CN117098819A - 细胞培养系统、其方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种表面涂层，其包含亲水性聚合物及聚电解质多层。亦提供一种细胞培养系统，其包含表面涂布有所述表面涂层的细胞培养制品。亦提供这些表面涂层及系统的用途及制备方法。

Description

细胞培养系统、其方法及用途

相关申请案之交叉引用

本申请案主张2020年12月31日申请的美国临时专利申请案第63/132,934号及2021年10月05日申请的美国临时专利申请案第63/252,268号的优先权及权益，其揭示内容特此以全文引用的方式并入本文中。

背景技术

从基础科学到临床前药物发现的应用，包括肿瘤生物学、神经退化性疾病及药物毒性的研究，研究人员对3D球状体模型的关注持续增长。三维(3D)细胞培养方法愈来愈多地被用于生成复杂的组织或肿瘤模型。

使用3D细胞培养方法及市场上可获得的产品形成的球状体存在许多差异，且此可能会影响其读出结果。举例而言，广泛用于3D细胞培养的非黏附技术，包括超低附着(ULA)盘及悬滴法，已经被证实不合适，因为这些方法通常经由细胞聚集产生球状体。此类球状体一般维持其原始异质性且含有多种具有不同特征的细胞，这将需要对细胞异质性有更好地了解。当数以万计的细胞聚集成球状体(亦即具有球形的团块)时，由于缺乏营养及氧气渗透，在数小时内形成广泛之中央坏死核，且因此阻碍细胞增殖。在真正的癌症中，扩展性中央坏死为一种罕见的现象。

另外，Matrigel为常用于基于组织的细胞生长，诸如类器官形成的嵌入基质。但失焦、低效的化合物扩散及样品分离的困难限制其用于基于3D球状体的体外应用。

球状体形成的标准化对于产生均一3D细胞培养物及自基于球状体的分析及药物筛选获得可再现结果至关重要。因此，需要开发能够可靠地形成单细胞衍生的球状体的新的细胞培养系统及方法。

发明内容

本发明提供一种用于涂布细胞培养制品的表面涂层。本文所述的表面涂层包含亲水性聚合物及聚电解质多层。本文提供的基质有利于水合保存。其可防止细胞培养基质因在环境温度下长期储存而导致的不想要的表面裂纹。在一些实施例中，本文提供的表面涂层使得能够形成衍生自单细胞的单细胞衍生的球状体。本发明亦提供一种包含细胞培养制品的细胞培养系统。本发明另提供这些表面涂层及系统的用途及制备方法。

因此，本发明的一个态样提供一种用于涂布细胞培养制品的表面的组合物。本文所述的组合物包含a)亲水性聚合物，其中所述亲水性聚合物沉积于细胞培养制品的表面上，及b)聚电解质多层，其中所述亲水性聚合物与所述聚电解质多层的聚阳离子或聚阴离子直接接触。

本文所述的细胞培养制品可由任何适合的塑料或聚合物制成，诸如聚乙烯、聚丙烯、聚甲基戊烯、环烯烃聚合物、环烯烃共聚物、聚氯乙烯、聚氨基甲酸酯、聚酯、聚酰胺、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-乙烯醇共聚物、乙烯-丙烯酸共聚物、乙烯-丙烯酸甲酯共聚物、乙烯-甲基丙烯酸共聚物、乙烯-甲基丙烯酸甲酯共聚物、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸甲酯及聚甲基丙烯酸甲酯或其衍生物或其类似物。

本文所述的表面涂层可为脱水或水合的。在一些实施例中，表面涂层处于脱水状态。在一些实施例中，表面涂层处于水合状态。

适合的亲水性聚合物包括但不限于聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙二醇)(PEG)、PEG-丙烯酸酯、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚-L-丙交酯(PLLA)、聚-D-丙交酯(PDLA)、聚(L-丙交酯-共-D,L-丙交酯)(PLDLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PL-co-GA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(p-HEMA)及其衍生物。

在一些实施例中，亲水性聚合物为PVA、PEG、PVP、PEI、PMMA或其衍生物。在一些实施例中，吸收性聚合物为PVA。在一些实施例中，亲水性聚合物为PEG或PEG-丙烯酸酯，诸如PEGMA、PEGDMA或PEGDA。在一些实施例中，亲水性聚合物为PLA或衍生物，诸如PLLA、PDLA或PLDLLA。在一些实施例中，亲水性聚合物为PGA或衍生物，诸如PLGA。在一些实施例中，亲水性聚合物为PMAA或衍生物，诸如pHEMA。

在某些实施例中，亲水性聚合物(例如PVA)的体积为表面涂层总体积的0.01-10％。

本文所述的聚电解质多层包含至少一个层对(称为“双层”)，其包含阳离子聚电解质(称为“聚阳离子”)及聚电解质(称为“聚阴离子”)。在一些实施例中，聚阳离子为聚(氨基酸)。在一些实施例中，聚阴离子为聚(氨基酸)。在一些实施例中，聚阳离子及聚阴离子为聚(氨基酸)。本文所述的聚(氨基酸)可包含L及/或D氨基酸形式。如本文所述，聚电解质多层可通过以交替方式沉积聚阳离子及聚阴离子经由逐层组装而形成。

在一些实施例中，具有式(聚阳离子/聚阴离子)_n的聚电解质多层包含n个聚阳离子及聚阴离子的双层，其中n为1至30范围内的整数。在一些实施例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，n在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，具有式聚阴离子(聚阳离子/聚阴离子)_n的聚电解质多层包含n+1层聚阴离子及n层聚阳离子，其中n为1至30范围内的整数。在一些实施例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，n在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，具有式聚阳离子(聚阴离子/聚阳离子)_n的聚电解质多层包含n+1层聚阳离子及n层聚阴离子，其中n为1至30范围内的整数。在一些实施例中，n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，n在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，聚阳离子为聚(L-离氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PLA)、聚(L-鸟氨酸)(PLO)、聚(L-组氨酸)(PLH)或其组合。在一较佳实施例中，聚阳离子为PLL。

在较佳实施例中，聚阴离子为聚(L-麸氨酸)(PLGA)、聚(L-天冬氨酸)(PLAA)或其组合。在一较佳实施例中，聚阴离子为PLGA。

在一些实施例中，这些聚电解质多层包含至少一个聚阳离子/聚阳离子的层对(亦即双层)，其选自由以下组成的群：PLL/PLGA、PLL/PLAA、PLA/PLGA、PLA/PLAA、PLO/PLGA、PLO/PLAA、PLH/PLGA、PLH/PLAA及其组合。

在一些实施例中，本文所述的双层包含PLL及PLGA的组合。在一些实施例中，本文所述的双层包含PLO及PLGA的组合。在一些实施例中，本文所述的双层包含PLH及PLGA的组合。在一些实施例中，本文所述的双层包含PLA及PLGA的组合。

在一些实施例中，本文所述的双层包含PLL及PLAA的组合。在一些实施例中，本文所述的双层包含PLO及PLAA的组合。在一些实施例中，本文所述的双层包含PLH及PLAA的组合。在一些实施例中，本文所述的双层包含PLA及PLAA的组合。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层的厚度可在30nm至30μm范围内。在一些实施例中，表面涂层的厚度在100nm至20μm范围内。在一些实施例中，表面涂层的厚度为200、400、600或800nm。在一些实施例中，表面涂层的厚度为1、5、10、15或20μm。

与公知培养方法相比，本发明的表面涂层提高多种细胞的增殖率，包括但不限于肿瘤细胞、富潜能及多潜能干细胞及前驱细胞、造血细胞及免疫细胞。另外，具有高保水性的表面涂层提供如下优势：防止表面涂层因在环境温度下长期储存而脱水所导致的不想要的表面裂纹。

在另一态样中，本发明提供用于涂布细胞培养制品的方法。本文所述的方法包含以下步骤：(a)提供具有疏水性表面的细胞培养制品；(b)通过处理改质疏水性表面；(c)将亲水性聚合物施加至经改质表面；及(d)在亲水性聚合物上依次沉积聚阳离子及聚阴离子的交替层。

在一些实施例中，本文所述的处理为电浆处理、电晕放电或UV臭氧处理。在一些实施例中，本文所述的疏水性表面在处理后经照射或亲水化。在一些实施例中，疏水性表面在将亲水性聚合物(例如PVA)施加至表面后经亲水化。在一些实施例中，亲水性聚合物(例如PVA)共价连接(亦即结合)至表面。可使用交联剂来促进交联(亦即结合)。例示性交联剂包括但不限于马来酸、甲醛、戊二醛、丁醛、硼酸钠或其组合。

本发明提供一种细胞培养系统，其包含细胞培养制品，所述制品具有经组态以培养细胞的具有本发明表面涂层的基质。在一些实施例中，细胞培养系统进一步包含细胞。在一些实施例中，细胞适合为人类细胞。在一些实施例中，细胞适合为活细胞。在一些实施例中，细胞培养系统进一步包含培养基。

在一些实施例中，本文所揭示的细胞培养系统能够将细胞，特别是单细胞或低密度细胞(例如，在一毫升中丰度小于1000的细胞)高效且可扩展地繁殖成3D，使得当前市场平台(例如，超低附着(ULA)盘、悬滴)上无法形成的困难细胞类型有可能形成3D细胞培养物。

如本文所揭示，聚电解质多层及培养基的一或多个参数可由使用者基于细胞的一或多个微环境选择准则来选择。

本文所揭示的细胞培养系统不仅能够实现细胞附着及生长，且亦能够收获活的培养细胞(例如3D细胞培养物、组织及器官)。无法收获活细胞为当前市场平台的重大缺陷，且其导致难以建立及维持足够数目的细胞的生产能力。根据本发明实施例的一态样，可自细胞培养系统收获活细胞，包括80％至100％活的，或约85％至约99％活的，或约90％至约99％活的。举例而言，在收获的细胞中，至少80％为活的，至少85％为活的，至少90％为活的，至少91％为活的，至少92％为活的，至少93％为活的，至少94％为活的，至少95％为活的，至少96％为活的，至少97％为活的，至少98％为活的，或至少99％为活的。在一些实施例中，可使用细胞解离酶，例如胰蛋白酶、TrypLE或Accutase，自表面涂层释放细胞。在较佳实施例中，细胞可在不使用细胞解离酶的情况下自表面涂层释放。

在另一态样中，本发明提供使用本文所揭示的细胞培养制品培养细胞的方法。培养细胞的方法包含以下步骤：a)提供表面涂布有本发明的表面涂层的细胞培养制品；b)在经涂布表面上接种细胞；c)在适合的培养基下培养细胞一段充足的时间以形成一或多个球状体。在一些实施例中，本文产生的球状体黏附于基质。在一些实施例中，本文产生的球状体半附着于基质。在一些实施例中，球状体经由单细胞增殖衍生自单细胞。培养的细胞(例如培养及收获的细胞)可用于各种应用，诸如分析及表征、筛选药物、分离单细胞衍生的纯系、生成细胞库及生成动物模型。

如本文所述，细胞为活细胞。在一些实施例中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞为组织细胞、免疫细胞、内皮细胞、干细胞、上皮细胞、间质细胞、间皮细胞、肿瘤细胞或肿瘤相关细胞。

如本文所述，培养细胞包含维持及/或增殖细胞。在一些实施例中，培养细胞包含维持细胞。在一些实施例中，培养细胞包含增殖细胞。在一些实施例中，培养细胞可进一步包含分化细胞。

