JPWO2018003476A1 - 細胞懸濁液の膜分離方法及び細胞培養装置 - Google Patents

細胞懸濁液の膜分離方法及び細胞培養装置 Download PDF

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Abstract

本開示は、細胞とデブリスとを適切に分離することができる細胞懸濁液の膜分離方法及び細胞培養装置を提供する。即ち、一方の面に形成された入側の開口と、他方の面に形成され且つ入側の開口と連通する出側の開口と、を有し、入側の開口と出側の開口とが膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されている濾過膜を用いて、細胞懸濁液の膜分離処理を行う。

Description

本開示は、細胞懸濁液の膜分離方法及び細胞培養装置に関する。
フィルタを用いた細胞懸濁液の膜分離処理に関する技術として、以下の技術が知られている。例えば、特開２０１３−４２６８９号公報には、複数の貫通孔が形成された金属基板からなり、貫通孔の開口形状が、短辺の長さが５．０μｍ〜１５．０μｍの長方形又は角丸長方形である癌細胞濃縮フィルタを用いて血中循環癌細胞を捕獲することが記載されている。
また、特開２０１５−８７３８２号公報には、短軸直径が３．０μｍ以上１５μｍ以下で、長軸直径が、短軸直径に対し１．１倍〜３倍の楕円形の孔を、２００個／ｍｍ２〜４００００個／ｍｍ２の孔密度で含むフィルタを用い、フィルタの孔に対するフィルタ処理容量が血液に換算して６μｌ／孔以下となるように血液検体をフィルタ処理して稀少細胞を分離することが記載されている。
細胞の培養においては、培養期間中に実施される培地交換処理などにおいて、細胞懸濁液から、死細胞、細胞破砕物、細胞分泌物などのデブリスを複数の開口を有する濾過膜（フィルタ）を用いて除去する膜分離処理が実施されている。しかしながら、従来の濾過膜を用いた膜分離処理では、デブリスによって濾過膜の開口が閉塞する目詰まりが生じ、デブリスを適切に排出できない可能性があった。また、濾過膜に目詰まりが生じると、濾過膜に接触する細胞懸濁液の圧力が上昇し、細胞にダメージを与える可能性がある。濾過膜の目詰まりを防止するために濾過膜の開口径を大きくすると、回収すべき細胞もデブリスとともに濾過膜を透過してしまう。
また、胚性幹細胞（ES細胞：Embryonic Stem cell)、人工多能性幹細胞（iPS細胞：Induced pluripotent stem cell）などの、スフェアと呼ばれる細胞の凝集体（以下、細胞凝集体という）を形成する細胞においては、死細胞、細胞破砕物、細胞分泌物などのデブリス並びに単一細胞（シングルセル）を複数の開口を有する濾過膜（フィルタ）を用いて除去する膜分離処理が実施されている。しかしながら、従来の濾過膜を用いた膜分離処理では、デブリス及び単一細胞によって濾過膜の開口が閉塞する目詰まりが生じ、デブリス及び単一細胞を適切に排出できない可能性があった。また、濾過膜に目詰まりが生じると、濾過膜に接触する細胞懸濁液の圧力が上昇し、細胞にダメージを与えるおそれがある。濾過膜の目詰まりを防止するために濾過膜の開口径を大きくすると、回収すべき細胞凝集体もデブリス及び単一細胞とともに濾過膜を透過してしまう。
本開示は、細胞凝集体と、細胞凝集体の径よりも小さい径の単一細胞及びデブリス（死細胞、細胞破砕物、細胞分泌物等）とを適切に分離できる細胞懸濁液の膜分離方法及び細胞培養装置を提供する。
また、本開示は、単一細胞と、単一細胞の径よりも小さい径のデブリス（死細胞、細胞破砕物、細胞の分泌物等）とを適切に分離できる細胞懸濁液の膜分離方法及び細胞培養装置を提供する。
本開示に係る第１の態様は、細胞懸濁液の膜分離方法であって、第１の面に形成された入側の開口と、第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ入側の開口と連通する出側の開口と、を有し、入側の開口と出側の開口とが膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されている濾過膜を用いて、細胞懸濁液の膜分離処理を行うことを含む。
本開示に係る第２の態様は、細胞懸濁液の膜分離方法であって、第１の面に形成された入側の開口と、第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ入側の開口と連通する出側の開口と、を有し、入側の開口と出側の開口とを接続する経路が非直線状である濾過膜を用いて、細胞懸濁液の膜分離処理を行うことを含む。
本開示に係る第３の態様は、上記態様において、細胞懸濁液が細胞凝集体、単一細胞及びデブリスを含む場合、本開示に係る膜分離方法は、膜分離処理において細胞凝集体と、単一細胞及びデブリスと、を濾過膜を用いて分離することを含んでいてもよい。
本開示に係る第４の態様は、上記態様において、細胞懸濁液が、単一細胞及びデブリスを含む場合、本開示に係る膜分離方法は、膜分離処理において、単一細胞とデブリスと、を濾過膜を用いて分離することを含んでいてもよい。
本開示に係る第５の態様は、上記第３の態様において、濾過膜の入側の開口の径が、細胞凝集体の径の０．０１倍以上３倍以下であることが好ましい。
本開示に係る第６の態様は、上記第４の態様において、単一細胞がヒト由来細胞である場合、濾過膜の入側の開口の径が、単一細胞の径の０．０５倍以上０．８倍以下であることが好ましい。
本開示に係る第７の態様は、上記第４の態様において、単一細胞が非ヒト細胞である場合、濾過膜の入側の開口の径が、単一細胞の径の０．１倍以上２倍以下であることが好ましい。
本開示に係る第８の態様は、上記第４、第７の態様において、単一細胞が非ヒト細胞である場合、濾過膜の開口径分布の平均値をＸ、標準偏差をσとしたとき、０＜σ／Ｘ≦０．１を満たすことが好ましい。
本開示に係る第９の態様は、上記第４、第７、第８の態様において、単一細胞が非ヒト細胞である場合、濾過膜の膜厚は１５０μｍ以下であることが好ましい。
本開示に係る第１０の態様は、上記第４、第７〜第９の態様において、単一細胞が非ヒト細胞である場合、濾過膜の第１の面に加わるゲージ圧が−７０キロパスカル以上７０キロパスカル以下であることが好ましい。
本開示に係る第１１の態様は、上記第４、第７〜第１０の態様において、単一細胞が非ヒト細胞である場合、濾過膜を透過した濾液に含まれる単一細胞の個数密度が、濾過膜を透過する前の細胞懸濁液に含まれる単一細胞の個数密度の５０％以下であることが好ましい。
本開示に係る第１２の態様は、上記第４、第７〜第１１の態様において、単一細胞が非ヒト細胞である場合、濾過膜を透過した濾液に含まれる、単一細胞の径の１／１０以上１／２以下の径のデブリスの個数密度が、濾過膜を透過する前の細胞懸濁液に含まれる、単一細胞の径の１／１０以上１／２以下の径のデブリスの個数密度の５０％以上１００％以下であることが好ましい。
本開示に係る第１３の態様は、上記第４、第７〜第１２の態様において、単一細胞が非ヒト細胞である場合、単一細胞の径が５μｍ以上２５μｍ以下であることが好ましい。
本開示に係る第１４の態様は、上記第４、第７〜第１３の態様において、単一細胞は、ＣＨＯ細胞であってもよい。
本開示に係る第１５の態様は、上記第３の態様において、細胞凝集体は、ヒト由来細胞の凝集体であり、単一細胞はヒト由来細胞であってもよい。
本開示に係る第１６〜１９の態様は、上記第６、第１５の態様において、細胞凝集体または単一細胞がヒト由来細胞を含む場合、ヒト由来細胞は幹細胞または巨核球であってもよい。
本開示に係る第２０の態様は、上記態様において、濾過膜の第１の面に加わる圧力と、濾過膜の第２の面に加わる圧力との差を０．０１キロパスカル以上６０キロパスカル以下として膜分離処理を行うことを含んでいてもよい。
本開示に係る第２１の態様は、上記態様において、表面に親水化処理が施された濾過膜を用いて膜分離処理を行うことを含んでいてもよい。
本開示に係る第２２の態様は、上記態様において、濾過膜は、繊維状部材を綾畳織りして形成されたメッシュを含んで構成されていてもよい。また、本開示に係る第２３の態様において、メッシュは、金属を含んで構成されていてもよい。
本開示に係る第２４の態様は、上記第１〜第２１の態様において、各々が貫通孔を有する複数のメッシュを、貫通孔の位置を濾過膜の膜面と平行な方向に互いにずらして積層して構成された濾過膜を好適に用いることができる。また、本開示に係る第２３の態様において、複数のメッシュは、金属を含んで構成されていてもよい。
本開示に係る第２５の態様は、上記態様において、細胞懸濁液を、濾過膜の膜面の方向に沿って流して膜分離処理を行うことを含んでいてもよい。本開示に係る第２６の態様は、上記第２５の態様において、細胞懸濁液を、濾過膜の膜面に沿って往復移動させてもよい。
本開示に係る第２７の態様は、膜分離方法であって、細胞を培養するための培養容器と、第１の面に形成された入側の開口と、第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ入側の開口と連通する出側の開口と、が膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されている濾過膜を有し、培養容器で培養された細胞が流通する流路を介して培養容器に接続された濾過部と、を含む細胞培養装置の濾過膜を用いて培養容器から供給された細胞懸濁液の膜分離処理を行うものであり、培養容器内の細胞懸濁液の液量をＬとし、膜分離処理において濾過膜を透過した濾液の１日あたりの液量をＮとしたとき、０．１≦Ｎ／Ｌ≦６を満たすように膜分離処理を行うというものである。
本開示に係る第２８の態様は、細胞培養装置であって、細胞を培養するための培養容器と、培養容器で培養された細胞が流通する流路を介して培養容器に接続された濾過部と、を含む。濾過部は、第１の面に形成された入側の開口と、第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ入側の開口と連通する出側の開口と、を有する濾過膜を備える。濾過膜において、入側の開口と出側の開口とが濾過膜の膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されている。
本開示に係る第２９の態様は、細胞培養装置であって、細胞を培養するための培養容器と、培養容器で培養された細胞が流通する流路を介して培養容器に接続された濾過部と、を含む。濾過部は、第１の面に形成された入側の開口と、第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ入側の開口と連通する出側の開口とを有する濾過膜を備える。濾過膜において、入側の開口と出側の開口とを接続する経路が非直線状である。
本開示に係る第３０の態様は、上記第２８、第２９の態様において、濾過膜の表面には、親水化処理が施されていてもよい。
本開示に係る第３１の態様は、上記第２８〜第３０の態様において、濾過膜が、繊維状部材を綾畳織りして形成されたメッシュを含んで構成されていてもよい。
本開示に係る第３２の態様は、上記第２８〜第３０の態様において、濾過膜が、貫通孔を有する複数のメッシュを、貫通孔の位置を濾過膜の膜面と平行な方向に互いにずらして積層して構成されていてもよい。
本開示の上記態様によれば、細胞に与えるダメージを軽減しながら、細胞凝集体と、細胞凝集体の径よりも小さい径の単一細胞及びデブリス（死細胞、細胞破砕物、細胞の老廃物及び細胞から分泌された蛋白質等）とを分離することが可能となる。
また、本開示に上記態様よれば、細胞に与えるダメージを軽減しながら、単一細胞と、単一細胞の径よりも小さい径のデブリス（死細胞、細胞破砕物、細胞の老廃物及び細胞から分泌された蛋白質等）とを分離することが可能となる。
本開示の例示的実施形態に係る濾過装置の模式的な構成を示す図である。 本例示的実施形態に係る濾過膜の典型的な構造を示す断面図である。 本例示的実施形態に係る濾過膜に好適に用いることができる綾畳織メッシュの構造を示す斜視図である。 綾畳織メッシュの開口を拡大して示す斜視図である。 綾畳織メッシュを透過する流体の流れを示す図である。 本例示的実施形態に係る濾過膜に好適に用いることができる積層メッシュの構造を示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る濾過膜の膜面差圧を制御する制御系の構成の一例を示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る細胞懸濁液の膜分離方法の一例を示すフローチャートである。 本開示の例示的実施形態に係る細胞懸濁液の膜分離方法の一例を示すフローチャートである。 本開示の例示的実施形態に係る細胞懸濁液の膜分離方法の一例を示すフローチャートである。 本開示の例示的実施形態に係る濾過装置の構成を示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る濾過装置の構成を示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置が継代処理を実施する場合における、細胞及び培地等の流れを示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置が培地交換処理を実施する場合における細胞及び培地等の流れを示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置が分割処理を実施する場合における細胞及び培地等の流れを示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置が凍結処理を実施する場合における細胞及び培地等の流れを示す図である。 本開示の例示的実施形態に係る制御部が実行する細胞培養プログラムにおける処理の流れを示すフローチャートである。 本開示の他の例示的実施形態に係る細胞培養装置の構成の一例を示す図である。 膜分離処理前の細胞懸濁液の顕微鏡写真である。 表１における実施例１−１の条件で膜分離処理を行った後の細胞懸濁液の顕微鏡写真である。 表１における実施例１−１の条件で膜分離処理を行った後の透過側に排出された濾液の顕微鏡写真である。 表１における比較例１−１の条件で膜分離処理を行った後の透過側に排出された濾液の顕微鏡写真である。
以下、本開示の例示的実施形態の一例を図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素及び部分には同一の参照符号を付与し、重複する説明は省略する。
［第１の例示的実施形態］
本開示の例示的実施形態に係る膜分離方法により膜分離処理が行われる対象は、例えば、単一細胞及び細胞の凝集体の少なくとも一方を含む細胞懸濁液である。
「細胞」としては、培養に適していれば特に限定されるものではないが、例えば、動物細胞、昆虫細胞、酵母等を挙げることができる。本開示の例示的実施形態に係る膜分離方法が適用される細胞としては、ヒト細胞又は非ヒト動物細胞が好ましい。
「ヒト細胞」としては、ヒト由来の細胞または組織であれば特に限定されないが、例えば、ヒト外胚葉系細胞、ヒト中胚葉系細胞、ヒト内胚葉系細胞、ヒト受精卵からこれらの細胞へ分化する過程に含まれる細胞、ヒト胚性幹細胞及びヒト体性幹細胞が挙げられる。具体的な例として、例えば、ヒト由来の、筋芽細胞；（骨髄、脂肪組織、末梢血、皮膚、毛根、筋組織、子宮内膜、胎盤、臍帯血由来の）間葉系幹細胞；心筋細胞；線維芽細胞；心臓幹細胞；胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell）、胚性腫瘍細胞（ＥＣ細胞：Embryonal Carcinoma cell）及び胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞：Embryonic Germ Cell）などの多能性幹細胞；多能性幹細胞由来の細胞；鼻粘膜上皮細胞；網膜色素上皮細胞；滑膜細胞；軟骨細胞；肝細胞；腎細胞；副腎細胞；膵島細胞などの膵細胞；口腔粘膜上皮細胞及び内皮細胞などの上皮細胞；歯根膜細胞；歯肉細胞；骨膜細胞；皮膚細胞；巨核球などの造血系細胞；血小板などの血球細胞等が挙げられ、多能性幹細胞、多能性幹細胞由来の細胞、巨核球及び血小板が好ましく、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）がより好ましい。
「多能性幹細胞由来の細胞」としては、多能性幹細胞に由来する細胞であれば限定されないが、例えば、分化細胞が挙げられる。「分化細胞」とは、多能性幹細胞が分化して生じた特定の機能的又は形態的特徴を有する娘細胞を意味する。分化細胞は通常安定しており、その増殖能は低く、別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
「非ヒト動物細胞」としては、ヒト以外の動物細胞であれば特に限定されないが、例えば、チャイニーズハムスター卵巣由来のＣＨＯ細胞；ベイビーハムスター腎臓由来のＢＨＫ細胞；ヒト子宮頸部癌由来のＨｅＬａ細胞；マウス乳癌由来のＣ−１２７細胞；マウス線維芽細胞であるＮＩＨ／３Ｔ３、ＢＡＬＢ３Ｔ３；アフリカミドリザル腎臓由来のＶｅｒｏｔｓＳ３細胞；マウス細胞株ＮＳ０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１８２７）、ＳＰ２／０（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１５８１）；マウスミエローマ由来のＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞；ラットミエローマ由来のＹ３ Ａｇ１．２．３．細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６３１）、ＹＯ細胞（ＥＣＡＣＣ Ｎｏ：８５１１０５０１）、ＹＢ２／３ＨＬ．Ｐ２．Ｇ１１．１６Ａｇ．２０細胞、ＹＢ２／０細胞（ＡＴＣＣ ＣＲＬ−１６６２）；シリアンハムスター腎臓組織由来のＢＨＫ−２１細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−１０）、ＭＤＣＫ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−３４）などが挙げられ、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ−２１細胞及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞がより好ましい。
