CN112512656A - 用于组织和细胞聚集体解离及单细胞富集的微流体过滤装置及方法 - Google Patents

用于组织和细胞聚集体解离及单细胞富集的微流体过滤装置及方法 Download PDF

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Abstract

一种微流体组织解离和过滤装置，同时过滤大的组织碎片，并将较小的聚集体解离成单细胞，从而提高单细胞的产量和纯度。该装置包括在上游位置处耦接至第一微流体通道的入口和在下游位置处的第一出口。第一过滤膜介于第一微流体通道和第二微流体通道之间，其中，第二微流体通道经由第一过滤膜与第一微流体通道流体连通。第一过滤膜在切向流形式下操作。第二出口耦接至第二微流体通道的下游位置，并且包括介于第二出口和第二微流体通道之间的第二过滤膜。对于不同的组织类型，双膜装置使单细胞数目增加至少3倍。

Description

用于组织和细胞聚集体解离及单细胞富集的微流体过滤装置 及方法
相关申请
本申请要求于2018年5月30日提交的美国临时专利申请号62/678,171的优先权，其通过引证并入本文。根据35 U.S.C.§119和其他适用法规要求优先权。
技术领域
技术领域大体上涉及用于从组织碎片和细胞聚集体获得单细胞的微流体装置和方法。更具体地，本发明涉及一种廉价的微流体装置，该装置同时过滤大的组织碎片，并将较小的聚集体解离成单细胞，从而提高了单细胞产量和纯度。
关于联邦政府赞助研究开发的声明
本发明是在国家科学基金会授予的第IIP1362165号拨款的政府支持下完成的。政府在本发明中享有某些权利。
背景技术
越来越多地在单个细胞水平上对复杂组织进行分析，以对多样性进行分类并鉴定稀有驱动细胞。该分析可以提供全面的细胞普查，其可用于更好地了解组织或器官生物学，例如人类细胞图谱计划所倡导的普查，以及改善包括实体瘤在内的主要疾病的诊断和治疗。理想地定位基于细胞的诊断技术，诸如流式细胞术、大规模细胞术和单细胞RNA测序，以实现上述目标，但是主要的限制是需要首先将组织分解为单细胞悬液。传统上，通过用手术刀切成小块、用蛋白水解酶消化、用移液器机械分离和/或涡旋然后用细胞过滤器过滤以除去残留的聚集体，从而将组织解离。最近已经开发了微流体技术以自动化和改善组织解离，包括使用锋利的表面边缘、柱阵列和产生流体动力射流的分支通道网络进行芯片上(on-chip)的消化和解聚。
尽管这些装置具有改进的处理速度和单细胞产量，但是已经发现在处理之后总是留有大量的小聚集体。通常使用细胞过滤器从消化的组织样品中去除大的组织碎片和细胞聚集体，这些过滤器含有孔径在35-80μm范围内的尼龙
Figure BDA0002924341580000021
滤网。这些孔足够大，可以使小的聚集体和团簇与单细胞一起通过。虽然可以使用孔径较小的细胞过滤器，但由于担心丢失单细胞，通常避免使用它们。通过增强解离能力或提供芯片上分离机制来消除这些聚集体将提高单细胞悬液的质量，并能够立即进行下游分析。
发明内容
在一个实施例中，提供了一种微流体组织解离和过滤装置，其包括在上游位置处耦接至第一微流体通道的入口，第一微流体通道在下游位置处耦接至第一出口。第一过滤膜介于第一微流体通道和第二微流体通道之间，其中第二微流体通道经由第一过滤膜与第一微流体通道流体连通。第二出口耦接至第二微流体通道的下游位置。第一出口容纳未通过第一过滤膜的流体和内容物的通路，而第二出口容纳通过第一过滤膜的流体和细胞或较小的细胞聚集体的通路。在一些实施例中，第二微流体通道包括介于第二出口和第二微流体通道之间的第二过滤膜。第二过滤膜优选地包括的孔径小于第一过滤膜中含有的孔径，从而可以进行附加的过滤。
在一个实施例中，微流体组织解离和过滤装置可以由多个分离的基板或层制成，该多个分离的基板或层彼此粘结或以其他方式粘附以形成层压结构。这些基板或层可以是基于聚合物的，然后彼此粘附以形成由多个层形成的最终的整体结构。第一微流体通道可以位于这些层中的一个(或多个)中，而第二微流体通道可以位于一个(或多个)不同的层中。在其他层中形成的口、孔或洞可用于流体地连接第一微流体通道和第二微流体通道(或附加的通道)以及固定相应的过滤膜。
将过滤膜放置在微流体装置内使滞留体积最小化并提高了洗涤效率。此外，微流体组织解离和过滤装置可以在高流速(>10mL/min)下操作，并且可以很容易地与其他流体动力学组织消化和聚集体解离技术集成在一起。