在一些实施例中，细胞为干细胞，诸如间质干细胞(MSC)或富潜能干细胞(PSC)，包括胚胎干细胞(ESC)及诱导性富潜能干细胞(iPSC)。

在一些实施例中，细胞为肿瘤细胞，且培养的细胞为肿瘤球状体。肿瘤球状体可衍生自细胞株、肿瘤组织或液体生检。在一些实施例中，本文所述的肿瘤球状体衍生自由癌症患者获得的血液样品分离的循环肿瘤细胞(CTC)。在一些实施例中，本文所述的血液样品为全血。血液样品可通过液体生检获得。在一些实施例中，本文所述的癌症患者为患有转移性癌症的人类癌症患者。在一些实施例中，血液样品是在治疗性治疗之前、期间及/或之后自癌症患者获得。

本发明的另一态样提供一种活体外制备单细胞衍生的球状体的方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供包含本发明的基质的细胞培养系统；(b)自样品分离细胞(例如肿瘤细胞及/或肿瘤相关细胞)以提供经分离细胞；(c)将经分离细胞接种在基质上；及(d)在适合的培养基下培养细胞充足的时间以产生一或多个球状体，其中一或多个球状体为单细胞衍生的。

本发明的另一态样提供分离单细胞衍生的纯系的方法，各纯系由基因相同的均质细胞群体构成。

图式简单说明

图1A为本发明的表面涂层的一实施例的侧视截面图。亲水性聚合物102沉积于细胞培养制品202中的孔101的表面上。102与孔101的表面并未交联。301为聚阴离子。302为聚阳离子。103为聚电解质多层的一实施例，包括301及302的4个双层。最外层为301。102与302直接接触。

图1B为本发明的表面涂层的一实施例的侧视截面图。亲水性聚合物102沉积于细胞培养制品202中的孔101的表面上。102与孔101的表面交联。301为聚阴离子。302为聚阳离子。103为聚电解质多层的一实施例，包括301及302的4个双层。最外层为301。102与302直接接触。

图2A为本发明的表面涂层的一实施例的侧视截面图。亲水性聚合物102沉积于细胞培养制品202中的孔101的表面上。102与孔101的表面并未交联。301为聚阴离子。302为聚阳离子。103为聚电解质多层的一实施例，包括5层302及4层301。最外层为302。102与302直接接触。

图2B为本发明的表面涂层的一实施例的侧视截面图。亲水性聚合物102沉积于细胞培养制品202中的孔101的表面上。102与孔101的表面交联。301为聚阴离子。302为聚阳离子。103为聚电解质多层的一实施例，包括5层302及4层301。最外层为302。102与302直接接触。

图3A为本发明的表面涂层的一实施例的侧视截面图。亲水性聚合物102沉积于细胞培养制品202中的孔101的表面上。102与孔101的表面并未交联。301为聚阴离子。302为聚阳离子。103为聚电解质多层的一实施例，包括301及302的4个双层。最外层为302。102与301直接接触。

图3B为本发明的表面涂层的一实施例的侧视截面图。亲水性聚合物102沉积于细胞培养制品202中的孔101的表面上。102与孔101的表面交联。301为聚阴离子。302为聚阳离子。103为聚电解质多层的一实施例，包括301及302的4个双层。最外层为302。102与301直接接触。

图4A为本发明的表面涂层的一实施例的侧视截面图。亲水性聚合物102沉积于细胞培养制品202中的孔101的表面上。102与孔101的表面并未交联。301为聚阴离子。302为聚阳离子。103为聚电解质多层的一实施例，包括5层301及4层302。最外层为301。102与301直接接触。

图4B为本发明的表面涂层的一实施例的侧视截面图。亲水性聚合物102沉积于细胞培养制品202中的孔101的表面上。102与孔101的表面交联。301为聚阴离子。302为聚阳离子。103为聚电解质多层的一实施例，包括5层301及4层302。最外层为301。102与301直接接触。

图5说明细胞培养制品的表面改质的一实施例。由聚苯乙烯塑料制成的组织培养盘首先通过臭氧电浆处理，接着将经光活化的迭氮苯基-PVA添加至经改质表面，以形成PVA交联的聚苯乙烯盘。

图6说明细胞培养制品的表面改质的一实施例。由聚四氟乙烯(PTFE)制成的组织培养盘首先通过电浆气体处理，随后将PVA沉积于PTFE盘的经改质表面上。应用交联剂戊二醛(GA)将PVA交联至PTFE，以形成PVA交联的PTFE盘。

图7展示在供应完全DMEM培养基的癌细胞生长过程中的第0、1、2、3、4及5天，在本发明的表面涂层上培养的HCT116结肠直肠癌细胞的延时显微镜观察结果。(影像由LeicaDMI6000B延时显微镜在10倍物镜下拍摄)。

图8A-E展示使用本发明的培养平台进行体外培养及形成衍生自(A)肺癌细胞株A549、H1299、PC-9及H1975；(B)肝癌细胞株SNU-398、SNU-475、PLC/PRF/S、Hep3B及Huh7；(C)乳癌细胞株MDA-MB-231及CGBC01；(D)结肠直肠癌细胞株HCT116、HCT15及WiDr；及(E)人类舌鳞状细胞癌细胞株SAS、卵巢癌细胞株SK-OV-3及来源于人类膀胱癌患者的细胞株T24的球状体(7-14天后)的结果。

图9A-C展示在本发明的培养平台上CTC衍生的球状体培养的代表性时间依赖性影像。(A)自乳癌患者的血液样品分离CTC；14天后形成CTC衍生的球状体。(B)自头颈癌患者的血液样品分离CTC；38天后形成CTC衍生的球状体。(C)自结肠直肠癌患者的血液样品分离CTC；在13-27天后形成CTC衍生的球状体。比例尺：50μm。

图10A-B展示衍生自由结肠直肠癌(CRC)患者获得的原发性结肠直肠肿瘤组织的肿瘤球状体的影像。在(A)2周及(B)4周后在本发明的培养平台上产生肿瘤球状体。

具体实施方式

本发明涉及新一代无支架3D细胞培养技术及其用途。在一些实施例中，提供一种用于表面涂层的新组合物。亦提供一种细胞培养系统，其包含可用于细胞培养，尤其3D细胞培养的表面涂层。所述表面涂层可诱导形成高度均一的3D细胞培养物，使得任何其他低附着表面上无法形成的困难初级细胞类型有可能形成3D细胞培养物。与公知培养方法相比，本文所述的表面涂层提高多种细胞的增殖率，包括但不限于肿瘤细胞、富潜能及多潜能干细胞及前驱细胞、造血细胞及免疫细胞。在某些实施例中，表面涂层包含亲水性聚合物(例如PVA)及一或多对聚电解质。

表面涂层

本发明的表面涂层包含亲水性聚合物及聚电解质多层。在一些情况下，表面涂层如图1中所示。如图1中所示，104指示说明性表面涂层。亲水性聚合物102沉积于细胞培养盘202的孔201的顶面上。聚电解质多层103沉积于亲水性聚合物层102的顶部上。

在不受任何特定理论束缚的情况下，咸信表面涂层能够使接种在表面涂层上的细胞(例如自血液提取的稀有细胞、低密度细胞或单细胞)在存在或不存在基质的情况下稳健繁殖或稳定维持较长时间段，例如超过48小时、超过72小时、超过96小时、超过5天、超过6天、超过7天或在1至数周内(例如1、2、3、4、5、6或更多周)。

1)亲水性聚合物

本文所述的亲水性聚合物为亲水性吸收性聚合物(“吸收性聚合物”)，其为水溶性的且可由于吸收及保留水溶液而溶胀。可用于本发明的亲水性吸收性聚合物的非限制性清单包括亲水性及生物兼容性等级的以下聚合物及其衍生物：聚(乙烯醇)(PVA)、乙烯乙烯醇共聚物(通常为不可生物降解材料，其亲水程度取决于乙烯(疏水性)及乙烯醇(亲水性)基团的分布)、聚乙烯醇及乙烯乙烯醇的共聚物、聚丙烯酸酯组合物、聚氨基甲酸酯组合物、聚(乙二醇)(PEG)或称为聚(氧乙烯)(POE)及聚(环氧乙烷)(PEO)，及其衍生物，包括但不限于聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)及聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)；含氮材料，诸如聚丙烯酰胺(无丙烯酰胺毒性残留物)、聚乙烯吡咯啶酮、聚乙烯胺及聚乙烯亚胺；带电材料，诸如各种形式的聚(乳酸)亦称为聚丙交酯(例如聚-L-丙交酯(PLLA)及其衍生物、聚-D-丙交酯(PDLA)及其衍生物、聚(L-丙交酯-共-D,L-丙交酯)(PLDLLA)及其衍生物)、聚(乙醇酸)(PGA)亦称为聚乙交酯、乳酸及乙醇酸的共聚物聚(乳酸-共-乙醇酸)(PL-co-GA)、PLA及/或PGA与PEG的共聚物；聚甲基丙烯酸；聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(poly-HEMA)，以及此项技术中已知的其他吸收性、亲水性及生物兼容性材料。

在一些实施例中，亲水性吸收性聚合物是选自由以下组成的群：聚(乙烯醇)(PVA)、乙烯乙烯醇的共聚物、聚乙烯醇及乙烯乙烯醇的共聚物、聚丙烯酸酯组合物、聚氨基甲酸酯组合物、聚(乙二醇)(PEG)、PEG-丙烯酸酯、聚乙二醇甲基丙烯酸酯(PEGMA)、聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEGDMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚乙烯胺(PVAm)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚-L-丙交酯(PLLA)、聚-D-丙交酯(PDLA)、聚(L-丙交酯-共-D,L-丙交酯)(PLDLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PL-co-GA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)及聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(p-HEMA)。

在一些实施例中，亲水性吸收性聚合物是选自由以下组成的群：PVA、PEG、PEG-丙烯酸酯、聚丙交酯、PMMA、p-HEMA、其组合或衍生物。在一些实施例中，吸收性聚合物为PVA或其衍生物。在一些实施例中，吸收性聚合物为PEG或PEG-丙烯酸酯，诸如PEGMA、PEGDMA或PEGDA。在一些实施例中，吸收性聚合物为聚丙交酯或衍生物，诸如PLLA、PDLA或PLDLLA。在一些实施例中，吸收性聚合物为PGA或衍生物，诸如PLGA。在一些实施例中，吸收性聚合物为PMAA或衍生物，诸如pHEMA。

在一些实施例中，亲水性聚合物的平均分子量为约2,500g/mol至约200,000g/mol。在一些情况下，亲水性聚合物的平均分子量为约5,000g/mol至约175,000g/mol、约5,000g/mol至约150,000g/mol、约5,000g/mol至约125,000g/mol、约5,000g/mol至约100,000g/mol、约5,000g/mol至约75,000g/mol、约5,000g/mol至约50,000g/mol、约5,000g/mol至约25,000g/mol、约5,000g/mol至约10,000g/mol、约10,000g/mol至约175,000g/mol、约10,000g/mol至约150,000g/mol、约10,000g/mol至约125,000g/mol、约10,000g/mol至约100,000g/mol、约10,000g/mol至约75,000g/mol、约10,000g/mol至约50,000g/mol、约10,000g/mol至约25,000g/mol、约20,000g/mol至约150,000g/mol或约50,000g/mol至约150,000g/mol。

在一些情况下，亲水性聚合物直接沉积于目标基质的表面上。在其他情况下，亲水性聚合物间接沉积于表面上。在一些情况下，在亲水性聚合物层与基质表面之间形成一或多个附加层(例如1、2、3、4、5或更多层)。在一些情况下，在亲水性聚合物层与基质表面之间形成一个附加层(在本文中亦称为最内层)。

在一些实施例中，亲水性聚合物为PVA。PVA的平均分子量可在约10,000g/mol至约125,000g/mol范围内。在一些情况下，PVA的平均分子量为约10,000g/mol至约100,000g/mol、约10,000g/mol至约75,000g/mol、约10,000g/mol至约50,000g/mol、约20,000g/mol至约125,000g/mol、约20,000g/mol至约100,000g/mol、约20,000g/mol至约75,000g/mol、约20,000g/mol至约50,000g/mol、约50,000g/mol至约125,000g/mol或约50,000g/mol至约100,000g/mol。

