CN116472338A - 细胞块的制造方法 - Google Patents
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Abstract
一种细胞块的制造方法,其在细胞培养基材上进行粘附培养,细胞培养基材具有(A)及(B)这2个区域,所述细胞块的制造方法具有工序(1)~(3)。(A)具有细胞增殖性且面积为0.001~1mm2的岛状的区域,(B)与(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域,(1)制备包含间充质细胞和外胚层来源细胞的细胞悬浮液的工序,(2)使细胞悬浮液与细胞培养基材接触,使所述2种细胞随机地粘附于(A)区域,细胞悬浮液与细胞培养基材的接触面上的、所述2种细胞的合计细胞数为100~100000个细胞/cm2,(3)培养粘附于(A)区域的细胞而形成包含所述2种细胞的细胞块的工序。
Description
技术领域
本发明涉及细胞块的制造方法,其能够高效地制造含有包含间充质细胞及外胚层来源细胞在内的2种以上细胞、并且具有外胚层来源细胞的含量多的部位、及前述细胞的含量少的(间充质细胞的含有比例多的)部位的至少2种部位的细胞块,并且能够稳定地输送。
背景技术
近年来,通过将在生物体外培养的细胞移植到人体中、从而使受损脏器等再生的尝试正在活跃地进行中。作为再生医疗的细胞源,除了利用iPS细胞等多能干细胞的方法以外,还报道了移植被称为器官原基的由上皮系细胞和间充质细胞制作的细胞块的方法。
作为器官原基的制造方法,报道了将上皮系细胞的细胞块和间充质细胞的细胞块这2种细胞块在胶原凝胶内以相邻方式配置的方法(例如,参照专利文献1。)。但是,该方法需要在凝胶内一个一个地分别制作器官原基,存在器官原基的量产性不足的问题。
作为制作器官原基的其它方法,已知如下方法:使用不粘附细胞的U形底的细胞培养基材,以混合状态培养上皮系细胞和间充质细胞,从而自发形成上皮系细胞和间充质细胞分别聚集而成的细胞块(例如,参照专利文献2。)。该方法虽然器官原基的量产性优异,但是由于细胞块以浮游状态存在,因此存在在培养操作中、器官原基输送时细胞块容易因培养基的揺动而摇动、器官原基容易损伤的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本专利第5932671号公报
专利文献2:日本专利第6425319号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的在于,提供细胞块的制造方法,其能够高效地制造含有2种以上细胞且在细胞粘附于基材的状态下具有外胚层来源细胞的含量多的部位、及前述细胞的含量少的(间充质细胞的含有比例多的)部位的至少2种部位的细胞块,并且能够稳定地输送。
用于解决问题的方案
本发明人等鉴于以上方面反复进行了深入研究,结果发现,通过在细胞粘附区域经图案化的细胞培养基材上对2种以上细胞进行粘附培养能够解决上述课题,从而完成了本发明。
即,本发明为:
<1>一种细胞块的制造方法,其特征在于,其在细胞培养基材上进行粘附培养,前述细胞培养基材具有下述(A)及(B)这2个区域,所述细胞块的制造方法具有下述工序(1)~(3)。
(A)具有细胞增殖性且面积为0.001~1mm2的岛状的区域。
(B)与前述(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域。
(1)制备含有间充质细胞和外胚层来源细胞的细胞悬浮液的工序。
(2)使前述工序(1)中制备的细胞悬浮液与前述细胞培养基材接触,使前述间充质细胞和前述外胚层来源细胞随机地粘附在前述(A)区域的工序,前述细胞悬浮液与前述细胞培养基材的接触面上的、前述间充质细胞与前述外胚层来源细胞的合计细胞数为每单位面积100~100000个细胞。
(3)培养粘附于前述(A)区域的细胞,形成包含前述间充质细胞和前述外胚层来源细胞的细胞块的工序。
<2>根据<1>所述的制造方法,其中,前述细胞悬浮液中的、前述间充质细胞与前述外胚层来源细胞的细胞数的比为1:10~10:1。
<3>根据<1>或<2>所述的细胞块的制造方法,其特征在于,在前述工序(3)中,前述细胞块包含前述间充质细胞比前述外胚层来源细胞的含有比例多的部位、及前述外胚层来源细胞比前述间充质细胞的含有比例多的部位,前述间充质细胞比前述外胚层来源细胞的含有比例多的部位在基材面内方向的最大截面积与前述外胚层来源细胞比前述间充质细胞的比例多的部位在基材面内方向的最大截面积的比为2:1~1:20。
<4>根据权利要求<1>~<3>中任一项所述的细胞块的制造方法,其特征在于,还具有下述工序(4)。
(4)培养前述工序(3)中形成的前述细胞块而形成器官原基的工序。
<5>根据<4>所述的细胞块的制造方法,其特征在于,前述器官原基中存在多能蛋白聚糖。
<6>一种毛囊原基分化诱导试剂盒,其包含具有下述(A)及(B)这2个区域的细胞培养基材。
(A)具有细胞增殖性且面积为0.001~1mm2的圆形的区域。
(B)与前述(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域。
<7>根据<6>所述的毛囊原基分化诱导试剂盒,其还包含:具有间充质细胞增殖性及上皮系细胞增殖性的培养基。
发明的效果
本发明的细胞块的制造方法可以提供一种细胞块的制造方法,其能够高效地制造包含间充质细胞及外胚层来源细胞的2种以上细胞且具有外胚层来源细胞的含量多的部位、及前述细胞的含量少的(间充质细胞的含有比例多的)部位的至少2种部位的细胞块,并且能够稳定地输送。
进而,本发明的细胞块的制造方法形成外胚层来源细胞的含有比例多的部位及间充质细胞的含有比例多的部位,从而产生与生物体内相同的组织结构,所制造的细胞块能够分化为具有人体再生能力的成熟状态。
附图说明
图1为示出本发明的细胞块的制造方法的示意图。
图2为实施例1的培养第1天的细胞块的相位差显微镜图像。
图3为实施例1的培养第6天的细胞块的相位差显微镜图像。
图4为实施例1的培养第11天的细胞块的相位差显微镜图像。
图5为实施例3的培养第1天的细胞块的相位差显微镜图像。
图6为实施例3的培养第1天的细胞块的荧光显微镜图像。
图7为实施例3的培养第7天的细胞块的相位差显微镜图像。
图8为实施例3的培养第7天的细胞块的荧光显微镜图像。
图9为实施例4的培养第7天的细胞块的相位差显微镜图像。
图10为实施例4的培养第7天的细胞块的荧光显微镜图像。