本開示の例示的実施形態に係る膜分離方法を細胞凝集体と、単一細胞及びデブリスとの分離に用いる場合には、ヒト細胞が好ましく、ヒト由来の多能性幹細胞及びヒト由来の多能性幹細胞由来の細胞がより好ましく、ヒト由来の人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）がさらに好ましい。
本開示の例示的実施形態に係る膜分離方法を単一細胞と、デブリスとの分離に用いる場合には、ヒト細胞又は非ヒト細胞が好ましく、ヒト由来の人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳ細胞）、巨核球、血小板、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ−２１細胞及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞が好ましい。別の態様においては、非ヒト細胞が好ましく、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ−２１細胞及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞がより好ましく、ＣＨＯ細胞がさらに好ましい。
本開示の例示的実施形態に係る膜分離方法は、巨核球（単一細胞）と、巨核球の分泌物である血小板（デブリス）の分離に用いることもできる。
「細胞凝集体」とは、細胞の凝集体であり、スフェアとも呼ばれる。
「単一細胞」とは、凝集体を形成していない、個別の細胞を意味する。
「デブリス」としては、例えば、死細胞、細胞破砕物、細胞分泌物が挙げられる。
「細胞分泌物」としては、例えば、細胞の老廃物、細胞から分泌される蛋白質及び細胞から分泌される、上記細胞と異なる細胞（例えば、血小板等）が挙げられる。
「巨核球」には、成熟した巨核球のほか、巨核前駆細胞または巨核芽球細胞等が含まれる。「巨核球」は、成体組織から採取した巨核球のほか、多能性幹細胞、造血前駆細胞又は間葉系細胞等の分化能を有する細胞から分化させた巨核球であっても良い。
図１は、本開示の例示的実施形態に係る細胞懸濁液の膜分離方法を実施する濾過装置６０の構成を示す模式図である。濾過装置６０は、細胞懸濁液中に含まれる細胞凝集体と、細胞凝集体を形成しない単一細胞及びデブリス（死細胞、細胞破砕物、細胞の老廃物及び細胞から分泌された蛋白質等）と、を濾過膜６１を用いて分離する細胞懸濁液の膜分離処理を行う装置である。また、濾過装置６０は、単一細胞と、デブリスとを濾過膜６１を用いて分離する膜分離処理を行う場合にも用いることができる。濾過装置６０は、例えば、細胞の培養に使用したデブリスを含む使用済みの培地を、新鮮な培地に交換する培地交換処理などにおいて使用することができる。
濾過装置６０は、容器６８と、容器６８内の空間を供給側６２と透過側６３とに隔てる濾過膜６１と、を備える。また、濾過装置６０は、供給側６２において、細胞懸濁液が流入する流入口６４と細胞懸濁液が流出する流出口６５とを有する。膜分離処理が行われる細胞懸濁液は、流入口６４から容器６８の内部に流入して流出口６５から容器６８の外部に流出する間に濾過膜６１上を通過する。細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの小さい成分は、培地等の液体とともに濾過膜６１を透過して透過側６３に排出される。例えば、濾過装置６０によって、細胞凝集体と、単一細胞及びデブリスと、を分離する場合、細胞凝集体よりもサイズの小さい単一細胞及びデブリスは、濾過膜６１を透過して透過側６３に排出される。また、濾過装置６０によって、単一細胞と、デブリスとを分離する場合、単一細胞よりもサイズの小さいデブリスは、濾過膜６１を透過して透過側６３に排出される。容器６８の透過側６３には、ポンプＰ１１が設けられた排出流路６７が接続されており、透過側６３に排出された成分は、排出流路６７を経由して廃液回収容器（図示せず）に回収される。一方、細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの大きい成分（細胞凝集体または単一細胞）は、濾過膜６１を透過せず、流出口６５から容器６８の外部に流出して回収される。このように、濾過装置６０は、膜分離処理対象である細胞懸濁液が、濾過膜６１の膜面に沿って流れるクロスフロー（タンジェンシャルフロー）方式による濾過を行うことが可能である。このようにクロスフロー方式による濾過を行うことで、デットエンド方式による濾過を行う場合と比較して、濾過膜６１の目詰まりを抑制することができる。その結果、膜分離処理中における供給側６２の圧力上昇を抑制することができ、膜分離処理中に細胞が受けるダメージを軽減できる。
図２は、本例示的実施形態に係る細胞懸濁液の膜分離方法に適用し得る濾過膜６１の典型的な構造を示す断面図である。なお、図２には、濾過膜６１を用いて、細胞凝集体Ｃ１と、単一細胞Ｃ２及びデブリスＤとを分離する場合が例示されている。濾過膜６１は、供給側６２の第１の面ＦＩ１に形成された入側の開口ＯＰ１と、透過側の第２の面ＦＩ２に形成され且つ開口ＯＰ１と連通する出側の開口ＯＰ２と、を有する。開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とは、濾過膜６１の膜面と平行な方向に互いにずれた位置に配置されている。換言すれば、開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であり、屈曲または湾曲している。本例示的実施形態において、開口ＯＰ１と開口ＯＰ２は、互いに重なる部分を有していない。すなわち、濾過膜６１は第１の面ＦＩ１と第２の面ＦＩ２との間を直線的に貫通する見通し孔を有していない。なお、開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とが部分的に重なっていてもよい。濾過膜６１は、例えば、金属またはプラスチックなどからなる繊維状部材７０を編み込むことによって形成されたメッシュ状のフィルタ膜であってもよい。
上記のような構造を有する濾過膜６１を用いることで、濾過装置６０の容器６８の供給側を濾過膜６１の膜面に沿って流れる細胞凝集体Ｃ１は、供給側の開口ＯＰ１から濾過膜６１の内部に侵入し得る。しかしながら、濾過膜６１の透過側の開口ＯＰ２は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、濾過膜６１の内部に侵入した細胞凝集体Ｃ１は、単一細胞Ｃ２及びデブリスＤと比較して透過側に容易に流出することができない。
一方、細胞凝集体を形成しない単一細胞Ｃ２及びデブリスＤは、細胞凝集体Ｃ１のサイズよりも十分に小さいので、濾過膜６１の透過側に容易に流出することができる。また、単一細胞Ｃ２及びデブリスＤは、濾過膜６１の開口ＯＰ１に侵入した細胞凝集体Ｃの脇を抜けて透過側に流出することもできる。なお、細胞凝集体Ｃ１の径として、５０μｍ〜３００μｍ程度が想定され、単一細胞Ｃ２の径として、５μｍ〜２５μｍ程度が想定される。また、デブリスＤとしての死細胞及び細胞破砕物の径は、単一細胞Ｃ２の径よりもさらに小さく、例えば単一細胞Ｃ２の径の２分の１程度が想定される。
例えば、繊維状部材を平織りすることにより形成される単純なメッシュ状の濾過膜を用いて膜分離処理を行った場合には、細胞凝集体は変形することによって容易に濾過膜の編目を抜けて透過側に流出する。細胞凝集体の透過側への流出を防止するために、濾過膜の網目のサイズを小さくすると、目詰まりが生じ、また、濾過膜の網目によって細胞凝集体が分断され、透過側に流出する。このように、膜分離処理において、平織りメッシュ等の単純な構造の濾過膜を用いた場合には、濾過膜の網目のサイズを適宜選択しても、細胞凝集体とデブリスとの分離を適切に行うことが困難である。
これに対し、本例示的実施形態に係る濾過膜６１によれば、透過側の開口ＯＰ２は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、濾過膜６１の内部に侵入した細胞凝集体Ｃ１の透過側への流出が抑制され、細胞凝集体Ｃ１と、単一細胞Ｃ２及びデブリスＤとを適切に分離することができる。また、本例示的実施形態に係る濾過膜６１によれば、細胞凝集体Ｃ１は、濾過膜６１の厚さ方向における深部にまで侵入することが困難となるため、濾過膜６１の閉塞（目詰まり）を抑制することができ、また、膜分離処理において細胞が受けるダメージを小さくすることができる。
濾過膜６１を用いて、細胞凝集体Ｃ１と、単一細胞Ｃ２及びデブリスＤとを分離する場合、濾過膜６１の開口ＯＰ１及びＯＰ２の径は、細胞凝集体Ｃ１の径の０．０１倍以上３．０倍以下であることが好ましく、より好ましくは０．０１３倍以上２．３倍以下、更に好ましくは０．０２倍以上２．０倍以下である。開口ＯＰ１及びＯＰ２の径を細胞凝集体Ｃ１の径の０．０１倍以上とすることで、細胞懸濁液中に含まれる細胞凝集体Ｃ１、単一細胞Ｃ２およびデブリスＤのうち、単一細胞Ｃ１及びデブリスＤを適切に透過側に排出することができる。開口ＯＰ１及びＯＰ２の径を細胞凝集体Ｃ１の径の３．０倍以下とすることで、濾過膜６１表面に細胞凝集体Ｃ１が捕捉されることを抑制するとともに、細胞凝集体Ｃ１の透過側への流出を抑制することができる。なお、開口ＯＰ１及びＯＰ２の径とは、開口ＯＰ１及びＯＰ２の形状が円形である場合にはその直径を意味し、開口ＯＰ１及びＯＰ２の形状が多角形である場合にはその辺の長さを意味する。細胞凝集体Ｃ１の径として円相当直径を用いてもよい。円相当直径とは、細胞凝集体の各々の輪郭線によって画定される領域を、同じ面積を有する円とみなした場合の円の直径をいう。
以上の説明では、濾過膜６１を用いて、細胞凝集体と、単一細胞及びデブリスとを分離する場合を例示したが、濾過膜６１を用いて、単一細胞とデブリスとを分離することも可能である。濾過膜６１を用いて、単一細胞とデブリスとを分離する場合、細胞凝集体と、単一細胞及びデブリスとを分離する場合に用いる濾過膜よりも開口ＯＰ１及びＯＰ２の径が小さい濾過膜を用いて膜分離処理を行うことが好ましい。単一細胞とデブリスとを分離する膜分離処理において、濾過膜６１を用いることで、濾過装置６０の容器６８の供給側を濾過膜６１の膜面に沿って流れる単一細胞は、供給側の開口ＯＰ１から濾過膜６１の内部に侵入し得る。しかしながら、濾過膜６１の透過側の開口ＯＰ２は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、濾過膜６１の内部に侵入した単一細胞は、デブリスと比較して透過側に容易に流出することができない。一方、デブリスは、単一細胞のサイズよりも小さいので、濾過膜６１の透過側に容易に流出することができる。また、デブリスは、濾過膜６１の開口ＯＰ１に侵入した単一細胞の脇を抜けて透過側に流出することもできる。本例示的実施形態に係る濾過膜６１によれば、透過側の開口ＯＰ２は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、濾過膜６１の内部に侵入した単一細胞の透過側への流出が抑制され、単一細胞と、デブリスとを適切に分離することができる。また、本例示的実施形態に係る濾過膜６１によれば、単一細胞は、濾過膜６１の厚さ方向における深部にまで侵入することが困難となるため、濾過膜６１の閉塞（目詰まり）を抑制することができ、また、膜分離処理において細胞が受けるダメージを小さくすることができる。
濾過膜６１を用いて、単一細胞とデブリスとを分離する場合、濾過膜６１の開口ＯＰ１及びＯＰ２の径は、単一細胞の径の０．０５倍以上０．８倍以下であることが好ましく、より好ましくは０．０７倍以上０．６倍以下、更に好ましくは０．１倍以上０．４倍以下である。開口ＯＰ１及びＯＰ２の径を単一細胞の径の０．２倍以上とすることで、細胞懸濁液に含まれる単一細胞及びデブリスのうち、デブリスを適切に透過側に排出することができる。開口ＯＰ１及びＯＰ２の径を単一細胞の径の０．４倍以下とすることで、濾過膜６１表面に単一細胞が捕捉されることを抑制するとともに、単一細胞の透過側への流出を抑制することができる。
また、特に、濾過膜６１を用いて、単一細胞とデブリスとを分離する場合には、濾過膜６１の開口ＯＰ１及びＯＰ２の径の均一性が確保されていることが好ましい。すなわち、濾過膜６１の開口ＯＰ１及びＯＰ２の径の分布における平均値をＸ、標準偏差をσとしたとき、０＜σ／Ｘ≦０．１を満たすことが好ましく、より好ましくは０＜σ／Ｘ≦０．０５、更に好ましくは０＜σ／Ｘ≦０．０２である。０＜σ／Ｘ≦０．１を満たすことにより、単一細胞の透過側への排出を抑制しつつデブリスを透過側に排出させることが可能となる。なお、σおよびＸは、水銀圧入法により測定し、既知の統計解析手法により求めることができる。
また、濾過膜６１の第１の面ＦＩ１及び第２の面ＦＩ２は、親水化処理が施されているか、親水基修飾されていることが好ましい。これにより、濾過膜６１のぬれ性が向上し、第１の面ＦＩ１、第２の面ＦＩ２及び膜内に気泡が滞留することを抑制できる。また、細胞から分泌される蛋白質や細胞自身が第１の面ＦＩ１および第２の面ＦＩ２に付着することを抑制できる。その結果、クロスフロー方式の濾過を実施する場合に、濾過膜６１の膜面に沿って均一な流れを形成することが可能となり、濾過膜６１の第１の面ＦＩ１および第２の面ＦＩ２全体を有効に使用することが可能となる。
濾過膜６１に対する親水化処理または親水基修飾は、例えば、プラズマ処理によって行うことができる。また、アニオン性親水基を有するアクリル樹脂等の親水性樹脂を濾過膜６１に塗布してもよい。また、濾過膜６１に酸化チタン樹脂を導入することによって生じる光触媒作用を利用して親水化処理または親水基修飾を行ってもよい。また、濾過膜６１を、アルカリケイ酸塩樹脂、シリコーン樹脂、水ガラス等の無機材料でコートしてもよい。
濾過膜６１として、例えば、図３Ａに示すような、繊維状部材を綾畳織りして形成される綾畳織メッシュ６１Ａを好適に用いることができる。綾畳織メッシュ６１Ａは、隣り合う横糸７１同士が密接し且つ一定の間隔を有して通る縦糸７２を横糸７１が例えばｎ本ずつ乗り越えながら縦糸７２に絡むように編みこまれた構造を有する。なお、ｎは２以上の自然数である（ｎ≧２）。綾畳織メッシュ６１Ａは、網目の見通しがなく、横糸７１と縦糸７２との交差部に形成される隙間によって開口が形成される。綾畳織メッシュ６１Ａに用いられる繊維状部材は、例えばステンレス等の金属またはポリエステル等の樹脂で構成され、ステンレス等の金属が好ましい。
図３Ｂは、綾畳織メッシュ６１Ａの開口ＯＰを拡大して示す斜視図である。綾畳織メッシュ６１Ａの開口ＯＰは、２本の横糸７１と１本の縦糸７２の織りによって生じる隙間によって形成される。なお、綾畳織メッシュ６１Ａの開口ＯＰの径は、標準粒子による濾過試験を行い、阻止率９５％となる粒子径（すなわち、粒子透過試験による９５％分離粒子径）として算出される。綾畳織メッシュ６１Ａを濾過膜として用いて、細胞凝集体と、単一細胞及びデブリスとを分離する場合、綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径は、４μｍ以上１５０μｍ以下であることが好ましい。綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径を４μｍ以上とすることで、単一細胞及びデブリスを適切に透過側に排出することができる。綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径を１５０μｍ以下とすることで綾畳メッシュ６１Ａの表面に細胞凝集体が捕捉されることを抑制するとともに、細胞凝集体の透過側への流出を抑制することができる。
一方、綾畳織メッシュ６１Ａを濾過膜として用いて、単一細胞とデブリスとを分離する場合、単一細胞がヒト細胞であるときには、綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径は、１μｍ以上５μｍ以下であることが好ましい。綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径を１μｍ以上とすることで、デブリスを適切に透過側に排出することができる。綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径を５μｍ以下とすることで綾畳メッシュ６１Ａの表面に単一細胞が捕捉されることを抑制するとともに、細胞凝集体の透過側への流出を抑制することができる。
単一細胞とデブリスとを分離する場合、単一細胞が非ヒト細胞であるときには、綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径は、１μｍ以上２０μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは２μｍ以上１２μｍ以下、更に好ましくは３μｍ以上７μｍ以下である。綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径を１μｍ以上とすることで、デブリスを適切に透過側に排出することができる。綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径を２０μｍ以下とすることで綾畳メッシュ６１Ａの表面にデブリスが捕捉されることを抑制するとともに、単一細胞の透過側への流出を抑制することができる。