在一个实施例中，过滤膜由形成编织网的聚合物线制成。例如，过滤膜可以由聚酰胺线制成，该聚酰胺线产生界限分明的、微米尺寸的孔。而所利用的特定孔径可以取决于要过滤的细胞的性质。通常，孔的尺寸为约5个实至约1,000中，，更优选为约10选为至约1,000中，、或约5约0至约100 0。在一个实施例中，第一过滤膜具有直径为d1的孔，第二过滤膜具有直径为d2的孔，其中d1＞d2。例如，在一个实施例中，第一过滤膜具有直径在15，在和1000一个范围内的孔，而第二过滤膜具有在5内的和100孔，范围内的较小直径的孔。该后者实施例涉及多阶段微流体组织解离和过滤装置。对于基于尺寸的循环肿瘤细胞(CTC)与较小血细胞的分离，在一个实施例中，孔径可在5-10细胞的范围内。取决于应用，流速可以在很宽的流量范围内变化。例如，对于使用微流体组织解离和过滤装置的CTC过滤，流速范围可以从全血mL/hr到稀释血10mL/min。对于诸如脂肪组织的其他组织，可以使用较大的孔，例如，在500脂肪组织的其他组织，可范围内的孔。
在一个实施例中，微流体组织解离和过滤装置将孔径范围为5至50实施的聚酰胺(例如
Figure BDA0002924341580000031
)网状膜集成到激光微加工的、层压的塑料或基于聚合物的微流体装置中。微流体组织解离和过滤装置可以在传统的直接过滤模式下操作，样品通过过滤膜，或者在切向过滤模式下利用错流防止膜堵塞，或者两者结合。使用癌细胞系证明，即使在高流速(mL/min)下操作，具有10μm或更小孔径的
Figure BDA0002924341580000032
膜也能去除所有含有四个或更多个细胞的聚集体。但是，有些2至3个细胞的团簇仍然穿过小至5μm的孔。有趣的是，观察到单细胞数目在通过比细胞小的孔径后会显著增加多达五倍，但这也与细胞损伤有关。还发现解离仅微弱地取决于通过膜的流速，但是在切向过滤模式下由于存在错流而显著减少了解离。
在另一个实施例中，通过串联耦接两个过滤装置提高了单细胞的回收和纯度，使得聚集体被逐渐解离成较小的尺寸。结果主要与第二膜的孔径相关，后者较小且总是用于直接过滤模式。接下来，使用切碎并消化的鼠肾脏组织样品优化性能。已发现，孔径为50μm和15μm的膜的组合产生的单细胞最多。最后，将孔径为50μm(第一过滤膜)和孔径为15μm(第二过滤膜)的膜集成到单个微流体组织解离和过滤装置中，并使用鼠肾脏、肝脏和乳腺肿瘤组织样品对结果进行验证。用胶原酶切碎并消化后，双膜微流体组织解离和过滤装置可使单细胞产量提高至少3倍，在某些情况下提高10倍以上，同时还能保持细胞活力并减少聚集体。最引人注目的是，使用微流体组织解离和过滤装置，经过短暂的15min消化后，会产生与60min消化一样多的单细胞。以这种方式减少处理时间将有助于保留细胞活力、表型和分子标记，以便随后进行分子分析。双膜微流体过滤装置可以与上游组织处理技术(诸如水切碎和分支通道阵列)集成在一起，以使各种组织类型的解离速度和效率最大化。通过将双膜微流体过滤装置与附加的上游组织处理技术以及下游操作(诸如细胞分选和检测)集成在一起，该装置可用于创建完整的组织分析平台。
在一个实施例中，微流体组织解离和过滤装置包括在上游位置处耦接至第一微流体通道的入口，第一微流体通道在下游位置处耦接至第一出口，以及介于第一微流体通道和第二微流体通道之间的第一过滤膜，其中第二微流体通道经由第一过滤膜与第一微流体通道流体连通。第二出口耦接至第二微流体通道的下游位置。
在另一个实施例中，微流体组织解离和过滤装置包括在上游位置处耦接至第一微流体通道的入口，第一微流体通道在下游位置处耦接至第一出口，其中第一微流体通道设置在微流体组织解离和过滤装置的第一层。该装置包括位于微流体装置的第二层内的第二微流体通道以及介于第一微流体通道与第二微流体通道之间的第一过滤膜，其中第二微流体通道通过含有第一过滤膜的连接通路与第一微流体通道流体连通。第二出口耦接至第二微流体通道的下游位置，并且第二过滤膜介于第二出口和第二微流体通道之间。
在另一个实施例中，微流体组织解离和过滤装置包括在上游位置处耦接至第一微流体通道的入口，第一微流体通道在下游位置处耦接至第一出口，其中第一微流体通道设置在微流体组织解离和过滤装置的第一层中。第二微流体通道位于微流体装置的第二层内，并且第一过滤膜介于第一微流体通道和第二微流体通道之间，其中第二微流体通道通过含有第一过滤膜的连接通路与第一微流体通道流体连通。该装置包括耦接至第二微流体通道的下游位置的第二出口以及介于第二出口和第二微流体通道之间的第二过滤膜。该装置还包括一个或多个附加的微流体通道，其设置在微流体组织解离和过滤装置的不同层中，其中一个或多个附加的微流体通道中的每一个具有与其耦接的相应的出口以及介于相邻的微流体通道之间的相应的过滤膜。在该实施例中，微流体组织解离和过滤装置可包括总共3、4、5、6、7、8、9、10个等数量的过滤膜。