图11为实施例5的培养第7天的细胞块的相位差显微镜图像。
图12为实施例5的培养第7天的细胞块的荧光显微镜图像。
图13为比较例4的培养第6天的细胞块的相位差显微镜图像。
具体实施方式
以下,对用于实施本发明的方式(以下,简称为“本实施方式”。)进行详细地说明。以下的本实施方式是用于说明本发明的示例,并非用于将本发明限定于以下的内容。本发明可以在其主旨的范围内进行适宜变形地加以实施。
本说明书中,“细胞块”表示多个细胞聚集而形成的细胞三维聚集块。另外,“器官原基”表示由上皮系细胞和间充质细胞形成的、通过移植到生物体中而能够再生为组织、脏器的细胞块。
另外,本说明书中,“共培养”表示将2种以上细胞混合而进行培养。
另外,本说明书中,“刺激应答性”表示通过外部刺激而结构发生变化或亲水性/疏水性的程度发生变化。此处,本说明书中“外部刺激”表示:超声波、振动、对流等力学刺激;光、电气、磁等电磁刺激;加热、冷却等热力学刺激,不包括由酶反应等生物反应所造成的刺激。
另外,本说明书中,“温度应答性”表示亲水性/疏水性的程度因温度变化而变化。进而,亲水性/疏水性的程度发生变化的临界温度记为“应答温度”。
另外,本说明书中,“细胞粘附性”表示在培养细胞的温度下容易粘附于细胞培养基材。“具有细胞粘附性”表示细胞在培养温度下能够直接或能借助生物体来源物质粘附于基材或细胞培养基材。另外,“不具有细胞粘附性”表示在培养温度下细胞无法粘附于基材或细胞培养基材。
另外,本说明书中,“细胞增殖性”表示在培养温度下细胞容易增殖,“具有细胞增殖性”表示细胞在培养温度下能够直接或借助生物体来源物质粘附于基材或细胞培养基材并进行增殖。另外,“不具有细胞增殖性”表示在培养温度下细胞无法粘附于基材或细胞培养基材、或者虽然粘附但无法增殖的情况。进而,“细胞增殖性高”表示在以相同培养期进行比较时增殖至更多细胞的情况。
另外,本说明书中,“生物体来源物质”是存在于生物体体内的物质,也可以是天然物,也可以是通过基因重组技术等人工合成的物质,另外,也可以是以前述生物体来源物质作为基础进行化学合成而得的物质。生物体来源物质没有特别限定,例如是作为构成生物体的基本材料的核酸、蛋白质、多糖以及作为它们的构成要素的核苷酸、核苷、氨基酸、各种糖、或者脂质、维生素、激素。
本发明的一个方面涉及一种细胞块的制造方法,其特征在于,在细胞培养基材上进行粘附培养,前述细胞培养基材具有下述(A)及(B)这2个区域,所述细胞块的制造方法具有下述工序(1)~(3)。
(A)具有细胞增殖性且面积为0.001~1mm2的岛状的区域。
(B)与前述(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域。
(1)制备含有间充质细胞和外胚层来源细胞的细胞悬浮液的工序。
(2)使前述工序(1)中制备的细胞悬浮液与细胞培养基材接触,使间充质细胞和外胚层来源细胞随机地粘附在前述(A)区域的工序,前述细胞悬浮液与前述细胞培养基材的接触面上的、前述间充质细胞与前述外胚层来源细胞的合计细胞数为每单位面积100~100000个细胞。
(3)培养粘附于前述(A)区域的细胞,形成包含间充质细胞和外胚层来源细胞的细胞块的工序。
本发明中使用的细胞培养基材具有下述(A)及(B)这2个区域。
(A)具有细胞增殖性且面积为0.001~1mm2的岛状的区域。
(B)与前述(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域。
前述(A)区域具有细胞增殖性。通过具有细胞增殖性,从而本发明的细胞培养基材能够培养细胞而制造细胞块。不具有细胞增殖性的情况下,不能培养细胞而形成细胞块。
(A)区域并且为面积0.001~1mm2的岛状的区域。通过为面积0.001~1mm2的岛状的区域,在对2种以上细胞进行粘附培养时,1种细胞能够自发地聚集而形成其含有比例多的部位。面积小于0.001mm2时,不能在全部的(A)区域中均匀地对细胞进行共培养。另外,面积超过1mm2时,在对2种以上细胞进行共培养时,形成全部细胞均匀分散状态的细胞块,不能制造具有1种细胞自发地聚集、其含有比例多的部位的细胞块。另外,从适于形成器官原基等具有人体再生能力的细胞块的角度出发,优选面积为0.005~0.5mm2,进一步优选面积为0.01~0.5mm2,特别优选面积为0.015~0.25mm2,最优选面积为0.02~0.2mm2。另外,在毛囊原基的培养中,优选面积为0.001~0.2mm2,进一步优选面积为0.001~0.1mm2,特别优选面积为0.001~0.05mm2,最优选面积为0.005~0.05mm2。
另外,从适于制造尺寸及形状均匀的细胞块的角度出发,(A)区域的面积的标准偏差/平均面积优选为80%以下,进一步优选为50%以下,特别优选为20%以下,最优选为5%以下。作为前述(A)区域的形状,没有特别限定,可根据作为目标的细胞块形状适宜设定,可列举例如圆、椭圆、多边形、不规则的由直线或曲线形成的闭合形状等。另外,从适于制造接近球形形状的细胞块的角度出发,优选圆或椭圆、多边形,进一步优选圆或椭圆、长方形,特别优选圆或椭圆、正方形,最优选圆或椭圆。
前述(B)区域与前述(A)区域相邻且不具有细胞增殖性。通过为与(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域,从而在培养细胞时能够仅在(A)区域中增殖细胞。(B)区域不与(A)区域相邻或具有细胞增殖性的情况下,在培养细胞时,细胞会逐渐扩展到(A)区域周围,因此不能制造具有1种细胞自发地聚集、其含有比例多的部位的细胞块。另外,从适于使制造的细胞块的尺寸及形状均匀化的角度出发,优选(B)区域不仅不具有细胞增殖性、而且不具有细胞粘附性。
作为(B)区域的形状,除了与(A)区域相邻以外没有限定,从适于制造尺寸及形状均匀的细胞块的角度出发,优选与(A)区域的边界线中的20%以上的长度是与(B)区域相邻的,进一步优选50%以上,特别优选80%以上,最优选(A)区域的周围全部为(B)区域。
作为(A)区域和(B)区域的面积比,没有特别限定,从适于提高培养基材的每单位面积能制造的细胞块的量的方面考虑,(A)区域的面积优选为基材整体的10%以上,进一步优选30%以上,特别优选50%以上,最优选70%以上。另外,从适于在多个(A)区域之间设置足够的距离、抑制多个(A)区域的集落融合而成为不均匀的形状的方面考虑,(B)区域的面积优选为基材整体的20%以上,进一步优选40%以上,特别优选60%以上,最优选80%以上。
