또는 소수성일 수 있다. 일부 실시양태에서, 실리콘 엘라스토머는 친수성 실리콘 엘라스토머이다. 일부 실시양태에서, 실리콘 엘라스토머는 소수성 실리콘 엘라스토머이다. 바람직한 실시양태에서, 실리콘 엘라스토머는 폴리디메틸실록산(PDMS)(예를 들어, Dow Corning의 Sylgard 184®, Alpine Technische Produkte GmbH의 Alpagel K, 또는 Silicone Solutions의 Nusil Shore 00이라는 상표명으로 판매됨)이다.
일부 예에서, 엘라스토머 멤브레인은 실리카, 알루미나, 탄산칼슘, 또는 실리콘 수지와 같은 하나 이상의 광물 충전제를 추가로 포함한다. 엘라스토머 멤브레인은 예를 들어 색상, 레올로지 및/또는 저장 수명을 향상시키기 위해 하나 이상의 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, 실리콘 엘라스토머 멤브레인은 200mm 미만, 100mm 미만, 50mm 미만, 40mm 미만, 30mm 미만, 20mm 미만, 10mm 미만 또는 1mm 미만의 두께를 가질 수 있다. 일부 경우에, 실리콘 엘라스토머 멤브레인의 두께가 100mm 미만이다. 일부 경우에, 실리콘 엘라스토머 멤브레인의 두께가 50mm 미만이다. 일부 경우에, 실리콘 엘라스토머 멤브레인의 두께가 10mm 미만이다. 일부 경우에, 실리콘 엘라스토머 멤브레인의 두께가 1mm 미만이다.
2) 흡수성 폴리머
본원에 기재된 흡수성 폴리머는 수용성이며 수용액의 흡수 및 보유의 결과로 팽창할 수 있는 친수성 폴리머이다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 흡수성 폴리머의 비제한적 목록에는 친수성 및 생체적합성 등급의 하기 폴리머 및 이의 유도체가 포함된다: 당업계에 공지된 기타 흡수성, 친수성 및 생체적합성 물질 중에서, 폴리(비닐 알코올)(PVA), 에틸렌 비닐 알코올 공중합체(친수성 정도가 에틸렌(소수성) 및 비닐 알코올(친수성) 기의 분포에 따라 달라지는 일반적으로 생분해되지 않는 물질), 폴리비닐 알코올 및 에틸렌 비닐 알코올의 공중합체, 폴리아크릴레이트 조성물, 폴리우레탄 조성물, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 더 잘 알려진 폴리(옥시에틸렌)(POE) 및 폴리(에틸렌 옥사이드)(PEO), 및 폴리에틸렌 글리콜 메타크릴레이트(PEGMA), 폴리에틸렌 글리콜 디메타크릴레이트(PEGDMA) 및 폴리에틸렌 글리콜 디아크릴레이트(PEGDA)를 포함하나 이에 제한되지 않는 이의 유도체; 폴리아크릴아미드(아크릴아미드 독성 잔류물 없음), 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐아민 및 폴리에틸렌이민과 같은 질소 함유 물질; 다양한 형태의 폴리락티드로서 알려진 폴리(락트산)(예를 들어, 폴리-L-락티드(PLLA) 및 이의 유도체, 폴리-D-락티드(PDLA) 및 이의 유도체, 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(PLDLLA) 및 이의 유도체), 폴리글리콜리드라고도 알려진 폴리(글리콜산)(PGA), 락트산 및 글리콜산 폴리(락트산-코-글리콜산)(PL-co-GA)의 공중합체, PLA 및/또는 PGA와 PEG의 공중합체와 같은 전기적으로 하전된 물질; 폴리메타크릴산; 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(폴리-HEMA).
일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 폴리(비닐 알코올)(PVA), 에틸렌 비닐 알코올의 공중합체, 폴리비닐 알코올 및 에틸렌 비닐 알코올의 공중합체, 폴리아크릴레이트 조성물, 폴리우레탄 조성물, 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), PEG-아크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜메타크릴레이트(PEGMA), 폴리에틸렌글리콜디메타크릴레이트(PEGDMA), 폴리에틸렌글리콜디아크릴레이트(PEGDA), 폴리아크릴아미드(PAM), 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리비닐아민(PVAm), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리-L-락티드(PLLA), 폴리-D-락티드(PDLA), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(PLDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락트산-코-글리콜산)(PL-co-GA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA) 및 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(p-HEMA)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PVA, PEG, PEG-아크릴레이트, 폴리락티드, PMMA, p-HEMA, 이들의 조합 또는 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PVA 또는 이의 유도체이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PEG 또는 PEGMA, PEGDMA 또는 PEGDA와 같은 PEG-아크릴레이트이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 폴리락티드 또는 PLLA, PDLA 또는 PLDLLA와 같은 유도체이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PGA 또는 PLGA와 같은 유도체이다. 일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PMAA 또는 pHEMA와 같은 유도체이다.
일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 약 2,500g/mol 내지 약 200,000g/mol의 평균 분자량을 갖는다. 일부 경우에, 흡수성 폴리머의 평균 분자량은 약 5,000g/mol 내지 약 175,000g/mol, 약 5,000g/mol 내지 약 150,000g/mol, 약 5,000g/mol 내지 약 125,000g/mol, 약 5,000g/mol 내지 약 100,000g/mol, 약 5,000g/mol 내지 약 75,000g/mol, 약 5,000g/mol 내지 약 50,000g/mol, 약 5,000g/mol 내지 약 25,000g/mol, 약 5,000g/mol 내지 약 10,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 175,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 150,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 125,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 100,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 75,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 50,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 25,000g/mol, 약 20,000g/mol 내지 약 150,000g/mol, 또는 약 50,000g/mol 내지 약 150,000g/mol이다.
일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PVA이다. PVA는 약 10,000g/mol 내지 약 125,000g/mol 범위의 평균 분자량을 가질 수 있다. 일부 예에서, PVA는 평균 분자량이 약 10,000g/mol 내지 약 100,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 75,000g/mol, 약 10,000g/mol 내지 약 50,000g/mol, 약 20,000g/mol 내지 약 125,000g/mol, 약 20,000g/mol 내지 약 100,000g/mol, 약 20,000g/mol 내지 약 75,000g/mol, 약 20,000g/mol 내지 약 50,000g/mol, 약 50,000g/mol 내지 약 125,000g/mol, 또는 약 50,000g/mol 내지 약 100,000g/mol이다.
일부 실시양태에서, 흡수성 폴리머는 PEG이다. 일부 예에서, PEG의 평균 분자량은 약 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1450, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900, 2000, 2100, 2200, 2300, 2400, 2500, 2600, 2700, 2800, 2900, 3000, 3250, 3350, 3500, 3750, 4000, 4250, 4500, 4600, 4750, 5000, 5500, 6000, 6500, 7000, 7500, 8000, 10,000, 12,000, 20,000, 35,000, 40,000, 50,000, 60,000 또는 100,000 Da이다.　
일부 예에서, 본원에 사용된 PEG는 개별(discrete) PEG(dPEG)이다. 개별 PEG는 하나 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함하는 중합체성 PEG일 수 있다. 일부 경우에, 개별 PEG는 2 내지 60개, 2 내지 50개, 또는 2 내지 48개의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다. 일부 경우에, dPEG는 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 35, 40, 42, 48, 50개 이상의 반복 에틸렌 옥사이드 단위를 포함한다.　
특정 실시양태에서, 흡수성 폴리머의 부피는 표면 코팅의 총 부피의 약 0.01% 내지 약 10%이다. 일부 예에서, 흡수성 폴리머는 표면 코팅의 총 부피의 약 0.01% 내지 약 9% v/v, 약 0.01% 내지 약 8% v/v, 약 0.01% 내지 약 7% v/v, 약 0.01% 내지 약 6% v/v, 약 0.01% 내지 약 5% v/v, 약 0.01% 내지 약 4% v/v, 약 0.01% 내지 약 3% v/v, 약 0.01% 내지 약 2% v/v, 약 0.01% 내지 약 1% v/v, 약 0.1% 내지 약 10% v/v, 약 0.1% 내지 약 9% v/v, 약 0.1% 내지 약 8% v/ v, 약 0.1% 내지 약 7% v/v, 약 0.1% 내지 약 6% v/v, 약 0.1% 내지 약 5% v/v, 약 0.1% 내지 약 4% v/v, 약 0.1% 내지 약 3% v/v, 약 1% 내지 약 10% v/v, 약 1% 내지 약 9% v/v, 약 1% 내지 약 8% v/v, 약 1% 내지 약 7% v/v, 약 1% 내지 약 6% v/v, 약 1% 내지 약 5% v/v, 약 1% 내지 약 4% v/v, 약 2% 내지 약 10% v/v, 또는 약 5% 내지 약 10% v/v이다. 일부 경우에, 흡수성 폴리머(예를 들어, PVA 또는 PEG)의 부피는 표면 코팅의 총 부피의 약 0.01%, 약 0.05%, 약 0.1%, 약 0.5%, 약 1%, 약 2%, 약 3%, 약 4%, 약 5%, 약 6%, 약 7%, 약 8%, 약 9%, 또는 약 10%이다.