附图说明
图1A示出了根据一个实施例的微流体组织解离和过滤装置的截面图，该装置包括串联的两(2)个过滤器。
图1B示出了根据一个实施例的微流体组织解离和过滤装置的截面图，该装置包括一(1)个过滤器。
图1C示出了根据一个实施例的微流体组织解离和过滤装置的截面图，该装置包括串联的三(3)个过滤器。
图1D示出了使用单个过滤器的微流体组织分离装置的局部截面透视图。
图1E示出了图1E的微流体组织分离装置的侧视截面图。
图1F示出了使用单个过滤器的微流体组织分离装置的顶视图以及示出了用于形成微流体组织分离装置的各个基板/层的分解图。
图1G示出了使用两个过滤器的微流体组织分离装置的局部截面透视图。
图1H示出了分解图，该分解图示出了用于形成图1G的微流体组织分离装置的各个基板/层。
图2示出了
Figure BDA0002924341580000051
网状膜的显微照片，其示出了具有高孔密度和均匀性的晶格网络。孔径大小(从左到右)为50、25、15、10和5μm。
图3A示出了这样的图，该图示出了由显微照片定量的单细胞、团簇和聚集体，并绘制为在通过过滤装置(包含具有指定孔径的一个膜)之前(对照)和之后的总群体的百分比。装置以12.5mL/min的流速在直接过滤模式下操作。随着孔径的减小，聚集体和团簇的去除效率提高，单细胞一开始低于30％，最高达到85％。
图3B示出了使用细胞计数器定量并通过对照归一化(normalize)的单细胞数目的图。通过5、10和15μm孔径过滤后，回收到的单细胞明显更多，表明聚集体解离为单细胞。
图3C示出了活力随孔径变化的图。活力通过碘化丙啶(propidium iodide)排除试验确定，并随孔径的增加而降低。
图3D示出了在较低流速下归一化的单细胞计数随孔径(通过膜的直接流动)变化的图，其通常导致较少的单细胞数目。
图3E示出了在较低流速下活力百分比随孔径(通过膜的直接流动)变化的图，尽管变化不大，但通常导致较高的活力。
图3F示出了对于使用不同错流比(40％至80％)的切向过滤实验，归一化的单细胞计数随孔径变化的图，其导致单细胞数目明显低于在12.5mL/min下的直接流实验。对于所有图3A至3F，误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。*表示相对于对照p<0.05，**表示p<0.01。
图4A示出了对于5、10和15μm膜过滤器(串联组合)的各种组合，群体百分比随孔径变化的图；装置通过管道连接，并在直接过滤模式下以12.5mL/min的流速操作。从所有过滤装置组合中消除了大的和小的聚集体群体。
图4B示出了单细胞(归一化的)(单细胞回收)随孔径变化的图。
图4C示出了活力百分比随孔径变化的图。单细胞回收和活力通常与5和10μm膜的单过滤膜直接过滤实验相似。15-15膜装置组合确实比单独的15μm多孔膜具有更高的单细胞数目。
图4D至图4F示出了切向过滤实验的结果，该实验使用25或50μm的膜，然后使用10或15μm的膜，错流60％，总流速12.5mL/min。图4D的结果示出了单细胞、团簇和聚集体，图4E示出了单细胞回收，图4F示出了活力全部主要由第二膜的孔径决定。误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。*表示相对于对照p<0.05，**表示p<0.01。