从适于形成尺寸均匀的细胞块的角度出发,本发明中使用的细胞培养基材优选在表面中含有基于亲水性高分子的层、并且(A)区域为利用等离子体处理、紫外线处理、电晕放电处理中的任意种或这些的组合对前述基于亲水性高分子的层的一部分进行了分解或改性而成的区域。通过使细胞培养基材在表面具有基于亲水性高分子的层,从而能够抑制(B)区域上吸附有助于基材-细胞间粘附的蛋白,形成不具有细胞粘附性或细胞增殖性的区域。另外,通过对基于亲水性高分子的层的一部分分解或改性,从而能够对(A)区域赋予细胞粘附性或细胞增殖性。另外,为了提高前述(A)区域的细胞粘附性及细胞增殖性、适于在短时间内形成细胞块,进一步优选(A)区域为等离子体处理区域。
另外,作为本发明中使用的细胞培养基材的其它制作方法,可列举通过光刻法、喷墨法、丝网印刷法等仅在细胞培养基材上的一部分区域上覆盖促进或抑制细胞粘附性的物质的方法。
为了适于使(B)区域形成不具有细胞粘附性或细胞增殖性的区域,前述基于亲水性高分子的层的层厚度优选为10nm以上,进一步优选为50nm以上,特别优选为100nm以上,最优选为500nm以上。另外,为了适于使(A)区域形成具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域,层厚优选为1000nm以下,进一步优选为500nm以下,特别优选为100nm以下,最优选为50nm以下。
作为前述基于亲水性高分子的层的形成方法,可以使用形成化学性结合的方法及基于物理性相互作用的方法中的至少一种来进行。作为形成化学性结合的方法,可列举紫外线照射、电子束照射、伽马射线照射、等离子体处理、电晕处理等形成反应性官能团的方法。另外,也可以通过以离子、自由基为反应源的有机反应对基材表面进行交联反应。作为基于物理性相互作用的方法,可使用以与作为对象的亲水性高分子相容性优异的基质为涂布材料的涂布、刷涂、浸涂、旋涂、棒涂、流涂、喷涂、辊涂、气刀涂布、刮刀涂布、凹版涂布、微凹版涂布、狭缝式涂布等方法。
作为前述亲水性高分子的种类,没有特别限定,可列举具有羟基、氨基、聚乙二醇基等极性基团者;具有甜菜碱结构、磷脂酰胆碱基等两性离子结构者。为了使(B)区域形成不具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域,优选羟基、磷脂酰胆碱基、或聚乙二醇基,进一步优选羟基或磷脂酰胆碱基,特别优选磷脂酰胆碱基。作为市售品,可适宜使用例如BIOSURFINE-AWP(东洋合成公司制)、Lipidure-CM5206(日油公司制)等。
从适于抑制亲水性高分子从细胞培养基材溶出而抑制高分子混入细胞聚集体、细胞块对品质造成的影响的角度出发,前述亲水性高分子优选为具有亲水性的单体单元和疏水性/反应性的单体单元这两者的无规共聚物或嵌段共聚物,进一步优选为具有亲水性的单体单元和疏水性/反应性的单体单元这两者的无规共聚物。另外,作为前述共聚物的组成比,为了适于使(B)区域形成不具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域,亲水性的单体单元优选为30wt%以上,进一步优选为40wt%以上,特别优选为50wt%以上,最优选为60wt%以上。进而,为了适于抑制亲水性高分子溶出,亲水性的单体单元优选为80wt%以下,进一步优选为50wt%以下,特别优选为30wt%以下,最优选为10wt%以下。
作为前述亲水性的单体单元,除了为亲水性以外没有特别限定,可列举例如丙烯酸2-二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙酯、丙烯酸2-二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸2-二乙基氨基乙酯、N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺等具有氨基者;N-(3-磺基丙基)-N-甲基丙烯酰氧基乙基-N,N-二甲基铵甜菜碱、N-甲基丙烯酰氧基乙基-N,N-二甲基铵-α-N-甲基羧基甜菜碱等具有甜菜碱者;丙烯酸羟基乙酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、N-(2-羟基乙基)丙烯酰胺、聚乙二醇单丙烯酸酯、聚乙二醇单甲基丙烯酸酯、聚丙二醇单丙烯酸酯、聚丙二醇单甲基丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇单丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇单甲基丙烯酸酯、二乙二醇单甲基醚丙烯酸酯、二乙二醇单甲基醚甲基丙烯酸酯、二乙二醇单乙基醚丙烯酸酯、二乙二醇单乙基醚甲基丙烯酸酯、丙烯酸2-甲氧基乙酯、甲基丙烯酸2-甲氧基乙酯、丙烯酸2-乙氧基乙酯、甲基丙烯酸2-乙氧基乙酯、丙烯酸3-丁氧基乙酯、甲基丙烯酸3-丁氧基乙酯、3-丁氧基乙基丙烯酰胺、丙烯酸糠酯、甲基丙烯酸糠酯、丙烯酸四氢糠酯、甲基丙烯酸四氢糠酯等具有聚乙二醇基、甲氧基乙基者;丙烯酸甲氧基甲酯、甲基丙烯酸甲氧基甲酯、丙烯酸2-乙氧基甲酯、甲基丙烯酸2-乙氧基甲酯、丙烯酸3-丁氧基甲酯、甲基丙烯酸3-丁氧基甲酯、3-丁氧基甲基丙烯酰胺等具有丙烯酸酯基者;2-甲基丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱、2-丙烯酰氧基乙基磷脂酰胆碱、3-(甲基)丙烯酰氧基丙基磷脂酰胆碱、4-(甲基)丙烯酰氧基丁基磷脂酰胆碱、6-(甲基)丙烯酰氧基己基磷脂酰胆碱、10-(甲基)丙烯酰氧基癸基磷脂酰胆碱、ω-(甲基)丙烯酰基(聚)氧亚乙基磷脂酰胆碱、2-丙烯酰胺乙基磷脂酰胆碱、3-丙烯酰胺丙基磷脂酰胆碱、4-丙烯酰胺丁基磷脂酰胆碱、6-丙烯酰胺己基磷脂酰胆碱、10-丙烯酰胺癸基磷脂酰胆碱、ω-(甲基)丙烯酰胺(聚)氧亚乙基磷脂酰胆碱等具有磷脂酰胆碱基者。
作为前述疏水性的单体单元,除了为疏水性以外没有特别限定,可列举例如丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸正丁酯、丙烯酸异丁酯、甲基丙烯酸异丁酯、丙烯酸叔丁酯、甲基丙烯酸叔丁酯、丙烯酸正己酯、甲基丙烯酸正己酯、丙烯酸正辛酯、甲基丙烯酸正辛酯、丙烯酸正癸酯、甲基丙烯酸正癸酯、丙烯酸正十二烷基酯、甲基丙烯酸正十二烷基酯、丙烯酸正十四烷基酯、甲基丙烯酸正十四烷基酯等。作为前述反应性的单体单元,从能够通过短时间的处理将亲水性高分子固定化于基材的角度出发,优选具有UV反应性的单体单元,可列举例如丙烯酸4-叠氮苯酯、甲基丙烯酸4-叠氮苯酯、丙烯酸2-((4-叠氮苯甲酰)氧基)乙酯、甲基丙烯酸2-((4-叠氮苯甲酰)氧基)乙酯等。