単一細胞とデブリスとを分離する場合、単一細胞が巨核球であり、デブリスが血小板であるときには、綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径は、１μｍ以上２０μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは２μｍ以上１２μｍ以下、更に好ましくは３μｍ以上７μｍ以下である。綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径を１μｍ以上とすることで、デブリスを適切に透過側に排出することができる。綾畳織メッシュ６１Ａの９５％分離粒子径を２０μｍ以下とすることで綾畳メッシュ６１Ａの表面に単一細胞が捕捉されることを抑制するとともに、細胞凝集体の透過側への流出を抑制することができる。
図３Ｃは、綾畳織メッシュ６１Ａの断面構造を示す図である。図３Ｃには、綾畳織メッシュ６１Ａを透過する流体の流れが矢印で示されている。綾畳織メッシュ６１Ａは、厚さ方向に直線的に貫通する見通し孔を有しないため、綾畳織メッシュ６１Ａを透過する流体は、流れ方向を変えながら透過側に向けて流れる。従って、流体に含まれる比較的径の大きい粒子は、透過側に流出せずに供給側に残り易い。すなわち、綾畳織メッシュ６１Ａを濾過膜６１として使用することで、図２に示す典型構造の場合と同様、細胞懸濁液の膜分離処理において、細胞凝集体の透過側への流出を抑制することができる。
また、濾過膜６１として、例えば、図４に示すような、２枚の平織メッシュ６１ｂ、６１ｃを積層することにより形成される積層メッシュ６１Ｄを用いることができる。平織メッシュ６１ｂ、６１ｃは、それぞれの貫通孔Ｈの位置が互いにずれるようにして積層される。積層メッシュ６１Ｄを用いる場合でも、細胞懸濁液の膜分離処理において、細胞凝集体または単一細胞の透過側への流出を抑制することができる。なお、３枚以上の平織メッシュを積層して積層メッシュ６１Ｄを構成してもよい。平織メッシュ６１ｂ、６１ｃに用いられる繊維状部材は、例えばステンレス等の金属またはポリエステル等の樹脂で構成され、ステンレス等の金属が好ましい。
濾過装置６０を用いて細胞懸濁液の膜分離処理を行っている間、濾過膜６１の供給側６２の第１の面ＦＩ１に加わる圧力と、濾過膜６１の透過側６３の第２の面ＦＩ２に加わる圧力との差分（以下、膜面差圧という）を、０．０１キロパスカル以上６０キロパスカル以下とすることが好ましい。濾過膜６１の膜面差圧を０．０１キロパスカル以上とすることで、デブリスを供給側から透過側に適切に排出することが可能となる。また、濾過膜６１の膜面差圧を６０キロパスカル以下とすることで、細胞凝集体または単一細胞の濾過膜による分割（破砕）を抑制しつつ膜分離処理を行うことができる。
図５は、細胞懸濁液の膜分離処理時の濾過膜６１の膜面差圧を制御する制御系８０の構成の一例を示す図である。制御系８０は、圧力センサ８１、８２、８３及びポンプ制御部８４を含んで構成されている。圧力センサ８１は、濾過装置６０の流入口６４近傍の圧力Ｍ１を検出し、検出した圧力Ｍ１の大きさを示す検出信号をポンプ制御部８４に供給する。圧力センサ８２は、濾過装置６０の流出口６５近傍の圧力Ｍ２を検出し、検出した圧力Ｍ２の大きさを示す検出信号をポンプ制御部８４に供給する。圧力センサ８３は、濾過装置６０の排出流路６７内の圧力Ｍ３を検出し、検出した圧力Ｍ３の大きさを示す検出信号をポンプ制御部８４に供給する。ポンプ制御部８４は、圧力センサ８１、８２、８３からそれぞれ供給される検出信号によって示される圧力Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３に基づいて、排出流路６７上に設けられたポンプＰ１１の単位時間当たり回転数を制御する。
ここで、膜分離処理中における濾過膜６１の膜面差圧ΔＭは、下記の（１）式によって表される。
ΔＭ＝（Ｍ１＋Ｍ２）／２−Ｍ３ ・・・（１）
なお、（Ｍ１＋Ｍ２）／２は、濾過装置６０の供給側６２の圧力の平均値を意味する。ポンプ制御部８４は、圧力センサ８１、８２、８３によって検出された圧力Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３を、上記の（１）式に代入することによって膜面差圧ΔＭを算出する。ポンプ制御部８４は、膜面差圧ΔＭが、５キロパスカル以上６０キロパスカル以下の範囲内における所定値となるようにポンプＰ１１の単位時間当たりの回転数を制御する。なお、ポンプＰ１１は、透過側６３に排出されたデブリスを含む液体を、排出流路６７を介して濾過装置６０の外部に排出する流れを形成するように動作する。ポンプＰ１１の単位時間当たりの回転数が大きくなる程、透過側６３の圧力は小さくなり、膜面差圧ΔＭは大きくなる方向に変化する。
濾過装置６０を用いて細胞懸濁液の膜分離処理を行っている間、濾過膜６１の目詰まりを解消するための処理を適宜行ってもよい。図６は、濾過膜６１の目詰まりを解消するための処理を含む、細胞懸濁液の膜分離方法の一例を示すフローチャートである。
膜分離工程Ａ１において、細胞懸濁液を濾過膜６１の膜面の方向に沿って流して細胞懸濁液の膜分離処理を行う。このとき、細胞懸濁液の流速を速度Ｖ１とする。膜分離工程Ａ１において、濾過膜６１の膜面には、気泡、細胞、細胞から分泌された蛋白質などが付着する場合がある。これらは、濾過膜６１の目詰まりの原因となる。
判定工程Ａ２において、膜分離処理を継続するか否かを判定し、膜分離処理を継続しない場合には処理は終了となり、膜分離処理を継続する場合には、処理を排出工程Ａ３に移行する。
排出工程Ａ３において、速度Ｖ１よりも大きい速度Ｖ２で、細胞懸濁液または洗浄用の液体を濾過膜６１の膜面の方向に沿って流す。このように、濾過膜６１の膜面上に比較的流速の大きい液流を発生させることで、濾過膜６１に付着した気泡、細胞、蛋白質などが掻きとられ、濾過膜６１の目詰まりが解消される。
上記の排出工程Ａ３を、図７に示すように、逆洗工程Ａ４に置き換えてもよい。逆洗工程Ａ４では、濾過装置６０の排出流路６７上に設けられたポンプＰ１１を停止させるとともに容器６８の透過側６３に培地等の洗浄用の液体または気体を注入して透過側６３から供給側６２に向かう液流または気流を発生させる。換言すれば、濾過膜６１の透過側６３の第２の面ＦＩ２に加わる圧力を供給側の第１の面ＦＩ１に加わる圧力よりも大きくする。すなわち、逆洗工程Ａ４では、濾過膜６１の第１の面ＦＩ１及び第２の面ＦＩ２に加わる圧力の大小関係が、膜分離工程Ａ１とは逆となる。このように、透過側６３から供給側６２に向かう液流または気流を発生させることで、濾過膜６１に付着した気泡、細胞、蛋白質などが濾過膜６１から除去され、濾過膜６１の目詰まりが解消される。
図８は、濾過装置６０を用いた細胞懸濁液の膜分離方法の他の例を示すフローチャートである。第１の膜分離工程Ｂ１において、細胞懸濁液を濾過膜６１の膜面に沿って流入口６４から流出口６５に向けて流すクロスフロー方式による濾過を行う。続いて、第２の膜分離工程Ｂ２において、流出口６５を閉鎖した状態で、第１の膜分離工程Ｂ１による膜分離処理が施された細胞懸濁液を、再度流入口６４から流入させる。これにより、第２の膜分離工程Ｂ２においては、細胞懸濁液の流れ方向が濾過膜６１の膜面に対して直交するデッドエンドフロー方式による濾過となる。
クロスフロー方式による濾過によれば、濾過膜６１の目詰まりを抑制し、また、細胞が受けるダメージを抑制することができるが、細胞懸濁液を高濃度で濃縮することが容易ではない。一方、デッドエンドフロー方式によれば、濾過膜６１の目詰まりを生じやすく、細胞にダメージが及ぶおそれがあるものの、細胞懸濁液の高濃度濃縮が可能となる。そこで、クロスフロー方式による濾過とデッドエンドフロー方式による濾過とを併用することで、濾過膜６１の目詰まり及び細胞へのダメージを最小限に抑えつつ、細胞懸濁液を所望の濃度にまで濃縮することが容易となる。
図９は、本開示の他の例示的実施形態に係る濾過装置６０Ａの構成を示す図である。濾過装置６０Ａにおいて、供給側６２における細胞懸濁液の流路の断面積は、流路の上流側（流入口６４側）から下流側（流出口６５側）に向けて徐々に小さくなっている。
ここで、流入口６４から流入する単位時間当たりの液量をＱ１、流出口６５から流出する単位時間当たりの液量をＱ２、排出流路６７から排出される単位時間当たりの液量をＱ３とすると、Ｑ１、Ｑ２、Ｑ３の間には、下記の（２）式によって示される関係が成立する。
Ｑ２＝Ｑ１−Ｑ３ ・・・（２）
すなわち、流出口６５から流出する液量Ｑ２は、流入口６４から流入する液量Ｑ１よりも少ない。従って、細胞懸濁液の流路の断面積を一定とした場合には、流路の下流側（流出口６５側）の流速が、上流側（流入口６４側）の流速よりも小さくなる。この場合、流速が小さくなる下流側において、濾過膜６１上に細胞凝集体または単一細胞が堆積しやすくなる。これを回避するために、下流側における流速の低下を見越して上流側の流速を大きくしておく対応が考えられる。しかしながら、この場合、細胞が受けるダメージが大きくなるおそれがあり、好ましくない。
本例示的実施形態に係る濾過装置６０Ａによれば、細胞懸濁液の流路の断面積が上流側（流入口６４側）から下流側（流出口６５側）に向けて徐々に小さくなっているので、流路の上流側と下流側とで細胞懸濁液の流速が略一定となる。すなわち、濾過装置６０Ａによれば、細胞が受けるダメージを抑制しつつ流路の下流側における流速低下が抑制され、濾過膜６１上における細胞凝集体または単一細胞の堆積を抑制することができる。
図１０は、本開示の他の例示的実施形態に係る濾過装置６０Ｂの構成を示す図である。濾過装置６０Ｂは、図１に示す濾過装置６０の流入口６４及び流出口６５にそれぞれ対応する第１の流通口６４Ａ及び第２の流通口６５Ａを有する。また濾過装置６０Ｂは、第１の流通口６４Ａに接続された第１の貯留容器９１及び第２の流通口６５Ａに接続された第２の貯留容器９２を有する。第１の貯留容器９１には、第１の貯留容器９１の内部の圧力を調整するための圧力調整機構９５が設けられている。同様に、第２の貯留容器９２には、第２の貯留容器９２の内部の圧力を調整するための圧力調整機構９７が設けられている。第１の流通口６４Ａと第１の貯留容器９１との間を繋ぐ流路上及び第２の流通口６５Ａと第２の貯留容器９２との間を繋ぐ流路上にはそれぞれ開閉バルブ９３及び９４が設けられている。
第１の貯留容器９１及び第２の貯留容器９２は、膜分離処理を行う細胞懸濁液を貯留しておくための容器である。細胞懸濁液が第１の貯留容器９１と第２の貯留容器９２との間を移動することで、細胞懸濁液は、濾過膜６１の膜面に沿って流れ、膜分離処理される。細胞懸濁液は、第１の貯留容器９１と第２の貯留容器９２との間を往復移動することで、所望の濃度にまで濃縮される。所望の濃度にまで濃縮された細胞懸濁液は、第１の貯留容器９１または第２の貯留容器９２に回収される。
細胞懸濁液を第１の貯留容器９１から第２の貯留容器９２へ移動させる場合、第１の貯留容器９１に貯留された細胞懸濁液の液面を圧力調整機構９５によって加圧するとともに開閉バルブ９３及び９４を開状態とする。一方、細胞懸濁液を第２の貯留容器９２から第１の貯留容器９１へ移動させる場合、第２の貯留容器９２に貯留された細胞懸濁液の液面を圧力調整機構９７によって加圧するとともに開閉バルブ９３及び９４を開状態とする。圧力調整機構９５及び９７は、細胞懸濁液の液面を、例えば清浄なエアーで加圧する機構を有する。圧力調整機構９５及び９７は、第１の貯留容器９１と第２の貯留容器９２との間に圧力差を生じさせることで、細胞懸濁液の液流を生じさせる。
本例示的実施形態に係る濾過装置６０Ｂによれば、細胞へのダメージが懸念されるチューブポンプ等の、チューブのしごき動作によって液流を発生させるタイプのポンプの使用が不要となる。すなわち、本例示的実施形態に係る濾過装置６０Ｂによれば、細胞にダメージを与えることなく細胞懸濁液の膜分離処理に必要な液流を発生させることが可能となる。
［細胞培養装置］
図１１は、濾過装置６０を含む本開示の例示的実施形態に係る細胞培養装置１の構成を示す図である。細胞培養装置１は、濾過装置６０の他、細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０及び凍結液供給部１３０を備える。また、細胞培養装置１は、培養容器２０、貯留容器３０、分割処理部４０、廃液回収容器１６及び凍結部１７を備える。
細胞培養装置１は、細胞供給部１００から供給される細胞を、培地供給部１１０から供給される培地（培養液）とともに培養容器２０内に収容し、培養容器２０内において細胞を培地中に例えば浮遊させた状態で培養する。
＜細胞供給部＞
細胞供給部１００は、細胞培養装置１による培養の対象となる多能性幹細胞を凍結させた状態で収容する細胞収容部１０１と、細胞収容部１０１に収容された細胞を、配管ｃ１を含んで構成される流路Ｆ３に送出するポンプＰ１とを有する。また、細胞供給部１００は、細胞収容部１０１と配管ｃ１とを接続する配管の、ポンプＰ１の下流側に設けられた開閉バルブＶ１を有する。細胞収容部１０１に収容された細胞は、ポンプＰ１が駆動され、開閉バルブＶ１が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
＜培地供給部＞
培地供給部１１０は、細胞の培養に使用する培地（培養液）を収容する培地収容部１１１及び１１４と、培地収容部１１１及び１１４にそれぞれ収容された培地を、流路Ｆ３に送出するポンプＰ２及びＰ３と、ポンプＰ２及びＰ３からそれぞれ送出された培地を除菌するためのフィルタ１１３及び１１６とを有する。また、培地供給部１１０は、培地収容部１１１と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１１３の下流側に設けられた開閉バルブＶ２と、培地収容部１１４と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１１６の下流側に設けられた開閉バルブＶ３とを有する。このように、培地供給部１１０は、培地収容部１１１、ポンプＰ２、フィルタ１１３及び開閉バルブＶ２を含む第１の系統と、培地収容部１１４、ポンプＰ３、フィルタ１１６及び開閉バルブＶ３を含む第２の系統と、からなる２系統の培地供給機能を備えており、互いに異なる２種類の培地が供給可能である。なお、培地供給部１１０における系統の数は、細胞の培養プロトコル等に応じて適宜増減することが可能である。すなわち、培地供給部１１０を、３種類以上の培地を供給可能とする構成としてもよいし、１種類の培地を供給可能とする構成としてもよい。培地収容部１１１に収容された培地は、ポンプＰ２が駆動され、開閉バルブＶ２が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。培地収容部１１４に収容された培地は、ポンプＰ３が駆動され、開閉バルブＶ３が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
本例示的実施形態に係る細胞培養装置１による細胞培養において適用し得る培地は、特に制限されず、あらゆる培地を適用することができる。具体的には、哺乳動物細胞用の基本培地（例えば、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、DMEM/F-12（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）、EMEM（Eagle's minimal essential medium）、BME（Basal Medium Eagle）、RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium）、E8 base medium、SkBM（Skeletal Muscle Cell Basal Medium）、MCDB104、MCDB153、199、L15）、市販品の幹細胞維持用培養液、昆虫細胞用の基本培地、酵
母用培地、細菌用培地、等の液体培地である。
本例示的実施形態に係る細胞培養装置１による細胞培養において適用し得る培地は、細胞を継続的に浮遊させる目的、及び／又は、細胞同士の過度の密着を防ぐ目的で、細胞毒性を有しない高分子化合物が添加されていてもよい。上記目的で培地に添加される高分子化合物は、例えば、培地の比重を調整する高分子化合物、培地の粘度を調整する高分子化合物、培地中で三次元ネットワーク構造を形成する高分子化合物である。このような高分子化合物としては、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、ダイユータンガム、デンプン、ペクチン等の多糖類；コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質；ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子；などが挙げられる。
本例示的実施形態に係る細胞培養装置１による細胞培養に適用し得る培地は、一般に添加可能な各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；無機塩；血清、血清代替物；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；増殖因子；分化抑制因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン等の金属イオン；などが添加されていてもよい。
＜希釈液供給部＞