在一些情况下，PVA直接沉积于目标基质的表面上。在其他情况下，PVA间接沉积于表面上。在一些情况下，在PVA层与表面之间形成一或多个附加层(例如1、2、3、4、5或更多层)。在一些情况下，在PVA层与基质表面之间形成一个附加层。

在一些实施例中，亲水性聚合物为PEG。在一些情况下，PEG的平均分子量为约200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1450、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、2500、2600、2700、2800、2900、3000、3250、3350、3500、3750、4000、4250、4500、4600、4750、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、10,000、12,000、20,000、35,000、40,000、50,000、60,000或100,000Da。

在一些情况下，本文利用的PEG为离散PEG(dPEG)。离散PEG可为包含多于一个重复环氧乙烷单元的聚合PEG。在一些情况下，离散PEG包含2至60个、2至50个或2至48个重复环氧乙烷单元。在一些情况下，dPEG包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、22、24、26、28、30、35、40、42、48、50或更多个重复环氧乙烷单元。

在某些实施例中，亲水性聚合物(例如PVA或PEG)的体积为表面涂层总体积的约0.01％至约10％。在一些情况下，亲水性聚合物为表面涂层总体积的约0.01％至约9％v/v、约0.01％至约8％v/v、约0.01％至约7％v/v、约0.01％至约6％v/v、约0.01％至约5％v/v、约0.01％至约4％v/v、约0.01％至约3％v/v、约0.01％至约2％v/v、约0.01％至约1％v/v、约0.1％至约10％v/v、约0.1％至约9％v/v、约0.1％至约8％v/v、约0.1％至约7％v/v、约0.1％至约6％v/v、约0.1％至约5％v/v、约0.1％至约4％v/v、约0.1％至约3％v/v、约1％至约10％v/v、约1％至约9％v/v、约1％至约8％v/v、约1％至约7％v/v、约1％至约6％v/v、约1％至约5％v/v、约1％至约4％v/v、约2％至约10％v/v或约5％至约10％v/v。在一些情况下，亲水性聚合物(例如PVA或PEG)的体积为表面涂层总体积的约0.01％、约0.05％、约0.1％、约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％或约10％。

在一些情况下，亲水性聚合物(例如PVA或PEG)的重量/表面涂层的总重量为约1％至约50％。在一些情况下，亲水性聚合物(例如PVA或PEG)的重量/表面涂层的总重量为约1％至约40％。在一些情况下，亲水性聚合物(例如PVA或PEG)的重量/表面涂层的总重量为约1％至约30％。在一些情况下，亲水性聚合物(例如PVA或PEG)的重量/表面涂层的总重量为约1％至约20％。在一些情况下，亲水性聚合物(例如PVA或PEG)的重量/表面涂层的总重量为约1％至约10％。

2)聚电解质多层

在某些实施例中，表面涂层包含聚电解质多层(PEM)。本文所述的PEM包含多数个交替的带相反电荷的聚合物(亦即聚电解质)层。本文所述的带相反电荷的聚合物包含带正电荷的聚电解质(在本文中亦称为聚阳离子)及带负电荷的聚电解质(在本文中亦称为聚阴离子)的组合。

例示性聚阳离子包括但不限于聚(L-离氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PLA)、聚(L-鸟氨酸)(PLO)、聚(L-组氨酸)(PLH)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚[α-(4-氨基丁基)-L-乙醇酸](PAGA)、甲基丙烯酸2-(二甲氨基)乙酯(DMAEMA)、甲基丙烯酸N,N-二乙氨基乙酯(DEAEMA)及其组合。在一些情况下，聚阳离子为PLL。在一些情况下，聚阳离子为PLO。在一些情况下，聚阳离子为PLH。在一些情况下，聚阳离子为PLA。

例示性聚阴离子包括但不限于聚-L-麸氨酸(PLGA)、聚-L-天冬氨酸(PLAA)、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(苯乙烯磺酸)(PSS)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(NIPAM)、聚(2-丙烯酰氨基-2-甲基-1-丙磺酸)(PAMPS)及其组合。在一些情况下，聚阴离子为PLGA。在一些情况下，聚阴离子为PLAA。

聚电解质多层可通过以交替方式沉积聚阳离子及聚阴离子经由逐层组装而形成。本文所述的聚电解质多层包括至少一个包括聚阳离子层及聚阴离子层的双层。

在一些实施例中，PEM可包括约1个双层至约100个双层。在一些实施例中，PEM可包括约1个双层至约50个双层。在一些实施例中，PEM可包括约1个双层至约30个双层。在一些实施例中，PEM可包括约1个双层至约20个双层。在一些实施例中，双层的数目为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。在一些实施例中，双层的数目为3。在一些实施例中，双层的数目为4。在一些实施例中，双层的数目为5。在一些实施例中，双层的数目为6。在一些实施例中，双层的数目为7。在一些实施例中，双层的数目为8。在一些实施例中，双层的数目为9。在一些实施例中，双层的数目为10。在一些实施例中，双层的数目为11。在一些实施例中，双层的数目为12。在一些实施例中，双层的数目为13。在一些实施例中，双层的数目为14。在一些实施例中，双层的数目为15。在一些实施例中，双层的数目为16。在一些实施例中，双层的数目为17。在一些实施例中，双层的数目为18。在一些实施例中，双层的数目为19。在一些实施例中，双层的数目为20。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个带正电荷的聚电解质及带负电荷的聚电解质的双层，其中聚阳离子是选自PLL、PLO、PLH及PLA，且聚阴离子是选自PLGA及PLAA。在一些实施例中，组数在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，组数大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，组数为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，组数在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个PLL及PLGA的双层。在一些实施例中，PLL及PLGA的双层的数目在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，双层的数目大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个PLO及PLGA的双层。在一些实施例中，PLO及PLGA的双层的数目在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，双层的数目大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个PLH及PLGA的双层。在一些实施例中，PLH及PLGA的双层的数目在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，双层的数目大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个PLA及PLGA的双层。在一些实施例中，PLA及PLGA的双层的数目在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，双层的数目大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个PLL及PLAA的双层。在一些实施例中，PLL及PLAA的双层的数目在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，双层的数目大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个PLO及PLAA的双层。在一些实施例中，PLO及PLAA的双层的数目在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，双层的数目大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个PLH及PLAA的双层。在一些实施例中，PLH及PLAA的双层的数目在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，双层的数目大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的聚电解质多层包含一或多个PLA及PLAA的双层。在一些实施例中，PLA及PLAA的双层的数目在1至100、3至60、3至50或3至30的范围内。在一些实施例中，双层的数目大于3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20。在一些实施例中，双层的数目在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

作为薄膜的PEM的厚度可在广泛的范围内，例如在约30nm至约30μm或约100nm至约20μm范围内。在一些实施例中，厚度为约100nm至约500nm、约500nm至约1μm或约1μm至约10μm。在一些实施例中，厚度为约200、400、600、800nm，或两者之间的任何数字。在一些实施例中，厚度为约1、5、10、15或20μm，或两者之间的任何数字。

许多方法可用于表征PEM。在一些实施例中，这些方法可包含椭偏仪法(厚度)、具有耗散监测的石英晶体微天平(质量吸附、黏弹性)、接触角分析(表面能)、傅立叶变换红外光谱法(官能基)、X射线光电子光谱法(化学组成)、扫描电子显微法(表面结构)及原子力显微法(粗糙度/表面结构)。

在一些实施例中，PEM可通过用移液管将聚阴离子或聚阳离子溶液以混合物形式或依次移至皿中/上而沉积。

在一些实施例中，PEM通过浸涂形成于表面上。在浸涂中，将基质浸渍于聚电解质溶液中一定量的时间(通常为10-15分钟)，接着多次冲洗且浸渍于相反电荷的第二聚电解质溶液中。重复此过程直至达成所需层数。

在一些实施例中，PEM通过喷涂形成于表面上。在一些实施例中，聚电解质可喷洒至表面上3-10秒，随后为10-30秒的休息/沥干期，通过喷水洗涤表面3-20秒，再为10秒的休息期，且用相反电荷的聚电解质重复所述循环。

在一些实施例中，PEM通过旋涂形成于表面上。旋涂为一种高度受控的方法，用于系统的基于溶液的涂层。典型的旋涂程序包括旋涂10-15秒，通过“旋涂”水冲洗至少一次，持续15-30秒，且用带相反电荷的聚电解质重复所述程序。洗涤步骤在旋涂中可能并非必需的。

3)表面涂层构筑

本发明的另一态样的特征在于一种使用本文所述的组合物涂布细胞培养制品的方法。本文所述的方法包含以下步骤：(a)提供具有疏水性表面的细胞培养制品；(b)通过处理改质疏水性表面；(c)将亲水性聚合物施加至经改质表面；及(d)在亲水性聚合物上依次沉积聚阳离子及聚阴离子的交替层。

在一些实施例中，本文所述的处理为电浆处理、电晕放电或UV臭氧处理。在一些实施例中，本文所述的疏水性表面在处理后经照射或亲水化。在一些实施例中，疏水性表面在将亲水性聚合物(例如PVA)施加至表面后经亲水化。在一些实施例中，亲水性聚合物(例如PVA)共价连接(亦即结合)至表面。可使用交联剂来促进交联(亦即结合)。例示性交联剂包括但不限于马来酸、甲醛、戊二醛、丁醛、硼酸钠或其组合。

如本文所述，若表面上的水滴的接触角小于90度(接触角定义为穿过水滴内部的角度)，则所述表面为亲水性的。实施例包括接触角为90度至0度的亲水性表面；技术人员应立即理解，明确规定的界限之间的所有范围及值均考虑在内，例如以下中的任一者可用作上限或下限：90、80、70、60、50、40、30、20、10、5、2、0度。

在一些实施例中，本文所述的基质包含(聚阴离子/聚阳离子)_n/PVA，其中聚阴离子/聚阳离子是选自PLGA/PLL、PLAA/PLL、PLGA/PLA、PLAA/PLA、PLGA/PLO、PLAA/PLO、PLGA/PLH及PLAA/PLH，且n为1至20范围内的整数，视情况为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。在一些实施例中，n在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的基质包含(聚阳离子/聚阴离子)_n/PEG，其中聚阳离子/聚阴离子是选自PLL/PLGA、PLL/PLAA、PLA/PLGA、PLA/PLAA、PLO/PLGA、PLO/PLAA、PLH/PLGA及PLH/PLAA，且n为1至20范围内的整数，视情况为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。在一些实施例中，n在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的基质包含聚阳离子(聚阴离子/聚阳离子)_n/PEG-丙烯酸酯，其中聚阴离子/聚阳离子是选自PLGA/PLL、PLAA/PLL、PLGA/PLA、PLAA/PLA、PLGA/PLO、PLAA/PLO、PLGA/PLH及PLAA/PLH，且n为1至20范围内的整数，视情况为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。在一些实施例中，n在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

在一些实施例中，本文所述的基质包含聚阴离子(聚阳离子/聚阴离子)_n/PVP，其中聚阳离子/聚阴离子是选自PLL/PLGA、PLL/PLAA、PLA/PLGA、PLA/PLAA、PLO/PLGA、PLO/PLAA、PLH/PLGA及PLH/PLAA，且n为1至20范围内的整数，视情况为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20。在一些实施例中，n在1-10、1-8、1-5、3-20、5-20、10-20、11-19、12-18、13-17或14-16的范围内。

本文所述的表面涂层可为脱水或水合的。在一些实施例中，表面涂层处于脱水状态。在其他实施例中，表面涂层处于水合状态。如本文所用，“脱水状态”及“水合状态”各自指相对于表面涂层的总体积的水溶液(例如水)的体积。在脱水状态下，水溶液(例如水)的体积为表面涂层总体积的小于20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于1％或小于0.5％。在水合状态下，水溶液(例如水)的体积为表面涂层总体积的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％或更高。