일부 예에서, 표면 코팅의 총 중량당 흡수성 폴리머(예를 들어, PVA 또는 PEG)의 중량은 약 1% 내지 약 50%이다. 일부 예에서, 표면 코팅의 총 중량당 흡수성 폴리머의 중량은 약 1% 내지 약 40%이다. 일부 예에서, 표면 코팅의 총 중량당 흡수성 폴리머의 중량은 약 1% 내지 약 30%이다. 일부 예에서, 표면 코팅의 총 중량당 흡수성 폴리머의 중량은 약 1% 내지 약 20%이다. 일부 예에서, 표면 코팅의 총 중량당 흡수성 폴리머의 중량은 약 1% 내지 약 10%이다.
3) 고분자전해질 다층
본 명세서에 개시된 바와 같이, 기판은 고분자전해질 다층(PEM)을 포함한다. 본 명세서에 기재된 PEM은 반대로 하전된 폴리머(즉, 고분자전해질)의 복수의 교대 층을 포함한다. 본 명세서에 기재된 반대로 하전된 폴리머는 양으로 하전된 고분자전해질(본원에서 다중양이온으로도 지칭됨) 및 음으로 하전된 고분자전해질(본원에서 다중음이온으로도 지칭됨)의 조합을 포함한다.
예시적인 다중양이온은 폴리(L-리신)(PLL), 폴리(L-아르기닌)(PLA), 폴리(L-오르니틴)(PLO), 폴리(L-히스티딘)(PLH), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리[α-(4-아미노부틸)-L-글리콜산](PAGA), 2-(디메틸아미노)에틸 메타크릴레이트(DMAEMA), N,N-디에틸아미노에틸 메타크릴레이트(DEAEMA), 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 다중양이온이 PLL이다. 일부 예에서, 다중양이온이 PLO이다. 일부 예에서, 다중양이온이 PLH이다. 일부 예에서, 다중양이온이 PLA이다.
예시적인 다중음이온은 폴리-L-글루탐산(PLGA), 폴리-L-아스파르트산(PLAA), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산)(PMAA), 폴리(스티렌설폰산)(PSS), 폴리(N-이소프로필아크릴아미드)(NIPAM), 폴리(2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판 설폰산)(PAMPS), 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 예에서, 다중음이온이 PLGA이다. 일부 예에서, 다중음이온이 PLAA이다.
고분자전해질 다층은 층별 조립을 통해 대안적인 방식으로 다중양이온 및 다중음이온을 적층함으로써 형성될 수 있다. 본 명세서에 기재된 고분자전해질 다층은 다중양이온 층 및 다중음이온 층을 포함하는 적어도 하나의 이중층을 포함한다.
일부 실시양태에서, PEM은 약 1개의 이중층 내지 약 100개의 이중층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEM은 약 1개의 이중층 내지 약 50개의 이중층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEM은 약 1개의 이중층 내지 약 30개의 이중층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PEM은 약 1개의 이중층 내지 약 20개의 이중층을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16개의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 4개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 5개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 6개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 7개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 8개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 9개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 10개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 11개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 12개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 13개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 14개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 15개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 16개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 17개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 18개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 19개이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 20개이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 양으로 하전된 고분자전해질(들) 및 음으로 하전된 고분자전해질(들)의 하나 이상의 이중층을 포함하며, 여기서 다중양이온은 PLL, PLO PLH 및 PLA로부터 선택되고, 다중음이온은 PLGA 및 PLAA로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 세트의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 세트의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 세트의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 세트의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 PLL 및 PLGA의 하나 이상의 이중층을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLL 및 PLGA의 이중층의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 PLO 및 PLGA의 하나 이상의 이중층을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLO 및 PLGA의 이중층의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 PLH 및 PLGA의 하나 이상의 이중층을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLH 및 PLGA의 이중층의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 PLA 및 PLGA의 하나 이상의 이중층을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLA 및 PLGA의 이중층의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 PLL 및 PLAA의 하나 이상의 이중층을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLL 및 PLAA의 이중층의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 PLO 및 PLAA의 하나 이상의 이중층을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLO 및 PLAA의 이중층의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 PLH 및 PLAA의 하나 이상의 이중층을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLH 및 PLAA의 이중층의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 고분자전해질 다층은 PLA 및 PLAA의 하나 이상의 이중층을 포함한다. 일부 실시양태에서, PLA 및 PLAA의 이중층의 수는 1 내지 100, 3 내지 60, 3 내지 50, 또는 3 내지 30의 범위이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 초과이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20이다. 일부 실시양태에서, 이중층의 수는 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위이다.
박막으로서 PEM의 두께는 넓은 범위, 예를 들어, 약 30nm 내지 약 30㎛, 또는 약 100nm 내지 약 20㎛의 범위일 수 있다. 일부 실시양태에서, 두께는 약 100nm 내지 약 500nm, 약 500nm 내지 약 1㎛, 또는 약 1㎛ 내지 약 10㎛이다. 일부 실시양태에서, 두께는 약 200, 400, 600, 800nm, 또는 이들 사이의 임의의 수이다. 일부 실시양태에서, 두께는 약 1, 5, 10, 15 또는 20㎛, 또는 이들 사이의 임의의 수이다.
PEM을 특성화하기 위한 여러 방법론을 사용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 방법론은 타원편광법(ellipsometry)(두께), 소산 모니터링이 있는 석영 결정 미세저울(질량 흡착, 점탄성), 접촉각 분석(표면 에너지), 푸리에 변환 적외선 분광법(작용기), X선 광전자 분광법(화학 조성물), 주사 전자 현미경(표면 구조), 및 원자력 현미경(거칠기/표면 구조)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, PEM은 다중음이온 또는 다중양이온 용액을 혼합물로 또는 순차적으로 접시 내로/위에 피펫팅함으로써 적층될 수 있다.
일부 실시양태에서, PEM은 딥 코팅에 의해 표면 상에 형성된다. 딥 코팅에서, 기판은 일정 시간(보통 10 내지 15분) 동안 고분자전해질 용액에 담그고 여러 번 헹구고 반대 전하의 두 번째 고분자전해질 용액에 담근다. 이 공정은 원하는 층의 수에 도달할 때까지 반복된다.
일부 실시양태에서, PEM은 분무 코팅에 의해 표면 상에 형성된다. 일부 실시양태에서, 고분자전해질을 3 내지 10초 동안 표면에 분무한 후 10 내지 30초의 휴지/배수 기간, 3 내지 20초 동안 물 스프레이로 표면 세척, 10초의 추가 휴지 기간, 및 반대 전하의 고분자전해질로 사이클을 반복할 수 있다.
일부 실시양태에서, PEM은 스핀 코팅에 의해 표면 상에 형성된다. 스핀 코팅은 시스템의 용액 기반 코팅을 위한 고도로 제어된 방법이다. 일반적인 스핀 코팅 절차에는 10 내지 15초 동안의 스핀 코팅, 15 내지 30초 동안 물을 "스핀 코팅"하여 적어도 한 번 헹구고 반대로 하전된 고분자전해질로 절차를 반복하는 것이 포함된다. 스핀 코팅에서는 세척 단계가 필요하지 않을 수 있다.
4) 세포 배양 기판의 구축
본 개시내용의 다른 측면은 본 개시내용의 세포 배양 기판을 제조하는 방법을 특징으로 한다. 본원에 기재된 방법은 (a) 지지체를 제공하는 단계; (b) 지지체의 표면상에 엘라스토머를 도포하는 단계; (c) 흡수성 폴리머를 엘라스토머 상에 도포하는 단계; (d) 고분자전해질의 층을 교대로 흡수성 폴리머 상에 순차적으로 적층시켜 다층 멤브레인을 형성하는 단계; 및 (e) 지지체로부터 다층 멤브레인을 박리하여 기판을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 엘라스토머는 실리콘 엘라스토머이다. 일부 실시양태에서, 실리콘 엘라스토머는 폴리디메틸실록산(PDMS)이다. 일부 실시양태에서, PDMS는 친수성 표면을 포함한다. 일부 실시양태에서, PDMS는 소수성 표면을 포함한다. 일부 실시양태에서, PDMS 소수성 표면을 친수성 표면으로 전환시키기 위해 표면 개질이 사용된다.
일부 실시양태에서, 본 개시내용의 기판을 제조하는 방법은, (a) 소수성 표면을 갖는 PDMS를 제공하는 단계; (b) PDMS의 소수성 표면을 처리로 개질시키는 단계; (c) PDMS의 개질된 표면에 흡수성 폴리머를 도포하는 단계; 및 (d) 고분자전해질의 층을 교대로 흡수성 폴리머 상에 순차적으로 적층시켜, 다층 멤브레인을 포함하는 기판을 수득하는 단계를 포함한다.