希釈液供給部１２０は、細胞の培養過程において適宜実施される希釈処理に用いられる希釈液を収容する希釈液収容部１２１と、希釈液収容部１２１に収容された希釈液を流路Ｆ３に送出するポンプＰ４と、ポンプＰ４から送出された希釈液を除菌するためのフィルタ１２３とを有する。また、希釈液供給部１２０は、希釈液収容部１２１と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１２３の下流側に設けられた開閉バルブＶ４を有する。希釈液収容部１２１に収容された希釈液は、ポンプＰ４が駆動され、開閉バルブＶ４が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。
本例示的実施形態に係る細胞培養装置１による細胞培養に適用し得る希釈液は、特に制限されず、例えば、哺乳動物細胞用の基本培地（例えば、DMEM、DMEM/F-12、MEM、DME、RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、L15、SkBM、Basal Medium、E8 base medium）を希釈液として使用することが可能である。なお、細胞培養過程において希釈処理が不要である場合には、希釈液供給部１２０を省略することが可能である。
＜凍結液供給部＞
凍結液供給部１３０は、培養された細胞を凍結部１７において凍結保存する場合に用いられる凍結液を収容する凍結液収容部１３１と、凍結液収容部１３１に収容された凍結液を、流路Ｆ３に送出するポンプＰ５と、ポンプＰ５から送出された凍結液を除菌するためのフィルタ１３３とを有する。また、凍結液供給部１３０は、凍結液収容部１３１、ポンプＰ５及びフィルタ１３３を接続する配管の、フィルタ１３３の下流側に設けられた開閉バルブＶ５を含む。凍結液収容部１３１に収容された凍結液は、ポンプＰ５が駆動され、開閉バルブＶ５が開状態となることにより流路Ｆ３に送出される。なお、培養された細胞を凍結保存する必要がない場合には、細胞培養装置１において凍結液供給部１３０を省略することが可能である。
＜培養容器＞
培養容器２０は、細胞供給部１００から供給される細胞を、培地供給部１１０から供給される培地とともに収容し、収容された細胞を培養するための容器である。培養容器２０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器やプラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。培養容器２０は、細胞及び培地を培養容器２０内に流入させるための流入口２１と、培養容器２０に収容された細胞及び培地を培養容器２０の外部に流出させるための流出口２２と、を有する。
培養容器２０は、例えば、温度３０℃〜４０℃（好ましくは３７℃）且つＣＯ２濃度２％〜１０％（好ましくは５％）に制御され且つ密閉されたインキュベータ２４内に収容され得る。インキュベータ２４は、培養容器２０内に培地とともに収容された細胞に酸素（Ｏ２）及び二酸化炭素（ＣＯ２）を供給するためのガス供給機構２５を備える。また、インキュベータ２４は、培養容器２０内の圧力を調整する圧力調整機構２６を備える。圧力調整機構２６は、培養容器２０内にエアーを導入することにより培養容器２０内の雰囲気を加圧し、または、培養容器２０内の雰囲気を外部に排出することにより培養容器２０内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構２６は、培養容器２０内の圧力を、後述する循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、培養容器２０内に収容された細胞及び培地を循環流路Ｆ１内に流出させる。
＜循環流路＞
細胞培養装置１は、培養容器２０の流出口２２と流入口２１とを接続する配管ａ１〜ａ７を含んで構成される循環流路Ｆ１を有する。培養容器２０に収容された細胞及び培地は、培養過程において実施される後述の各処理において、循環流路Ｆ１内を循環する。循環流路Ｆ１内を流れる細胞及び培地は、流入口２１を経由して培養容器２０内へ流入し、培養容器２０の内部に収容された細胞及び培地は、流出口２２を経由して循環流路Ｆ１内に流出する。
培養容器２０の流入口２１に接続された循環流路Ｆ１を構成する配管ａ７には開閉バルブＶ１１が設けられ、培養容器２０の流出口２２に接続された循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１には開閉バルブＶ１２が設けられている。開閉バルブＶ１１は、循環流路Ｆ１から培養容器２０内に細胞及び培地を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。開閉バルブＶ１２は、培養容器２０内から循環流路Ｆ１内に細胞及び培地を流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０及び凍結液供給部１３０に接続された配管ｃ１によって構成される流路Ｆ３は、接続部位Ｘ３において循環流路Ｆ１に接続されている。すなわち、細胞収容部１０１に収容された細胞、培地収容部１１１及び１１４にそれぞれ収容された培地、希釈液収容部１２１に収容された希釈液及び凍結液収容部１３１に収容された凍結液は、流路Ｆ３及び接続部位Ｘ３を経由して循環流路Ｆ１内に供給される。
流路Ｆ３を構成する配管ｃ１には、接続部位Ｘ３の近傍において開閉バルブＶ６が設けられている。開閉バルブＶ６は、細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０及び凍結液供給部１３０からそれぞれ、細胞、培地、希釈液または凍結液を循環流路Ｆ１内に供給する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
＜貯留容器＞
貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内、すなわち、循環流路Ｆ１の途中に設けられている。貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内を流れる細胞、培地、希釈液または凍結液を一時的に貯留するための容器であり、培養期間中に実施される後述する継代処理、培地交換処理、分割処理及び凍結処理において使用される。貯留容器３０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内を流れる細胞、培地、希釈液または凍結液を貯留容器３０内に流入させるための流入口３１と、貯留容器３０に収容された細胞、培地、希釈液または凍結液を循環流路Ｆ１内に流出させるための流出口３２を有する。貯留容器３０の流入口３１は、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１、ａ２及びａ３によって培養容器２０の流出口２２に接続されている。貯留容器３０の流出口３２は、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ４、ａ５、ａ６及びａ７によって培養容器２０の流入口２１に接続されている。また、本例示的実施形態においては、循環流路Ｆ１と流路Ｆ３とが接続される接続部位Ｘ３が貯留容器３０の流入口３１の近傍に配置されているが、循環流路Ｆ１と流路Ｆ３との接続位置は、循環流路Ｆ１内におけるあらゆる位置に配置することが可能である。
循環流路Ｆ１を構成する配管ａ２には、貯留容器３０の流入口３１の近傍において開閉バルブＶ１３が設けられている。開閉バルブＶ１３は、循環流路Ｆ１から貯留容器３０内に細胞及び培地等を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。また、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ５には、貯留容器３０の流出口３２の近傍において開閉バルブＶ１４が設けられている。開閉バルブＶ１４は、貯留容器３０から細胞及び培地等を培養容器２０、分割処理部４０または凍結部１７に移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
貯留容器３０は、貯留容器３０内の圧力を調整する圧力調整機構３３を備える。圧力調整機構３３は、貯留容器３０内にエアーを導入することにより貯留容器３０内の雰囲気を加圧し、または、貯留容器３０内の雰囲気を外部に排出することにより貯留容器３０内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構３３は、貯留容器３０内の圧力を循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、貯留容器３０内に貯留された細胞、培地、希釈液または凍結液を、流出口３２から循環流路Ｆ１内に流出させる。
細胞培養装置１は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間に位置する接続部位Ｘ１と、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流入口３１と培養容器２０の流出口２２との間に位置する接続部位Ｘ２と、を接続する配管ｂ１及びｂ２を含んで構成される流路Ｆ２を有する。循環流路Ｆ１内を流れる細胞及び培地等は、接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入することが可能である。また、流路Ｆ２内を流れる細胞及び培地等は、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流入することが可能である。
＜分割処理部＞
分割処理部４０は、流路Ｆ２内、すなわち、流路Ｆ２の途中に設けられている。分割処理部４０は、培養容器２０内において細胞を培養することによって形成される細胞凝集体を分割する分割処理を行うための処理容器４２を備える。処理容器４２内において行われる分割処理は、機械的分割処理であってもよいし、細胞解離酵素を用いた酵素処理であってもよい。機械的分割処理が適用される場合には、処理容器４２内には、メッシュフィルタが（図示せず）配置され得る。細胞凝集体をメッシュフィルタに通すことで、細胞凝集体はメッシュフィルタのメッシュサイズに応じたサイズに分割される。一方、酵素処理による分割処理が適用される場合には、処理容器４２内には、トリプシン−ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）等の細胞解離酵素が収容され得る。細胞凝集体を一定時間に亘り細胞解離酵素に浸漬することで、細胞凝集体が分割される。
分割処理部４０は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入する細胞凝集体を処理容器４２内で分割する。分割処理が施された細胞は、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出する。
分割処理部４０は、処理容器４２に連通する圧力容器４１と、圧力容器４１及び処理容器４２内の圧力を調整する圧力調整機構４３と、を備える。圧力調整機構４３は、圧力容器４１内にエアーを導入することにより圧力容器４１及び処理容器４２内の雰囲気を加圧し、または、圧力容器４１内の雰囲気を外部に排出することにより圧力容器４１及び処理容器４２内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構４３は、圧力容器４１及び処理容器４２内の圧力を循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、分割処理が施された細胞を循環流路Ｆ１内に流出させる。
流路Ｆ２を構成する配管ｂ１には、接続部位Ｘ１の近傍において開閉バルブＶ２１が設けられている。開閉バルブＶ２１は、貯留容器３０から分割処理部４０に細胞等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。一方、流路Ｆ２を構成する配管ｂ２には、接続部位Ｘ２の近傍に開閉バルブＶ２２が設けられている。開閉バルブＶ２２は、分割処理部４０によって分割処理が施された細胞を循環流路Ｆ１内に流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１には、接続部位Ｘ２の近傍であって接続部位Ｘ２の上流側に開閉バルブＶ１５が設けられている。開閉バルブＶ１５は、培養容器２０から貯留容器３０に細胞及び培地等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
＜攪拌部＞
攪拌部５０、５１及び５２は、それぞれ、流入する流体を攪拌する機能を有する。攪拌部５０、５１及び５２は、駆動部を有しない所謂スタティックミキサとしての構成を有していることが好ましく、例えば、管状体と、管状体の内部に固定設置され、管状体の内部にらせん状の流路を形成する攪拌エレメントと、を含んで構成され得る。なお、スタティックミキサを構成する管状体の内部の流路は、必ずしもらせん状であることを要しない。スタティックミキサは、管状体の内部を通過する流体を攪拌し得るように、管状体の内部に流路を形成する板状部材が管状体の内部に適宜配置された構造や管状体の内径を部分的に変化させた構造を有するものであってもよい。
攪拌部５０は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間に設けられている。より具体的には、攪拌部５０は、循環流路Ｆ１内において、貯留容器３０の流出口３２と接続部位Ｘ１との間に設けられている。なお、攪拌部５０は、循環流路Ｆ１内において、接続部位Ｘ１と培養容器２０の流入口２１との間に設けられていてもよい。攪拌部５１は、流路Ｆ３内における、培地供給部１１０と細胞供給部１００との間に設けられている。攪拌部５２は、流路Ｆ３における、細胞供給部１００からの配管が接続される部位の下流側に設けられている。
＜濾過装置＞
細胞培養装置１は、貯留容器３０の流入口３１と流出口３２とを接続する流路Ｆ６を有する。流路Ｆ６は、接続部位Ｘ５において循環流路Ｆ１に接続された配管ｆ１と、接続部位Ｘ６において循環流路Ｆ１に接続された配管ｆ２と、を含んで構成されている。
濾過装置６０は、流路Ｆ６内、すなわち、流路Ｆ６の途中に設けられている。濾過装置６０の流入口６４は、配管ｆ２を介して貯留容器３０の流出口３２に接続され、濾過装置６０の流出口６５は、配管ｆ１を介して貯留容器３０の流入口３１に接続されている。濾過装置６０の排出流路６７には、廃液回収容器１６が接続されている。配管ｆ２内に配置されたポンプＰ１０、Ｐ１１は、濾過装置６０において膜分離処理を行う場合に駆動される。膜分離処理によって濾過装置６０の透過側に排出されたデブリスを含む液体は、廃液回収容器１６に回収される。
流路Ｆ６を構成する配管ｆ１内には、接続部位Ｘ５の近傍において開閉バルブＶ５１が設けられている。また、流路Ｆ６を構成する配管ｆ２内には、接続部位Ｘ６の近傍において開閉バルブＶ５２が設けられている。開閉バルブＶ５１及びＶ５２は、濾過装置６０において膜分離処理が実施され、膜分離された細胞懸濁液が貯留容器３０内に回収されるまでの間、開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
廃液回収容器１６に回収される廃液には、使用済みの培地、使用済みの希釈液、細胞供給部１００から凍結状態で供給される細胞に随伴する凍結液等が含まれる。廃液回収容器１６の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
＜凍結部＞
細胞培養装置１は、接続部位Ｘ１において、循環流路Ｆ１に接続された配管ｅ１を含んで構成される流路Ｆ５を有する。流路Ｆ５の端部には、凍結部１７が設けられている。凍結部１７は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ５内に流入する細胞を凍結液供給部１３０から供給される凍結液とともに収容する保存容器１７ａを有する。保存容器１７ａは、例えば、バイアル、クライオチューブまたはバッグの形態を有するものであってもよい。凍結部１７は保存容器１７ａに収容された細胞及び凍結液を凍結させるフリーザを含んで構成され得る。また、凍結部１７は、液体窒素を充填したタンクを備えていてもよく、タンク内に保存容器１７ａを収容し得るように構成されていてもよい。また、凍結部１７は、例えば、太陽日酸社製のクライオライブラリー（登録商標）システムを含んで構成されていてもよい。流路Ｆ５を構成する配管ｅ１には、接続部位Ｘ１の近傍において開閉バルブＶ４１が設けられている。開閉バルブＶ４１は、貯留容器３０から凍結部１７に細胞及び凍結液を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。なお、流路Ｆ５と循環流路Ｆ１との接続位置は、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間であれば、いかなる位置であってもよい。また、細胞を凍結保存する必要がない場合には、凍結部１７を省略することが可能である。
＜制御部＞
制御部１８は、ポンプＰ１〜Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１１、開閉バルブＶ１〜Ｖ６、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ４１、Ｖ５１、Ｖ５２、ガス供給機構２５、圧力調整機構２６、３３及び４３の動作を統括的に制御する。これにより、所定の細胞培養プロトコルに沿った細胞の培養が、人手を介在させることなく、自動で実施される。なお、図１１において、制御部１８と、制御部１８によって制御される上記の各構成要素との間の電気的な接続配線は、図面の煩雑さを回避する観点から図示を省略している。