在一些实施例中，本文所述的表面涂层包含水溶液(例如水)。在一些情况下，水溶液(例如水)为表面涂层总重量的约1重量％至约60重量％。在一些情况下，水溶液(例如水)为表面涂层总重量的约1重量％至约50重量％、约1重量％至约40重量％、约1重量％至约30重量％、约1重量％至约20重量％、约10重量％至约60重量％、约10重量％至约50重量％、约10重量％至约40重量％、约10重量％至约30重量％、约10重量％至约20重量％、约20重量％至约60重量％、约20重量％至约50重量％、约20重量％至约40重量％或约30重量％至约60重量％。

在一些实施例中，表面涂层进一步包含填料。在一些情况下，填料包含矿物填料，诸如但不限于二氧化硅、氧化铝、碳酸钙或聚硅氧树脂。

聚阳离子及聚阴离子以及吸收性聚合物中的每一者可溶解于水溶液中以用于本发明。所述水溶液不含或基本上不含有机溶剂。应理解，水溶液中可能存在一些少量的有机溶剂，例如作为聚合后残留在聚合物中的一些有机溶剂的结果。如本文所用，“基本上不含”在其涉及水溶液中的有机溶剂时，意谓水溶液包含少于1重量％的有机溶剂。在许多实施例中，水溶液含有少于0.8％、少于0.5％、少于0.2％或少于0.1％的有机溶剂。

聚阳离子及聚阴离子以及吸收性聚合物中的每一者可以任何适合的浓度溶解于水溶液中，以用于涂布的目的。

细胞培养系统

本发明的细胞培养系统包含表面涂布有本文所述的表面涂层的细胞培养制品。

本文所述的细胞培养制品可由任何适合的塑料及其类似物制成。在某些实施例中，细胞培养制品由包含以下中的至少一者的材料制成：聚苯乙烯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚碳酸酯、聚乙烯吡咯啶酮、聚丁二烯、聚氯乙烯、聚环氧乙烷、聚吡咯及聚环氧丙烷。

在一些实施例中，细胞培养系统进一步包含细胞。在一些实施例中，细胞来源于细胞株。在一些实施例中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞为人类细胞。在一些实施例中，细胞为组织细胞、免疫细胞、内皮细胞、干细胞、上皮细胞、间质细胞、间皮细胞、癌细胞或肿瘤相关细胞。在一些实施例中，细胞培养系统进一步包含培养基。

本文所揭示的细胞培养系统不仅能够实现细胞附着及生长，且亦能够收获活的培养细胞(例如3D细胞培养物、组织及器官)。根据本发明的一些实施例，细胞培养系统可用于收获活细胞，包括80％至100％活的，或约85％至约99％活的，或约90％至约99％活的。举例而言，在收获的细胞中，至少80％为活的，至少85％为活的，至少90％为活的，至少91％为活的，至少92％为活的，至少93％为活的，至少94％为活的，至少95％为活的，至少96％为活的，至少97％为活的，至少98％为活的，或至少99％为活的。在一些实施例中，可使用或不使用细胞解离酶，例如胰蛋白酶、TrypLE或Accutase，自细胞培养系统释放细胞。

其方法及用途

用于培养细胞的方法

在不受任何特定理论束缚的情况下，咸信本文所揭示的表面涂层能够使得细胞稳健繁殖及/或稳定维持。因此，本发明提供一种用于培养细胞的方法。所述方法包含以下步骤：(a)提供表面涂布有本发明的表面涂层的细胞培养制品；(b)在经涂布表面上接种细胞；及(c)在适合的培养基下培养细胞。在一些实施例中，细胞培养一段充足的时间以形成球状体。在较佳实施例中，球状体为3D球状体。在一些实施例中，本文所述的球状体是经由单细胞增殖产生。在一些实施例中，本文所述的球状体是在无细胞聚集的情况下经由单细胞增殖产生。在一些实施例中，球状体具有均一的尺寸。

在一些实施例中，本文所述的细胞可来源于细胞株、组织切片或液体生检。在一些实施例中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞为人类细胞。在一些实施例中，细胞为组织细胞、免疫细胞、内皮细胞、干细胞、上皮细胞、间质细胞、间皮细胞、癌细胞或肿瘤相关细胞。

在一些实施例中，本文所述的细胞为干细胞，诸如间质干细胞(MSC)或富潜能干细胞(PSC)，包括胚胎干细胞(ESC)及诱导性富潜能干细胞(iPSC)。

在一些实施例中，本文所述的细胞为癌细胞。本文所述的例示性癌症包括但不限于急性淋巴癌、急性骨髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳癌、肛门癌、肛管或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈部癌、胆囊或胸膜癌、鼻、鼻腔或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食道癌、子宫颈癌、胃肠道类癌瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰脏癌、腹膜癌、网膜及肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睪丸癌、甲状腺癌、输尿管癌及膀胱癌。

在一些实施例中，本文所述的细胞为肿瘤相关细胞。例示性肿瘤相关细胞包括但不限于肿瘤细胞丛、肿瘤浸润性淋巴球(TIL)、癌症相关巨噬细胞样细胞(CAML)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、肿瘤相关单核球/巨噬细胞谱系细胞(MMLC)、癌症干细胞、肿瘤微栓子、肿瘤相关基质细胞(TASC)、肿瘤相关骨髓细胞(TAMC)、肿瘤相关调节性T细胞(Treg)、癌症相关纤维母细胞(CAF)、肿瘤源性内皮细胞(TEC)、肿瘤相关嗜中性球(TAN)、肿瘤相关血小板(TAP)、肿瘤相关免疫细胞(TAI)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)及其组合。

例示性细胞包括低密度细胞、单细胞、稀有细胞或其组合。低密度细胞可为在接种时在基质上每平方公分少于5000个的细胞，例如在基质上每平方公分不超过约1、5、10、20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、4000或4500中的任一者。

在一些实施例中，在步骤(c)中接种经分离细胞包含将细胞以每平方公分一个细胞至10个细胞的密度平板接种于基质表面(亦即细胞生长表面)上。在一些实施例中，在步骤(c)中接种经分离细胞包含将细胞以每平方公分10个细胞至100个细胞的密度平板接种于基质表面上。在一些实施例中，在步骤(c)中接种经分离细胞包含将细胞以每平方公分100个细胞至1000个细胞的密度平板接种于基质表面上。

在一些实施例中，将细胞培养一段时间，范围介于约2天至约5周，诸如约3至约14天，例如约7天。在一些实施例中，将细胞培养3天，且球状体的平均直径在约40μm至约200μm范围内。

在例示性实施例的方法中可采用任何适合的培养基。例示性培养基包括但不限于达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)、表皮生长因子(EGF)及/或碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)补充有B27补充剂、表皮生长因子(EGF)及碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)的混合物。

制备单细胞衍生的球状体的方法

在另一态样中，本发明提供一种制备单细胞衍生的球状体的方法，所述方法包含以下步骤：(a)提供表面涂布有本发明的表面涂层的细胞培养制品；(b)在经涂布表面上接种细胞；及(c)在适合的培养基下培养细胞一段充足的时间以形成球状体，其中这些球状体为单细胞衍生的。本文所述的球状体是经由单细胞增殖产生。在一些实施例中，球状体具有均一的尺寸。在一些实施例中，单细胞衍生的纯系半附着或松散地附着于本发明的基质上。

在一些实施例中，细胞来源于细胞株。在一些实施例中，细胞为哺乳动物细胞。在一些实施例中，细胞为人类细胞。在一些实施例中，细胞为组织细胞、免疫细胞、内皮细胞、干细胞、上皮细胞、间质细胞、间皮细胞、癌细胞或肿瘤相关细胞。

在一些实施例中，细胞为干细胞，诸如间质干细胞(MSC)或富潜能干细胞(PSC)，包括胚胎干细胞(ESC)及诱导性富潜能干细胞(iPSC)。

在一些实施例中，细胞为癌细胞。在某些实施例中，癌细胞分离自人类原发性肿瘤组织。在某些实施例中，癌细胞分离自癌症患者的血液样品。本文所述的例示性癌症包括但不限于急性淋巴癌、急性骨髓性白血病、肺泡横纹肌肉瘤、骨癌、脑癌、乳癌、肛门癌、肛管或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈部癌、胆囊或胸膜癌、鼻、鼻腔或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食道癌、子宫颈癌、胃肠道类癌瘤、神经胶质瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、肝癌、肺癌、恶性间皮瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰脏癌、腹膜癌、网膜及肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、胃癌、睪丸癌、甲状腺癌、输尿管癌及膀胱癌。

在一些实施例中，细胞为肿瘤相关细胞。例示性肿瘤相关细胞包括但不限于肿瘤细胞丛、肿瘤浸润性淋巴球(TIL)、癌症相关巨噬细胞样细胞(CAML)、肿瘤相关巨噬细胞(TAM)、肿瘤相关单核球/巨噬细胞谱系细胞(MMLC)、癌症干细胞、肿瘤微栓子、肿瘤相关基质细胞(TASC)、肿瘤相关骨髓细胞(TAMC)、肿瘤相关调节性T细胞(Treg)、癌症相关纤维母细胞(CAF)、肿瘤源性内皮细胞(TEC)、肿瘤相关嗜中性球(TAN)、肿瘤相关血小板(TAP)、肿瘤相关免疫细胞(TAI)、骨髓源性抑制细胞(MDSC)及其组合。

例示性细胞包括低密度细胞、单细胞、稀有细胞或其组合。低密度细胞可为在接种时在基质上每平方公分少于5000个的细胞，例如在基质上每平方公分不超过约1、5、10、20、50、100、200、300、500、1000、2000、3000、4000或4500中的任一者。

在一些实施例中，在步骤(c)中接种经分离细胞包含将细胞以每平方公分一个细胞至10个细胞的密度平板接种于基质表面(亦即细胞生长表面)上。在一些实施例中，在步骤(c)中接种经分离细胞包含将细胞以每平方公分10个细胞至100个细胞的密度平板接种于基质表面上。在一些实施例中，在步骤(c)中接种经分离细胞包含将细胞以每平方公分100个细胞至1000个细胞的密度平板接种于基质表面上。

在一些实施例中，培养步骤发生在2-8天的时间段内(例如，2、3、4、5、6、7或8天)。在其他实施例中，培养步骤发生在7-14天的时间段内(例如，7、8、9、10、11、12、13或14天)。在其他实施例中，培养步骤发生在1-4周的时间段内(例如，1、2、3或4周)。在一些实施例中，将细胞培养3天，且球状体的平均直径在约40μm至约200μm范围内。

在例示性实施例的方法中可采用任何适合的培养基。例示性培养基包括但不限于达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)、表皮生长因子(EGF)及/或碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)、达尔伯克氏改良伊格尔氏培养基(DMEM)补充有B27补充剂、表皮生长因子(EGF)及碱性纤维母细胞生长因子(bFGF)的混合物。

在一些实施例中，单细胞衍生的球状体的尺寸小于200μm的直径。在一些实施例中，单细胞衍生的球状体的尺寸小于150μm的直径。在一些实施例中，单细胞衍生的球状体的尺寸为约40、50、60、70、80、90、100、110、120、130或140μm的直径。

在某些实施例中，单细胞衍生的球状体可用于筛选治疗剂。在某些实施例中，筛选治疗剂的方法包含：(a)将测试物质施加至其产生的单细胞衍生的球状体；及(b)评估测试物质对单细胞衍生的球状体的影响。在一些实施例中，用成像系统分析测试物质的影响，例如分析基因或蛋白质的生物化学活性及/或表达量。