本发明中使用的细胞培养基材另外也可以具有刺激应答性。通过使细胞培养基材具有刺激应答性,从而可以利用外部刺激使细胞块从细胞培养基材剥离,能够在抑制对细胞的损伤的情况下回收细胞。作为前述刺激应答性,只要能够利用外部刺激而剥离细胞块就没有特别限定,可列举温度应答性、光应答性、pH应答性、磁应答性、电场应答性、力学刺激应答性,优选为温度应答性、光应答性、pH应答性、力学刺激应答性中的任一种或它们中的多种的组合,进一步优选为温度应答性、光应答性、力学刺激应答性中的任一种或它们中的多种的组合,特别优选为温度应答性、力学刺激应答性中的任一种或它们中的多种的组合,最优选温度应答性。
另外,从在细胞培养基材上培养细胞时能够以接近体温的温度来培养细胞的角度出发,作为前述温度应答性没有特别限定,优选应答温度为50℃以下,进一步优选为35℃以下,另外从培养中进行培养基更换等操作时适于抑制细胞剥离的角度出发,特别优选为25℃以下,最优选为15℃以下。进而,从能够在不损伤细胞的温度下通过冷却操作形成细胞块的角度出发,应答温度的下限值优选为0℃以上,进一步优选为1℃以上,特别优选为3℃以上,最优选为4℃以上。作为对细胞培养基材赋予前述温度应答性的方法,从细胞培养基材的量产性优异的角度出发,优选在基材表面设置基于温度应答性高分子的层的方法。作为高分子的种类,没有特别限定,可以适宜地使用通过疏水性相互作用等物理作用固定化于基材的嵌段共聚物、借助叠氮基等反应性基团固定化于基材的共聚物、通过将单体涂布于基材并且在基材上进行电子束聚合或自由基聚合而固定化于基材上的聚合物等。
前述温度应答性高分子的种类没有特别限定,作为用于赋予温度应答性的单体单元,可列举例如丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺等(甲基)丙烯酰胺化合物;N,N-二乙基丙烯酰胺、N-乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-异丙基甲基丙烯酰胺、N-环丙基丙烯酰胺、N-环丙基甲基丙烯酰胺、N-叔丁基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基甲基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺等N-烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物;N,N-二甲基(甲基)丙烯酰胺、N,N-乙基甲基丙烯酰胺、N,N-二乙基丙烯酰胺等N,N-二烷基取代(甲基)丙烯酰胺衍生物;1-(1-氧代-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-丙烯基)-吗啉、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吡咯烷、1-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-哌啶、4-(1-氧代-2-甲基-2-丙烯基)-吗啉等具有环状基团的(甲基)丙烯酰胺衍生物;甲基乙烯基醚等乙烯基醚;N-脯氨酸甲酯丙烯酰胺等脯氨酸衍生物,从适于将应答温度设为0~50℃的方面考虑,优选N,N-二乙基丙烯酰胺、N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺、N-正丙基甲基丙烯酰胺、N-乙氧基乙基丙烯酰胺、N-四氢糠基丙烯酰胺、N-四氢糠基甲基丙烯酰胺,进一步优选N-正丙基丙烯酰胺、N-异丙基丙烯酰胺,特别优选N-异丙基丙烯酰胺。另外,在培养操作过程中在进行培养基更换时使用室温的培养基的情况下,从适于将嵌段共聚物的应答温度设为比室温低的温度的方面考虑,优选N-正丙基丙烯酰胺、N-脯氨酸甲酯丙烯酰胺。
本发明中,从适于迅速地进行由集落形成细胞块的工序的方面考虑,温度应答性高分子中包含的温度应答性的结构单元比率优选70wt%以上,进一步优选80wt%以上,特别优选90wt%以上,最优选92wt%以上。
作为前述温度应答性高分子,从适于抑制温度应答性高分子从细胞培养基材溶出、抑制高分子混入细胞聚集体、细胞块中对品质的影响的角度出发,优选具有温度应答性的单体单元和疏水性的单体单元这两者的无规共聚物或嵌段共聚物,进一步优选具有亲水性的单体单元和疏水性的单体单元这两者的嵌段共聚物。疏水性的单体单元可优选使用与前述的亲水性高分子时相同的疏水性的单体单元。
本发明中,温度应答性高分子另外可以包含用于控制应答温度的单体单元。可列举例如亲水性或疏水性的单体单元,没有特别限定,可列举例如丙烯酸2-二甲基氨基乙酯、甲基丙烯酸2-二甲基氨基乙酯、丙烯酸2-二乙基氨基乙酯、甲基丙烯酸2-二乙基氨基乙酯、N-[3-(二甲基氨基)丙基]丙烯酰胺等具有氨基者;N-(3-磺丙基)-N-甲基丙烯酰氧基乙基-N,N-二甲基铵甜菜碱、N-甲基丙烯酰氧基乙基-N、N-二甲基铵-α-N-甲基羧基甜菜碱等具有甜菜碱者;丙烯酸羟基乙酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、N-(2-羟基乙基)丙烯酰胺、聚乙二醇单丙烯酸酯、聚乙二醇单甲基丙烯酸酯、聚丙二醇单丙烯酸酯、聚丙二醇单甲基丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇单丙烯酸酯、甲氧基聚乙二醇单甲基丙烯酸酯、二乙二醇单甲醚丙烯酸酯、二乙二醇单甲醚甲基丙烯酸酯、二乙二醇单乙基醚丙烯酸酯、二乙二醇单乙基醚甲基丙烯酸酯、丙烯酸2-甲氧基乙酯、甲基丙烯酸2-甲氧基乙酯、丙烯酸2-乙氧基乙酯、甲基丙烯酸2-乙氧基乙酯、丙烯酸3-丁氧基乙酯、甲基丙烯酸3-丁氧基乙酯、3-丁氧基乙基丙烯酰胺、丙烯酸糠酯、甲基丙烯酸糠酯、丙烯酸四氢糠酯、甲基丙烯酸四氢糠酯等具有聚乙二醇基、甲氧基乙基者;丙烯酸甲氧基甲酯、甲基丙烯酸甲氧基甲酯、丙烯酸2-乙氧基甲酯、甲基丙烯酸2-乙氧基甲酯、丙烯酸3-丁氧基甲酯、甲基丙烯酸3-丁氧基甲酯、3-丁氧基甲基丙烯酰胺等具有丙烯酸酯基者;2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、2-丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱、3-(甲基)丙烯酰氧基丙基磷酸胆碱、4-(甲基)丙烯酰氧基丁基磷酸胆碱、6-(甲基)丙烯酰氧基己基磷酸胆碱、10-(甲基)丙烯酰氧基癸基磷酸胆碱、ω-(甲基)丙烯酰基(聚)氧亚乙基磷酸胆碱、2-丙烯酰胺乙基磷酸胆碱、3-丙烯酰胺丙基磷酸胆碱、4-丙烯酰胺丁基磷酸胆碱、6-丙烯酰胺己基磷酸胆碱、10-丙烯酰胺癸基磷酸胆碱、ω-(甲基)丙烯酰胺(聚)氧亚乙基磷酸胆碱等具有磷酸胆碱基者。