일부 실시양태에서, 처리는 플라즈마 처리, 코로나 방전 또는 UV 오존 처리를 포함한다. 일부 실시양태에서, PDMS의 소수성 표면은 처리 후에 조사된다. 일부 실시양태에서, PDMS 표면은 PDMS의 개질된 표면에 흡수성 폴리머를 도포한 후 친수화 된다. 일부 실시양태에서, PDMS의 소수성 표면은 PDMS의 개질된 표면에 PVA를 도포한 후 친수성 표면으로 전환될 수 있다. 일부 실시양태에서, PDMS의 소수성 표면은 하이드로실릴화에 의해 개질된다. 일부 실시양태에서, PDMS 표면은 PEG-아크릴레이트를 표면-개질된 PDMS에 도포한 후 친수화 된다. 일부 실시양태에서, PDMS 및 PEG는 가교결합되어 친수화된 PDMS 표면을 제공한다. 흡수성 폴리머와 PDMS 사이의 가교결합을 용이하게 하기 위해 가교제가 사용될 수 있다. 예시적인 가교제는 말레산, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 부탄알(부티르알데히드), 붕산나트륨, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 명세서에 기재된 바와 같이, 표면 상의 물방울에 대한 접촉각이 90도 미만(접촉각은 액적 내부를 통과하는 각도로 정의됨)인 경우 표면은 친수성이다. 실시양태는 90도 내지 0도의 접촉각을 갖는 친수성 표면을 포함하고; 당업자는 명백하게 명시된 경계 사이의 모든 범위와 값이 고려된다는 것을 즉시 인식할 것이고, 예를 들어 다음 중 하나를 상한 또는 하한으로 사용할 수 있다: 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 10, 5, 2, 0도.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기판은 (다중음이온/다중양이온)n/X/PDMS를 포함하고, 여기서 다중음이온/다중양이온은 PLGA/PLL, PLAA/PLL, PLGA/PLA, PLAA/PLA, PLGA/PLO, PLAA/ PLO, PLGA/PLH 및 PLAA/PLH로부터 선택되고, X는 PVA, PEG, PEG-아크릴레이트 또는 PVP이고, n은 1에서 20 범위의 정수, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, X는 PEG-아크릴레이트이고, PEG-아크릴레이트는 PDMS에 가교결합된다. 일부 실시양태에서, X는 PVA이고, PDMS 및 PVA는 가교결합이 없다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기판은 (다중양이온/다중음이온)n/X/PDMS를 포함하고, 여기서 다중양이온/다중음이온은 PLL/PLGA, PLL/PLAA, PLA/PLGA, PLA/PLAA, PLO/PLGA, PLO/PLAA, PLH/PLGA 및 PLH/PLAA로부터 선택되고, X는 PVA, PEG, PEG-아크릴레이트 또는 PVP이고, n은 1에서 20 범위의 정수, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, X는 PEG-아크릴레이트이고, PEG-아크릴레이트는 PDMS에 가교결합된다. 일부 실시양태에서, X는 PVA이고, PDMS 및 PVA는 가교결합이 없다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기판은 다중양이온(다중음이온/다중양이온)n/X/PDMS을 포함하고, 여기서 다중음이온/다중양이온은 PLGA/PLL, PLAA/PLL, PLGA/PLA, PLAA/PLA, PLGA/PLO, PLAA/PLO, PLGA/PLH 및 PLAA/PLH로부터 선택되고, X는 PVA, PEG, PEG-아크릴레이트 또는 PVP이고, n은 1에서 20 범위의 정수, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, X는 PEG-아크릴레이트이고, PEG-아크릴레이트는 PDMS에 가교결합된다. 일부 실시양태에서, X는 PVA이고, PDMS 및 PVA는 가교결합이 없다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 기판은 다중음이온(다중양이온/다중음이온)n/X/PDMS를 포함하고, 여기서 다중양이온/다중음이온은 PLL/PLGA, PLL/PLAA, PLA/PLGA, PLA/PLAA, PLO/PLGA, PLO/ PLAA, PLH/PLGA 및 PLH/PLAA로부터 선택되고, X는 PVA, PEG, PEG-아크릴레이트 또는 PVP이고, n은 1에서 20 범위의 정수, 선택적으로 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20이다. 일부 실시양태에서, n은 1 내지 10, 1 내지 8, 1 내지 5, 3 내지 20, 5 내지 20, 10 내지 20, 11 내지 19, 12 내지 18, 13 내지 17, 또는 14 내지 16의 범위에 있다. 일부 실시양태에서, X는 PEG-아크릴레이트이고, PEG-아크릴레이트는 PDMS에 가교결합된다. 일부 실시양태에서, X는 PVA이고, PDMS 및 PVA는 가교결합이 없다.
본원에 기재된 엘라스토머 멤브레인의 표면 코팅은 탈수되거나 수화될 수 있다. 일부 실시양태에서, 표면 코팅은 탈수된 상태이다. 다른 실시양태에서, 표면 코팅은 수화된 상태이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, "탈수된 상태" 및 "수화된 상태"는 각각 표면 코팅의 총 부피를 기준으로 한 수용액(예를 들어, 물)의 부피를 의미한다. 탈수된 상태에서, 수용액(예를 들어, 물)의 부피는 표면 코팅의 전체 부피의 20% 미만, 15% 미만, 10% 미만, 5% 미만, 1% 미만 또는 0.5% 미만이다. 수화된 상태에서, 수용액(예를 들어, 물)의 부피는 표면 코팅의 전체 부피의 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 엘라스토머 멤브레인의 표면 코팅은 수용액(예를 들어, 물)을 포함한다. 일부 경우에, 수용액(예를 들어, 물)은 표면 코팅의 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 60 중량%이다. 일부 경우에, 수용액(예를 들어, 물)은 표면 코팅의 총 중량의 약 1중량% 내지 약 50중량%, 약 1중량% 내지 약 40중량%, 약 1중량% 내지 약 30중량%, 약 1중량% 내지 약 20중량%, 약 10중량% 내지 약 60중량%, 약 10중량% 내지 약 50중량%, 약 10중량% 내지 약 40중량%, 약 10중량% 내지 약 30중량% , 약 10중량% 내지 약 20중량%, 약 20중량% 내지 약 60중량%, 약 20중량% 내지 약 50중량%, 약 20중량% 내지 약 40중량%, 또는 약 30중량% 내지 약 60 중량%이다.
일부 실시양태에서, 기판은 충전제를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 충전제는 실리카, 알루미나, 탄산칼슘, 또는 실리콘 수지와 같은 광물 충전제를 포함하지만 이에 제한되지는 않는다.
다중양이온 및 다중음이온, 및 흡수성 폴리머 각각은 본 발명에서 사용하기 위해 수용액에 용해될 수 있다. 수용액에는 유기 용매가 없거나 실질적으로 없다. 일부 소량의 유기 용매가 수용액에 존재할 수 있으며, 예를 들어 결과적으로 중합 후 폴리머에 일부 유기 용매가 잔류할 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 수용액 중의 유기 용매와 관련하여 "실질적으로 없는"은 수용액이 중량 기준으로 1% 미만의 유기 용매를 포함함을 의미한다. 많은 실시양태에서, 수용액은 0.8% 미만, 0.5% 미만, 0.2% 미만 또는 0.1% 미만의 유기 용매를 함유한다.
다중양이온 및 다중음이온, 및 흡수성 폴리머 각각은 코팅 목적에 적합한 임의의 농도로 수용액에 용해될 수 있다.
세포 배양 시스템
본 개시내용은 본 개시내용의 기판을 포함하고 세포를 배양하도록 구성된 세포 배양 물품을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공한다.
본원에 개시된 기판은 다양한 구성의 임의의 적합한 세포 배양 물품에 대해 구성가능하고 적응가능하다. 예시적인 세포 배양 물품은 세포 배양 접시, 6, 12, 96, 384 및 1536 웰 플레이트와 같은 단일 및 다중 웰 플레이트와 같은 세포 배양 플레이트를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 명세서에 기재된 세포 배양 물품은 소다석회 유리, 파이렉스 유리(pyrex glass), 바이코 유리(vycor glass), 석영 유리와 같은 유리 물질; 규소; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리메틸펜텐, 사이클릭 올레핀 중합체, 사이클릭 올레핀 공중합체, 폴리염화비닐, 폴리우레탄, 폴리에스테르, 폴리아미드, 에틸렌-아세트산비닐 공중합체, 에틸렌-비닐알코올 공중합체, 에틸렌-아크릴산 공중합체, 에틸렌-아크릴산메틸 공중합체, 에틸렌-메타크릴산 공중합체, 에틸렌-메타크릴산메틸 공중합체, 폴리아크릴산, 폴리메타크릴산, 폴리아크릴산메틸, 및 폴리메타크릴산메틸 또는 이들의 유도체 등과 같은 플라스틱 또는 중합체를 포함하는 임의의 적합한 물질로 제조될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포 배양 시스템은 세포를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포주로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조직 세포, 면역 세포, 내피 세포, 줄기 세포, 상피 세포, 간엽 세포, 중피 세포, 암 세포 또는 종양 관련 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포 배양 시스템은 배양 배지를 추가로 포함한다.
본 명세서에 개시된 세포 배양 시스템은 세포 부착 및 성장 뿐만 아니라 배양된 세포(예를 들어, 3D 세포 배양, 조직 및 기관)의 생존 가능한 수확을 가능하게 한다. 본 개시내용의 일부 실시양태에 따르면, 세포 배양 시스템은 80% 내지 100% 생존 가능, 또는 약 85% 내지 약 99% 생존 가능, 또는 약 90% 내지 약 99% 생존 가능을 비롯한 생존가능한 세포를 수확하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 수확된 세포 중 80% 이상은 생존 가능하고, 85% 이상은 생존 가능하며, 90% 이상은 생존 가능하고, 91% 이상은 생존 가능하며, 92% 이상은 생존 가능하고, 93% 이상은 생존 가능하며, 94% 이상은 생존 가능하고, 95% 이상은 생존 가능하고, 96% 이상은 생존 가능하고, 97% 이상은 생존 가능하고, 98% 이상은 생존 가능하거나 또는 99% 이상은 생존 가능하다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포 분리 효소, 예를 들어, 트립신, TrypLE 또는 Accutase를 사용하거나 사용하지 않고 세포 배양 시스템으로부터 방출될 수 있다.