在一些实施例中，其产生的单细胞衍生的球状体为肿瘤球状体。在一些实施例中，本文所述的测试物质为化学治疗药物，诸如细胞毒性或细胞抑制性化学治疗药物。在一些实施例中，治疗剂为免疫检查点抑制剂，诸如免疫检查点抑制剂。在一些实施例中，治疗剂为核酸药物。在一些实施例中，治疗剂为治疗性细胞组合物，其包括但不限于T细胞、自然杀手(NK)细胞及树突状细胞。

在一些实施例中，将细胞培养一段时间，范围介于约2天至约5周，诸如约3至约14天，例如约7天。在一些实施例中，将细胞培养3天，且至少一个3D球状体的平均直径在约40μm至约200μm范围内。

在一些态样中，本文提供一种根据采用本文所述的细胞培养系统的培养方法中的任一者产生的单细胞衍生的球状体(例如肿瘤球状体)。在一些态样中，提供一种根据采用本文所述的细胞培养系统的培养方法中的任一者衍生的单细胞衍生的球状体(例如肿瘤球状体)库。

分离单细胞衍生的纯系的方法

随着基因体编辑技术进入常规实验室中实行，单细胞衍生的纯系变得愈来愈重要。限制稀释法为分离单细胞的传统方法，依赖于单纯系性的统计概率，所述概率会随着方案的微小变化而显著改变。所述技术虽然在分离单细胞方面效率极低，但保持细胞活力。相反，流动式细胞测量术可高效率地提供单细胞纯系，但对细胞活力产生负面影响。这些平台的共同特点为其一般以含有大量细胞的悬浮液开始，这些细胞通过随机限制在微结构中“个别化”。当细胞群体较小时，这些方法均为不切实际的，因为其在混合及/或转移过程中产生相当大的细胞损失。本发明的方法提供一种用于分离活的单细胞纯系的高效替代方案。在一些实施例中，所述方法不需要将细胞单独限制在微结构中。

在一些实施例中，本文提供一种分离单细胞衍生的纯系的方法。本文所述的方法包含：1)使用表面涂布有本发明的组合物的细胞培养制品培养异质细胞群体，以获得包含单细胞衍生的纯系的多数个细胞纯系；及2)自细胞培养制品分离单细胞衍生的纯系。

在一些实施例中，异质细胞群体包含黏附细胞。在一些实施例中，异质细胞群体包含非黏附细胞。在一些实施例中，异质细胞群体包含自细胞株分离的细胞。在一些实施例中，异质细胞群体包含自个体的液体生检分离的细胞。在一些实施例中，异质细胞群体包含自个体的组织生检分离的细胞。在一些实施例中，异质细胞群体包含已经基因工程改造的细胞。在一些实施例中，异质细胞群体包含已经工程改造以包含基因突变的细胞。在一些实施例中，异质细胞群体包含已经工程改造以包含异源核苷酸序列的细胞。

在一些实施例中，单细胞衍生的纯系半附着或松散地附着于本文所揭示的经涂布表面上。

在一些实施例中，在培养7天或更多天后，在细胞培养系统中未观察到细胞碎片。

在一些实施例中，培养步骤发生在2-8天的时间段内(例如，2、3、4、5、6、7或8天)。在其他实施例中，培养步骤发生在7-14天的时间段内(例如，7、8、9、10、11、12、13或14天)。在其他实施例中，培养步骤发生在1-4周的时间段内(例如，1、2、3或4周)。

在一些实施例中，单细胞衍生的纯系形成单细胞衍生的球状体。在一些实施例中，单细胞衍生的纯系的直径为约40μm至约200μm。在一些实施例中，单细胞衍生的纯系的直径为约50μm至约150μm。在一些情况下，单细胞衍生的纯系的直径为约50μm至约120μm、约50μm至约100μm、约50μm至约80μm、约50μm至约60μm、约80μm至约150μm、约80μm至约120μm、约80μm至约100μm、约100μm至约200μm、约100μm至约150μm或约100μm至约120μm。

在一些情况下，单细胞衍生的纯系形成单细胞衍生的球状体。在一些情况下，球状体包含约8至约1000个细胞。在一些情况下，球状体包含约8至约800个细胞、约8至约500个细胞、约8至约400个细胞、约8至约300个细胞、约8至约200个细胞、约8至约100个细胞、约10至约1000个细胞、约10至约800个细胞、约10至约500个细胞、约10至约400个细胞、约10至约300个细胞、约10至约200个细胞、约10至约100个细胞、约50至约1000个细胞、约50至约800个细胞、约50至约500个细胞、约50至约400个细胞、约50至约300个细胞、约50至约200个细胞、约100至约1000个细胞、约100至约800个细胞、约100至约500个细胞、约100至约400个细胞、约100至约300个细胞、约300至约1000个细胞、约300至约800个细胞、约300至约500个细胞、约500至约1000个细胞或约500至约800个细胞。

在一些实施例中，安置于经涂布表面上的至少10％的细胞形成单细胞衍生的球状体。在一些实施例中，安置于经涂布表面上的至少20％的细胞形成单细胞衍生的球状体。在一些实施例中，安置于经涂布表面上的至少30％的细胞形成单细胞衍生的球状体。在一些实施例中，安置于经涂布表面上的至少40％的细胞形成单细胞衍生的球状体。在一些实施例中，安置于经涂布表面上的至少50％的细胞形成单细胞衍生的球状体。在一些实施例中，安置于经涂布表面上的至少60％的细胞形成单细胞衍生的球状体。在一些实施例中，安置于经涂布表面上的至少70％的细胞形成单细胞衍生的球状体。

在一些实施例中，本文所述的方法进一步包含分析单细胞衍生的纯系，从而获得单细胞的特征。在一些情况下，分析单细胞衍生的纯系的步骤包含对单细胞衍生的纯系进行定序分析。在一些实施例中，分析步骤包含进行基因分型分析。在一些实施例中，基因分型分析为基于PCR的分析。在一些实施例中，基因分型分析为基于数组杂交的分析。在一些实施例中，分析步骤包含分析复本数变异。在一些实施例中，分析步骤包含分析基因突变。在一些实施例中，分析步骤包含分析单核苷酸多形现象。

在一些实施例中，分析单细胞衍生的纯系的步骤包含对单细胞衍生的纯系进行蛋白质粒分析。例示性蛋白质粒分析包括凝胶电泳，诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、二维凝胶电泳或毛细管电泳；高效液相层析(HPLC)；及亲和层析。

在一些实施例中，单细胞的特征包含以下一或多项：基因型、表观遗传概况、基因或蛋白质的表达量、对药物的反应、耐药性概况或转移潜力。

在一些态样中，本文提供一种根据采用本文所述的细胞培养系统的培养方法中的任一者产生的单细胞衍生的纯系。在一些态样中，提供一种根据采用本文所述的细胞培养系统的培养方法中的任一者衍生的单细胞衍生的纯系库。

患者来源的类肿瘤异种移植物的产生

在另一态样中，本发明提供一种用于产生基于患者来源的类肿瘤的异种移植物的方法。患者来源的类肿瘤可经由来源于患者血液、组织(例如膀胱、胃、乳房、胰脏、结肠或肺)或细胞株的肿瘤细胞的活体外生长产生。基于患者来源的类肿瘤的异种移植物可通过将类肿瘤直接转移至高度免疫缺陷型小鼠中来建立，且随后通过小鼠之间的继代来维持。异种移植模型可用于生物医学转用研究，且一旦验证，其可用作癌症药物开发中功效筛选的转用临床前模型。

在一些实施例中，本文提供一种产生患者来源的肿瘤异种移植动物模型的方法，其包含：a)使用本文提供的细胞培养系统中的任一者培养包含来源于患者的肿瘤细胞的多数个细胞，以获得多数个类肿瘤；b)自3D细胞培养系统分离类肿瘤；及3)将经分离类肿瘤接种至非人类动物中，从而产生患者来源的肿瘤异种移植动物模型。

在一些实施例中，多数个肿瘤细胞获自患者的原发性组织。在一些实施例中，多数个肿瘤细胞获自患者的血液。在一些实施例中，来源于患者的肿瘤细胞在3D细胞培养系统上培养之前作为动物模型初级异种移植物生长。

在一些实施例中，非人类动物为免疫缺陷的。在一些实施例中，非人类动物为小鼠。

在一些实施例中，肿瘤细胞为来源于实体肿瘤的循环肿瘤细胞(CTC)。在其他情况下，肿瘤细胞为来源于血液科恶性肿瘤的CTC。在一些实施例中，患者患有转移性癌症。

在一些实施例中，培养步骤包含在一周内将肿瘤细胞扩增10至100倍(例如10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍或100倍)。

采用非黏附条件进行3D细胞培养的方法包括悬滴法(Kelm等人Biotechnol.Bioeng.83,173-180(2003))、旋转生物反应器(Zhau等人,In VitroCell.Dev.Biol.Anim.33,375-380(1997))、磁悬浮(Souza等人Nat.Nanotechnol.5,291-296(2010))。然而，一些最广泛使用的非黏附技术不代表模拟活体内肿瘤形成的真正的3D细胞培养。当诸如悬滴、反应器或U形底盘中数以万计的细胞聚集成球状体(亦即具有球形的团块)时，由于缺乏超过200μm深度的营养及氧气渗透，在数小时内形成广泛之中央坏死核。在真正的癌症中，扩展性中央坏死为一种罕见的现象。此非生理相关的癌症表现因缺乏经由细胞分裂的进行性肿瘤发展以及缺乏与适当细胞外基质(ECM)的相互作用而加剧。在一些实施例中，本文提供的3D细胞培养系统能够将细胞球状体/类肿瘤的尺寸维持在约100μm，且随着细胞随时间推移继续增殖而诱导其分裂成较小的球状体。

在一些实施例中，类肿瘤的直径为约50μm至约150μm。在一些实施例中，类肿瘤的直径为约100μm至约150μm。在一些情况下，类肿瘤的直径为约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm或约150μm。在一些实施例中，在培养8天后，类肿瘤的平均尺寸为约150μm。

在一些实施例中，培养步骤发生在7-14天的时间段内(例如，7、8、9、10、11、12、13或14天)。在一些实施例中，培养超过7天的类肿瘤的尺寸维持在直径约50μm至约150μm的范围内。在一些情况下，类肿瘤的直径为约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm或约150μm。

在一些实施例中，多数个细胞进一步包含来源于患者的肿瘤相关细胞。在一些实施例中，肿瘤相关细胞包含肿瘤相关基质细胞。在一些实施例中，多数个类肿瘤包含肿瘤细胞及肿瘤相关细胞。在一些实施例中，类肿瘤衍生自单细胞。

在一些实施例中，癌症为实体肿瘤或血液科恶性肿瘤。在一些情况下，癌症为结肠直肠癌、乳癌、胰脏癌、头颈癌、膀胱癌、卵巢癌、胃癌或前列腺癌。

在一些实施例中，制备患者来源的类肿瘤的方法以介于0.5与1之间的产率比(例如自CTC的产率)提供类肿瘤。在一些实施例中，制备患者来源的类肿瘤的方法以介于0.6与1之间的产率比(例如自CTC的产率)提供类肿瘤。在一些实施例中，制备患者来源的类肿瘤的方法以介于0.7与1之间的产率比(例如自CTC的产率)提供类肿瘤。在一些实施例中，制备患者来源的类肿瘤的方法以介于0.8与1之间的产率比(例如自CTC的产率)提供类肿瘤。

在一些态样中，本文提供根据采用本文所述的细胞培养系统的方法中的任一者制备的患者来源的肿瘤异种移植模型。在一些实施例中，患者来源的肿瘤异种移植模型能够自发转移。在一些实施例中，异种移植模型可通过将自一个异种移植模型分离的患者来源的肿瘤细胞注射至另一个非人类动物体内而活体内繁殖。