作为本发明中的温度应答性高分子的分子量,没有特别限制,为了适于提高温度应答性高分子的强度,以数均分子量计优选为1000~100万,进一步优选为2000~50万,特别优选为5000~30万,最优选为1万~20万。
本发明中,从适于抑制温度应答性高分子混入细胞块中的方面考虑,温度应答性高分子所含有的数均分子量5000以下的成分优选为50%以下,进一步优选为30%以下,特别优选为10%以下,最优选为5%以下。另外,数均分子量10000以下的成分优选为50%以下,进一步优选为30%以下,特别优选为10%以下,最优选为5%以下。进而,数均分子量30000以下的成分优选为50%以下,进一步优选为30%以下,特别优选为10%以下,最优选为5%以下。嵌段共聚物中包含的特定分子量以下的成分的含量可以通过凝胶渗透色谱仪进行测定。
本发明中的亲水性/温度应答性高分子可以根据需要包含链转移剂、聚合引发剂、阻聚剂等。作为链转移剂,没有特别限制,可以适宜地使用通常使用者,例如可列举二硫代苯甲酸酯、三硫代碳酸酯、4-氰基-4-[(十二烷基硫烷基硫代羰基)硫烷基]戊酸、2-氰基丙烷-2-基-N-甲基-N-(吡啶-4-基)二硫代氨基甲酸酯、(甲基-2-[甲基(4-吡啶)二硫代碳酸酯]丙酸酯)。另外,作为聚合引发剂,没有特别限制,可以适宜地使用通常使用者,可列举例如偶氮二异丁腈、1,1’-偶氮二(环己甲腈)、二叔丁基过氧化物、叔丁基过氧化氢、过氧化氢、过二硫酸钾、过氧化苯甲酰、三乙基硼、二乙基锌等。进而,作为阻聚剂,没有特别限制,可以适宜地使用通常使用者,可列举氢醌、对甲氧基苯酚、1,2,4,5-四嗪-1(2H)-基,3,4-二氢-2,4,6-三苯基(Triphenylverdazyl)、2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基、4-羟基-2,2,6,6-四甲基哌啶基-1-氧基等。
作为本发明中的亲水性/温度应答性高分子的合成方法,没有特别限定,可以使用NTS Inc.发行、“自由基聚合手册”、p.161~225(2010)中记载的活性自由基聚合技术。
本发明中,从适于提高细胞增殖性的方面考虑,基于温度应答性高分子的层的层厚优选具有1000nm以下,进一步优选200nm以下,特别优选100nm以下,最优选50nm以下。另外,从适于迅速进行由细胞块形成细胞块的工序的方面考虑,基于温度应答性高分子的层的层厚优选具有5nm以上,进一步优选20nm以上,特别优选30nm以上,最优选35nm以上。
本发明中,细胞培养基材可以根据需要在表面含有生物体来源物质。作为前述生物体来源物质,没有特别限定,例如可列举基质胶、层粘连蛋白、纤连蛋白、玻连蛋白、胶原蛋白等。
这些生物体来源物质可以是天然物,也可以是通过基因重组技术等人工合成而成者,也可以是通过限制性酶等切割而得的片段、以这些生物体来源物质作为基础的合成蛋白质或合成肽。
本发明中,作为前述基质胶,从获得容易性的方面考虑,例如可以适宜使用作为市售品的Matrigel(Corning Incorporated制)、Geltrex(Thermo Fisher Scientific制)。
前述层粘连蛋白的种类没有特别限定,例如可以使用据报道对人iPS细胞的表面所表达的α6β1整合素显示出高活性的层粘连蛋白511、层粘连蛋白521或层粘连蛋白511-E8片段。前述层粘连蛋白可以是天然物,也可以是通过基因重组技术等人工合成而成者,另外,也可以是以前述层粘连蛋白作为基础的合成蛋白质或合成肽。从获得容易性的方面考虑,例如可以适宜使用作为市售品的iMatrix-511(Nippi,Inc制)。
前述玻连蛋白可以是天然物,也可以是通过基因重组技术等人工合成而成者,另外,也可以是以前述玻连蛋白为基础的合成蛋白质或合成肽。从获得容易性的方面考虑,例如可以适宜使用作为市售品的玻连蛋白、人血浆来源(和光纯药工业株式会社制)、synthemax(Corning Incorporated制)、玻连蛋白(VTN-N)(Thermo Fisher Scientific制)。
前述纤连蛋白可以是天然物,也可以是通过基因重组技术等人工合成而成者,另外,也可以是以前述纤连蛋白为基础的合成蛋白质或合成肽。从获得容易性的方面考虑,例如可以适宜使用作为市售品的纤连蛋白溶液、人血浆来源(和光纯药工业株式会社制)、Retronectin(Takara Bio Inc.制)。
前述胶原蛋白的种类没有特别限定,例如可以使用I型胶原蛋白、IV型胶原蛋白。前述胶原蛋白可以是天然物,也可以是通过基因重组技术等人工合成而成者,另外,也可以是以前述胶原蛋白为基础的合成肽。从获得容易性的方面考虑,例如可以适宜使用作为市售品的人胶原蛋白I(Corning Incorporated制)、人胶原蛋白IV(Corning Incorporated制)。
本发明中,为了能够抑制生物体来源物质的变性、能够提高细胞增殖性,优选生物体来源物质通过非共价键而并非共价键固定化于细胞培养基材上。此处,本发明中“非共价键”表示静电相互作用、疏水性相互作用(日文原文:水不溶性相互作用)、氢键、π-π相互作用、偶极-偶极相互作用、伦敦色散力、其它范德华相互作用等源自分子间力的共价键以外的结合力。生物体来源物质在嵌段共聚物上的固定化可以是由单一的结合力所引起的,也可以是多种的组合。
本发明中,生物体来源物质的固定化方法没有特别限定,例如可以适宜使用如下方法:通过在细胞培养基材上涂布生物体来源物质的溶液规定时间而使其固定化的方法;在培养细胞时,在培养液中添加生物体来源物质而使生物体来源物质吸附至细胞培养基材的固定化方法。