이의 제조방법 및 용도
1) 세포 배양 방법
임의의 특정 이론에 구속됨이 없이, 본원에 개시된 기판은 세포의 강력한 증식 및/또는 안정적인 유지를 가능하게 하는 것으로 믿어진다. 따라서, 본 개시내용은 세포 배양 방법을 제공한다. 상기 방법은 (a) 본 개시내용의 기판을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공하는 단계; (b) 기판의 표면에 세포를 시딩하는 단계; 및 (c) 적절한 배지 하에 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 스페로이드를 형성하기에 충분한 기간 동안 배양된다. 바람직한 실시예에서, 스페로이드는 3D 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 스페로이드는 단일 세포 증식을 통해 생성된다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 스페로이드는 세포 응집 없이 단일 세포 증식을 통해 생성된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 균일한 크기를 갖는다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 세포주, 조직 생체검사 또는 액체 생체검사로부터 유래될 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조직 세포, 면역 세포, 내피 세포, 줄기 세포, 상피 세포, 간엽 세포, 중피 세포, 암 세포 또는 종양 관련 세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함하는 간엽 줄기 세포(MSC) 또는 만능 줄기 세포(PSC)와 같은 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 암 세포이다. 본원에 기재된 예시적인 암은 급성 림프계 암, 급성 골수성 백혈병, 폐포 횡문근육종, 골암, 뇌암, 유방암, 항문암, 항문관 또는 항문직장암, 눈의 암, 간내 담관암, 관절암, 목암, 담낭암 또는 흉막암, 코암, 비강암 또는 중이암, 구강암, 외음부암, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 위장관 유암종, 신경교종, 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 악성 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 복막암, 대망막암, 장간막암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연부조직암, 위암, 고환암, 갑상선암, 요관암 및 방광암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.　
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포는 종양 관련 세포이다. 종양 관련 세포의 예에는 종양 세포 클러스터, 종양 침윤 림프구(TIL), 암 관련 대식세포(CAML), 종양 관련 대식세포(TAM), 종양 관련 단핵구/대식세포 계통 세포(MMLC), 암 줄기 세포, 종양 미세색전, 종양 관련 기질 세포(TASC), 종양 관련 골수 세포(TAMC), 종양 관련 조절 T 세포(Treg), 암 관련 섬유아세포(CAF), 종양 유래 내피 세포(TEC), 종양 관련 호중구(TAN), 종양 관련 혈소판(TAP), 종양 관련 면역 세포(TAI), 골수 유래 억제 세포(MDSC), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 세포는 저밀도 세포, 단일 세포, 희귀 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 저밀도 세포는 시드될 때 세포일 수 있고, 기판 상에서 cm2 당 5000개 미만, 예를 들어, 기판상에서 약 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 4500/cm2 중 어느 것 보다 크지 않다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 분리된 세포를 시딩하는 것은 기판 표면(즉, 세포 성장 표면) 상에 cm2당 1개 내지 10개 세포의 밀도로 세포를 플레이팅(plating)하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 분리된 세포를 시딩하는 것은 세포를 기판 표면 상에 cm2당 10개 세포 내지 100개 세포의 밀도로 플레이팅하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 분리된 세포를 시딩하는 것은 세포를 기판 표면 상에 cm2당 100개 세포 내지 1000개 세포의 밀도로 플레이팅하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포는 약 2일 내지 약 5주, 예를 들어 약 3 내지 약 14일, 예를 들어 약 7일 범위의 기간 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 3일 동안 배양되고 스페로이드는 약 40㎛ 내지 약 200㎛ 범위의 평균 직경을 갖는다.
임의의 적합한 배양 배지가 예시적 실시양태의 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 배양 배지는 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM), 표피 성장 인자(EGF) 및/또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), B27 보충물, 표피 성장 인자(EGF) 및 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 보충된 둘베코 개질된 이글 배지(DMEM)의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
2) 단일 세포 유래 스페로이드를 제조하는 방법
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 (a) 본 개시내용의 기판을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공하는 단계; (b) 기판의 표면에 세포를 시딩하는 단계; 및 (d) 스페로이드가 단일 세포 유래인 스페로이드를 형성하기에 충분한 시간 동안 적절한 배지 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는 단일 세포 유래 스페로이드를 제조하는 방법을 제공한다. 본원에 기재된 스페로이드는 단일 세포 증식을 통해 생성된다. 일부 실시양태에서, 스페로이드는 균일한 크기를 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 클론은 본 개시내용의 기판 상에 반-부착되거나 느슨하게 부착된다.
일부 실시양태에서, 세포는 세포주로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조직 세포, 면역 세포, 내피 세포, 줄기 세포, 상피 세포, 간엽 세포, 중피 세포, 암 세포 또는 종양 관련 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 배아 줄기 세포(ESC) 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함하는 간엽 줄기 세포(MSC) 또는 만능 줄기 세포(PSC)와 같은 줄기 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 암 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 암 세포이다. 특정 실시양태에서, 암 세포는 인간 원발성 종양 조직으로부터 분리된다. 특정 실시양태에서, 암 세포는 암 환자의 혈액 샘플로부터 분리된다. 본원에 기재된 예시적인 암은 급성 림프계 암, 급성 골수성 백혈병, 폐포 횡문근육종, 골암, 뇌암, 유방암, 항문암, 항문관 또는 항문직장암, 눈의 암, 간내 담관암, 관절암, 목암, 담낭암 또는 흉막암, 코암, 비강암 또는 중이암, 구강암, 외음부암, 만성 림프성 백혈병, 만성 골수암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 위장관 유암종, 신경교종, 호지킨 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 악성 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비호지킨 림프종, 난소암, 췌장암, 복막암, 대망막암 및 장간막암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신장암, 피부암, 소장암, 연부조직암, 위암, 고환암, 갑상선암, 요관암 및 방광암을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.　
일부 실시양태에서, 세포는 종양 관련 세포이다. 종양 관련 세포의 예에는 종양 세포 클러스터, 종양 침윤 림프구(TIL), 암 관련 대식세포(CAML), 종양 관련 대식세포(TAM), 종양 관련 단핵구/대식세포 계통 세포(MMLC), 암 줄기 세포, 종양 미세색전, 종양 관련 기질 세포(TASC), 종양 관련 골수 세포(TAMC), 종양 관련 조절 T 세포(Treg), 암 관련 섬유아세포(CAF), 종양 유래 내피 세포(TEC), 종양 관련 호중구(TAN), 종양 관련 혈소판(TAP), 종양 관련 면역 세포(TAI), 골수 유래 억제 세포(MDSC), 및 이들의 조합을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
예시적인 세포는 저밀도 세포, 단일 세포, 희귀 세포, 또는 이들의 조합을 포함한다. 저밀도 세포는 시드될 때 세포일 수 있고, 기판 상에서 cm2 당 5000개 미만, 예를 들어, 기판상에서 약 1, 5, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 500, 1000, 2000, 3000, 4000 또는 4500/cm2 중 어느 것 보다 크지 않다.
일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 분리된 세포를 시딩하는 것은 기판 표면(즉, 세포 성장 표면) 상에 cm2당 1개 내지 10개 세포의 밀도로 세포를 플레이팅(plating)하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 분리된 세포를 시딩하는 것은 세포를 기판 표면 상에 cm2당 10개 세포 내지 100개 세포의 밀도로 플레이팅하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 단계 (c)에서 분리된 세포를 시딩하는 것은 세포를 기판 표면 상에 cm2당 100개 세포 내지 1000개 세포의 밀도로 플레이팅하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 배양 단계는 2 내지 8일(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8일)의 기간에 걸쳐 발생한다. 다른 실시양태에서, 배양 단계는 7 내지 14일(예를 들어, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일)의 기간에 걸쳐 발생한다. 다른 실시양태에서, 배양 단계는 1 내지 4주의 기간(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4주)에 걸쳐 발생한다. 일부 실시양태에서, 세포는 3일 동안 배양되고 스페로이드는 약 40㎛ 내지 약 200㎛ 범위의 평균 직경을 갖는다.
임의의 적합한 배양 배지가 예시적 실시양태의 방법에 사용될 수 있다. 예시적인 배양 배지는 둘베코 수정 이글 배지(DMEM), 표피 성장 인자(EGF) 및/또는 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), B27 보충물, 표피 성장 인자(EGF) 및 기본 섬유아세포 성장 인자(bFGF)가 보충된 둘베코 수정 이글 배지(DMEM)의 혼합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 스페로이드의 크기는 직경이 200㎛ 미만이다. 일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 스페로이드의 크기는 직경이 150㎛ 미만이다. 일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 스페로이드의 크기는 직경이 약 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 또는 140㎛이다.
특정 실시양태에서, 단일 세포 유래 스페로이드는 치료제를 스크리닝(screening)하기 위해 사용될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료제를 스크리닝하는 방법은 (a) 이로부터 생성된 단일 세포 유래 스페로이드에 시험 물질을 적용하는 단계; 및 (b) 단일 세포 유래 스페로이드에 대한 시험 물질의 효과를 평가하는 단계를 포함한다. 일부 실시양태에서, 시험 물질의 효과는 예를 들어 유전자 또는 단백질의 생화학적 활성 및/또는 발현 수준을 분석하기 위해 이미징 시스템으로 분석된다.
일부 실시양태에서, 이로부터 생성된 단일 세포 유래 스페로이드는 종양 스페로이드이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시험 물질은 세포독성 또는 세포정지 화학요법 약물과 같은 화학요법 약물이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 면역 관문 억제제(immune checkpoint inhibitor), 예컨대 면역 관문 억제제이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 핵산 약물이다. 일부 실시양태에서, 치료제는 T 세포, 자연 살해(NK) 세포, 및 수지상 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 치료 세포 조성물이다.