在一些态样中，本文提供一种分析治疗剂(例如抗癌药物)的活体内活性的方法，其包含向根据本文所述的方法中的任一者制备的患者来源的肿瘤异种移植动物模型投与治疗剂(例如抗癌药物)，及分析治疗剂对患者来源的肿瘤异种移植动物模型的影响。

在一些态样中，本文提供一种生物库，其包含根据采用本文所述的细胞培养系统的方法中的任一者制备的多数个不同类肿瘤。

活体外3D共培养物的产生

在另一态样中，本发明提供一种用于产生衍生自肿瘤细胞及肿瘤相关基质或免疫细胞(例如纤维母细胞、内皮细胞及免疫细胞)的3D共培养肿瘤模型的方法，特别是衍生自患者来源的肿瘤细胞及肿瘤相关基质细胞(例如纤维母细胞、内皮细胞及/或免疫细胞)的患者来源的3D共培养肿瘤模型。3D共培养肿瘤模型提供对活体内肿瘤微环境的改进模拟，可用于肿瘤微环境的基础研究以及建立癌症疗法及癌症免疫疗法的活体外药物筛选模型。

在一些实施例中，本文提供一种用于产生衍生自肿瘤细胞及肿瘤相关基质或免疫细胞(例如纤维母细胞、内皮细胞及/或免疫细胞)的3D共培养肿瘤模型的方法，其中所述方法包含a)在本文提供的3D培养系统中的任一者上培养包含肿瘤细胞及肿瘤相关基质细胞的多数个细胞，以获得包含肿瘤细胞及肿瘤相关基质细胞的多个类肿瘤。在一些实施例中，肿瘤细胞及肿瘤相关基质细胞在类肿瘤内形成直接的细胞-细胞接触。在一些实施例中，所述方法包含聚集肿瘤细胞及肿瘤相关基质细胞(例如通过培养混合细胞群体。

在一些实施例中，基质细胞包含纤维母细胞、内皮细胞或间质干细胞。在一些实施例中，免疫细胞包含骨髓衍生的抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞、嗜中性球、肿瘤浸润性淋巴球、T细胞、B细胞、树突状细胞或任何其他肿瘤相关免疫细胞。

在一些实施例中，本文提供的3D共培养肿瘤模型提供研究抗癌药物对正常细胞的细胞毒性作用的宝贵工具。在一些实施例中，本文提供的方法包含评估抗癌药物对共培养物中的肿瘤细胞(例如高度增殖细胞)与正常非肿瘤细胞的影响。

肝细胞的3D细胞培养物的产生

在另一态样中，本发明提供一种用于产生肝细胞的3D细胞培养模型的方法。3D细胞培养在评估肝胆药物处置及药物诱导的肝毒性方面表现出优于公知2D细胞培养的肝特异性功能，此是归因于3D模型再现活体内样生理条件。3D肝细胞培养可用于组织工程改造及药物开发。

一旦肝细胞自肝脏分离且在公知初级培养物中生长，这些重要酶的活性就会迅速丧失。此丧失对于大鼠肝细胞尤为突出，在培养之前24小时内就会失去其80％的CYP活性(Paine,A J,In:Berry,M N等人(编),The Hepatocyte Review,Kluwer AcademicPublishers,Netherlands,第411-420页,2000)。

在一些实施例中，本文提供一种在本文所述的3D培养系统中的任一者上培养肝细胞的方法，其中肝细胞维持初级肝细胞的一或多个肝特异性基因表达及功能，诸如白蛋白分泌、病毒感染性及/或细胞色素3P450(CYP)酶活性。CYP为一个酶家族，定位于肝细胞内质网的细胞质侧，催化有机化合物的氧化，使得水溶性增加，从而促进细胞排泄。在一些实施例中，在本文所述的3D培养系统中的任一者上培养的肝细胞维持参与正常药物代谢的一或多个基因的基因表达及功能至少5天、至少7天、至少10天、至少14天或至少21天的培养期。

在一些实施例中，3D细胞培养平台用于培养初级肝细胞。在一些实施例中，初级肝细胞是自人类或其他哺乳动物的肝脏生检分离。在一些实施例中，3D细胞培养平台用于培养胎儿肝细胞。

在一些实施例中，3D细胞培养平台用于培养永生化细胞株。在一些实施例中，细胞株表达一或多个1/II期异生药物代谢基因及/或肝细胞特异性转录物。在一些实施例中，在本文所述的3D培养系统中的任一者上培养的细胞维持参与正常药物代谢的一或多个基因的基因表达及功能至少5天、至少7天、至少10天、至少14天或至少21天的培养期。在一些实施例中，细胞为HepG2、Huh7或HepaRG。

在一些实施例中，本文提供一种使用本文所述的3D细胞培养系统中的任一者培养肝细胞的方法，其中肝细胞活体外维持肝功能，诸如表达关键细胞色素P450(CYP)药物代谢酶。在一些实施例中，肝细胞在延长的时间段内维持肝功能，诸如至少5天、至少7天、至少10天、至少15天或至少20天。

使用公知3D培养系统培养肝细胞，由于大于200μm的球状体中心缺氧，导致细胞球状体中形成坏死核(Hussein等人“Three dimensional culture of HepG2 liver cellson a rat decellularized liver matrix for pharmacological studies”.J BiomedMater Res B Appl Biomater,2016.104(2):第263-73页)。在一些实施例中，本文提供的3D细胞培养系统能够将细胞球状体(例如肝细胞球状体)的尺寸维持在约100μm，且随着细胞随时间推移继续增殖而诱导其分裂成较小的球状体。

在一些实施例中，细胞球状体的直径为约50μm至约150μm。在一些实施例中，细胞球状体的直径为约100μm至约150μm。在一些情况下，细胞球状体的直径为约50μm、约60μm、约70μm、约80μm、约90μm、约100μm、约110μm、约120μm、约130μm、约140μm或约150μm。在一些实施例中，在培养8天后，细胞球状体的平均尺寸为150μm。在一些实施例中，培养超过7天的细胞球状体的尺寸维持在约50μm至约150μm的范围内。

在一些实施例中，所述方法包含在本文提供的3D培养系统中的任一者上培养肝细胞及非实质细胞(NPC)。在一些实施例中，非实质细胞包括胆管上皮细胞、肝窦内皮细胞(LSEC)、肝星状细胞(HSC)及/或Kupffer 8细胞(KC)。

在另一实施例中，本发明提供一种评估由哺乳动物肝细胞活体内代谢的药剂的代谢的方法，其包含(a)使用本文所述的3D培养系统中的任一者培养哺乳动物肝细胞；(b)向培养容器中的肝细胞培养物中添加所评估的药剂，持续一段足以使肝细胞的酶代谢所述药剂且将其转化为其一或多种代谢物的时间；(c)鉴别培养物的培养基或细胞中所述一或多种代谢物的存在或量测其浓度，从而评估所述药剂的代谢。

活体外干细胞球状体的产生

在另一态样中，本发明提供一种用于活体外产生干细胞球状体的方法。本文所述的干细胞包含间质干细胞(MSC)及富潜能干细胞(PSC)，包括胚胎干细胞(ESC)及诱导性富潜能干细胞(iPSC)。这些干细胞球状体为细胞疗法、组织工程改造、高通量药理学筛选及毒性测试的有前景的候选物。这些应用需要大量高质量细胞；然而，MSC及PSC的可扩展生产已成为难题。本文提供的3D培养系统可允许MSC及PSC的高效干细胞增殖及分化。

在一些实施例中，本文提供一种使用本文提供的3D培养系统中的任一者进行3D细胞培养的方法，其中所述方法增加细胞群体的干细胞特性及/或增殖率。在一些实施例中，细胞为间质干细胞或富潜能干细胞。在一些实施例中，细胞为胚胎干细胞或诱导性富潜能干细胞。

在一些实施例中，所述方法增加一或多个干细胞特性相关基因的表达。举例而言，细胞表面CD133代表干细胞表征的生物标记中的一者且与多种细胞特征相关，诸如干细胞特性、再生、分化及不同细胞谱系的代谢。在一些实施例中，所述方法增加细胞中CD133的表达。在一些实施例中，所述方法诱导CD133细胞群体中的CD133表达。

在一些实施例中，所述方法在培养期间维持一或多个干细胞特性相关基因的表达。在一些实施例中，培养期为至少7天、至少10天、至少14天或至少21天。

套组

在某些实施例中，本文揭示一种套组或制品，其包含本文所述的3D细胞培养系统。在一些情况下，所述套组用于分离单细胞衍生的纯系。在一些情况下，所述套组进一步包含经分隔以接收一或多个容器(诸如小瓶、管及其类似物)的封装或容器，每个容器均包含待用于本文所述的方法中的各别要素中的一者。适合的容器包括例如瓶子、小瓶、注射器及试管。在一个实施例中，容器由多种材料形成，诸如玻璃或塑料。

在一些情况下，所述套组进一步包含列出内含物及/或使用说明的标签及具有使用说明的包装插页，例如使用本文所述的3D培养系统培养异质细胞群体以获得包含单细胞衍生的纯系的多数个细胞纯系的说明。通常亦将包括一套说明。

特定术语

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语具有与熟习所主张的主题所属技术者通常所理解相同的含义。应理解，前述一般描述及以下详细描述仅为例示性及解释性的且不限制所主张的任何主题。在本申请案中，除非另外特定陈述，否则单数的使用包括多数。必须指出，除非上下文另外明确指示，否则如本说明书及随附申请专利范围中所使用，单数形式“一(a/an)”及“所述”包括多数个指示物。在本申请案中，除非另有陈述，否则“或”的使用意谓“及/或”。此外，术语“包括(including)”以及诸如“包括(include)”、“包括(includes)”及“包括(included)”的其他形式的使用并非限制性的。

如本文所用，范围及量可表示为“约”特定值或范围。约亦包括准确量。因此，“约5μL”意谓“约5μL”，且亦意谓“5μL”。一般而言，术语“约”包括预计在实验误差内的量。

本文所用的章节标题仅用于组织目的而不应理解为限制所描述的主题。

如本文所用，术语“包含”欲意谓方法包括所叙述的步骤或要素，但不排除其他。“基本上由……组成”应意谓使申请专利范围仅为包括步骤或要素而开放，这些步骤或要素不会实质性地影响所主张的方法的基本及新颖特征。“由……组成”应意谓排除申请专利范围中未规定的任何要素或步骤。由这些过渡术语中的每一者定义的实施例均在本发明的范畴内。

如本文所用，术语“带正电荷的聚电解质”涵盖包含两个或更多个正电荷的多数个单体单元或非聚合分子。在一些情况下，带正电荷的聚电解质亦涵盖多数个单体单元或非聚合分子，其包含正电荷基团、中性电荷基团或负电荷基团，净电荷为正。

如本文所用，术语“阳离子聚合物”涵盖多数个单体单元或非聚合分子。在一些情况下，阳离子聚合物为合成聚合物。在其他情况下，阳离子聚合物为天然聚合物。

如本文所用，术语“阳离子多肽”是指包含两个或更多个正电荷的多肽。在一些情况下，阳离子多肽包含带正电荷的氨基酸残基、带负电荷的残基及极性残基，但多肽的净电荷为正。在一些情况下，阳离子多肽的长度为8至100个氨基酸。在一些情况下，阳离子多肽的长度为8至80、8至50、8至40、8至30、8至25、8至20、8至15、10至100、10至80、10至50、10至40、10至30、10至20、20至100、20至80、20至50、20至40、20至30、30至100、30至80、30至50、40至100、40至80或50至100个氨基酸。

如本文所用，术语“带负电荷的聚电解质”涵盖包含两个或更多个负电荷的多数个单体单元或非聚合分子。在一些情况下，带负电荷的聚电解质亦涵盖多数个单体单元或非聚合分子，其包含正电荷基团、中性电荷基团或负电荷基团，净电荷为负。