图5A至图5E示出了刚获得的肾脏组织的结果，该肾脏组织在通过两个串联耦接的过滤器之前被切碎并用胶原酶消化。图5A和5B示出了在直接或切向(60％错流)过滤模式下对与10或15μm膜组合的25或50μm膜的评估。使用细胞计数器确定单细胞计数。如图5A所示，消化15min后，对于所有膜组合和过滤模式，装置处理使单细胞回收提高了2-4倍。插图示出在50μm孔径的膜上捕获的组织。图5B示出了在30min消化后，在所有情况下，装置处理如何使单细胞回收增加超过5倍。结果通常基于第二膜的孔径，并且不会随第一膜的孔径或过滤模式发生明显变化。图5C至5E示出了使用流式细胞术研究50-10和50-15组合的结果。图5C显示，在15和30min的消化时间，从50-15和50-10膜组合中回收的单组织细胞数目超出了对照5至10倍。消化60min后，50-15μm组合使单组织细胞的回收提高了2.5倍。图5D显示，在15和30min消化时间，在所有条件下，活力为～90％，但在60min消化后，对照活力降低至～80％并且50-15μm过滤组合降低至75％。图5E示出了使用分散的信息对聚集数和团簇数目进行定量，并且给出了相对于单细胞的聚集数和团簇数目。随着消化时间的增加，对照的聚集体增加，使用50-15膜组合的聚集体保持同样，但使用50-10膜组合的聚集体减少。误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。*表示在相同消化时间相对于对照p<0.05，**表示p<0.01。
图6A至图6F示出了使用鼠肝脏(图6A至6C)和乳腺肿瘤组织样品(图6D至6F)的集成双膜过滤装置的验证。将刚获得的鼠肝脏和乳腺肿瘤组织切碎并用胶原酶消化，然后通过含有50和15μm膜的微流体过滤。如图6A所示，在15和30min的消化后，装置处理使单肝脏组织细胞分别增加了5倍和2倍。装置在60min后不再进一步增加单肝脏组织细胞，因为酶消化完全释放了细胞。参考图6B，对于对照和装置条件，活力保持大于90％。如图6C中所见，在所有消化时间，对照的聚集体均以～1％的量存在，并且通常通过装置处理而减少。在图6D中，在所有消化时间，装置处理使单上皮细胞增加了3倍。如图6E中所见，对于肿瘤，细胞活力显著较低，为40-50％，但不随消化时间或装置处理而显著变化。在所有条件下，聚集体构成细胞悬浮液的约15-20％(图6F)。误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。*表示在相同消化时间相对于对照p<0.05，**表示p<0.01。
图7A至图7E示出了使用MCF-7细胞的单个过滤装置实验。图7A示出了在直接过滤模式和12.5mL/min流速下进行的实验的活单细胞数目。对于5、10和15μm孔径中的每一个，值均比对照高约40％。图7B示出了在0.25、1和4mL/min流速下直接过滤实验获得的细胞群体。图6C至6E示出了使用12.5mL/min总流速和80％(图7C)、60％(图7D)和40％(图7E)错流比的切向过滤实验获得的细胞群。误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。*表示相对于对照p<0.05，**表示p<0.01。
图8A至图8F示出了使用MCF-7细胞的双过滤装置实验。图8A示出了在直接过滤模式和12.5mL/min流速下进行的双过滤装置实验的活单细胞数目。对于膜，所有包括5μm孔径的组合的值均最低。图8B为在切向过滤模式下以12.5mL/min总流速和60％错流率进行的双过滤装置实验的活单细胞数目。在所有情况下，值均比对照高近2倍。图8C至8F示出了在切向过滤模式下以12.5mL/min总流速和80％错流比进行的双过滤装置实验的结果。细胞群体(图8C)、单细胞回收(图8D)、活力(图8E)和活单细胞回收(图8F)的结果类似于60％错流比实验。误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。*表示相对于对照p<0.05，**表示p<0.01。
图9A至图9D示出了使用鼠肾脏组织的过滤装置的优化。图9A、9B使用两个串联的单膜过滤装置进行实验。图9A示出了红细胞的回收，图9B示出了白细胞的回收，它们与消化时间和装置处理的增加而增加，其方式与图5C中的单组织细胞回收结果一致。图9C、9D示出了使用具有已消化60min的肾脏组织的集成双膜过滤装置进行的实验。装置处理后，单组织细胞数目相对于对照增加了约60％(图9C)。活力保持在＞85％，类似于对照(图9D)。误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。*表示相对于相同消化时间对照的p<0.05，**表示p<0.01。