일부 실시양태에서, 세포는 약 2일 내지 약 5주, 예를 들어 약 3 내지 약 14일, 예를 들어 약 7일 범위의 기간 동안 배양된다. 일부 실시양태에서, 세포는 3일 동안 배양되고 적어도 하나의 3D 스페로이드는 약 40㎛ 내지 약 200㎛ 범위의 평균 직경을 갖는다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 세포 배양 시스템을 사용하는 배양 방법 중 어느 하나에 따라 생성된 단일 세포-유래 스페로이드(예를 들어, 종양 스페로이드)가 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 세포 배양 시스템을 사용하는 배양 방법 중 어느 하나에 따라 유래된 단일 세포-유래 스페로이드(예를 들어, 종양 스페로이드)의 라이브러리(library)가 제공된다.
3) 단일 세포 유래 클론을 분리하는 방법
게놈 편집 기술이 일상적인 실험실 실습에 들어감에 따라 단일 세포 유래 클론의 중요성이 커지고 있다. 단일 세포를 분리하는 전통적인 방법인 제한 희석은, 프로토콜에 대한 약간의 변경으로 크게 달라질 수 있는 단클론성에 대한 통계적 확률에 의존한다. 이 기술은 단일 세포를 분리하는 데 매우 비효율적이지만 세포 생존력을 보존한다. 반대로, 유세포 분석(flow cytometry)은 단일 세포 클론을 고효율로 제공할 수 있지만 세포 생존력에 부정적인 영향을 미친다. 이러한 플랫폼들의 공통된 특성은 일반적으로 미세 구조에 무작위 갇힘(random confinement)으로 인해 '개별화'되는 많은 수의 세포를 포함하는 현탁액으로 시작한다는 것이다. 이 두 가지 방법은 혼합 및/또는 이동 중에 상당한 세포 손실을 발생시키기 때문에 세포 집단이 작을 때 비실용적이다. 본 발명의 방법은 생존 가능한 단일 세포 클론을 분리하기 위한 효율적인 대안을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 미세구조에 세포의 개별적 갇힘을 필요로 하지 않는다.
일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 클론을 분리하는 방법이 본원에 제공된다. 본 명세서에 기술된 방법은 다음을 포함한다: 1) 본 개시내용의 기판을 포함하는 세포 배양 시스템을 사용하여 세포의 이종 집단을 배양하여 단일 세포 유래 클론을 포함하는 복수의 세포 클론을 수득하는 단계; 및 2) 세포 배양 시스템으로부터 단일 세포 유래 클론을 분리하는 단계.
일부 실시양태에서, 세포의 이종 집단은 부착성 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 이종 집단은 비-부착 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 이종 집단은 세포주로부터 분리된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 이종 집단은 대상체의 액체 생체검사로부터 분리된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 이종 집단은 대상체의 조직 생체검사로부터 분리된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 이종 집단은 유전적으로 조작된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 이종 집단은 유전적 돌연변이를 포함하도록 조작된 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포의 이종 집단은 이종 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 조작된 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 클론은 본 개시내용의 기판 상에 반-부착되거나 느슨하게 부착된다.
일부 실시양태에서, 배양 7일 이상 후에 세포 배양 시스템에서 세포 파편이 관찰되지 않는다.
일부 실시양태에서, 배양 단계는 2 내지 8일(예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 8일)의 기간에 걸쳐 발생한다. 다른 실시양태에서, 배양 단계는 7 내지 14일(예를 들어, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 또는 14일)의 기간에 걸쳐 발생한다. 다른 실시양태에서, 배양 단계는 1 내지 4주의 기간(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4주)에 걸쳐 발생한다.
일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 클론은 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 클론은 약 40㎛ 내지 약 200㎛의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 클론은 약 50㎛ 내지 약 150㎛의 직경을 갖는다. 일부 경우에, 단일 세포 유래 클론은 직경이 약 50㎛ 내지 약 120㎛, 약 50㎛ 내지 약 100㎛, 약 50㎛ 내지 약 80㎛, 약 50㎛ 내지 약 60㎛, 약 80㎛ 내지 약 150㎛, 약 80㎛ 내지 약 120㎛, 약 80㎛ 내지 약 100㎛, 약 100㎛ 내지 약 200㎛, 약 100㎛ 내지 약 150㎛, 또는 약 100㎛ 내지 약 120㎛이다.
일부 예에서, 단일 세포 유래 클론이 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다. 일부 경우에, 스페로이드는 약 8 내지 약 1000개의 세포를 포함한다. 일부 경우에, 스페로이드는 약 8 내지 약 800개의 세포, 약 8 내지 약 500개의 세포, 약 8 내지 약 400개의 세포, 약 8 내지 약 300개의 세포, 약 8 내지 약 200개의 세포, 약 8 내지 약 100개의 세포, 약 10 내지 약 1000개의 세포, 약 10 내지 약 800개의 세포, 약 10 내지 약 500개의 세포, 약 10 내지 약 400개의 세포, 약 10 내지 약 300개의 세포, 약 10 내지 약 200개의 세포, 약 10 내지 약 100개의 세포, 약 50 내지 약 1000개의 세포, 약 50 내지 약 800개의 세포, 약 50 내지 약 500개의 세포, 약 50 내지 약 400개의 세포, 약 50 내지 약 300개의 세포 , 약 50 내지 약 200개의 세포, 약 100 내지 약 1000개의 세포, 약 100 내지 약 800개의 세포, 약 100 내지 약 500개의 세포, 약 100 내지 약 400개의 세포, 약 100 내지 약 300개의 세포, 약 300 내지 약 1000개의 세포, 약 300 내지 약 800개의 세포, 약 300 내지 약 500개의 세포, 약 500 내지 약 1000개의 세포, 또는 약 500 내지 약 800개의 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 기판 상에 배치된 세포의 적어도 10%는 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 기판 상에 배치된 세포의 적어도 20%는 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 기판 상에 배치된 세포의 적어도 30%는 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 기판 상에 배치된 세포의 적어도 40%는 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 기판 상에 배치된 세포의 적어도 50%는 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 기판 상에 배치된 세포의 적어도 60%는 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다. 일부 실시양태에서, 기판 상에 배치된 세포의 적어도 70%는 단일 세포 유래 스페로이드를 형성한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 단일 세포 유래 클론을 분석함으로써 단일 세포의 특성을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 일부 경우에, 단일 세포 유래 클론을 분석하는 단계는 단일 세포 유래 클론을 시퀀싱(sequencing) 분석에 적용하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석 단계는 유전자형 분석을 수행하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 유전자형 분석은 PCR 기반 분석이다. 일부 실시양태에서, 유전자형 분석은 어레이 혼성화(array hybridization) 기반 분석이다. 일부 실시양태에서, 분석 단계는 카피 수 변이를 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석 단계는 유전적 돌연변이를 분석하는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 분석 단계는 단일 뉴클레오티드 다형성을 분석하는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 세포 유래 클론을 분석하는 단계는 단일 세포 유래 클론을 단백질체 분석에 적용하는 것을 포함한다. 예시적인 단백질체 분석은 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE), 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE), 2차원 겔 전기영동 또는 모세관 전기영동과 같은 겔 전기영동; 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC); 및 친화성 크로마토그래피를 포함한다.
일부 실시양태에서, 단일 세포의 특징은 유전자형, 후성 유전학적 프로파일, 유전자 또는 단백질의 발현 수준, 약물에 대한 반응, 약물 내성 프로파일, 또는 전이 가능성 중 하나 이상을 포함한다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 세포 배양 시스템을 사용하는 배양 방법 중 어느 하나에 따라 생성된 단일 세포 유래 클론이 본원에 제공된다. 일부 측면에서, 본원에 기재된 세포 배양 시스템을 사용하는 배양 방법 중 어느 하나에 따라 유래된 단일 세포 유래 클론의 라이브러리가 제공된다.
키트
특정 실시양태에서, 본원에 기재된 세포 배양 기판을 포함하는 키트 또는 제조 물품이 본원에 개시된다. 일부 예에서, 키트는 바이알, 튜브 등과 같은 하나 이상의 용기를 수용하도록 구획화된 패키지 또는 용기를 추가로 포함하며, 각각의 용기(들)는 본원에 기재된 방법에 사용되는 개별 요소 중 하나를 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 일 실시양태에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로 형성된다.
일부 경우에, 키트는 내용물 및/또는 사용 지침을 나열하는 라벨, 및 사용 지침, 예를 들어 단일 세포 유래 클론을 포함하는 복수의 세포 클론을 수득하기 위해 본원에 기재된 세포 배양 기판을 사용하여 세포의 이종 집단을 배양하기 위한 지침이 있는 패키지 삽입물을 추가로 포함한다. 일반적으로 일련의 지침도 포함된다.