如本文所用，术语“阴离子聚合物”涵盖多数个单体单元或非聚合分子。在一些情况下，阴离子聚合物为合成聚合物。在其他情况下，阴离子聚合物为天然聚合物。

如本文所用，术语“阴离子多肽”是指包含两个或更多个负电荷的多肽。在一些情况下，阴离子多肽包含带正电荷的氨基酸残基、带负电荷的残基及极性残基，但多肽的净电荷为负。在一些情况下，阴离子多肽的长度为8至100个氨基酸。在一些情况下，阴离子多肽的长度为8至80、8至50、8至40、8至30、8至25、8至20、8至15、10至100、10至80、10至50、10至40、10至30、10至20、20至100、20至80、20至50、20至40、20至30、30至100、30至80、30至50、40至100、40至80或50至100个氨基酸。

如本文所用，术语“亲水性聚合物”涵盖包含一或多个亲水性基团的多数个单体单元或非聚合分子。在一些情况下，亲水性聚合物对水溶液为可渗透的。在其他情况下，亲水性聚合物为不可渗透的或不吸收水溶液。在一些情况下，亲水性聚合物涵盖非反应性聚合物，或不含反应性基团(例如与另一种化合物形成共价键的基团)的聚合物。

如本文所用，术语“聚合物”包括均聚物及共聚物、分支链及非分支链以及天然或合成聚合物。

如本文所用，术语“制品”是指细胞培养制品，诸如片、膜、管、盘、皿或生物医学装置。在一些情况下，生物医学装置为经设计以在组织(例如哺乳动物组织)或体液中或之上，较佳在人类组织或体液中或之上使用的任何制品。例示性装置包括但不限于细胞培养皿、细胞培养盘、生物反应器及其类似物。

如本文所用，免疫细胞涵盖嗜中性球、嗜酸性球、嗜碱性球、肥大细胞、单核球、巨噬细胞、树突状细胞、自然杀手细胞及淋巴球(B细胞及T细胞)。

内皮细胞为排列在血管及淋巴管的内表面的细胞。例示性内皮细胞包括高内皮微静脉(HEV)骨髓内皮及脑内皮。

上皮细胞为排列在器官及血管的外表面以及内部器官内腔的内表面的细胞。例示性上皮细胞包括鳞状上皮细胞、立方体上皮细胞及柱状上皮细胞。

如本文所用，术语“干细胞”涵盖成人干细胞及胚胎干细胞。例示性干细胞包括造血干细胞、间质干细胞(MSC)、神经干细胞、上皮干细胞、皮肤干细胞、胚胎干细胞(ESC)及诱导性富潜能干细胞(iPSC)。

如本文所用，术语“化学成分确定的培养基”是指所有化学组分已知的活体外培养基。化学成分确定的培养基可包括基础培养基(诸如DMEM、F12或RPMI 1640，含有氨基酸、维生素、无机盐、缓冲剂、抗氧化剂及能量来源)，其补充有重组白蛋白、化学成分确定的脂质、重组胰岛素及/或锌、重组运铁蛋白或铁、硒及抗氧化剂硫醇，诸如2-巯基乙醇或1-硫甘油。

如本文所用，术语“富集培养基”是指活体外培养基，其中基础培养基进一步补充有生长因子、维生素及必需营养素。

如本文所用，术语“半附着”及“松散地附着”可互换使用，且关于培养的细胞，是指可通过温和的搅拌或温和的机械力自基质表面分离的细胞。在一些情况下，细胞可在不需要细胞解离酶的情况下分离。

如本文所用，术语“单细胞衍生的球状体”是指体外生长且以3D型式形成的细胞丛，所述丛由安置于表面涂层上的单细胞生长而成。

在一些实施例中，治疗剂包括但不限于化学治疗药物、免疫检查点抑制剂、核酸药物、治疗性细胞组合物或其组合。

在一些实施例中，治疗剂为细胞毒性或细胞抑制性化学治疗药物。化学治疗药物可为烷基化剂(诸如顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)、甲氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、达喀尔巴嗪(dacarbazine)、洛莫司汀(lomustine)、卡莫司汀(carmustine)、丙卡巴肼(procarbazine)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)及异环磷酰胺(ifosfamide))、抗代谢物(诸如氟尿嘧啶(fluorouracil，5-FU)、吉西他滨(gemcitabine)、甲氨喋呤(methotrexate)、阿糖胞苷(cytosine arabinoside)、氟达拉宾(fludarabine)及氟尿苷(floxuridine))、抗有丝分裂剂(包括紫杉烷(taxane)，诸如太平洋紫杉醇(paclitaxel)及多烯紫杉醇(decetaxel)及长春花生物碱，诸如长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春瑞宾(vinorelbine)及长春地辛(vindesine))、蒽环霉素(anthracycline)(包括小红莓(doxorubicin)、道诺霉素(daunorubicin)、戊柔比星(valrubicin)、埃达霉素(idarubicin)及表柔比星(epirubicin)，以及放射菌素，诸如放线菌素D(actinomycinD))、细胞毒性抗生素(包括丝裂霉素(mitomycin)、普卡霉素(plicamycin)及博莱霉素(bleomycin))、拓朴异构酶抑制剂(包括喜树碱，诸如喜树碱(camptothecin)、伊立替康(irinotecan)及拓朴替康(topotecan)以及表鬼臼毒素的衍生物，诸如安吖啶(amsacrine)、依托泊苷(etoposide)、磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)及替尼泊苷(teniposide))、针对血管内皮生长因子(VEGF)的抗体(诸如贝伐单抗(bevacizumab，)、其他抗VEGF化合物)；抗PD-1(抗计划性死亡-1)治疗剂，诸如抗体或化合物(例如纳武单抗(Nivolumab))；沙利度胺(thalidomide，/>)及其衍生物，诸如来那度胺(lenalidomide，/>)；内皮生长抑素；血管生长抑素；受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂，诸如舒尼替尼(sunitinib，/>)；酪氨酸激酶抑制剂，诸如索拉非尼(sorafenib，/>)、埃罗替尼(erlotinib，/>)、帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)及拉帕替尼(lapatinib)；转型生长因子-α或转型生长因子-β抑制剂及针对表皮生长因子受体的抗体，诸如帕尼单抗(panitumumab，/>)及西妥昔单抗(cetuximab，/>)。

在一些实施例中，治疗剂为免疫检查点抑制剂。免疫检查点抑制剂可为CD137、CD134、PD-1、KIR、LAG-3、PD-L1、PDL2、CTLA-4、B7.1、B7.2、B7-DC、B7-H1、B7-H2、B7-H3、B7-H4、B7-H5、B7-H6、B7-H7、BTLA、LIGHT、HVEM、GAL9、TIM-3、TIGHT、VISTA、2B4、CGEN-15049、CHK 1、CHK2、A2aR、TGF-β、PI3Kγ、GITR、ICOS、IDO、TLR、IL-2R、IL-10、PVRIG、CCRY、OX-40、CD160、CD20、CD52、CD47、CD73、CD27-CD70、CD40及其组合。

在一些实施例中，治疗剂为核酸药物。核酸药物可为DNA、DNA质粒、nDNA、mtDNA、gDNA、RNA、siRNA、miRNA、mRNA、piRNA、反义RNA、snRNA、snoRNA、vRNA及其组合。在一些实施例中，治疗性核酸为DNA质粒，其包含编码选自由以下组成的群的基因的核苷酸序列：GM-CSF、IL-12、IL-6、IL-4、IL-12、TNF、IFNy、IFNa及其组合。

在一些实施例中，治疗剂为治疗性细胞组合物。例示性治疗性细胞组合物包括但不限于T细胞、自然杀手(NK)细胞及树突状细胞。

在一些实施例中，治疗剂为治疗性抗原结合分子组合物。例示性治疗性抗原结合分子组合物包括但不限于单株抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、scFV、Fab、VHH/VH等。

在一些情况下，治疗剂包含一线疗法。如本文所用，“一线疗法”包含对患有癌症的个体的初步治疗。在一些情况下，癌症为原发性癌症。在其他情况下，癌症为转移性或复发性癌症。在一些情况下，一线疗法包含化学疗法。在其他情况下，一线治疗包含放射疗法。熟习此项技术者将容易理解，不同的一线治疗可适用于不同类型的癌症。

在一些情况下，治疗剂包含二线疗法、三线疗法或四线疗法。

如本文所用，术语“个体(individual(s))”、“个体(subject(s))”及“患者”意谓任何哺乳动物。在一些实施例中，哺乳动物为人类。在一些实施例中，哺乳动物为非人类。这些术语均不要求或限于以健康照护工作者(例如医生、注册护士、从业护士、医师助理、护理员或临终关怀工作者)的监督(例如持续或间歇性)为特征的情形。

实例

这些实例仅出于说明的目的提供且不限制本文所提供的申请专利范围的范畴。实例1：本发明的表面涂层的构筑

(i)PVA或PEG涂布的聚苯乙烯盘

首先对由聚苯乙烯塑料制成的组织培养盘进行处理：将聚苯乙烯盘暴露于电浆气体，以改质疏水性塑料表面，使其更具亲水性，随后将亲水性聚合物(例如PVA或PEG)沉积于聚苯乙烯盘的经改质表面上，以形成PVA或PEG涂布的聚苯乙烯盘。

(ii)PVA交联的聚苯乙烯盘

首先对由聚苯乙烯塑料制成的组织培养盘进行处理：将聚苯乙烯盘暴露于臭氧电浆，以改质疏水性塑料表面，使其更具亲水性，随后将光活化的迭氮苯基-PVA添加至聚苯乙烯盘的经电浆处理表面，以形成PVA交联的聚苯乙烯盘(图5中所示)。迭氮苯基衍生的聚(乙烯醇)(AzPh-PVA)可通过将PVA的-OH基团与4-迭氮苯甲酸偶合来合成，如报导(J.Nanosci.Nanotechnol.,2009,9,230-239)。

(iii)PVA交联的PTFE盘

首先对由聚四氟乙烯(PTFE)制成的组织培养盘进行处理：将PTFE盘暴露于电浆气体中，以改质疏水性塑料表面，使其更具亲水性，随后将亲水性聚合物(例如PVA或PEG)沉积于PTFE盘的经改质表面上。应用交联剂戊二醛(GA)将PVA交联至PTFE，以形成PVA交联的PTFE盘(图6中所示)。

聚电解质多层的堆积

PLL(MW 150K-300K)、PLGA(MW 50K-100K)、PLO(0.01％)溶液、PLH(MW 5K-25K)、PLA(MW 15K-70K)可购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO,USA)。将聚阳离子及聚阴离子均溶解于Tris-HCl缓冲液(pH 7.4)中，且沉积于用Tris-HCl缓冲液冲洗后的PVA或PEG涂布的表面上。沉积每层聚阳离子或聚阴离子且培育10分钟，随后用Tris-HCl缓冲液洗涤3次，持续2、1及1分钟。PLL/PLGA、PLO/PLGA、PLH/PLGA及PLA/PLGA多层膜可如下通过在PVA或PEG涂布的表面上逐层自组装来制造。

PLL/PLGA多层

在一些实施例中，聚电解质多层为PLL/PLGA多层，其可通过在(i)PVA或PEG涂布的聚苯乙烯盘、(ii)PVA交联的聚苯乙烯盘或(iii)PVA交联的PTFE盘的表面上依次沉积PLL及PLGA来构筑。各沉积步骤包含将PLL或PLGA溶液添加至盘表面，培育10分钟且洗涤3次，持续2、1及1分钟。

在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLL)₃/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLL)₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLL)₁₀/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLL)₁₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLL(PLGA/PLL)₃/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLL(PLGA/PLL)₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLL(PLGA/PLL)₁₀/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLL(PLGA/PLL)₁₅/PVA构成的表面涂层。