以下に、本例示的実施形態に係る細胞培養装置１において実施され得る処理の一例を示す。細胞培養装置１は、例えば、以下に例示する継代処理、培地交換処理、分割処理及び凍結処理を実施する。なお、以下に説明する継代処理、培地交換処理、分割処理及び凍結処理は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ６、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ４１、Ｖ５１、Ｖ５２、ポンプＰ１〜Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１１、圧力調整機構２６、３３及び４３の動作を制御することにより実現される。
＜継代処理＞
細胞培養装置１は、細胞収容部１０１に収容された細胞を、培地収容部１１１及び１１４に収容された培地とともに培養容器２０内に収容して細胞培養を開始する継代処理を以下のようにして実施する。なお、以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が機械的分割処理である場合を例示する。図１２は、細胞培養装置１が継代処理を実施する場合における、細胞及び培地等の流れを示す図である。なお、図１２において、細胞及び培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップＳ１において、細胞収容部１０１において凍結状態で収容された細胞及び希釈液収容部１２１に収容された希釈液が、流路Ｆ３及び循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。細胞及び希釈液は、流路Ｆ３内において攪拌部５２を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップＳ２において、開閉バルブＶ５１及びＶ５２が開状態とされ、ポンプＰ１０及びＰ１１が駆動される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞、細胞に付随する凍結液及び希釈液を含む細胞懸濁液が濾過装置６０内に流入する。濾過装置６０は、細胞、凍結液及び希釈液を含む細胞懸濁液から凍結液及び希釈液を除去する膜分離処理を行う。凍結液及び希釈液は、廃液回収容器１６内に回収され、膜分離処理が施された細胞は、貯留容器３０内に回収される。
ステップＳ３において、培地収容部１１１及び１１４に収容された培地Ａ及び培地Ｂが、流路Ｆ３及び循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入し、貯留容器３０内に貯留された細胞と合流する。培地Ａ及び培地Ｂは、攪拌部５１及び５２を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップＳ４において、貯留容器３０内に貯留された細胞及び培地が、攪拌部５０を経由して分割処理部４０内に移送される。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において分割処理が施される。これにより、凍結状態の細胞が分割される。ステップＳ５において、分割処理が施された細胞が培地とともに貯留容器３０内に移送される。
ステップＳ６において、貯留容器３０内に貯留された細胞及び培地が、攪拌部５０を経由して培養容器２０内に流入する。細胞及び培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞供給部１００から供給された細胞が、培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０に収容される。
なお、上記の例では、濾過装置６０における膜分離処理を１回のみとしているが、必要に応じて、細胞懸濁液を貯留容器３０と濾過装置６０との間で繰り返し循環させることにより、膜分離処理の実施回数を２回以上としてもよい。
＜培地交換処理＞
細胞培養においては、細胞から分泌される蛋白質等の代謝物や死細胞などによって培地が変質する。そのため、培養期間内における適切な時期に、培養容器２０内における使用済みの培地を、新たな培地に交換する培地交換処理が必要とされる。本例示的実施形態に係る細胞培養装置１は、上記の培地交換処理を、以下のようにして実施する。図１３は、細胞培養装置１が培地交換処理を実施する場合における細胞及び培地等の流れを示す図である。なお、図１３において、細胞及び培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップＳ１１において、培養容器２０から細胞及びデブリスを含む使用済みの培地が貯留容器３０内に移送される。ステップＳ１２において、開閉バルブＶ５１及びＶ５２が開状態とされ、ポンプＰ１０及びＰ１１が駆動される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液が、濾過装置６０内に流入する。濾過装置６０は、細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液から、デブリスを含む使用済みの培地を除去する膜分離処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器１６内に回収され、膜分離処理が施された細胞は、貯留容器３０内に回収される。
ステップＳ１３において、培地収容部１１１及び１１４に収容された新たな培地Ａ及び新たな培地Ｂが、流路Ｆ３及び循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入し、貯留容器３０内に貯留された細胞と合流する。培地Ａ及び培地Ｂは、攪拌部５１及び５２を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップＳ１４において、貯留容器３０に貯留された細胞及び新たな培地が、攪拌部５０を経由して培養容器２０内に流入する。細胞及び新たな培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞は、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０内に収容される。
なお、上記の例では、濾過装置６０における膜分離処理を１回のみとしているが、必要に応じて、細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液を、貯留容器３０と濾過装置６０との間で繰り返し循環させることにより、膜分離処理の実施回数を２回以上としてもよい。
＜分割処理＞
多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じるスフェアと呼ばれる細胞凝集体のサイズが過大となると、細胞凝集体同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、細胞凝集体の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。従って、細胞凝集体のサイズが過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、細胞凝集体を分割する分割処理が必要となる場合がある。本例示的実施形態に係る細胞培養装置１は、上記の分割処理を、以下のようにして実施する。なお、以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が機械的分割処理である場合を例示する。図１４は、細胞培養装置１が分割処理を実施する場合における細胞及び培地等の流れを示す図である。なお、図１４において、細胞及び培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップＳ２１において、培養容器２０から細胞及び使用済みの培地が貯留容器３０内に移送される。ステップＳ２２において、開閉バルブＶ５１及びＶ５２が開状態とされ、ポンプＰ１０及びＰ１１が駆動される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液が、濾過装置６０内に流入する。濾過装置６０は、細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液から使用済みの培地を除去する膜分離処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器１６内に回収され、膜分離処理が施された細胞は、貯留容器３０内に回収される。
ステップＳ２３において、培地収容部１１１及び１１４に収容された新たな培地Ａ及び新たな培地Ｂが、流路Ｆ３及び循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入し、貯留容器３０内に貯留された細胞と合流する。培地Ａ及び培地Ｂは、攪拌部５１及び５２を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップＳ２４において、貯留容器３０内に貯留された細胞及び新たな培地は、分割処理部４０内に移送され、分割処理部４０内において細胞凝集体に対する分割処理が施される。ステップＳ２５において、分割処理が施された細胞が、培地とともに貯留容器３０内に移送される。
ステップＳ２６において、貯留容器３０内に貯留された細胞及び培地が、攪拌部５０を経由して培養容器２０内に流入する。細胞及び培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞は、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０内に収容される。
なお、上記の例では、濾過装置６０における膜分離処理を１回のみとしているが、必要に応じて、細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液を貯留容器３０と濾過装置６０との間で繰り返し循環させることにより、膜分離処理の実施回数を２回以上としてもよい。また、上記の例では、濾過装置６０における膜分離処理及び新たな培地の供給を、分割処理前に実施しているが、濾過装置６０における膜分離処理及び新たな培地の供給を、分割処理後に実施してもよい。
＜凍結処理＞
培養された細胞を回収して保存する場合、細胞を保存容器内に回収して凍結保存することが一般的である。本例示的実施形態に係る細胞培養装置１は、培養された細胞を回収して凍結させる凍結処理を、以下のようにして実施する。図１５は、細胞培養装置１が凍結処理を実施する場合における細胞及び培地等の流れを示す図である。なお、図１５において、細胞及び培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップＳ４１において、培養容器２０から細胞及び使用済みの培地が貯留容器３０内に移送される。ステップＳ４２において、開閉バルブＶ５１及びＶ５２が開状態とされ、ポンプＰ１０及びＰ１１が駆動される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液が、濾過装置６０内に流入する。濾過装置６０は、細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液から使用済みの培地を除去する膜分離処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器１６内に回収され、膜分離処理が施された細胞は、貯留容器３０内に回収される。
ステップＳ４３において、凍結液収容部１３１に収容された凍結液が、流路Ｆ３及び循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入し、貯留容器３０内に貯留された細胞と合流する。凍結液は、攪拌部５１及び５２を通過することで、攪拌される。
ステップＳ４４において、貯留容器３０に貯留された細胞及び凍結液が、攪拌部５０及び流路Ｆ５を経由して凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容される。細胞及び凍結液は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。凍結部１７は、保存容器１７ａ内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。
なお、上記の例では、濾過装置６０における膜分離処理を１回のみとしているが、必要に応じて、細胞及び使用済みの培地を含む細胞懸濁液を貯留容器３０と濾過装置６０との間で繰り返し循環させることにより、膜分離処理の実施回数を２回以上としてもよい。
＜細胞培養処理＞
細胞培養装置１は、制御部１８が以下に例示する細胞培養処理プログラムを実行することにより、細胞培養を、人手を介在させることなく自動で行うことが可能である。図１６は、制御部１８が実行する細胞培養プログラムにおける処理の流れを示すフローチャートである。
ステップＳ１０１において、制御部１８は、上記の継代処理を実行することにより、細胞供給部１００から供給される細胞及び培地供給部１１０から供給される培地を培養容器２０内に収容し、細胞培養を開始する。
ステップＳ１０２において、制御部１８は、細胞培養を開始してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理（１回目）を実施することにより、培養容器２０内の使用済みの培地を、培地収容部１１１及び１１４に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。
ステップＳ１０３において、制御部１８は、１回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理（２回目）を実施することにより、培養容器２０内の使用済みの培地を、培地収容部１１１内及び１１４内に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。
ステップＳ１０４において、制御部１８は、２回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の分割処理を実施することにより、細胞凝集体を分割して細胞培養を継続する。
ステップＳ１０５において、制御部１８は、上記のステップＳ１０２〜Ｓ１０４における処理を１サイクルとする培養サイクルのサイクル数が、所定数に達したか否かを判定する。制御部１８は、培養サイクルのサイクル数が所定数に達していないと判定した場合には、処理をステップＳ１０２に戻す。一方、制御部１８は、培養サイクルのサイクル数が所定のサイクル数に達したと判定した場合には、処理をステップＳ１０６に進める。培養サイクルの進行とともに、細胞の培養スケールは増大する。
ステップＳ１０６において、制御部１８は、上記の凍結処理を実施することによって培養された細胞を凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容して凍結保存する。
なお、上記の例では、培養サイクルの１サイクル内において、培地交換処理を２回実施しているが、培養サイクルの１サイクル内における培地交換処理の実施回数は、適宜変更することが可能である。
本例示的実施形態に係る細胞培養装置１によれば、培地交換処理や分割処理等の細胞培養において必要とされる一連の処理を閉鎖系において連続的に実施することが可能となる。これにより、均質な細胞の大量生産が可能となる。本例示的実施形態に係る細胞培養装置１によれば、継代処理から凍結処理までの細胞培養に必要な一連の処理を人手を介在させることなく行うことが可能である。なお、本例示的実施形態に係る細胞培養装置１を、多能性幹細胞以外の細胞、及び多能性幹細胞由来の細胞以外の細胞の培養に用いることも可能である。
［第２の例示的実施形態］
本開示に係る膜分離方法は、非ヒト細胞において、抗体を発現させるための細胞培養に適用することができる。本開示の係る膜分離方法を用いて、培養容器内で培養されている非ヒト細胞を含む細胞懸濁液からデブリスを除去することにより、抗体の発現効率を高めることができる。
抗体の発現に用いる細胞としては、特に限定されないが、動物細胞（非ヒト細胞）、植物細胞、 酵母などの真核細胞、枯草菌などの原核細胞及び大腸菌などが挙げられる。ＣＨＯ 細胞、ＢＨＫ−２１細胞及びＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞などの動物細胞（非ヒト細胞）が好ましく、ＣＨＯ 細胞がより好ましい。
非ヒト細胞において、発現させる抗体としては、特に限定されないが、例えば、抗IL-6レセプター抗体、抗IL-6抗体、抗グリピカン-3抗体、抗CD3抗体、抗CD20抗体、抗GPIIb/IIIa抗体、抗TNF抗体、抗CD25抗体、抗EGFR抗体、抗Her2/neu抗体、抗RSV抗体、抗CD33抗体、抗CD52抗体、抗IgE抗体、抗CD11a抗体、抗VEGF抗体及び抗VLA4抗体などが挙げられる。抗体としては、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、ウサギ及びサル等の動物由来のモノクローナル抗体だけでなく、キメラ抗体、ヒト化抗体及びbispecific抗体など人為的に改変した抗体も含む。
得られた抗体又はその断片は、均一にまで精製することができる。抗体又はその断片の分離及び精製は通常のポリペプチドで使用されている分離及び精製方法を使用すればよい。例えば、アフィニティークロマトグラフィー等のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動及び等電点電気泳動等を適宜選択、組み合わせれば、抗体を分離及び精製することができるが、これらに限定されるものではない。得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は酵素結合免疫吸着検定法(Enzyme-linked immunosorbent assay；ELISA）等により行うことができる。