특정 용어
달리 규정하지 않는 한, 본원에서 사용되는 기술 용어 및 과학 용어는 청구범위가 속하는 당업자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상기 일반 설명 및 하기 상세한 설명은 단지 예시적 및 설명적이고 청구된 주제의 제한적이 아님이 이해되어야 한다. 본 출원에서 단수의 사용은 특별히 달리 언급하지 않는 한 복수를 포함한다. 본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 내용이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 복수의 지시 대상을 포함한다는 점에 유의해야 한다. 본 출원에서, "또는(or)"의 사용은 달리 명시되지 않으면 "및/또는(and/or)"을 의미한다. 또한, "포함하는(including)"이라는 용어와 "포함하다(include)", "포함하다(includes)" 및 "포함된(included)"과 같은 다른 형태의 사용은 제한적이지 않다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 범위 및 양은 특정 값 또는 범위 "약"으로 표현될 수 있다. 약은 정확한 양도 포함한다. 따라서 "약 5 μL"은 "약 5 μL" 및 또한 "5 μL"을 의미한다. 일반적으로 "약"이라는 용어는 실험 오차 범위 내에 있을 것으로 예상되는 양을 포함한다.
본원에 사용된 섹션 제목은 구성적 목적으로만 사용되며 설명된 주제를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "포함하는(comprising)"이라는 용어는 방법이 인용된 단계 또는 요소를 포함하지만 다른 것을 배제하지 않는다는 것을 의미하도록 의도된다. "필수적으로 이루어진"은 청구된 방법의 기본 및 신규 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 단계 또는 요소의 포함에 대해서만 청구범위를 공개하는 것을 의미한다. "이루어진"은 청구 범위에 명시되지 않은 임의의 요소 또는 단계를 제외하는 것을 의미한다. 이러한 전환 용어 각각에 의해 정의된 실시양태는 본 개시의 범위 내에 있다.
본원에 사용된 용어 "양으로 하전된 고분자전해질"은 2개 이상의 양전하를 포함하는 복수의 단량체 단위 또는 비-중합체 분자를 포함한다. 일부 예에서, 양으로 하전된 고분자전해질은 또한 양의 순 전하를 갖는 전하 양전하 기, 전하 중성 기 또는 전하 음전하 기를 포함하는 복수의 단량체 단위 또는 비-중합체 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "양이온성 폴리머"는 복수의 단량체 단위 또는 비중합체성 분자를 포함한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리머는 합성 폴리머이다. 다른 경우에, 양이온성 폴리머는 천연 폴리머이다.
본원에 사용된 용어 "양이온성 폴리펩티드"는 2개 이상의 양전하를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 음으로 하전된 잔기, 및 극성 잔기를 포함하지만 폴리펩티드의 순전하는 양이다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드는 길이가 8 내지 100개 아미노산이다. 일부 경우에, 양이온성 폴리펩티드는 8 내지 80, 8 내지 50, 8 내지 40, 8 내지 30, 8 내지 25, 8 내지 20, 8 내지 15, 10 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 20 내지 40, 20 내지 30, 30 내지 100, 30 내지 80, 30 내지 50, 40 내지 100, 40 내지 80, 또는 50 내지 100개의 아미노산이다.
본원에 사용된 용어 "음으로 하전된 고분자전해질"은 2개 이상의 음전하를 포함하는 복수의 단량체 단위 또는 비-중합체 분자를 포함한다. 일부 경우에, 음으로 하전된 고분자전해질은 또한 음의 순 전하를 갖는 전하 양전하 기, 전하 중성 기 또는 전하 음전하 기를 포함하는 복수의 단량체 단위 또는 비-중합체 분자를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "음이온성 폴리머"는 복수의 단량체 단위 또는 비-중합체성 분자를 포함한다. 일부 경우에, 음이온성 폴리머는 합성 폴리머이다. 다른 경우에, 음이온성 폴리머는 천연 폴리머이다.
본원에 사용된 용어 "음이온성 폴리펩티드"는 2개 이상의 음전하를 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. 일부 경우에, 음이온성 폴리펩티드는 양으로 하전된 아미노산 잔기, 음으로 하전된 잔기, 및 극성 잔기를 포함하지만 폴리펩티드의 순전하는 음이다. 일부 경우에, 음이온성 폴리펩티드는 길이가 8 내지 100개 아미노산이다. 일부 경우에, 음이온성 폴리펩티드는 길이가 8 내지 80, 8 내지 50, 8 내지 40, 8 내지 30, 8 내지 25, 8 내지 20, 8 내지 15, 10 내지 100, 10 내지 80, 10 내지 50, 10 내지 40, 10 내지 30, 10 내지 20, 20 내지 100, 20 내지 80, 20 내지 50, 20 내지 40, 20 내지 30, 30 내지 100, 30 내지 80, 30 내지 50, 40 내지 100, 40 내지 80, 또는 50 내지 100개의 아미노산이다.
본원에 사용된 용어 "흡수성 폴리머"는 하나 이상의 친수성 기를 포함하는 복수의 단량체 단위 또는 비-중합체성 분자를 포함한다. 일부 경우에, 흡수성 폴리머는 수용액에 대해 투과성이다. 다른 경우에, 흡수성 폴리머는 불투과성이거나 수용액을 흡수하지 않는다. 일부 경우에, 흡수성 폴리머는 비반응성 폴리머, 또는 반응성 기, 예를 들어 다른 화합물과 공유 결합을 형성하는 기를 함유하지 않는 폴리머를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "폴리머"는 단독중합체 및 공중합체, 분지형 및 비분지형, 및 천연 또는 합성 폴리머를 모두 포함한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 용어 "엘라스토머"는 점탄성 특성, 낮은 결정도 및 높은 비정질 함량을 갖는 폴리머를 지칭한다. 경우에 따라 엘라스토머는 다른 물질에 비해 영률이 낮고 파단 신율이 높다. 일부 경우에, 엘라스토머는 탄소, 수소, 산소 및/또는 규소의 단량체로부터 생성된 비정질 폴리머이다.
본원에 사용된 면역 세포는 호중구, 호산구, 호염기구, 비만 세포, 단핵구, 대식세포, 수지상 세포, 자연 살해 세포 및 림프구(B 세포 및 T 세포)를 포함한다.
내피 세포는 혈관과 림프관의 내부 표면을 따라 늘어선 세포이다. 예시적인 내피 세포는 고내피 세정맥(HEV), 골수의 내피, 및 뇌의 내피를 포함한다.
상피 세포는 장기와 혈관의 외부 표면, 및 내부 장기 내 구멍의 내부 표면을 따라 늘어선 세포이다. 예시적인 상피 세포는 편평 상피, 입방 상피 및 원주 상피를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 바와 같이, "줄기세포"라는 용어는 성체 줄기세포 및 배아 줄기세포를 포함한다. 예시적인 줄기 세포는 조혈 줄기 세포, 간엽 줄기 세포(MSC), 신경 줄기 세포, 상피 줄기 세포, 피부 줄기 세포, 배아 줄기 세포(ESC), 및 유도 만능 줄기 세포(iPSC)를 포함한다.
실시예
이러한 실시예는 설명의 목적으로만 제공되며 본원에 제공된 청구 범위를 제한하지 않는다.
실시예 1: 본 발명의 기판의 구성
소수성 표면을 갖는 PDMS의 제조
소수성 표면을 갖는 PDMS를 제조하는 절차는 PDMS 단량체 A와 경화제 B(Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트, Dow Corning)를 10:1(w/w) 비율로 혼합한 PDMS 혼합물로 이루어진다. 혼합물을 페트리 접시에 붓고 70℃에서 15시간 동안 경화시킨다. 약 1mm 두께의 생성된 PDMS 멤브레인은 소수성이다.
임의의 적절한 PDMS 친수성 표면 개질을 사용하여 소수성 표면을 친수성 표면으로 전환할 수 있다. 다음은 PDMS 친수성 표면 개질의 예시적인 실시양태이다.
PVA 적층을 통한 PDMS의 친수성 표면 개질
처리의 제1 단계는 PDMS 표면을 산소 플라즈마에 노출시킨 다음 플라즈마 산화된 PDMS 표면을 짧은 시간(예를 들어, 10분) 동안 물에서 1 내지 2wt% PVA에 노출시키는 것이다. 산소 플라즈마 처리는 PDMS 표면에 표면 실라놀기(Si-OH), 알코올성 수산기(C-OH) 및 카르복실산(COOH)의 라디칼 종을 생성하고 이러한 종은 PVA 분자와 활성화된 PDMS 표면 사이에 수소 결합을 허용하는데, 이는 영구적으로 친수화된 표면으로 이어진다. PVA 처리된 PDMS 표면은 장기간에 걸쳐 친수성을 유지한다.
PDMS 표면 특성에 대한 PVA 적층의 영향을 조사하기 위해 접촉각 측정을 적용할 수 있다. 플라즈마 및 PVA로 처리된 PDMS는 처리되지 않은 PDMS보다 낮은 물-공기 접촉각을 나타낸다. PVA 코팅이 있는 플라즈마 산화된 PDMS 표면의 표면 거칠기는 처리되지 않은 PDMS 표면의 표면 거칠기보다 높다.
하이드로실릴화 및 PEG 접합을 통한 PDMS의 친수성 표면 개질
도 6은 하이드로실릴화를 통한 PDMS의 예시적인 친수성 표면 개질을 도시한다. 폴리(에틸렌 글리콜) 메틸 에테르 아크릴레이트(PEG-아크릴레이트)는 PDMS 표면에 PEG-아크릴레이트 사슬의 공유 결합을 통해 PDMS의 소수성 표면을 개질하는 데 사용할 수 있다. PDMS 표면에 SiH 기의 포함은 산 촉매를 사용하여 PDMS의 Me2SiO를 PHMS의 HMeSiO로 교환하는 것을 포함한다. 이것은 표면에 고농도의 SiH 기가 있는 PDMS로 이어진다.