本发明中,基材的材质没有特别限定,不仅可以使用通常细胞培养中使用的玻璃、聚苯乙烯等物质,而且可以使用通常能赋予形态的物质、例如聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚偏氟乙烯、聚四氟乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚甲基丙烯酸甲酯等高分子化合物、陶瓷、金属类等。从培养操作的容易性方面考虑,基材的材质优选包含玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯、聚丙烯中的至少1种,进一步优选包含玻璃、聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯中的至少1种,从适于提高挠性的方面考虑,特别优选聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、聚乙烯。另外,从适于通过利用后述亲水化处理而进行的图案化来赋予细胞增殖性的方面考虑,最优选聚苯乙烯、聚碳酸酯、聚对苯二甲酸乙二醇酯。
作为基材的形状,没有特别限制,可以是如板、薄膜那样的平面形状,也可以是纤维、多孔颗粒、多孔膜、中空纤维。另外,也可以是通常细胞培养等中使用的容器(petri培养皿等细胞培养皿、烧瓶、板、袋等)。从培养操作的容易性的方面考虑,优选为如板、薄膜那样的平面形状、或作为平膜的多孔膜。另外,根据需要,可以通过在基材上设置隔板等来设置用于区分各细胞块的结构。
本发明中,从适于迅速地进行由细胞块形成细胞块的工序、而且在制造较大的细胞块的情况下能使营养无遗留地分配到细胞块内部的方面考虑,优选基材为多孔基材、且多孔基材的孔径小于细胞。另外,从适于迅速地进行由细胞块形成细胞块的工序的方面考虑,前述孔径优选0.01~8μm,进一步优选0.01~3μm,特别优选0.01~1μm,最优选0.1~1μm。此处,本发明中多孔基材的“孔径”表示多孔基材所具有的细孔的、沿着多孔基材的面内方向的直径的平均值,可以通过测定多孔基材的激光显微镜图像、扫描型电子显微镜图像、透射型电子显微镜图像中20个以上的细孔的直径并求出平均值,从而计算。
作为前述多孔基材,另外从适于迅速地进行由细胞块形成细胞块的工序的方面考虑,孔隙率优选为0.01~60%,进一步优选0.01~20%,特别优选0.01~4%,最优选0.01~1.5%。此处,本发明中多孔基材的“孔隙率”是对于多孔基材的表面的一个主面、用细孔部分的总面积除以基材面积而得到的值,表示以面积比例计在基材面中存在何种程度的孔隙,可以通过在多孔基材的激光显微镜图像、扫描型电子显微镜图像、透射型电子显微镜图像中观察边长为多孔基材的细孔孔径的200倍以上的正方形区域,由此测定。
本发明的细胞培养基材可以实施灭菌。灭菌的方法没有特别限定,可以使用高压蒸汽灭菌、UV灭菌、γ射线灭菌、环氧乙烷气体灭菌等。从适于抑制嵌段共聚物的变性的方面考虑,优选高压蒸汽灭菌、UV灭菌、环氧乙烷气体灭菌,从适于抑制基材的变形的方面考虑,进一步优选UV灭菌或环氧乙烷气体灭菌,从批量生产性优异的方面考虑,特别优选环氧乙烷气体灭菌。
作为本发明的细胞块的制造方法中使用的细胞,只要能够粘附于细胞培养基材则没有特别限定。例如除了中国仓鼠卵巢来源CHO细胞、小鼠结缔组织L929、人胚肾来源HEK293细胞、人宫颈癌来源HeLa细胞等各种细胞系化细胞之外,还可以使用例如:作为构成生物体内的各组织、器官的上皮细胞、内皮细胞;显示出收缩性的骨骼肌细胞、平滑肌细胞、心肌细胞;构成神经系统的神经元细胞、胶质细胞、成纤维细胞;参与生物体的代谢的肝实质细胞、肝非实质细胞、脂肪细胞;作为具有分化能力的细胞的间充质干细胞、骨髄细胞、Muse细胞那样存在于各种组织中的干细胞、进而ES细胞、iPS细胞等具有分化多能性的干细胞(多能干细胞)、由这些细胞分化诱导的细胞等。从适于形成器官原基角度出发,优选使用上皮系细胞及间充质细胞。
本发明的细胞块的制造方法具有下述工序(1)~(3)。
(1)制备含有间充质细胞和外胚层来源细胞的细胞悬浮液的工序。
(2)使前述工序(1)中制备的细胞悬浮液与细胞培养基材接触,使间充质细胞和外胚层来源细胞随机地粘附于(A)区域的工序,前述细胞悬浮液与前述细胞培养基材的接触面上的、前述间充质细胞与前述外胚层来源细胞的合计细胞数为每单位面积100~100000个细胞。
(3)培养粘附于前述(A)区域的细胞,形成包含间充质细胞和外胚层来源细胞的细胞块的工序。
另外,本发明的细胞块的制造方法可以具有下述工序(4)。
(4)培养前述工序(3)中形成的细胞块而形成器官原基的工序。
前述工序(1)中,制备含有间充质细胞和外胚层来源细胞这2种细胞的细胞悬浮液。作为细胞悬浮液的制备方法,没有特别限定,分别将预先培养的2种以上细胞用酶等以单细胞状态剥离回收,在培养基中以期望的比例混合。作为2种以上细胞的混合比,从适于形成1种细胞的含有比例多的部位的角度出发,以细胞数计,以各细胞全部以均一比例混合时的细胞比例为基准,优选在0.5~1.5倍的范围内,进一步优选为0.8~1.2倍的范围内,特别优选在0.9~1.1倍的范围内,最优选在0.95~1.05倍的范围内。细胞悬浮液中的、间充质细胞与外胚层来源细胞的细胞数比可以为1:10~10:1,可以为1:5~5:1,优选为1:1。当细胞悬浮液中的间充质细胞与外胚层来源细胞的细胞数比在这些范围内时,更适于形成间充质细胞或外胚层来源细胞的含有比例多的部位。
前述工序(2)中,使前述工序(1)中制备的细胞悬浮液与细胞培养基材接触,使间充质细胞和外胚层来源细胞随机地粘附于(A)区域。在此,细胞悬浮液与细胞培养基材的接触面上的、间充质细胞和外胚层来源细胞的合计细胞数为每单位面积100~100000个细胞。通过使细胞粘附,细胞块固定化于细胞培养基材,因此能够减少在培养操作、输送时由揺动导致的细胞块损伤。在细胞未粘附时,在培养操作、输送时细胞块容易由于与细胞培养基材的壁面、其它细胞块碰撞而被损伤。为了使足够量的细胞粘附于(A)区域容易形成1种细胞的含有比例多的部位,细胞培养基材的每单位面积的接种细胞数(细胞悬浮液与细胞培养基材的接触面上的、间充质细胞和外胚层来源细胞的合计细胞数)优选为1000个细胞/cm2以上,进一步优选为3000个细胞/cm2以上,特别优选为5000个细胞/cm2以上,最优选为10000个细胞/cm2以上。另外,为了抑制细胞以浮游状态聚集,细胞培养基材的每单位面积的接种细胞数(细胞悬浮液与细胞培养基材的接触面上的、间充质细胞和外胚层来源细胞的合计细胞数)优选为100000个细胞/cm2以,进一步优选为80000个细胞/cm2以下,特别优选为50000个细胞/cm2以下,最优选为20000个细胞/cm2以下。