PLO/PLGA多层

在一些实施例中，聚电解质多层为PLO/PLGA多层，其可通过在(i)PVA或PEG涂布的聚苯乙烯盘、(ii)PVA交联的聚苯乙烯盘或(iii)PVA交联的PTFE盘的表面上依次沉积PLO及PLGA来构筑。各沉积步骤包含将PLO或PLGA溶液添加至盘表面，培育10分钟且洗涤3次，持续2、1及1分钟。

在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLO)₃/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLO)₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLO)₁₀/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLO)₁₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLO(PLGA/PLO)₃/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLO(PLGA/PLO)₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLO(PLGA/PLO)₁₀/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLO(PLGA/PLO)₁₅/PVA构成的表面涂层。

PLH/PLGA多层

在一些实施例中，聚电解质多层为PLH/PLGA多层，其可通过在(i)PVA或PEG涂布的聚苯乙烯盘、(ii)PVA交联的聚苯乙烯盘或(iii)PVA交联的PTFE盘的表面上依次沉积PLH及PLGA来构筑。各沉积步骤包含将PLH或PLGA溶液添加至盘表面，培育10分钟且洗涤3次，持续2、1及1分钟。

在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLH)₃/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLH)₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLH)₁₀/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLH)₁₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLH(PLGA/PLH)₃/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLH(PLGA/PLH)₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLH(PLGA/PLH)₁₀/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLH(PLGA/PLH)₁₅/PVA构成的表面涂层。

PLA/PLGA多层

在一些实施例中，聚电解质多层为PLA/PLGA多层，其可通过在(i)PVA或PEG涂布的聚苯乙烯盘、(ii)PVA交联的聚苯乙烯盘或(iii)PVA交联的PTFE盘的表面上依次沉积PLA及PLGA来构筑。各沉积步骤包含将PLA或PLGA溶液添加至盘表面，培育10分钟且洗涤3次，持续2、1及1分钟。

在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLA)₃/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLA)₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLA)₁₀/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由(PLGA/PLA)₁₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLA(PLGA/PLA)₃/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLA(PLGA/PLA)₅/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLA(PLGA/PLA)₁₀/PVA构成的表面涂层。在一个实施例中，构筑由PLA(PLGA/PLA)₁₅/PVA构成的表面涂层。

耗散型石英晶体微天平(QCM-D)量测

QCM实验在Q-Sense E4(Biolin Scientific AB/Q-sence,Sweden)下进行。在0.1M十二烷基硫酸钠中清洗经氧化硅(SiO₂)涂布的石英晶体芯片(AT-cut石英晶体，f0＝5MHz)，接着用Milli-Q水冲洗，在氮气下干燥且暴露于氧电浆20秒。对于QCM-D量测，腔室稳定在25℃且所有量测均在第三谐波(15MHz)下记录。为了模拟连续表面涂层，QCM-D腔室中各涂布步骤的浓度及洗涤条件为相同的。约1％牛血清白蛋白(BSA，Millipore,Bedford,MA)用于非特异性吸附研究，且引入腔室中的表面上。

表面化学分析

本发明的表面涂层的化学组成是通过在硅晶圆上进行C₆₀(10kV,10nA)蚀刻的X射线光电子光谱法(XPS；VersaProbe III,PHI)来分析。所用通能为93.9eV，步长为0.5eV。量测样品层中碳、氮、氧及硅的相对原子浓度，最大厚度为10nm。

通过使用原子力显微镜(AFM)量测表面粗糙度

本发明的表面涂层的粗糙度是使用原子力显微镜(AFM；Nanowizard 3,JPKinstrument)以轻敲模式来量测。将谐振频率为134kHz的硅悬臂用于实验。

实例2：单细胞衍生的球状体的形成

图7展示在供应完全DMEM培养基的癌细胞生长过程中的第0、1、2、3、4及5天，在本发明的表面涂层上培养的HCT116结肠直肠癌细胞的延时显微镜观察结果。(影像由LeicaDMI6000B延时显微镜在10倍物镜下拍摄)。

实例3：细胞株衍生的肿瘤球状体的产生

本发明的表面涂层提供生物兼容性多层涂布表面，其能够使细胞黏附以进行细胞增殖，且亦提供直接在表面上形成球状体的不积垢特征。用各种癌细胞株测试包含本发明的表面涂层的细胞培养系统，结果是成功培养且形成衍生自各种癌细胞株的球状体(图8A-E中所示)。图8A-E展示使用本发明的培养平台进行体外培养及形成衍生自(A)肺癌细胞株A549、H1299、PC-9及H1975；(B)肝癌细胞株SNU-398、SNU-475、PLC/PRF/S、Hep3B及Huh7；(C)乳癌细胞株MDA-MB-231及CGBC01；(D)结肠直肠癌细胞株HCT116、HCT15及WiDr；及(E)人类舌鳞状细胞癌细胞株SAS、卵巢癌细胞株SK-OV-3及来源于人类膀胱癌患者的细胞株T24的球状体(7-14天后)的结果。这些癌细胞在本发明的培养系统上生长7至14天(接种细胞的数目为约1000)。实例4：CTC衍生的肿瘤球状体的产生

用各种患者来源的CTC测试包含本发明的表面涂层的细胞培养系统，结果是成功培养且形成衍生自患者来源的CTC的球状体(图9A-C中所示)。图9A-C展示在本发明的培养平台上CTC衍生的球状体培养的代表性时间依赖性影像。(A)自乳癌患者的血液样品分离CTC；14天后形成CTC衍生的球状体。(B)自头颈癌患者的血液样品分离CTC；38天后形成CTC衍生的球状体。(C)自结肠直肠癌患者的血液样品分离CTC；在13-27天后形成CTC衍生的球状体。比例尺：50μm。

其产生的球状体可进一步有益于医学治疗及应用的未来诊断及指导，例如：非侵入性早期癌症侦测、个人用药指导、治疗前及治疗后的耐药性调查、基于免疫细胞的癌症疗法的细胞活性评估，且通过使用体外培养的患者来源的初级CTC细胞提供大量材料来阐明参与癌症进展的机制。

实例5：组织衍生的肿瘤球状体的产生

将来源于动物模型初级异种移植物的初级组织细胞在本发明的细胞培养系统上培养7天。图10A-B展示衍生自由结肠直肠癌(CRC)患者获得的原发性结肠直肠肿瘤组织的肿瘤球状体的影像。在2周及4周后在本发明的培养平台上产生肿瘤球状体。结果表明，本发明的细胞培养平台能够自初级组织细胞形成类肿瘤。

虽然本文已显示及描述本发明的较佳实施例，但对于熟习此项技术者应显而易见，此类实施例仅藉助于实例提供。熟习此项技术者现将在不背离本发明的情况下想到许多变化、改变及取代。应理解，本文所述的本发明实施例的各种替代方案可用于实践本发明。预期以下申请专利范围界定本发明的范畴，且因此涵盖这些申请专利范围及其等效物的范畴内的方法及结构。

Claims (31)

1.一种用于涂布细胞培养制品的组合物，所述组合物包含：

a)亲水性聚合物，其中所述亲水性聚合物沉积于所述细胞培养制品的表面上，及

b)聚电解质多层，其中所述亲水性聚合物与这些聚电解质多层的聚阳离子或聚阴离子直接接触。

2.如请求项1的组合物，其中所述亲水性聚合物是选自由以下组成的群：聚(乙烯醇)(PVA)、聚(乙二醇)(PEG)、PEG-丙烯酸酯、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚乙烯亚胺(PEI)、聚-L-丙交酯(PLLA)、聚-D-丙交酯(PDLA)、聚(L-丙交酯-共-D,L-丙交酯)(PLDLLA)、聚(乙醇酸)(PGA)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PL-co-GA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚(甲基丙烯酸羟乙酯)(p-HEMA)及其衍生物。

3.如请求项2的组合物，其中所述亲水性聚合物为PVA、PEG、PEG-丙烯酸酯、PVP、PEI、PMMA或其衍生物。

4.如请求项2的组合物，其中所述亲水性聚合物为PVA、PEG或PEG-丙烯酸酯。

5.如请求项1的组合物，其中所述亲水性聚合物与所述细胞培养制品的表面交联。

6.如请求项1的组合物，其中所述亲水性聚合物不含交联。

7.如请求项1的组合物，其中所述聚阳离子为聚(氨基酸)。

8.如请求项1的组合物，其中所述聚阴离子为聚(氨基酸)。

9.如请求项1的组合物，其中所述聚阳离子是选自由以下组成的群：聚(L-离氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PLA)、聚(L-鸟氨酸)(PLO)、聚(L-组氨酸)(PLH)及其组合。

10.如请求项9的组合物，其中所述聚阳离子为PLL、PLA、PLO或PLH。

11.如请求项1的组合物，其中所述聚阴离子为聚(L-麸氨酸)(PLGA)、聚(L-天冬氨酸)(PLAA)或其组合。

12.如请求项1的组合物，其中(聚阳离子/聚阴离子)的双层是选自由以下组成的群：PLL/PLGA、PLL/PLAA、PLA/PLGA、PLA/PLAA、PLO/PLGA、PLO/PLAA、PLH/PLGA、PLH/PLAA及其组合。

13.如请求项1的组合物，其中这些聚电解质多层是经由逐层组装而形成。

14.如请求项1的组合物，其中这些聚电解质多层包含n个双层，其中n为1至30范围内的整数，且其中最外层为聚阳离子或聚阴离子。

15.如请求项1的组合物，其中这些聚电解质多层包含n个(聚阳离子/聚阴离子)的双层及附加聚阴离子层，其中n为1至30范围内的整数，且其中最外层为聚阴离子。

16.如请求项1的组合物，其中这些聚电解质多层包含n个(聚阴离子/聚阳离子)的双层及附加聚阳离子层，其中n为1至30范围内的整数，且其中最外层为聚阳离子。

17.如请求项1的组合物，其中所述细胞培养制品是通过包含以下步骤的方法涂布：

a)提供具有表面的细胞培养制品，其中所述表面为疏水性的，

b)通过处理改质所述疏水性表面，

c)将亲水性聚合物施加至经改质表面，及

d)在所述亲水性聚合物上依次沉积聚阳离子及聚阴离子的交替层。

18.如请求项17的组合物，其中所述处理为电浆处理、电晕放电或UV臭氧处理。

19.如请求项17的组合物，其中所述处理为硅氢化。

20.如请求项17的组合物，其中所述疏水性表面在所述处理后经照射或亲水化。

21.如请求项17的组合物，其中在将吸收性聚合物施加至所述经改质表面后使所述表面亲水化。

22.如请求项17的组合物，其中所述亲水性聚合物为PVA、PEG或PEG-丙烯酸酯。

23.如请求项17的组合物，其中所述亲水性聚合物与所述表面交联。

24.如请求项17的组合物，其中所述表面不含交联。

25.一种细胞培养系统，其包含表面涂布有如请求项1的组合物的细胞培养制品。

26.如请求项25的细胞培养系统，其进一步包含细胞及/或培养基。

27.一种用于培养细胞的方法，所述方法包含：

a)提供表面涂布有如请求项1的组合物的细胞培养制品，

b)在所述经涂布表面上接种细胞，及

c)在适合的培养基下培养这些细胞一段充足的时间以形成一或多个球状体。

28.如请求项27的方法，其中所述一或多个球状体是经由单细胞增殖产生。

29.如请求项27的方法，其中所述一或多个球状体的平均直径在50μm与150μm之间。

30.如请求项27的方法，其中所述接种包含将这些细胞以每平方公分少于1000个细胞的密度平板接种于基质上。

31.一种用于获得及视情况表征单细胞衍生的球状体的方法，所述方法包含：

a)在涂布有如请求项1的组合物的表面上培养异质细胞群体，以获得至少一个安置于所述表面上的单细胞衍生的球状体，及

b)视情况，分析所述单细胞衍生的球状体，从而获得单细胞的至少一个特征。