처리의 제1 단계는 PDMS를 메탄올이 포함된 폴리하이드로메틸실록산(PHMS)에 침지하여 PDMS 표면에 SiH 기를 도입(PDMS-SiH)하는 것이다. 촉매량의 트리플루오로메탄설폰산을 첨가하고 시스템을 실온에서 약 30분 동안 설정하였다. 그런 다음 PDMS 표면을 용매(예를 들어, 메탄올, 헥산)에서 순차적으로 헹구어 잔류 반응물을 제거하고 진공 건조한다.
처리의 제2 단계는 PDMS-SiH 샘플을 PEG-아크릴레이트와 디에틸렌-글리콜 디메틸 에테르(1:3, v/v)의 혼합물에 도입하여 PEG 개질된 PDMS 표면을 제조하는 것이다. 촉매량의 Karstedt 촉매(백금-디비닐테트라메틸디실록산 착물)를 반응 혼합물에 첨가하고 70℃에서 충분한 반응 시간 동안 교반한다. 개질된 PDMS 표면은 처리되지 않은 PDMS보다 낮은 물-공기 접촉각 및 높은 표면 에너지를 나타낸다.
고분자전해질 다층의 구축
PLL(MW 150K-300K), PLGA(MW 50K-100K), PLO(0.01%) 용액, PLH(MW 5K-25K), PLA(MW 15K-70K)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)로부터 상업적으로 입수가능하다. 다중양이온 및 다중음이온 모두 Tris-HCl 완충액(pH 7.4)에 용해되고 Tris-HCl 완충액으로 헹군 후 PVA 또는 PEG 코팅 표면에 적층된다. 다중양이온 또는 다중음이온의 각 층을 적층하고 10분 동안 배양한 다음 Tris-HCl 완충액으로 2, 1, 1분 동안 3회 세척한다. PLL/PLGA, PLO/PLGA, PLH/PLGA 및 PLA/PLGA 다층 필름은 다음과 같이 PVA 또는 PEG 코팅된 표면에 층별 자기조립(self-assembly)에 의해 제조할 수 있다.
PLL/PLGA 다층
일부 실시양태에서, 고분자전해질 다층은 PVA/PDMS 또는 PEG/PDMS의 표면 상에 PLL 및 PLGA를 순차적으로 적층함으로써 구성될 수 있는 PLL/PLGA 다층이다. 각 적층 단계는 플레이트 표면에 PLL 또는 PLGA 용액을 첨가하고, 10분 동안 배양하고 2, 1 및 1분 동안 3번 세척하는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, (PLGA/PLL)3/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLL)5/PVA/PDMS로 구성된 기판 코팅이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLL)10/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLL)15/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLL(PLGA/PLL)3/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLL(PLGA/PLL)5/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLL(PLGA/PLL)10/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLL(PLGA/PLL)15/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLL)3/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLL)5/PEG/PDMS로 구성된 기판 코팅이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLL)10/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLL)15/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLL(PLGA/PLL)3/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLL(PLGA/PLL)5/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLL(PLGA/PLL)10/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLL(PLGA/PLL)15/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다.
PLO/PLGA 다층
일부 실시양태에서, 고분자전해질 다층은 PVA/PDMS 또는 PEG/PDMS의 표면 상에 PLO 및 PLGA를 순차적으로 적층함으로써 구성될 수 있는 PLO/PLGA 다층이다. 각 적층 단계는 플레이트 표면에 PLO 또는 PLGA 용액을 첨가하고 10분 동안 배양하고 2, 1, 1분 동안 3번 세척하는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, (PLGA/PLO)3/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLO)5/PVA/PDMS로 구성된 기판 코팅이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLO)10/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLO)15/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLO(PLGA/PLO)3/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLO(PLGA/PLO)5/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLO(PLGA/PLO)10/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLO(PLGA/PLO)15/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLO)3/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLO)5/PEG/PDMS로 구성된 기판 코팅이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLO)10/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLO)15/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLO(PLGA/PLO)3/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLO(PLGA/PLO)5/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLO(PLGA/PLO)10/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLO(PLGA/PLO)15/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구축된다.
PLH/PLGA 다층
일부 실시양태에서, 고분자전해질 다층은 PVA/PDMS 또는 PEG/PDMS의 표면 상에 PLH 및 PLGA를 순차적으로 적층함으로써 구성될 수 있는 PLH/PLGA 다층이다. 각 적층 단계는 PLH 또는 PLGA 용액을 플레이트 표면에 첨가하고 10분 동안 배양하고 2, 1 및 1분 동안 3회 세척하는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, (PLGA/PLH)3/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLH)5/PVA/PDMS로 구성된 기판 코팅이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLH)10/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLH)15/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLH(PLGA/PLH)3/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLH(PLGA/PLH)5/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLH(PLGA/PLH)10/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLH(PLGA/PLH)15/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLH)3/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLH)5/PEG/PDMS로 구성된 기판 코팅이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLH)10/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLH)15/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLH(PLGA/PLH)3/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLH(PLGA/PLH)5/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLH(PLGA/PLH)10/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLH(PLGA/PLH)15/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다.
PLA/PLGA 다층
일부 실시양태에서, 고분자전해질 다층은 PVA/PDMS 또는 PEG/PDMS의 표면 상에 PLA 및 PLGA를 순차적으로 적층함으로써 구성될 수 있는 PLA/PLGA 다층이다. 각 적층 단계는 PLA 또는 PLGA 용액을 플레이트 표면에 첨가하고 10분 동안 배양하고 2, 1, 1분 동안 3회 세척하는 것을 포함한다.
일 실시양태에서, (PLGA/PLA)3/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLA)5/PVA/PDMS로 구성된 기판 코팅이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLA)10/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLA)15/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLA(PLGA/PLA)3/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLA(PLGA/PLA)5/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLA(PLGA/PLA)10/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLA(PLGA/PLA)15/PVA/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLA)3/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLA)5/PEG/PDMS로 구성된 기판 코팅이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLA)10/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, (PLGA/PLA)15/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLA(PLGA/PLA)3/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLA(PLGA/PLA)5/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLA(PLGA/PLA)10/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다. 일 실시양태에서, PLA(PLGA/PLA)15/PEG/PDMS로 구성된 기판이 구성된다.
석영 결정 미세저울 소산(QCM-D) 측정
QCM 실험은 Q-Sense E4(Biolin Scientific AB/Q-sence, 스웨덴)에서 수행되었다. 산화규소(SiO2) 코팅된 석영 결정 칩(AT-컷 석영 결정, f0 = 5MHz)을 0.1M 도데실 황산나트륨으로 세척한 다음 Milli-Q 물로 헹구고 질소 하에 건조시키고, 산소 플라즈마에 20초 동안 노출시켰다. QCM-D 측정을 위해, 챔버는 25℃로 안정화되었고 모든 측정은 세 번째 배음(overtone)(15MHz)에서 기록되었다. 연속 표면 코팅을 시뮬레이션하기 위해 QCM-D 챔버에서 각 코팅 단계의 농도와 세척 조건이 동일하다. 약 1% 소 혈청 알부민(BSA, Millipore, Bedford, MA)이 비특이적 흡착 조사에 사용되었으며 표면의 챔버에 도입되었다.
표면 화학 분석
본 발명의 표면 코팅의 화학적 조성은 실리콘 웨이퍼 상에서 C60(10 kV, 10 nA) 에칭을 이용한 X선 광전자 분광법(XPS; VersaProbe III, PHI)에 의해 분석되었다. 사용된 통과 에너지는 0.5 eV 단계에서 93.9 eV였다. 탄소, 질소, 산소 및 규소의 상대 원자 농도는 샘플 층에서 최대 두께 10nm까지 측정되었다.
원자력 현미경(Atomic-Force Microscope; AFM)을 이용한 표면 거칠기 측정
본 발명의 표면 코팅의 거칠기는 탭 모드(tapping mode)로 원자력 현미경(AFM; Nanowizard 3, JPK 기기)을 사용하여 측정하였다. 134kHz의 공진 주파수를 가진 실리콘 캔틸레버(cantilever)가 실험에 사용되었다.
실시예 2: 단일 세포 유래 스페로이드의 형성
도 7은 완전한 DMEM 배지가 공급된 암 세포의 성장 동안 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 7일에 본 발명의 기판 상에서 배양된 HCT116 결장직장암 세포의 시간 경과 현미경 관찰을 나타낸다(10x 대물렌즈에서 Leica DMI6000B 시간 경과 현미경으로 촬영한 이미지).
실시예 3: 세포주 유래 종양 스페로이드의 생성
본 발명의 기판은 세포 증식을 위한 세포 부착을 가능하게 하는 생체적합성 다층 코팅된 표면을 제공하고, 또한 표면에서 직접 스페로이드 형성을 위한 비오염 특성을 제공한다. 비교를 위해, 도 8A 내지 8C는 4, 7 및 14일 동안 다양한 배양 플레이트에서 HCT116 결장직장암 세포의 생체외 배양 결과를 보여준다. (A) 조직 배양 플레이트(TCP), (B) PVA/PDMS 코팅된 표면을 포함하는 배양 플레이트, 및 (C) (PLL/PLGA)15/PVA/PDMS 코팅된 표면을 포함하는 배양 플레이트. 세포는 TCP 및 PVA/PDMS 코팅된 표면에 접착성인 반면, 세포는 (PLL/PLGA)15/PVA/PDMS 코팅된 표면에서 스페로이드(즉, 종양 스페로이드)를 형성한다.