图10A至图10D示出了鼠肝脏和肿瘤组织样品的红细胞和白细胞回收。示出了肝脏(图10A、10B)和乳腺肿瘤细胞(图10C、10D)悬浮液的结果。在所有情况下，红细胞和白细胞计数均随着消化时间和装置处理的增加而增加。随着消化时间和装置处理的增加，回收增加，其方式与图6A至6F中的单组织/上皮细胞一致。误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。*表示在相同消化时间相对于对照p<0.05，**表示p<0.01。
具体实施方式
图1A示出了根据一个实施例的微流体组织解离和过滤装置10的截面图。如图1D、图1E、图1F、图1G和图1H中最佳示出的，微流体组织解离和过滤装置10形成在一个或多个基板或层12中。基板或层12可以由聚合物或塑料材料形成，该聚合物或塑料材料含有形成在其中的各种特征部，这些特征部被层压或以其他方式粘结在一起以形成根据一个实施例的最终的微流体组织解离和过滤装置10。形成在基板或层12中的各种特征部包括通道和流体通路(在下文中更详细地描述)，在微流体组织解离和过滤装置10的操作期间，流体流过该通道和流体通路。
微流体组织解离和过滤装置10包括入口14、流体通过入口14流入微流体组织解离和过滤装置10。入口14可以包括如图所示的倒钩端40或类似物，其可以连接至用于将含有组织的流体输送到微流体组织解离和过滤装置10的管道或其他导管。入口14在上游位置处流体地耦接至第一微流体通道16(箭头指示流体流动的方向)。第一微流体通道16还耦接至位于下游位置处的第一出口18。第一出口18可以包括如图所示的倒钩端40，该倒钩端可以连接至用于从微流体组织解离和过滤装置10去除含有细胞和细胞聚集体的流体的管道或其他导管。第一微流体通道16至少部分地限定在一个或多个基板或层12中。例如，第一微流体通道16的表面(顶部、底部、侧面)可以限定在一个或多个基板或层12中。第一微流体通道16的典型截面尺寸可包括在约200μ0至约1mm范围内的高度和在约1mm至约1cm范围内的宽度。第一微流体通道16的长度(从一端到另一端)可以在几厘米和几十厘米甚至几百厘米之间变化(例如，在一个实例中，从约5cm至约100cm)。应当理解，这些尺寸是说明性的。
参考图1A，微流体组织解离和过滤装置10包括第二微流体通道20。在一个实施例中，第二微流体通道20设置在微流体组织解离和过滤的不同基板或层12中。如图1D、图1E、图1F、图1G和图1H所示的装置10。在这方面，第二微流体通道20位于与第一微流体通道16不同的平面中。例如，第二微流体通道20可以位于比第一微流体通道16低的平面中。可以在一个或多个基板或层12中限定第二微流体通道20。第二微流体通道20的典型截面尺寸可以包括在约200 00至约1mm范围内的高度以及在约1mm至约1cm范围内的宽度。第二微流体通道20的长度(从一端到另一端)可以在几厘米和几十厘米甚至几百厘米之间变化(例如，在一个实例中，从约5cm至约100cm)。应当理解，这些尺寸是说明性的。
第二微流体通道20通过流体通路22流体地连接到第一微流体通道16。将第二微流体通道20连接到第一微流体通道16的流体通路22可以包括在第一微流体通道16至第二微流体通道20之间延伸的口、孔或洞。流体通路22可以形成或限定在一个或多个层12中，位于形成第一微流体通道16和第二微流体通道20的层12之间。第一过滤膜24设置在流体通路22中或横跨流体通路22，并且介于第一微流体通道16和第二微流体通道20之间。例如，第一过滤膜24可以形成为单层的编织网状聚合物线，其被夹在中间在两个相邻的层12之间并延伸横跨流体通路22。在一个实施例中，用于第一过滤膜24的线是聚酰胺线(例如
Figure BDA0002924341580000101
)。在一个实施例中，构成第一过滤膜24的孔径可以在约1孔径至约100以在的范围内。在本文中，孔径是指特定过滤膜的标称孔径或平均孔径。在另一个实施例中，第一过滤膜24的孔径可以在约5径可至约50可以的范围内。
参考图1A，第二微流体通道20与第一微流体通道16间隔开，并且流体通过进入流体通路22然后穿过第一过滤膜24进入第二微流体通道20(箭头表示流量方向)。就此而言，第二微流体通道20与第一微流体通道16流体连通。如图1A所示，第二出口26耦接至第二微流体通道20的下游位置。第二出口26可以包括如图所示的倒钩端40或类似物，其可以连接至用于从微流体组织解离和过滤装置10去除单细胞和流体的管道或其他导管。第二过滤膜28设置在流体通路30中或横跨流体通路30，该流体通路30将第二微流体通道20耦接至第二出口26。流体通路30可以包括在第二微流体通道20和第二出口26之间延伸的通孔、孔或小孔。流体通路30可以形成或限定在一个或多个层12中，位于形成第二微流体通道20的层12和具有第二出口26的顶层12之间。第二过滤膜28设置在流体通路30中或跨过流体通路30，并介于第二微流体通道20和第二出口26之间。和第一过滤膜24一样，第二过滤膜28可以形成为单层的编织网状聚合物线，其被夹在两个相邻的层12之间并延伸跨过流体通路30。