図１７は、膜分離処理を適宜実施しながら、非ヒト細胞において抗体を発現させるための細胞培養を行う、本開示の第２の例示的実施形態に係る細胞培養装置２の構成の一例を示す図である。細胞培養装置２は、濾過装置６０Ｃ、細胞培養容器６１０、培地収容部６２０、回収容器６３０を含んで構成されている。
濾過装置６０Ｃの基本構成は、上記した第１の例示的実施形態に係る濾過装置６０（図１参照）と同じである。濾過装置６０Ｃは、抗体を発現し得る単一細胞としての非ヒト細胞と、デブリスと、を濾過膜６００を用いて分離する細胞懸濁液の膜分離処理を行う装置である。
濾過装置６０Ｃは、容器内の空間を供給側６０４と透過側６０５とに隔てる濾過膜６００を備える。濾過膜６００の典型構造は、図２に示される濾過膜６１の構造と同じである。以下、濾過膜６００の構造について言及する場合に図２を適宜参照する。濾過膜６００として、例えば、図３Ａに示すような、繊維状部材を綾畳織りして形成される綾畳織メッシュ６１Ａを好適に用いることができる。また、濾過膜６００として、図４に示すような、２枚の平織メッシュ６１ｂ、６１ｃを積層することにより形成される積層メッシュ６１Ｄを好適に用いることができる。
濾過装置６０Ｃは、供給側６０４に細胞懸濁液を流入および流出させるための流通口６０１及び６０２を有し、透過側６０５に排出されたデブリスを回収容器６３０に排出させるための排出口６０３を有する。流通口６０１には、配管Ｔ２の一端が接続されており、配管Ｔ２の他端は細胞培養容器６１０に接続されている。また、流通口６０２には、配管Ｔ１の一端が接続されており、配線Ｔ１の他端は往復動ポンプＰ１０１に接続されている。排出口６０３には、配管Ｔ３の一端が接続されており、配管Ｔ３の他端は、回収容器６０３に接続されている。配管Ｔ３上には引き抜きポンプＰ１０３が設けられている。細胞培養容器６１０と培地収容部６２０とは配管Ｔ４によって接続されており、配管Ｔ４上には液送ポンプＰ１０２が設けられている。配管Ｔ１〜Ｔ４は、例えば、シリコンチューブ等の管状部材で構成されている。
細胞培養装置２は、圧力センサ７０１〜７０３を備え、各部のゲージ圧がモニタされる。圧力センサ７０１により、配管Ｔ１内の流通口６０２近傍のゲージ圧がモニタされる。圧力センサ７０２により、配管Ｔ２内の流通口６０１近傍のゲージ圧がモニタされる。圧力センサ７０３により、配管Ｔ３内の排出口６０３近傍のゲージ圧がモニタされる。すなわち、圧力センサ７０１および７０２によって濾過膜６００の供給側６０４の膜面に加わるゲージ圧がモニタされ、圧力センサ７０３によって濾過膜６００の透過側６０５の膜面に加わるゲージ圧がモニタされる。
細胞培養容器６１０では、抗体を発現し得る単一細胞としての非ヒト細胞が培養される。濾過装置６０Ｃは、細胞培養容器６１０内で培養された非ヒト細胞およびデブリスを含む細胞懸濁液の膜分離処理を行う。
往復動ポンプＰ１０１、液送ポンプＰ１０２及び引き抜きポンプＰ１０３が稼働することで、細胞培養容器６１０内の細胞懸濁液が流通口６０１から濾過装置６０Ｃの内部に流入する。往復動ポンプＰ１０１の往復動作により、濾過装置６０Ｃの内部に流入した細胞懸濁液は、濾過膜６００の供給側６０４の膜面に沿って往復移動する。細胞懸濁液が、濾過膜６００上を流れる間、細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの小さいデブリスは、培地等の液体とともに濾過膜６００を透過して透過側６０５に排出される。透過側６０５に排出されたデブリスは、配管Ｔ３を経由して回収容器６３０に回収される。一方、細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの大きい単一細胞としての非ヒト細胞は、濾過膜６００を透過せず、細胞培養容器６１０内に回収される。培地収容部６２０からは、回収容器６３０に回収された濾液の量に応じた量の新鮮培地が細胞培養容器６１０に供給される。
単一細胞としての非ヒト細胞とデブリスとを分離する膜分離処理において、濾過膜６００を用いることで、濾過装置６０Ｃの供給側６０４を濾過膜６００の膜面に沿って流れる非ヒト細胞は、供給側の開口ＯＰ１（図２参照）から濾過膜６００の内部に侵入し得る。しかしながら、濾過膜６００の透過側の開口ＯＰ２（図２参照）は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、濾過膜６００の内部に侵入した非ヒト細胞は、デブリスと比較して透過側に容易に流出することができない。一方、デブリスは、非ヒト細胞のサイズよりも小さいので、濾過膜６００の透過側に容易に流出することができる。また、デブリスは濾過膜６００の開口ＯＰ１に侵入した非ヒト細胞の脇を抜けて透過側に流出することもできる。本例示的実施形態に係る濾過膜６００によれば、透過側の開口ＯＰ２は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、濾過膜６００の内部に侵入した非ヒト細胞の透過側への流出が抑制され、非ヒト細胞と、デブリスとを適切に分離することができる。また、本例示的実施形態に係る濾過膜６００によれば、非ヒト細胞は、濾過膜６００の厚さ方向における深部にまで侵入することが困難となるため、濾過膜６００の閉塞（目詰まり）を抑制することができ、また、膜分離処理において非ヒト細胞が受けるダメージを小さくすることができる。
濾過膜６００を用いて、非ヒト細胞とデブリスとを分離する場合、濾過膜６００の開口ＯＰ１及びＯＰ２（図２参照）の径は、非ヒト細胞の径の０．１倍以上２倍以下であることが好ましく、より好ましくは０．１５倍以上１倍以下、更に好ましくは０．２倍以上０．８倍以下である。開口ＯＰ１及びＯＰ２の径を非ヒト細胞の径の０．１倍以上とすることで、細胞懸濁液中に含まれる非ヒト細胞及びデブリスのうち、デブリスを適切に透過側に排出することができる。開口ＯＰ１及びＯＰ２の径を非ヒト細胞の径の２倍以下とすることで、濾過膜６００表面に非ヒト細胞が捕捉されることを抑制するとともに、非ヒト細胞の透過側への流出を抑制することができる。
濾過膜６００を用いて、非ヒト細胞とデブリスとを分離する場合には、濾過膜６００の開口ＯＰ１及びＯＰ２（図２参照）の径の均一性が確保されていることが好ましい。すなわち、濾過膜６００の開口ＯＰ１及びＯＰ２の径の分布における平均値をＸ、標準偏差をσとしたとき、σ／Ｘで表される変動率は、０＜σ／Ｘ≦０．１を満たすことが好ましく、より好ましくは０＜σ／Ｘ≦０．０５、更に好ましくは０＜σ／Ｘ≦０．０２である。０＜σ／Ｘ≦０．１を満たすことにより、非ヒト細胞の透過側への排出を抑制しつつデブリスを透過側に排出させることが可能となる。なお、σおよびＸは、水銀圧入法により測定し、既知の統計解析手法により求めることができる。
濾過装置６００を用いて細胞懸濁液の膜分離処理を行っている間、濾過膜６００の供給側６０４の面に加わる圧力と、濾過膜６００の透過側６０５の面に加わる圧力との差分である膜面差圧を、０．０１キロパスカル以上６０キロパスカル以下とすることが好ましい。濾過膜６００の膜面差圧を０．０１キロパスカル以上とすることで、デブリスを供給側から透過側に適切に排出することが可能となる。また、濾過膜６００の膜面差圧を６０キロパスカル以下とすることで、非ヒト細胞の濾過膜による分割（破砕）を抑制しつつ膜分離処理を行うことができる。
濾過膜６００を用いて、非ヒト細胞とデブリスとを分離する場合には、濾過膜６００の膜厚は、１５０μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ以下であり、更に好ましくは８０μｍ以下である。濾過膜６００の膜厚を１５０μｍ以下とすることで、細胞が濾過膜６００によって補足されることによって、目詰まりが生じるリスク及び細胞がダメージを受けるリスクを軽減することができる。
濾過膜６００を用いて、非ヒト細胞とデブリスとを分離する場合には、濾過膜６００の供給側６０４に加わるゲージ圧が−７０キロパスカル以上７０キロパスカル以下であることが好ましく、より好ましくは−４０キロパスカル以上４０キロパスカル以下であり、更に好ましくは−２０キロパスカル以上２０キロパスカル以下である。濾過膜６００の供給側６０４に加わるゲージ圧を−７０キロパスカル以上７０キロパスカル以下とすることで、非ヒト細胞がダメージを受けるリスクを軽減することができる。
濾過膜６００を用いて、非ヒト細胞とデブリスとを分離する場合には、単一細胞としての非ヒト細胞の径は、５μｍ以上２５μｍ以下が好ましく、より好ましくは７μｍ以上２２μｍ以下であり、更に好ましくは８μｍ以上２０μｍ以下である。非ヒト細胞の径を、５μｍ以上２５μｍ以下とすることで、非ヒト細胞とデブリスとの膜分離が容易となる。
濾過膜６００を用いて、非ヒト細胞とデブリスとを分離する場合には、濾過膜６００を透過した濾液に含まれる、非ヒト細胞の個数密度［個／ｍｌ］が、濾過膜６００を透過する前の細胞懸濁液に含まれる、非ヒト細胞の個数密度［個／ｍｌ］の５０％以下であることが好ましく、より好ましくは２０％以下であり、更に好ましくは５％以下である。
濾過膜６００を用いて、非ヒト細胞とデブリスとを分離する場合には、濾過膜６００を透過した濾液に含まれる、非ヒト細胞の径の１／１０以上１／２以下の径のデブリスの個数密度［個／ｍｌ］が、濾過膜６００を透過する前の細胞懸濁液に含まれる、非ヒト細胞の径の１／１０以上１／２以下の径のデブリスの個数密度［個／ｍｌ］の５０％以上１００％以下であることが好ましく、より好ましくは７０％以上１００％以下であり、更に好ましくは８０％以上１００％以下である。
また、図１７に示す細胞培養装置２において、細胞培養容器６１０内の細胞懸濁液の液量をＬとし、膜分離処理において濾過膜６００を透過した濾液の１日あたりの液量をＮとしたとき、０．１≦Ｎ／Ｌ≦６を満たすことが好ましく、より好ましくは０．１５≦Ｎ／Ｌ≦５であり、更に好ましくは０．２≦Ｎ／Ｌ≦４．５である。０．１≦Ｎ／Ｌ≦６を満たすことで、細胞培養容器６１０に収容された細胞懸濁液からデブリスを効率よく抜き出すことができ、細胞がダメージを受けるリスクを軽減することができる。
［第３の例示的実施形態］
本開示に係る膜分離方法は、巨核球細胞において、血小板を産生させるための細胞培養に適用することができる。本開示に係る膜分離方法を用いて、培養容器内で培養されている巨核球細胞及び血小板を含む細胞懸濁液から血小板を分離することにより、血小板を分離回収することができる。血小板分離後の培養容器内で血小板産生能を有する巨核球細胞を培養することによって、培養後に得られる総血小板容量を高めることができる。
巨核球および血小板は、成体組織から採取した巨核球および血小板でもよいし、多能性幹細胞、造血前駆細胞または間葉系細胞等の分化能を有する細胞から分化させた巨核球および血小板でもよいし、通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで作製された巨核球および血小板でもよいし、上記を組み合わせたものでもよい。
巨核球および血小板が由来する生物種は特に限定されないが、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、羊、ブタ、サルなど）であり、より好ましくはヒトである。
多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、核移植胚性幹細胞（ｎｔＥＳ細胞）、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられるが、これらに限定されない。
造血前駆細胞としては、骨髄由来、臍帯血由来、動員（Ｇ−ＣＳＦ）末梢血、ＥＳ細胞由来中肺葉系細胞または末梢血由来細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。これらの造血前駆細胞としては、例えば、ＣＤ３４陽性のもの（例えばＣＤ３４＋細胞、ＣＤ１３３＋細胞、ＳＰ細胞、ＣＤ３４＋ＣＤ３８−細胞、ｃ−ｋｉｔ＋細胞あるいはＣＤ３−、ＣＤ４−、ＣＤ８−およびＣＤ３４＋細胞のもの）が挙げられる（国際公開ＷＯ２００４／１１０１３９）。
間葉系細胞としては、例えば、間葉系幹細胞および脂肪前駆細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞としては、例えば、繊維芽細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。
多能性幹細胞、造血前駆細胞または間葉系細胞等の分化能を有する細胞を分化させることによって巨核球および血小板を産生する方法は、当業者に一般的に知られた方法に従って行えばよく、特に限定されない。分化能を有する細胞を、巨核球に分化させるのに適した分化誘導培地を用いて適切な培養条件下において培養することにより、分化能を有する細胞を巨核球へと分化させることができ、巨核球からさらに血小板が産生されるようになる。通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞にダイレクトリプログラミング技術を用いることで巨核球および血小板を産生する方法としては、巨核球への誘導遺伝子を発現するように遺伝子導入するか、または、特定の核酸、タンパク質もしくは低分子化合物等を培養液中に添加することで、通常の方法では巨核球への分化能を有さない細胞を巨核球に分化することで巨核球へと分化させることができる。
図１７は、膜分離処理を適宜実施しながら、巨核球細胞において血小板を産生させるための細胞培養を行う、本開示の第３の例示的実施形態に係る細胞培養装置２の構成の一例を示す図である。細胞培養装置２は、濾過装置６０Ｃ、細胞培養容器６１０、培地収容部６２０、回収容器６３０を含んで構成されている。
濾過装置６０Ｃの基本構成は、上記した第１の例示的実施形態に係る濾過装置６０（図１参照）と同じである。濾過装置６０Ｃは、血小板を産生し得る単一細胞としての巨核球細胞と、血小板と、を濾過膜６００を用いて分離する細胞懸濁液の膜分離処理を行う装置である。
濾過装置６０Ｃは、容器内の空間を供給側６０４と透過側６０５とに隔てる濾過膜６００を備える。濾過膜６００の典型構造は、図２に示される濾過膜６１の構造と同じである。以下、濾過膜６００の構造について言及する場合に図２を適宜参照する。濾過膜６００として、例えば、図３Ａに示すような、繊維状部材を綾畳織りして形成される綾畳織メッシュ６１Ａを好適に用いることができる。また、濾過膜６００として、図４に示すような、２枚の平織メッシュ６１ｂ、６１ｃを積層することにより形成される積層メッシュ６１Ｄを好適に用いることができる。
濾過装置６０Ｃは、供給側６０４に細胞懸濁液を流入および流出させるための流通口６０１及び６０２を有し、透過側６０５に排出された血小板を回収容器６３０に排出させるための排出口６０３を有する。流通口６０１には、配管Ｔ２の一端が接続されており、配管Ｔ２の他端は細胞培養容器６１０に接続されている。また、流通口６０２には、配管Ｔ１の一端が接続されており、配線Ｔ１の他端は往復動ポンプＰ１０１に接続されている。排出口６０３には、配管Ｔ３の一端が接続されており、配管Ｔ３の他端は、回収容器６０３に接続されている。配管Ｔ３上には引き抜きポンプＰ１０３が設けられている。細胞培養容器６１０と培地収容部６２０とは配管Ｔ４によって接続されており、配管Ｔ４上には液送ポンプＰ１０２が設けられている。配管Ｔ１〜Ｔ４は、例えば、シリコンチューブ等の管状部材で構成されている。
細胞培養装置２は、圧力センサ７０１〜７０３を備え、各部のゲージ圧がモニタされる。圧力センサ７０１により、配管Ｔ１内の流通口６０２近傍のゲージ圧がモニタされる。圧力センサ７０２により、配管Ｔ２内の流通口６０１近傍のゲージ圧がモニタされる。圧力センサ７０３により、配管Ｔ３内の排出口６０３近傍のゲージ圧がモニタされる。すなわち、圧力センサ７０１および７０２によって濾過膜６００の供給側６０４の膜面に加わるゲージ圧がモニタされ、圧力センサ７０３によって濾過膜６００の透過側６０５の膜面に加わるゲージ圧がモニタされる。
細胞培養容器６１０では、血小板を産生し得る単一細胞としての巨核球細胞が培養される。濾過装置６０Ｃは、細胞培養容器６１０内で培養された巨核球細胞および血小板を含む細胞懸濁液の膜分離処理を行う。
往復動ポンプＰ１０１、液送ポンプＰ１０２及び引き抜きポンプＰ１０３が稼働することで、細胞培養容器６１０内の細胞懸濁液が流通口６０１から濾過装置６０Ｃの内部に流入する。往復動ポンプＰ１０１の往復動作により、濾過装置６０Ｃの内部に流入した細胞懸濁液は、濾過膜６００の供給側６０４の膜面に沿って往復移動する。細胞懸濁液が、濾過膜６００上を流れる間、細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの小さい血小板は、培地等の液体とともに濾過膜６００を透過して透過側６０５に排出される。透過側６０５に排出された血小板は、配管Ｔ３を経由して回収容器６３０に回収される。一方、細胞懸濁液に含まれる比較的サイズの大きい単一細胞としての巨核球細胞は、濾過膜６００を透過せず、細胞培養容器６１０内に回収される。培地収容部６２０からは、回収容器６３０に回収された濾液の量に応じた量の新鮮培地が細胞培養容器６１０に供給される。
単一細胞としての巨核球細胞と血小板とを分離する膜分離処理において、濾過膜６００を用いることで、濾過装置６０Ｃの供給側６０４を濾過膜６００の膜面に沿って流れる巨核球細胞は、供給側の開口ＯＰ１（図２参照）から濾過膜６００の内部に侵入し得る。しかしながら、濾過膜６００の透過側の開口ＯＰ２（図２参照）は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、濾過膜６００の内部に侵入した巨核球は、血小板と比較して透過側に容易に流出することができない。一方、血小板は、巨核球細胞のサイズよりも小さいので、濾過膜６００の透過側に容易に流出することができる。また、血小板は濾過膜６００の開口ＯＰ１に侵入した巨核球細胞の脇を抜けて透過側に流出することもできる。本例示的実施形態に係る濾過膜６００によれば、透過側の開口ＯＰ２は、供給側の開口ＯＰ１からずれた位置に配置されているので、或いは開口ＯＰ１と開口ＯＰ２とを接続する経路が非直線状であるので、濾過膜６００の内部に侵入した巨核球細胞の透過側への流出が抑制され、巨核球細胞と、血小板とを適切に分離することができる。また、本例示的実施形態に係る濾過膜６００によれば、巨核球細胞は、濾過膜６００の厚さ方向における深部にまで侵入することが困難となるため、濾過膜６００の閉塞（目詰まり）を抑制することができ、また、膜分離処理において巨核球細胞が受けるダメージを小さくすることができる。