실시예 4: 환자 유래 종양 스페로이드 생성
본 발명의 기판을 포함하는 세포 배양 시스템은 다양한 환자-유래 임상 샘플로 시험되었고 성공적인 배양 및 스페로이드 형성을 초래하였다. 도 9A 내지 9D는 환자 유래 임상 샘플의 생체외 배양 결과를 보여준다: (A) 2주 동안 조직 배양 플레이트(TCP)에서 성장한 바늘 생체검사로부터의 유방암 세포, (B) 2주 동안 본 발명의 기판 상에서 성장한 바늘 생체검사로부터의 유방암 세포, (C) 2주 동안 본 발명의 기판 상에서 성장한 종양 조직으로부터의 요로상피암 세포, (D) 2주 동안 본 발명의 기판 상에서 성장한 종양 조직으로부터의 결장직장암 세포.
이로부터 생성된 스페로이드는 비침습성 조기 암 진단, 개인 의학 지침, 치료 전후 약물 내성 조사, 면역세포 기반 암 치료를 위한 세포 활성 평가와 같은 향후 진단 및 의료 치료 및 적용 지침에 추가로 도움이 될 수 있고, 생체 외 배양된 환자 유래 1차 CTC 세포를 사용하여 암 진행에 관여하는 기전을 규명하기 위한 실질적인 물질을 제공한다.
실시예 5: 인간 유래 스페로이드의 생성
도 10은 본 발명의 기판 상에서 2주 동안 성장시킨 환자 유래 정상 샘플의 유방 세포 및 결장직장 세포 및 환자 유래 종양 샘플의 유방암 세포 및 결장직장암 세포의 생체외 배양 결과를 나타낸다.
본 개시내용의 바람직한 실시양태가 본원에 도시되고 설명되었지만, 그러한 실시양태는 단지 예시로서 제공된다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 수많은 변형, 변경 및 대체가 이제 본 개시내용을 벗어나지 않고 당업자에게 발생할 것이다. 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시양태에 대한 다양한 대안이 본 발명을 실시하는데 이용될 수 있음을 이해해야 한다. 다음 청구범위는 본 개시내용의 범위를 정의하고 이들 청구범위 및 그 균등물의 범위 내의 방법 및 구조는 이에 의해 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (32)

  1. 표면 코팅을 갖는 엘라스토머 멤브레인(elastomer membrane)을 포함하는 세포 배양용 기판으로서, 상기 표면 코팅은,
    a) 흡수성 폴리머, 및
    b) 고분자전해질 다층을 포함하고,
    여기서, 상기 흡수성 폴리머는 상기 엘라스토머 멤브레인의 표면에 적층되고, 상기 고분자전해질 다층의 다중양이온 또는 다중음이온과 직접 접촉하고,
    상기 엘라스토머는 폴리디메틸실록산(PDMS)인, 세포 배양용 기판.
  2. 제1항에 있어서, 상기 흡수성 폴리머가 폴리(비닐 알코올)(PVA), 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), PEG-아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈(PVP), 폴리에틸렌이민(PEI), 폴리-L-락티드(PLLA), 폴리-D-락티드(PDLA), 폴리(L-락티드-코-D,L-락티드)(PLDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(락틱-코-글리콜산)(PL-co-GA), 폴리(메틸 메타크릴레이트)(PMMA), 폴리(하이드록시에틸 메타크릴레이트)(p-HEMA) 및 이들의 유도체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 기판.
  3. 제2항에 있어서, 상기 흡수성 폴리머가 PVA, PEG, PEG-아크릴레이트, PVP, PEI, PMMA 또는 이들의 유도체인, 기판.
  4. 제2항에 있어서, 상기 흡수성 폴리머가 PVA, PEG 또는 PEG-아크릴레이트인, 기판.
  5. 제1항에 있어서, 상기 흡수성 폴리머가 PDMS에 접합된 것인, 기판.
  6. 제1항에 있어서, 상기 흡수성 폴리머 및 PDMS가 접합되지 않은 것인, 기판.
  7. 제1항에 있어서, 상기 다중양이온이 폴리(아미노산)인, 기판.
  8. 제1항에 있어서, 상기 다중음이온이 폴리(아미노산)인, 기판.
  9. 제1항에 있어서, 상기 다중양이온이 폴리(L-리신)(PLL), 폴리(L-아르기닌)(PLA), 폴리(L-오르니틴)(PLO), 폴리(L-히스티딘)(PLH), 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 기판.
  10. 제9항에 있어서, 상기 다중양이온이 PLL, PLA, PLO 또는 PLH인, 기판.
  11. 제1항에 있어서, 상기 다중음이온이 폴리(L-글루탐산)(PLGA), 폴리(L-아스파르트산)(PLAA), 또는 이들의 조합인, 기판.
  12. 제1항에 있어서, (다중양이온/다중음이온)의 이중층이 PLL/PLGA, PLL/PLAA, PLA/PLGA, PLA/PLAA, PLO/PLGA, PLO/PLAA, PLH/PLGA, PLH/PLAA, 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 기판.
  13. 제1항에 있어서, 상기 고분자전해질 다층이 층별 조립을 통해 형성되는 것인, 기판.
  14. 제1항에 있어서, 상기 고분자전해질 다층이 n개의 이중층을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 30 범위의 정수이고, 최외각층은 다중양이온 또는 다중음이온인, 기판.
  15. 제1항에 있어서, 상기 고분자전해질 다층이 (다중양이온/다중음이온)의 n개의 이중층 및 다중음이온의 추가 층을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 30 범위의 정수이고, 최외각층이 다중음이온인, 기판.
  16. 제1항에 있어서, 상기 고분자전해질 다층이 (다중음이온/다중양이온)의 n개의 이중층 및 다중양이온의 추가 층을 포함하고, 여기서 n은 1 내지 30 범위의 정수이고, 최외각층은 다중양이온인, 기판.
  17. 제1항에 있어서,
    a) 소수성 표면을 갖는 PDMS를 제공하는 단계,
    b) 처리로 PDMS의 소수성 표면을 개질하는 단계,
    c) PDMS의 개질된 표면에 흡수성 폴리머를 도포하는 단계, 및
    d) 다중양이온 및 다중음이온의 층을 교대로 흡수성 폴리머 상에 순차적으로 적층하여 다층멤브레인 형태의 기판을 형성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것인, 기판.
  18. 제17항에 있어서, 상기 처리가 플라즈마 처리, 코로나 방전 또는 UV 오존 처리인, 기판.
  19. 제17항에 있어서, 상기 처리가 하이드로실릴화인, 기판.
  20. 제17항에 있어서, PDMS의 소수성 표면이 상기 처리 후에 조사(irradiate)되거나 친수화되는 것인, 기판.
  21. 제17항에 있어서, PDMS 표면이 PDMS의 개질된 표면에 상기 흡수성 폴리머를 도포한 후 친수화되는 것인, 기판.
  22. 제17항에 있어서, 상기 흡수성 폴리머가 PVA, PEG 또는 PEG-아크릴레이트인, 기판.
  23. 제17항에 있어서, 상기 흡수성 폴리머가 PDMS 표면에 가교결합된 것인, 기판.
  24. 제17항에 있어서, 상기 PDMS에 가교결합이 없는 것인, 기판.
  25. 제1항의 기판을 포함하는 세포 배양 시스템.
  26. 제25항에 있어서, 세포 및/또는 배양 배지를 추가로 포함하는, 세포 배양 시스템.
  27. a) 제1항의 기판을 포함하는 세포 배양 시스템을 제공하는 단계,
    b) 상기 기판에 세포를 시딩(seeding)하는 단계, 및
    c) 하나 이상의 스페로이드를 형성하기에 충분한 시간 동안 적절한 배지 하에 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 세포를 배양하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 스페로이드가 단일 세포 증식을 통해 생성되는 것인, 방법.
  29. 제27항에 있어서, 상기 하나 이상의 스페로이드가 50㎛ 내지 150㎛의 평균 직경을 갖는 것인, 방법.
  30. 제27항에 있어서, 상기 시딩이 기판 상에 cm2당 1000개 미만의 세포 밀도로 세포를 플레이팅하는 것을 포함하는, 방법.
  31. (a) 제1항의 기판 상에서 세포의 이종 집단을 배양하여 표면 코팅 상에 배치된 적어도 하나의 단일 세포 유래 스페로이드를 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 단일 세포는 상기 세포의 이종 집단에서의 세포인, 단계; 및 선택적으로 (b) 단일 세포 유래 스페로이드를 분석하여 단일 세포의 적어도 하나의 특성을 수득하는 단계를 포함하는, 단일 세포 유래 스페로이드를 수득하고 선택적으로 특성화하는 방법.
  32. (a) 암 환자로부터 유래된 종양 세포를 포함하는 복수의 세포를 제1항의 기판 상에서 배양하여 표면 코팅 상에 배치된 적어도 하나의 단일 세포 유래 튜머로이드(tumoroid)를 수득하는 단계로서, 여기서, 상기 단일 세포는 상기 복수의 세포에서 종양 세포인, 단계; 및 (b) 상기 튜머로이드를 하나 이상의 후보 제제(candidate agent)와 접촉시키고 암을 치료하기 위한 치료 효능을 나타내는 튜머로이드에서 하나 이상의 변화의 존재 또는 부재를 검출하는 단계를 포함하는, 개인 맞춤형 약물 스크리닝 방법.
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