第二过滤膜28可以由相似的材料制成并且具有相似的孔径，尽管其孔径小于第一过滤膜24。如本文所述，第一过滤膜24和第二过滤膜28可以使用单层的聚合物纤维的编织网形成。尽管它们也可以使用微加工膜或轨迹蚀刻膜(track-etched membrane)形成。通过将诸如聚碳酸酯或聚酯之类的膜材料暴露于带电粒子中来形成轨迹蚀刻膜。带电粒子穿过膜材料，形成薄弱点。然后使用蚀刻剂沿带电粒子形成的轨迹将聚合物材料吞噬掉。蚀刻剂将轨迹加宽至规定尺寸的孔。可以使用聚合物材料的光刻图案(正图案或负图案)来形成微加工膜。不管如何制造，各自的过滤膜24、28具有限定在其中的孔。使用公知的过滤膜制造技术可以很好地限定这些各自的孔的尺寸。通常，孔的尺寸范围为约1限定至约100在其，更优选为约5优选至约50选为。在一个实施例中，第一过滤膜24具有直径为d1的孔，第二过滤膜28具有直径为d2的孔，其中d1＞d2。这允许逐渐减小细胞聚集体和细胞的过滤。
如图1A所示，微流体组织解离和过滤装置10含有一(1)个入口14和两(2)个出口18、26。第一出口18收集切向流流出物，第二出口26收集穿过第一过滤膜24和第二过滤膜28的直接流流出物。如本文所述，在一个优选的实施例中，使用商业层压方法制造微流体组织解离和过滤装置10，其中基板或层12被制造成使用粘合剂和压力层压技术对丙烯酸薄板进行激光蚀刻和粘结。在一些实施例中，如图1D、图1E、图1F、图1G、图1H所示，总共使用七(7)个塑料层12，以及具有在1-100μ-范围内的明确限定的孔径的
Figure BDA0002924341580000121
网状过滤膜24、28，其设置在各个流体通路22、30内的层12之间。例如，如本文的实验中所解释的，网状过滤膜24、28以5、10、15、25和50μ0的孔径进行测试。第一微流体通道16将装置入口14连接至第一过滤膜24，并经由切向流出口18收集跨过第一过滤膜24的错流(cross-flow，交叉流)。第二微流体通道20收集通过第一过滤膜24和18的流，并引导流体流过第二过滤膜28并流出第二出口26。注意，在某些实施例中，第一出口18可以被完全塞住或省略，在这种情况下，第一过滤膜24和第二过滤膜28在没有切向流的情况下以直流模式操作。
图1B、图1D、图1E和图1F示出了微流体组织解离和过滤装置10的另一个实施例。如在先前的实施例中，微流体组织解离和过滤装置10含有一(1)个入口14和两(2)个出口18、26。第一出口18收集切向流流出物，而第二出口26收集通过过滤膜24的直接流流出物。在该实施例中，仅采用单个过滤膜24。微流体组织解离和过滤装置10是使用商业层压工艺制造的，其中丙烯酸薄板被激光蚀刻并使用粘合剂和压力层压法粘结。膜可以包括网状(例如
Figure BDA0002924341580000122
)过滤膜18，其具有在5、10、15、25和50μ0范围内的明确定义的孔径尺寸，其插入在第一微流体通道14和第二微流体通道20之间。在一些实施例中，虽然可以使用两个过滤膜24、28来提高性能，但是仅需要单个过滤膜24。另外，在一些实施例中，第一出口18可以完全塞住或省略，在这种情况下，第一膜以直流模式运行，没有切向流。
图1C示出了微流体组织解离和过滤装置10的又一个实施例。该实施例示出了利用第一过滤膜24、第二过滤膜28和第三过滤膜32的装置10。图1A和图1B中公开的实施例含有相似的附图标记。在该实施例中，第二过滤膜28在切向流上操作，其中已经将穿过第一过滤膜24的较大的聚集体引导出第二出口26。较小的聚集体通过第二过滤膜28并进入第三微流体通道34。第三过滤膜32位于将第三微流体通道34耦接到第三出口38的流体通路36中。流体通路36可以包括在第三微流体通道34和第三出口38之间延伸的口、孔或洞。流体通路36可以形成或限定在位于形成一个或多个层12中，该一个或多个层12位于形成第三微流体通道34的层12与具有第三出口38的顶层12之间。第三过滤膜32设置在流体通路36内或跨过流体通路36，并介于第三微流体通道34和第三出口38之间。类似于第一过滤膜24，第三过滤膜32可以形成为单层的编织网状聚合物线，其被夹在两个相邻的层12之间并延伸横跨流体通路36。