濾過膜６００を用いて、巨核球細胞と血小板とを分離する場合、濾過膜６００の開口ＯＰ１及びＯＰ２（図２参照）の径は、巨核球細胞の径の０．０５倍以上２倍以下であることが好ましく、より好ましくは０．１倍以上１倍以下、更に好ましくは０．１倍以上０．８倍以下である。開口ＯＰ１及びＯＰ２の径を巨核球細胞の径の０．０５倍以上とすることで、細胞懸濁液中に含まれる巨核球細胞及び血小板のうち、血小板を適切に透過側に排出することができる。開口ＯＰ１及びＯＰ２の径を巨核球細胞の径の２倍以下とすることで、濾過膜６００表面に巨核球細胞が捕捉されることを抑制するとともに、巨核球細胞の透過側への流出を抑制することができる。
濾過膜６００を用いて、巨核球細胞と血小板とを分離する場合には、濾過膜６００の開口ＯＰ１及びＯＰ２（図２参照）の径の均一性が確保されていることが好ましい。すなわち、濾過膜６００の開口ＯＰ１及びＯＰ２の径の分布における平均値をＸ、標準偏差をσとしたとき、σ／Ｘで表される変動率は、０＜σ／Ｘ≦０．１を満たすことが好ましく、より好ましくは０＜σ／Ｘ≦０．０５、更に好ましくは０＜σ／Ｘ≦０．０２である。０＜σ／Ｘ≦０．１を満たすことにより、巨核球細胞の透過側への排出を抑制しつつ血小板を透過側に排出させることが可能となる。なお、σおよびＸは、水銀圧入法により測定し、既知の統計解析手法により求めることができる。
濾過装置６００を用いて細胞懸濁液の膜分離処理を行っている間、濾過膜６００の供給側６０４の面に加わる圧力と、濾過膜６００の透過側６０５の面に加わる圧力との差分である膜面差圧を、０．０１キロパスカル以上６０キロパスカル以下とすることが好ましい。濾過膜６００の膜面差圧を０．０１キロパスカル以上とすることで、血小板を供給側から透過側に適切に排出することが可能となる。また、濾過膜６００の膜面差圧を６０キロパスカル以下とすることで、巨核球細胞の濾過膜による分割（破砕）を抑制しつつ膜分離処理を行うことができる。
濾過膜６００を用いて、巨核球細胞と血小板とを分離する場合には、濾過膜６００の膜厚は、１５０μｍ以下であることが好ましく、より好ましくは１００μｍ以下であり、更に好ましくは８０μｍ以下である。濾過膜６００の膜厚を１５０μｍ以下とすることで、細胞が濾過膜６００によって補足されることによって、目詰まりが生じるリスク及び細胞がダメージを受けるリスクを軽減することができる。
濾過膜６００を用いて、巨核球細胞と血小板とを分離する場合には、濾過膜６００の供給側６０４に加わるゲージ圧が−７０キロパスカル以上７０キロパスカル以下であることが好ましく、より好ましくは−４０キロパスカル以上４０キロパスカル以下であり、更に好ましくは−２０キロパスカル以上２０キロパスカル以下である。濾過膜６００の供給側６０４に加わるゲージ圧を−７０キロパスカル以上７０キロパスカル以下とすることで、巨核球細胞がダメージを受けるリスクを軽減することができる。
濾過膜６００を用いて、巨核球細胞と血小板とを分離する場合には、単一細胞としての巨核球細胞の径は、５μｍ以上４０μｍ以下が好ましく、より好ましくは７μｍ以上３０μｍ以下である。血小板の径は、１μｍ以上５μｍ以下が好ましく、より好ましくは２μｍ以上４μｍ以下である。
濾過膜６００を用いて、巨核球細胞と血小板とを分離する場合には、濾過膜６００を透過した濾液に含まれる、巨核球細胞の個数密度［個／ｍｌ］が、濾過膜６００を透過する前の細胞懸濁液に含まれる、巨核球細胞の個数密度［個／ｍｌ］の１０％以下であることが好ましく、より好ましくは５％以下であり、更に好ましくは１％以下である。
濾過膜６００を用いて、巨核球細胞と血小板とを分離する場合には、濾過膜６００を透過した濾液に含まれる、血小板の個数密度［個／ｍｌ］が、濾過膜６００を透過する前の細胞懸濁液に含まれる、血小板の個数密度［個／ｍｌ］の５０％以上１００％以下であることが好ましく、より好ましくは８０％以上１００％以下であり、更に好ましくは９０％以上１００％以下である。
また、図１７に示す細胞培養装置２において、細胞培養容器６１０内の細胞懸濁液の液量をＬとし、膜分離処理において濾過膜６００を透過した濾液の１日あたりの液量をＮとしたとき、０．１≦Ｎ／Ｌ≦６を満たすことが好ましく、より好ましくは０．１５≦Ｎ／Ｌ≦５であり、更に好ましくは０．２≦Ｎ／Ｌ≦４．５である。０．１≦Ｎ／Ｌ≦６を満たすことで、細胞培養容器６１０に収容された細胞懸濁液から血小板を効率よく抜き出すことができ、細胞がダメージを受けるリスクを軽減することができる。
以下に実施例と比較例を挙げて本開示についてさらに具体的に説明する。以下の各実施例に示す材料、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本開示の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本開示の範囲は以下に示す具体例により限定的に解釈されない。
実施例１は、細胞凝集体、単一細胞及びデブリスを含む細胞懸濁液に膜分離処理を施すことにより、細胞凝集体と、単一細胞及びデブリスとを分離する場合に関する。
下記において、物質濃度に関し「Ｍ」はモル濃度を表し、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌである。
下記において、「ＰＢＳ」とは、リン酸緩衝液（phosphate buffered saline）を意味し、「ＩＭＤＭ」とは、イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium）を意味する。
下記において、「スフェア」とは、球状の細胞凝集体を意味する。
＜材料＞
［ヒト人工多能性幹細胞株（ｈｉＰＳ細胞株）］
・２５３Ｇ１。株式会社ｉＰＳポータル（日本国京都府京都市上京区河原町通今出川下る梶井町４４８番地５）より分譲。
［基本培地及び培地添加剤］
・ＴｅＳＲ−Ｅ８、STEMCELL Technologies社の型番ST-05940。
・３％メチルセルロース液（ＩＭＤＭ中。メチルセルロース濃度はｗ／ｖ％）、R&D Systems社の型番HSC001。
・１０ｍＭ Ｙ−２７６３２液。Ｙ−２７６３２（ＲＯＣＫ阻害剤、Sigma-Aldrichの型番Y0503）をダルベッコＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇ不含）に溶解させた溶液。
［培地］
・培地１：ＴｅＳＲ−Ｅ８ ４５０ｍＬに３％メチルセルロース液５０ｍＬを加えてよく攪拌し、１０ｍＭ Ｙ−２７６３２液を、Ｙ−２７６３２の終濃度が１０μＭとなる量加え調製した。
・培地２：ＴｅＳＲ−Ｅ８ ４５０ｍＬに３％メチルセルロース液５０ｍＬを加えてよく攪拌し調製した。
［培養ディッシュ及び遠心チューブ］
・Ultra-Low Attachment Plate、Corning社の型番Costar3471。６ウェル、蓋付き。
・１５ｍＬ遠心チューブ、Thermo Scientific社の型番339650。
＜平面からの剥離及びスフェアの作製＞
７０％コンフルエントの状態に平面培養されたｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１を、ダルベッコＰＢＳ（Ｃａ，Ｍｇ不含）にてリンスした後、０．５ＭのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）溶液にて平面から剥離した。次いで、培地１で置換し、Ultra-Low Attachment Plateに細胞を培地ごと移し、３７℃、ＣＯ２ガス濃度５％のインキュベータ内に静置した。
培養開始から１日後ないし２日後に培地２を用いて培地交換を行い、直径５０〜３００μｍのスフェアを含む細胞懸濁液を３００ｍＬ作製した。Ultra-Low Attachment Plateをインキュベータから取り出し、平面上で縦及び横に動かしてスフェアをウェル内で均一に分散した。その後、３００ｍＬのスフェアを含む細胞懸濁液を１ｍＬのチューブに移し、これに７００μｌのＴｅＳＲ−Ｅ８を加えて４０００ｒｐｍ、３分の遠心分離処理を行い、上清を取り除いた。その後、細胞懸濁液に３００μＬのTrypLE Select（GIBCO社製 型番12563）を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、３７℃の雰囲気中に３分間静置した後、再度ボルテックスミキサーで攪拌した。図１７Ａは、以上の処理によって得られた細胞懸濁液の顕微鏡写真である。以上の処理によって得られた細胞懸濁液をヌクレオカウンター（chemometec社製 型番NC200）にて細胞数を測定したところ1.5×106個/mLであっ
た。また、細胞のViabilityは、９２．２％であった。
＜膜分離処理＞
以上の処理によって得られた細胞懸濁液を表１に示す各条件にて膜分離処理を行った。膜分離処理は、密閉空間を形成する滅菌された濾過モジュールを用いて行った。濾過モジュール内には、濾過膜が配置されている。濾過モジュールの流入口から流出口に向けて濾過膜の膜面に沿って細胞懸濁液を流すタンジェンシャルフロー方式による膜分離処理を行った。
チューブコネクタの一端に濾過モジュールの透過側（濾過側）を接続し、チューブコネクタの他端にルアーロックタイプのチューブコネクタを介してシリンジ（テルモ社製 型番SS50-LZ）を接続した。シリンジポンプ（Harvard社製 型番PHD-2000）を用いてシリンジの吸引速度を制御することで濾過流速を変化させ、濾過膜の膜面差圧を変化させた。濾過膜は表１に示すメッシュ、開口径を持つものを使用した。濾過膜の開口径は標準粒子による濾過試験を行い、阻止率９５％となる粒子径（すなわち、粒子透過試験による９５％分離粒子径）として求めた。
＜各実施例の相違点＞
各実施例において、濾過膜及び膜間差圧を表１のように相違させた。実施例１−１〜１−９及び参考例１−１〜１−２では綾畳織メッシュで構成された濾過膜を用いた。実施例１−１０では、２枚の平織メッシュを、網目位置を互いにずらして積層して構成された濾過膜を用いた。比較例１−１、１−２では、１枚の平織メッシュで構成された濾過膜を用いた。実施例１−１〜１〜１０、比較例１−１〜１−２、参考例１−１〜１−２において濾過膜として使用したメッシュの素材はステンレス鋼材ＳＵＳ３１６である。
＜膜間差圧の測定＞
濾過モジュールの流入口の圧力Ｍ１、流出口の圧力Ｍ２、透過側（濾液側）の圧力Ｍ３を圧力センサ（スペクトラム社製 型番ACPM49903N）で測定し、（１）式を用いて濾過膜の膜面差圧ΔＭを算出した。
＜細胞径の測定＞
膜分離処理前の細胞懸濁液を採取し、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＶｉ−ＣＥＬＬにより細胞の平均径を求めた。
＜膜分離処理の判定＞
膜分離処理によって得られた濃縮液、透過側に排出された濾液及び膜分離処理後の濾過膜の表面を位相差顕微鏡（オリンパス社製 型番IX73）により、倍率１０倍で観察した。なお濾過面積は５０ｃｍ２であった。
各条件によって膜分離処理を行った場合の総合判定の結果を表１に示す。総合判定Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤの判定基準を以下の通りとした。なお、表１において、ＭＥＳＨとは、濾過膜を構成するメッシュの横糸の２４．５ｍｍ（１インチ）間の網目数を意味する。表１において、最大膜間差圧とは、膜分離処理中における濾過膜の膜間差圧の最大値を意味する。
Ａ：膜分離処理後のスフェアの形状は保たれ、濾過膜上に変形細胞は見られない。透過側（濾液側）にはデブリスが存在し、分割されたスフェアは存在しない。
Ｂ：膜分離処理後のスフェアの形状は保たれるが、濾過膜上に変形したスフェアが存在する。透過側（濾液側）にはデブリスが存在し、分割されたスフェアは存在しない。
Ｃ：膜分離処理後のスフェアの形状は保たれるが、濾過膜上に変形したスフェアが存在する。透過側（濾液側）に分割されたスフェアが若干存在する。
Ｄ：膜分離処理後のスフェアの形状が崩れており、透過側（濾液側）に多くの分割されたスフェアが存在する。

表１に示すように、濾過膜として綾畳織メッシュを使用した場合（実施例１−１〜実施例１−８）および２枚の平織メッシュを網目位置をずらして積層したものを使用した場合（実施例１−１０）に、良好な総合判定結果を得ることができた。また、濾過膜として綾畳織メッシュを使用することで、総合判定ＡまたはＢを取得できる濾過膜の網目サイズ及び膜間差圧の範囲が広範に亘ることが確認できた。
図１８Ａは、膜分離処理前の細胞懸濁液の顕微鏡写真である。図１８Ｂは、表１における実施例１−１の条件で膜分離処理を行った後の細胞懸濁液の顕微鏡写真である。細胞懸濁液が濃縮され、デブリスが除去されている。図１８Ｃは、表１における実施例１−１の条件で膜分離処理を行った後の透過側に排出された濾液の顕微鏡写真である。濾液にはデブリスが存在するが、分割されたスフェアは存在していない。図１８Ｄは、表１における比較例１−１の条件で膜分離処理を行った後の透過側に排出された濾液の顕微鏡写真である。濾液には分割されたスフェアが多数存在している。
実施例２は、単一細胞及びデブリスを含む細胞懸濁液に膜分離処理を施すことにより、単一細胞と、デブリスとを分離する場合に関する。
＜単一細胞の作成＞
上記の実施例１に記載の手順に従い、ｈｉＰＳ細胞株２５３Ｇ１から作製した３００μｍ程度のスフェアを含む細胞懸濁液を５０ｇ、２分にて遠心分離し、上澄みを取り除いた後、TrypLE Select（GIBCO社製 型番12563）を添加し、ボルテックスミキサーで攪拌し、３７℃の雰囲気中に３分間静置した後、再度ボルテックスミキサーで攪拌し、単一細胞を含む細胞懸濁液を作製した。細胞数は、TrypLE SelectおよびＴｅＳＲ−Ｅ８培養培地量を変化させることで調整した。
＜膜分離処理＞
以上の処理によって得られた細胞懸濁液を表２に示す各条件にて膜分離処理を行った。膜分離処理は、密閉空間を形成する滅菌された濾過モジュールを用いて行った。濾過モジュール内には、濾過膜が配置されている。濾過モジュールの流入口から流出口に向けて濾過膜の膜面に沿って細胞懸濁液を流すタンジェンシャルフロー方式による膜分離処理を行った。
チューブコネクタの一端に濾過モジュールの透過側（濾過側）を接続し、チューブコネクタの他端にルアーロックタイプのチューブコネクタを介してシリンジ（テルモ社製 型番SS50-LZ）を接続した。シリンジポンプ（Harvard社製 型番PHD-2000）を用いてシリンジの吸引速度を制御することで濾過流速を変化させ、濾過膜の膜面差圧を変化させた。
濾過膜は表２に示すメッシュ、開口径、開口径分布（変動係数σ／Ｘ）を持つものを使用した。濾過膜の開口径は標準粒子による濾過試験を行い、阻止率９５％となる粒子径（すなわち、粒子透過試験による９５％分離粒子径）として求めた。濾過膜の開口径分布（変動係数σ／Ｘ）は、水銀圧入法により測定し、既知の統計解析手法により平均値Ｘ、標準偏差σを求めた。
＜各実施例の相違点＞
各実施例において、濾過膜及び膜間差圧を表１のように相違させた。実施例２−１〜２−２および参考例２−１〜２−２では綾畳織メッシュで構成された濾過膜を用いた。実施例２−３では、２枚の平織メッシュを、網目位置を互いにずらして積層して構成された濾過膜を用いた。比較例２−１、２−２では、１枚の平織メッシュで構成された濾過膜を用いた。実施例２−１〜２〜３、比較例２−１〜２−２、参考例２−１〜２−２において濾過膜として使用したメッシュの素材はステンレス鋼材ＳＵＳ３１６である。
＜膜間差圧の測定＞
濾過モジュールの流入口の圧力Ｍ１、流出口の圧力Ｍ２、透過側（濾液側）の圧力Ｍ３を圧力センサ（スペクトラム社製 型番ACPM49903N）で測定し、（１）式を用いて濾過膜の膜面差圧ΔＭを算出した。
＜細胞径の測定＞
膜分離処理前の細胞懸濁液を採取し、ＢＥＣＫＭＡＮ ＣＯＵＬＴＥＲ社のＶｉ−ＣＥＬＬにより細胞の平均径を求めた。
＜膜分離処理の判定＞
膜分離処理によって得られた濃縮液、透過側に排出された濾液及び膜分離処理後の濾過膜の表面を位相差顕微鏡（オリンパス社製 型番IX73）により、倍率１０倍で観察した。なお濾過面積は５０ｃｍ２であった。
各条件によって膜分離処理を行った場合の総合判定の結果を表２に示す。総合判定Ａ、Ｂ及びＣの判定基準を以下の通りとした。
Ａ：膜分離処理後の単一細胞の形状は保たれ、透過側（濾液側）にはデブリスが存在し、透過側（濾液側）に排出された単一細胞は存在しない。
Ｂ：膜分離処理後の単一細胞の形状は保たれ、透過側（濾液側）にはデブリスおよびわずかに単一細胞が見られる。
Ｃ：透過側（濾液側）にはデブリスおよび多数の単一細胞が見られる。

表２に示すように、濾過膜として綾畳織メッシュを使用した場合（実施例２−１、実施例２−２）および２枚の平織メッシュを網目位置をずらして積層したものを使用した場合（実施例２−３）に、良好な総合判定結果を得ることができた。
実施例３は、単一細胞としての非ヒト細胞及びデブリスを含む細胞懸濁液に膜分離処理を施すことにより、非ヒト細胞と、デブリスとを分離する場合に関する。
＜材料＞
細胞：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を使用した。
培地：無血清培地（Life technologies社 CD Opti CHO AGT Medium）を培地として使用した。
＜細胞のバッチ培養＞