前述工序(3)中,培养粘附于前述(A)区域的细胞,形成包含间充质细胞和外胚层来源细胞的细胞块。另外,通过采用本申请构成的细胞培养基材,从而形成具有外胚层来源细胞的含有比例多的部位、及前述细胞的含量少的(间充质细胞的含有比例多的)部位的至少2种部位的细胞块。通过在具有前述面积的区域内培养2种以上细胞,从而仅1种细胞自发地聚集,能够形成1种细胞的含有比例多的部位。
前述工序(3)中,从适于形成器官原基的角度出发,细胞块可以包含外胚层来源细胞比间充质细胞的含有比例多的部位(也简称为外胚层来源细胞的含有比例多的部位。)。另外,细胞块可以进一步包含间充质细胞比外胚层来源细胞的含有比例多的部位(也简称为间充质细胞的含有比例多的部位。)。细胞块包含间充质细胞的含有比例多的部位、及外胚层来源细胞的含有比例多的部位的情况下,从更适于形成器官原基的角度出发,间充质细胞的含有比例多的部位在基材面内方向的最大截面积与外胚层来源细胞的比例多的部位在基材面内方向的最大截面积的比优选为2:1~1:20,进一步优选为2:1~1:10,特别优选为1:1~1:5,最优选为1:1~1:2。
前述工序(4)中,培养前述工序(3)中形成的细胞块而形成器官原基。器官原基中可以表达作为毛乳头细胞标记物的多能蛋白聚糖蛋白(versican蛋白)。
前述细胞块优选具有由粘附于前述(A)区域的细胞构成的部位和粘附于前述粘附状态的细胞的大致球状的部位这样的至少2种部位,并且前述大致球状的部位的直径小于前述(A)区域的直径。通过使细胞块为前述形状,容易分化为毛囊原基等器官原基。
本发明中使用的培养基的种类没有特别限制,可根据所培养的细胞适宜选择。例如,在使用间充质细胞和上皮系细胞这2种作为所培养的细胞时,优选将DMEM(Takara BioInc.制)和角化细胞增殖培养基(Takara Bio Inc.制)以1:1混合而成的培养基。
对2种以上细胞(例如间充质细胞及外胚层来源细胞)进行共培养时,1种细胞(例如外胚层来源细胞)的含有比例多是指:在实施能够仅对特定细胞进行荧光标记的处理(免疫染色)后使用相位差显微镜及荧光显微镜观察细胞块时,某区域中的细胞块截面中1种细胞(例如外胚层来源细胞)的细胞数相对于所含的细胞数的比例为50%以上。对2种以上细胞(例如间充质细胞及外胚层来源细胞)进行共培养时,1种细胞(例如外胚层来源细胞)的含有比例少是指上述比例小于50%。
本发明的另一个方面涉及毛囊原基分化诱导试剂盒,其包含具有下述(A)及(B)这2个区域的细胞培养基材。作为本试剂盒中所含的细胞培养基材,可以使用与细胞块的制造方法中所使用的细胞培养基材相同的基材。
(A)具有细胞增殖性且面积为0.001~1mm2的圆形的区域。
(B)与前述(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域。
毛囊原基分化诱导试剂盒可以进一步包含具有间充质细胞增值性及上皮系细胞增殖性的培养基。作为具有间充质细胞增值性及上皮系细胞增殖性的培养基,可以使用与细胞块的制造方法中所使用的培养基(例如,将DMEM(Takara Bio Inc.制)和角化细胞增殖培养基(Takara Bio Inc.制)以1:1混合而成的培养基)相同的培养基。
实施例
以下,列举用于实施本发明的方式来对本发明进行详细地说明,但其是用于说明本发明的示例,并非用于将本发明限定于以下的内容。另外,可以在本发明的主旨的范围内进行适宜变更地加以实施。需要说明的是,只要没有特别声明,则试剂使用市售品。
[实施例1]
用具有多个直径0.2mm的圆形孔的金属掩模(MITANI MICRONICS Co.,Ltd.制)覆盖直径35mm的表面覆盖有亲水性高分子的培养皿(住友电木公司制、商品名:PrimeSurface),使用等离子体照射装置(VACUUM DEVICE公司制、商品名:plasma ionbombarder PIB-20)从金属掩模上部进行等离子体处理(20Pa气压下、导电电流20mA、照射时间30秒),由此制作具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域的细胞培养基材。
将聚苯乙烯制烧瓶中培养的间充质细胞(骨髄来源的间充质干细胞)和上皮系细胞(人牙龈上皮细胞)用0.5×TrypLE-EDTA溶液剥离,进行离心分离,将细胞再分散于将DMEM(Takara Bio Inc.制)和角化细胞增殖培养基(Takara Bio Inc.制)以1:1混合而成的培养基。计测细胞数,制作以1:1混合间充质细胞和上皮系细胞而成的细胞悬浮液。
对前述图案化的细胞培养基材添加前述细胞悬浮液,以4500个细胞/cm2接种细胞。在37℃、CO2浓度5%的环境下培养12天。通过相位差显微镜观察,确认在培养第1天的时刻在(A)区域内细胞随机地粘附,在培养第4天的时刻,上皮系细胞聚集而形成具有上皮系细胞的比例多的部位的细胞块。另外,在培养第11天的时刻,前述细胞块具有由粘附于前述(A)区域的细胞构成的部位和粘附于前述粘附状态的细胞的大致球状的部位这样的至少2种部位。
将形成了上述细胞块的细胞培养基材用振荡器振荡1小时,结果全部细胞均以粘附状态被固定化,未观察到细胞块的损伤。
[实施例2]
代替实施例1中的具有多个直径0.2mm的圆形孔的金属掩模,使用具有多个直径0.5mm的圆形孔的金属掩模。另外,代替实施例1中的细胞接种密度4500个细胞/cm2,以细胞接种密度15000个细胞/cm2实施培养。培养第1天的时刻,在(A)区域内细胞随机地粘附,在培养第6天的时刻,上皮系细胞聚集而形成具有上皮系细胞的比例多的部位的细胞块。
将形成了上述细胞块的细胞培养基材用振荡器振荡1小时,结果全部细胞均以粘附状态被固定化,未观察到细胞块的损伤。
[实施例3]
使用作为间充质细胞的经Vybrant DiO细胞标记溶液荧光染色的人毛乳头细胞,此外与实施例1同样地实施培养。
用相位差显微镜及荧光显微镜观察所培养的细胞,确认在培养第1天的时刻间充质细胞和上皮系细胞随机地存在于(A)区域,在培养第7天时,形成包含间充质细胞的比例多的部位(上皮系细胞的比例少的部位)和间充质细胞的比例少的部位(上皮系细胞的比例多的部位)的细胞块。对于细胞块,获得从细胞培养基材的垂直方向用相位差显微镜及荧光显微镜拍摄而得的图像。该图像中,间充质细胞的含有比例多的部位(上皮系细胞的比例少的部位)在基材面内方向的最大截面积与间充质细胞的比例少的部位(上皮系细胞的比例多的部位)在基材面内方向的最大截面积的比为1:8.5。