为了使用任何微流体组织解离和过滤装置10，使用例如一个或多个泵(未示出)使含有待处理材料的样品溶液流过装置10。可提供泵以推动或甚至拉动材料通过装置10。因此，泵可经由管道或类似类型的导管流体地连接至入口14或出口18、26、38。在一些实施例中，离开出口(例如出口18、26)的流体可以再循环回到入口14中，以使得待处理的材料多次通过微流体组织解离和过滤装置10。可以使用装置10处理许多的生物材料。例如，这包括组织、组织碎片、消化的组织、未消化的组织和细胞聚集体。该组织可以是健康组织或患病组织。在一些实施例中，微流体组织解离和过滤装置10可以在上游或下游端处耦接至其他装置。例如，诸如水切碎或分支微流体装置之类的组织解离装置可以耦接在装置10的上游，其中经处理的组织通向入口14。出口18、26、38可以与一个或多个下游装置耦接，用于对已解离的细胞进一步处理或分析。
结果和讨论
装置设计
微流体组织解离和过滤装置10被设计为去除由标准酶消化程序或类似的微流体处理产生的组织碎片和细胞聚集体。这提高了用于下游诊断应用的单细胞纯度，保留的任何聚集体都可以被进一步处理以提高总体细胞回收。图1A中示出了用于实验的装置10的示意图。样品经由入口14引入，并进入与微孔过滤膜24接触。穿过过滤膜24、28的样品将通过流出物出口离开。样品的一部分也可以沿着膜24的表面被引导并通过错流出口18离开。通过允许以直接或切向过滤模式进行操作，选择这种布置以使装置的实用性最大化。在直接过滤下，所有样品都将通过膜，以最大程度地提高样品回收和处理速度。在切向流下，错流将较大的组织碎片和细胞聚集物从膜表面清除，以防止堵塞。但是，并非所有样品都会被过滤，需要多次通过才能收集全部样品。
使用商业层压方法制造微流体组织解离和过滤装置10，将通道特征(包括通道、通孔或孔)激光微加工到硬塑料(聚对苯二甲酸乙二酯，PET)中。这提供了比替代制造方法(诸如光刻和聚二甲基硅氧烷(PDMS)铸造)更坚固的装置，因此更好地支持了快速组织过滤所需的高流速和压力。由图1D至图1H可见，总共使用了七(7)个PET层12，包括两个通道层12b、12f、三个通孔层12c、12d、12e和两个用于密封装置的层12a、12g。对于图1A、图1G、图1H的双滤膜实施例，包括两个位置用于安装薄的微孔过滤膜24、28。第一位置在装置10的中心，夹在通孔层12c、12d之间，并且该过滤膜24将用于大组织碎片和细胞聚集体的切向过滤或直接过滤。假设具有较小孔的第二过滤膜28可以帮助最大化单细胞纯度。该第二过滤膜28(在那些实施方式中，诸如在图1A、图1G、图1H中使用的情况下)被放置在流出物出口26的紧邻上游，被夹在底部通道12f和通孔层12e之间，并允许直接过滤较小的聚集体和团簇。软管倒钩40安装在顶层12a中，以用作装置入口14和出口18、26。在激光微加工之后，通过使用粘合剂将各个层12和膜24、28堆叠在一起来组装装置10，然后使用压力层压将其牢固粘结。通道高度为～300μm，其中包括塑料(250括塑)和粘合剂(～50合剂)的贡献。
对于微孔过滤膜24、28，使用单层编织的网。这些都是可商购的，孔径低至5μm，可从许多供应商处购买，价格低廉，可以切割成一定尺寸的即用型薄片。
Figure BDA0002924341580000141
线可形成具有高孔密度和均匀度的刚性晶格网络，可限制背压并允许高流速通过膜。图2中示出了本文所述实验中使用的
Figure BDA0002924341580000143
网状膜的显微照片。此外，假设
Figure BDA0002924341580000142
线的截面较窄且呈圆形，对于将聚集体分解成较小的团簇甚至是单细胞是理想的。当聚集体仅比孔稍大时，人们会期望解离机制最为普遍。这是因为跨越许多孔的聚集体更可能以与传统过滤类似的方式被捕获。考虑轨迹蚀刻膜，因为它们也便宜、易于使用，并且已广泛用于单细胞和聚集体过滤研究中。然而，孔是随机分布的，因此倾向于在高孔隙率下重叠。微加工膜可精确控制孔的尺寸、形状和位置，并已用于细胞过滤和分隔。然而，定制制造增加了成本和复杂性，并且膜在高孔隙率下可能不那么耐用。因此，可以得出结论，尼龙网状膜提供了成本和性能特征的最佳组合，同时还提供了聚集体解离的潜力。
细胞系聚集体的过滤