１Ｌの培地が入った培養容器に細胞を播種し、細胞濃度が５×１０５個/ｍｌになるように調整した。次いで、培養容器内で、３７℃、スターラー撹拌速度１００ｒｐｍ、ＡＩＲ流量４７．５ｍｌ／ｍｉｎ、Ｏ２流量８ｍｌ／ｍｉｎ、ＣＯ２流量２．５ｍｌ／ｍｉｎで５日間培養容器内でバッチ培養した。５日後の細胞濃度は１×１０７個/ｍｌ、細胞のバイアビリティは９５％であった。
＜濾過・灌流培養＞
次に、濾過モジュールの供給側の一方の流通口が培養容器にチューブ接続され、もう一方の流通口が往復動可能なダイアフラムポンプ（Refine Technology社、ATF2system）とチューブ接続された濾過モジュールを用いて膜分離処理を行った。ダイアフラムポンプを運転し培養容器内の細胞懸濁液を濾過モジュール内に供給した。ダイアフラムポンプは１Ｌ／ｍｉｎの流量で５秒毎に往復動を繰り返すように設定し、細胞懸濁液が濾過膜と平行かつ交互に液が流れるようにした。濾過膜は表３に示すメッシュ、開口径、開口径分布（変動係数σ／Ｘ）、膜厚を持つものを使用した。濾過膜の開口径は標準粒子による濾過試験を行い、阻止率９５％となる粒子径（すなわち、粒子透過試験による９５％分離粒子径）として求めた。濾過膜の開口径分布（変動係数σ／Ｘ）は、水銀圧入法により測定し、既知の統計解析手法により平均値Ｘ、標準偏差σを求めた。また濾過膜の膜厚は接触式膜厚測定計（アンリツ製）で求めた。
デブリス及び抗体の回収タンクとチューブ接続された濾過モジュールの透過側の排出口から、チューブポンプ（Cole Parmer社、マスターフレックスチューブポンプ）で濾液を抜き出した。濾液の抜き出し流量は、培養容器内の細胞懸濁液の総液量をＬ、濾液の1日当たりの抜き出し流量をＮとしたときにＮ／Ｌが１になるように濾過条件を設定した。また培養容器内の細胞懸濁液量が一定になるよう、培養容器内とチューブ接続された培地供給タンクより、濾液の抜き出し液量と同じ流量で、培地をチューブポンプ（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ社、マスターフレックスチューブポンプ）で供給した。
＜各実施例の相違点＞
各実施例において、細胞種類、濾過膜、濾過条件、圧力（濾過条件によって調整）を表３のように相違させた。実施例３−１〜３−８、実施例３−１１〜３−１８では綾畳織メッシュで構成された濾過膜を用いた。実施例３−９〜３−１０では、２枚の平織メッシュを、網目位置を互いにずらして積層して構成された濾過膜を用いた。比較例３−１では、１枚の平織メッシュで構成された濾過膜を用いた。比較例３−２ではＭＦ（Microfiltration Membrane）膜で構成された濾過膜を用いた。比較例３−３では焼結多孔質フィルタで構成された濾過膜を用いた。比較例３−４では、セラミックフィルタで構成された濾過膜を用いた。実施例３−１〜３〜１８、比較例３−１において濾過膜として使用したメッシュの素材はステンレス鋼材ＳＵＳ３１６である。
＜測定＞
１日間、濾過・灌流培養を行った後、下記の測定を行った。
＜圧力の測定＞
濾過モジュールの供給側のダイアフラムポンプ側に設けられた流通口の圧力Ｍ１と、濾過モジュールの供給側の培養容器側に設けられた流通口の圧力Ｍ２と、濾過モジュールの透過側の圧力Ｍ３を測定した。圧力はSpectrum Laboratories社のKrosFloデジタル圧力モニタで測定した。（１）式を用いて濾過膜の膜面差圧ΔＭを算出した。
＜細胞径の測定＞
培養容器内から細胞懸濁液を採取し、BECKMAN COULTER社のVi-CELLにより細胞の平均径を求めた。
＜細胞の個数濃度・バイアビリティ＞
培養容器内から細胞懸濁液を採取し、濾過モジュールの透過側から濾液を採取し、それぞれBECKMAN COULTER社のVi-CELLにより生細胞の個数濃度とバイアビリティを求めた。
＜デブリスの個数濃度＞
培養容器内から細胞懸濁液を採取し、濾過モジュールの濾過側から濾液を採取し、BECKMAN COULTER社のMultisizer4により、デブリスの個数濃度を求めた。デブリスは、細胞の平均径の１／１０以上１／２以下の径のものとした。
＜濾過の判定＞
濾過の総合判定として、以下基準で評価を行った。
Ａ：細胞の個数密度の透過側（濾液側）と供給側との比率が５％以下かつ、デブリスの個数密度の透過側（濾液側）と供給側との比率が８０％以上かつ、細胞のバイアビリティが９０％以上
Ｂ：細胞の個数密度の透過側（濾液側）と供給側との比率が２０％以下かつ、デブリスの個数密度の透過側（濾液側）と供給側との比率が７０％以上かつ、細胞のバイアビリティが８０％以上
Ｃ：細胞の個数密度の透過側（濾液側）と供給側との比率が５０％以下かつ、デブリスの個数密度の透過側（濾過側）と供給側との比率が５０％以上かつ、細胞のバイアビリティが７０％以上
Ｄ：細胞の個数密度の透過側（濾液側）と供給側との比率が５０％を越えるもしくは、デブリスの個数密度の透過側（濾液側）と供給側との比率が５０％未満もしくは、細胞のバイアビリティが７０％未満
表３に示すように、実施例３−１〜３−１８において、比較例３−１〜３−４と比較して良好な総合判定結果を得ることができた。
実施例４は、単一細胞としてのヒト巨核球及びデブリスとしてのヒト血小板を含む細胞懸濁液に膜分離処理を施すことにより、ヒト巨核球と、ヒト血小板とを分離する場合に関する。
＜材料＞
培地：RPMI１６４０（Life Technologies社）４５０mlにウシ血清(Life Technologies社) ５０mlを添加したものを使用した。
巨核球：MEG-01(ATCC社)を巨核球として使用した。これを培地と混合することで、細胞懸濁液(６×１０５cells/ml)を調製した。
血小板：ラット末梢血から単離したものを血小板として使用した。クエン酸-デキロース溶液(ACD)(sigma-aldrich社)が入った１５ml遠心分離用コニカルチューブ(Falcon社)にラットから採血した全血 １０mlを回収した。３００×g、室温で７分間遠心し、遠心後のPlasma層及びBufffy coat層を回収した。回収液を同様に遠心分離を行い、Plasma層のみを回収した後に、１８００×g、室温で５分間遠心し、上清を回収することで血小板を得た。これを培地と混合することで、細胞懸濁液(６×１０７cells/ml)を調製した。
巨核球液と血小板液を等量混合することで、細胞懸濁液として細胞分離試験に使用した。
＜細胞濾過試験＞
濾過モジュール(ADVANTEC社、KS-47)の供給側の一方の流通口が細胞懸濁液を含むシリンジ(テルモ社)にチューブ接続された濾過モジュールを用いて膜分離処理を行った。シリンジをシリンジポンプ(HARVARD APPARATUS社、PHD ULTRA 4400)に設置し、１ｍｌ/ｍｉｎの流量で細胞懸濁液が濾過モジュール内の濾過膜に対して直交するデッドエンド方式で供給されるよう、シリンジポンプを運転した。濾過モジュールの透過側の排出口から排出された濾液を回収した。
濾過膜は表４に示すメッシュ、開口径、開口径分布（変動係数σ／Ｘ）、膜厚を持つものを使用した。濾過膜の開口径は標準粒子による濾過試験を行い、阻止率９５％となる粒子径（すなわち、粒子透過試験による９５％分離粒子径）として求めた。濾過膜の開口径分布（変動係数σ／Ｘ）は、水銀圧入法により測定し、既知の統計解析手法により平均値Ｘ、標準偏差σを求めた。また濾過膜の膜厚は接触式膜厚測定計（アンリツ製）で求めた。
＜各実施例の相違点＞
各実施例において、濾過膜を表４のように相違させた。実施例４−１〜４−３では綾畳織メッシュで構成された濾過膜を用いた。比較例４−１〜４−４では、平織メッシュで構成された濾過膜を用いた。濾過膜として使用したメッシュの素材はステンレス鋼材ＳＵＳ３１６である。
＜測定＞
濾液を回収した後、下記の測定を行った。
＜巨核球の個数濃度＞
濾過モジュールの透過側から濾液を採取し、BECKMAN COULTER社のVi-CELLにより巨核球濃度を求めた。以下の式から得た巨核球阻止率を求めた。
巨核球阻止率(%)=100-(濾液中の巨核球濃度/元液中の巨核球濃度)×100
＜血小板の個数濃度＞
濾過モジュールの透過側から濾液を採取し、シスメックス社のXT-2000ivにより血小板濃度を求めた。以下の式から得た血小板透過率を求めた。
血小板透過率(%)=(濾液中の血小板濃度/元液中の血小板濃度)×100
＜濾過の判定＞
濾過の総合判定として、以下基準で評価を行った。
Ａ：巨核球阻止率が５％未満かつ、血小板透過率が９０％以上
Ｂ：巨核球阻止率が１０％未満かつ、血小板透過率が９０％以上
Ｃ：巨核球阻止率が１０％以上もしくは、血小板透過率が９０％未満

表４に示すように、実施例４−１〜４−３において、比較例４−１〜４−４と比較して良好な総合判定結果を得ることができた。
日本出願２０１６−１３０５７９、及び日本出願２０１７−０９５６７３の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。
本明細書に記載された全ての文献、特許出願、および技術規格は、個々の文献、特許出願、および技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

Claims (32)

  1. 第１の面に形成された入側の開口と、前記第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ前記入側の開口と連通する出側の開口と、を有し、前記入側の開口と前記出側の開口とが膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されている濾過膜を用いて、細胞懸濁液の膜分離処理を行う
    細胞懸濁液の膜分離方法。
  2. 第１の面に形成された入側の開口と、前記第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ前記入側の開口と連通する出側の開口と、を有し、前記入側の開口と前記出側の開口とを接続する経路が非直線状である濾過膜を用いて、細胞懸濁液の膜分離処理を行う
    細胞懸濁液の膜分離方法。
  3. 前記細胞懸濁液は、細胞凝集体、単一細胞及びデブリスを含み、
    前記膜分離処理において、前記細胞凝集体と、前記単一細胞及び前記デブリスと、を前記濾過膜を用いて分離する、
    請求項１または請求項２に記載の膜分離方法。
  4. 前記細胞懸濁液は、単一細胞及びデブリスを含み、
    前記膜分離処理において、前記単一細胞と前記デブリスと、を前記濾過膜を用いて分離する、
    請求項１または請求項２に記載の膜分離方法。
  5. 前記濾過膜の前記入側の開口の径は、前記細胞凝集体の径の０．０１倍以上３．０倍以下である、請求項３に記載の膜分離方法。
  6. 前記単一細胞は、ヒト由来細胞であり、
    前記濾過膜の前記入側の開口の径は、前記単一細胞の径の０．０５倍以上０．８倍以下である、
    請求項４に記載の膜分離方法。
  7. 前記単一細胞は、非ヒト細胞であり、
    前記濾過膜の前記入側の開口の径は、前記単一細胞の径の０．１倍以上２倍以下である、
    請求項４に記載の膜分離方法。
  8. 前記単一細胞は、非ヒト細胞であり、
    前記濾過膜の開口径分布の平均値をＸ、標準偏差をσとしたとき、０＜σ／Ｘ≦０．１を満たす、
    請求項４または請求項７に記載の膜分離方法。
  9. 前記単一細胞は、非ヒト細胞であり、
    前記濾過膜の膜厚は、１５０μｍ以下である、
    請求項４、請求項７及び請求項８のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  10. 前記単一細胞は、非ヒト細胞であり、
    前記濾過膜の前記第１の面に加わるゲージ圧は、−７０キロパスカル以上７０キロパスカル以下である、
    請求項４及び請求項７から請求項９のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  11. 前記単一細胞は、非ヒト細胞であり、
    前記濾過膜を透過した濾液に含まれる前記単一細胞の個数密度は、前記濾過膜を透過する前の細胞懸濁液に含まれる前記単一細胞の個数密度の５０％以下である、
    請求項４及び請求項７から請求項１０のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  12. 前記単一細胞は、非ヒト細胞であり、
    前記濾過膜を透過した濾液に含まれる、前記単一細胞の径の１／１０以上１／２以下の径のデブリスの個数密度は、前記濾過膜を透過する前の細胞懸濁液に含まれる、前記単一細胞の径の１／１０以上１／２以下の径のデブリスの個数密度の５０％以上１００％以下である、
    請求項４及び請求項７から請求項１１のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  13. 前記単一細胞は、非ヒト細胞であり、
    前記単一細胞の径は、５μｍ以上２５μｍ以下である、
    請求項４及び請求項７から請求項１２のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  14. 前記単一細胞は、ＣＨＯ細胞である、請求項４及び請求項７から請求項１３のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  15. 前記細胞凝集体は、ヒト由来細胞の凝集体であり、前記単一細胞は、ヒト由来細胞である、請求項３に記載の膜分離方法。
  16. 前記ヒト由来細胞は、幹細胞である、請求項６または請求項１５に記載の膜分離方法。
  17. 前記単一細胞は、ヒト由来細胞である、請求項４に記載の膜分離方法。
  18. 前記ヒト由来細胞は、幹細胞である、請求項１７に記載の膜分離方法。
  19. 前記ヒト由来細胞は、巨核球である、請求項１７に記載の膜分離方法。
  20. 前記濾過膜の前記第１の面に加わる圧力と、前記濾過膜の前記第２の面に加わる圧力との差を０．０１キロパスカル以上６０キロパスカル以下として前記膜分離処理を行う、請求項１から請求項１９のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  21. 表面に親水化処理が施された前記濾過膜を用いて前記膜分離処理を行う、請求項１から請求項２０のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  22. 前記濾過膜は、繊維状部材を綾畳織りして形成されたメッシュを含んで構成されている、請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  23. 前記濾過膜は、各々が貫通孔を有する複数のメッシュを、貫通孔の位置を前記濾過膜の膜面と平行な方向に互いにずらして積層して構成されている、請求項１から請求項２１のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  24. 前記メッシュは、金属で構成されている、請求項２２または請求項２３に記載の膜分離方法。
  25. 前記細胞懸濁液を、前記濾過膜の膜面の方向に沿って流して前記膜分離処理を行う、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載の膜分離方法。
  26. 前記細胞懸濁液を、前記濾過膜の膜面に沿って往復移動させて前記膜分離処理を行う、請求項２５に記載の膜分離方法。
  27. 細胞を培養するための培養容器と、第１の面に形成された入側の開口と、前記第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ前記入側の開口と連通する出側の開口と、が膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されている濾過膜を有し、前記培養容器で培養された細胞が流通する流路を介して前記培養容器に接続された濾過部と、を含む細胞培養装置の前記濾過膜を用いて前記培養容器から供給された細胞懸濁液の膜分離処理を行う膜分離方法であって、
    前記培養容器内の細胞懸濁液の液量をＬとし、前記膜分離処理において前記濾過膜を透過した濾液の１日あたりの液量をＮとしたとき、
    ０．１≦Ｎ／Ｌ≦６
    を満たす膜分離方法。
  28. 細胞を培養するための培養容器と、
    第１の面に形成された入側の開口と、前記第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ前記入側の開口と連通する出側の開口と、が膜面と平行な方向においてずれた位置に配置されている濾過膜を有し、前記培養容器で培養された細胞が流通する流路を介して前記培養容器に接続された濾過部と、
    を含む細胞培養装置。
  29. 細胞を培養するための培養容器と、
    第１の面に形成された入側の開口と、前記第１の面とは反対側の第２の面に形成され且つ前記入側の開口と連通する出側の開口とを有し、前記入側の開口と前記出側の開口とを接続する経路が非直線状である濾過膜を備え、前記培養容器で培養された細胞が流通する流路を介して前記培養容器に接続された濾過部と、
    を含む細胞培養装置。
  30. 前記濾過膜の表面には、親水化処理が施されている、請求項２８または請求項２９に記載の細胞培養装置。
  31. 前記濾過膜は、繊維状部材を綾畳織りして形成されたメッシュを含んで構成されている、請求項２８から請求項３０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
  32. 前記濾過膜は、貫通孔を有する複数のメッシュを、貫通孔の位置を前記濾過膜の膜面と平行な方向に互いにずらして積層して構成されている、請求項２８から請求項３０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
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