[实施例4]
使用人毛乳头细胞作为间充质细胞,此外与实施例1同样地实施培养后,使用Human Versican Isoform V0 Antibody(R&D SYSTEMS制)及Donkey anti-Goat IgG(H+L)Cross-Adsorbed Secondary Antibody,Alexa Fluor488(Thermo Fisher制)进行多能蛋白聚糖的荧光染色。
用相位差显微镜及荧光显微镜观察所培养的细胞,确认在培养第1天的时刻间充质细胞和上皮系细胞随机地存在于(A)区域,在培养第7天时,形成包含间充质细胞的比例多的部位(上皮系细胞的比例少的部位)和间充质细胞的比例少的部位(上皮系细胞的比例多的部位)的细胞块。另外,用荧光显微镜观察培养的细胞,确认表达了多能蛋白聚糖。对于细胞块,获得了从细胞培养基材的垂直方向用相位差显微镜及荧光显微镜拍摄而得的图像。在该图像中,间充质细胞的含有比例多的部位(上皮系细胞的比例少的部位)在基材面内方向的最大截面积与间充质细胞的比例少的部位(上皮系细胞的比例多的部位)在基材面内方向的最大截面积的比为1:4.9。
[实施例5]
代替实施例1中的具有多个直径0.2mm的圆形孔的金属掩模的,使用具有多个直径0.1mm的圆形孔的金属掩模来制作具有细胞粘附性及细胞增殖性的区域的细胞培养基材。使用人毛乳头细胞作为间充质细胞,此外与实施例4同样地实施培养。
用相位差显微镜及荧光显微镜观察所培养的细胞,确认在培养第1天的时刻间充质细胞和上皮系细胞随机地存在于(A)区域,在培养第7天时,形成包含间充质细胞的比例多的部位(上皮系细胞的比例少的部位)和间充质细胞的比例少的部位(上皮系细胞的比例多的部位)的细胞块。另外,用荧光显微镜观察培养的细胞,确认表达了多能蛋白聚糖。对于细胞块,获得了从细胞培养基材的垂直方向用相位差显微镜及荧光显微镜拍摄而得的图像。在该图像中,间充质细胞的含有比例多的部位(上皮系细胞的比例少的部位)在基材面内方向的最大截面积与间充质细胞的比例少的部位(上皮系细胞的比例多的部位)在基材面内方向的最大截面积的比为1.5:1。
[比较例1]
不使用实施例1中的间充质细胞,取而代之仅对上皮系细胞进行培养,除此以外与实施例1同样地进行培养。即使持续培养12天,也仅形成全部细胞均匀地分布的细胞块,未形成具有1种细胞的比例多的部位的细胞块。
[比较例2]
不使用实施例1中的上皮系细胞,取而代之仅对间充质细胞进行培养,除此以外与实施例1同样地进行培养。即使持续培养12天,也仅形成全部细胞均匀地分布的细胞块,未形成具有1种细胞的比例多的部位的细胞块。
[比较例3]
代替实施例1中的具有多个直径0.2mm的圆形孔的金属掩模,使用具有多个直径1.5mm的圆形孔的金属掩模。另外,代替实施例1中的细胞接种密度4500个细胞/cm2,以细胞接种密度15000个细胞/cm2实施培养。即使持续培养12天,也仅形成全部细胞均匀地分布的细胞块,未形成具有1种细胞的比例多的部位的细胞块。
[比较例4]
使用细胞非粘附的U形底容器(住友电木公司制、商品名:PrimeSurface96孔板)作为细胞培养基材,细胞接种密度为2400个细胞/孔,除此以外与实施例1同样地实施培养。在培养第4天的时刻,确认上皮系细胞聚集而形成具有上皮系细胞的比例多的部位的细胞块。
将上述细胞块全部回收到在表面覆盖有直径35mm的亲水性高分子的培养皿(住友电木公司制、商品名:PrimeSurface)中,将细胞培养基材用振荡器振荡1小时,结果细胞块受到损伤,未保持原来的形状。
[比较例5]
代替实施例1中的细胞接种密度4500个细胞/cm2,以细胞接种密度150000个细胞/cm2实施培养。在培养第7天细胞形成了浮游状态形成细胞块。将细胞培养基材用振荡器振荡1小时,结果细胞块受到损伤,未能保持原来的形状。
[表1]
附图标记说明
A(A)区域
B(B)区域
1 上皮系细胞
2 间充质细胞
3 细胞块
4具有上皮系细胞的含有比例多的部位(间充质细胞的含有比例少的)和前述细胞的含有比例少的部位(间充质细胞的含有比例多的)这样的至少2种部位的细胞块
Claims (7)
1.一种细胞块的制造方法,其特征在于,其在细胞培养基材上进行粘附培养,所述细胞培养基材具有下述(A)及(B)这2个区域,所述细胞块的制造方法具有下述工序(1)~(3),
(A)具有细胞增殖性且面积为0.001~1mm2的岛状的区域,
(B)与所述(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域,
(1)制备含有间充质细胞和外胚层来源细胞的细胞悬浮液的工序,
(2)使所述工序(1)中制备的细胞悬浮液与所述细胞培养基材接触,使所述间充质细胞和所述外胚层来源细胞随机地粘附在所述(A)区域的工序,所述细胞悬浮液与所述细胞培养基材的接触面上的、所述间充质细胞与所述外胚层来源细胞的合计细胞数为每单位面积100~100000个细胞,
(3)培养粘附于所述(A)区域的细胞,形成包含所述间充质细胞和所述外胚层来源细胞的细胞块的工序。
2.根据权利要求1所述的细胞块的制造方法,其中,所述细胞悬浮液中的、所述间充质细胞与所述外胚层来源细胞的细胞数的比为1:10~10:1。
3.根据权利要求1或2所述的细胞块的制造方法,其特征在于,在所述工序(3)中,所述细胞块包含所述间充质细胞比所述外胚层来源细胞的含有比例多的部位、及所述外胚层来源细胞比所述间充质细胞的含有比例多的部位,所述间充质细胞比所述外胚层来源细胞的含有比例多的部位在基材面内方向的最大截面积与所述外胚层来源细胞比所述间充质细胞的比例多的部位在基材面内方向的最大截面积的比为2:1~1:20。
4.根据权利要求1~3中任一项所述的细胞块的制造方法,其特征在于,还具有下述工序(4),
(4)培养所述工序(3)中形成的所述细胞块而形成器官原基的工序。
5.根据权利要求4所述的细胞块的制造方法,其特征在于,所述器官原基中存在多能蛋白聚糖。
6.一种毛囊原基分化诱导试剂盒,其包含具有下述(A)及(B)这2个区域的细胞培养基材,
(A)具有细胞增殖性且面积为0.001~1mm2的圆形的区域,
(B)与所述(A)区域相邻且不具有细胞增殖性的区域。
7.根据权利要求6所述的毛囊原基分化诱导试剂盒,其还包含:具有间充质细胞增殖性及上皮系细胞增殖性的培养基。
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