首先研究了孔径为5、10、15、25或50μm的
Figure BDA0002924341580000151
网状膜的单细胞回收和活力。为了消除混杂效应，最初使用仅含有第一膜24的制造的装置10。该第一膜24以直流模式而不是切向流模式使用。实验是使用MCF-7人乳腺癌细胞进行的，该细胞具有很强的凝聚力，可以从标准组织培养物中获得大量聚集体。请注意，MCF-7细胞的直径约为20μm，非常大。使用注射泵使细胞悬浮液通过装置，并使用直接过滤以12.5mL/min的速度进行初始测试。装置流出物被回收，并在相差显微镜下成像，以鉴定单细胞、2至3个细胞的团簇、4至10个细胞的小聚集体以及>10个细胞的大聚集体。每个群体的回收结果绘制在图3A中。大聚集体和小聚集体分别占对照群体的10％和15％。这些百分比在过滤后根据孔径降低，对于5和10μm的孔，该百分比降低至<0.5％。单细胞最初以少于30％存在，随着孔径的减小逐渐上升，最高达到85％。除5和10μm孔径外，所有孔径的团簇均保持在40-45％左右，但即便如此，团簇仍以相当高的水平存在。
使用细胞计数器对单细胞数目进行定量，并且在通过对照归一化之后将结果绘制在图3B中。对于50μ0孔径，～15％的单细胞损失了，这很可能是由于装置10内的滞留或非特异性粘附所致。对于所有其他孔径，过滤后会回收更多的单细胞，这表明有一定百分比的聚集体和/或团簇群体被解离为单细胞。随着孔径的减小，解离变得更加明显，对于5团簇孔径，单细胞增加了5倍以上。然而，如通过使用碘化丙锭排除试验的流式细胞术所测定的，通过较小孔挤出细胞损害了活力(图3C)。具体而言，活力的损失与单细胞回收成反比。结果，对于5、10和15μ5孔径，回收的存活的单细胞数目保持恒定，比对照高约40％(见图7A至图7E)。
在仍然利用直接过滤模式的同时检查了流速的影响。发现将流速降至低至0.25mL/min导致总体趋势趋向于更低的单细胞数目和更高的活力，但是这些变化并不明显(图3D至图3E)。对于每种流速，聚集体、团簇和单细胞百分比也相似(见图7A至图7E)。最后，通过使用在抽出模式下操作的两个注射泵使样品在错流出口18和流出物出口26之间转移来研究切向过滤模式。总流速保持恒定在12.5mL/min，类似于直接过滤实验，而错流从40％更改为80％。然后，将从错流出口收集的样品以12.5mL/min的直接过滤模式通过过滤膜，并将两种流出物合并后再进行分析。发现在所有错流比下单细胞数目都相似(图3F)，其明显低于以12.5mL/min的直接过滤实验(与图3B比较)。实际上，即使所有切线实验均使用更高的膜流通速率(>2.5mL/min)，切向过滤下的单细胞数目也与0.25mL/min的直接过滤相似。发现在50μ0的孔径下，切向过滤更有效地去除了大聚集体(见图7A至图7E)。综上，得出的结论是，在压力驱动的流动下，聚集体和团簇的解离主要取决于膜的孔径和是否存在错流，而较少地取决于通过膜的流速。
使用两个膜改善聚集体解离
基于这些结果，推测可以通过使样品通过两个串联的
Figure BDA0002924341580000161
膜来增强聚集体的解离。这是因为第一膜将减小聚集体尺寸，使得第二膜可以更好地释放单个细胞。因此，使用管道将两个单膜过滤装置串联连接，并以12.5mL/min的速度进行直接过滤实验。由于解离是重点，因此以各种组合测试了较小孔径的膜。已经发现，即使对于15μm的孔径，将MCF-7悬浮液通过两个过滤装置也几乎消除了所有聚集体(图4A)。相对于单个过滤装置实验，团簇也减少了(与图3A相比)，对于5-5膜组合，团簇的含量低至9％。图4B和图4C中分别示出了单细胞数目和活力结果。相对于单个过滤装置情况(与图3B相比)，对于5-5和10-5膜组合，单细胞产量没有变化(因为样品已经很好地分离了)。
然而，15-5膜组合产生较少的单细胞，这表明15μm膜捕获了5μm膜将能够解离成单细胞的聚集体。对于10μm的膜，单过滤装置和双过滤装置实验之间的单细胞数目相似。使用两个膜是有利的唯一情况是15-15膜组合，单细胞数目的增加比对照高了50％至150％。发现细胞活力主要由第二个较小的膜的孔径决定，值类似于单个过滤装置实验(与图3C相比)。虽然观察到活力通常与单细胞数目相关，但活单细胞数在采用5μm膜的条件下最低(见图8A至8F)。因此，至少对于这些～20μm MCF-7细胞来说，5μm的孔被认为太小。对于10-10、15-10和15-15的膜组合，活单细胞回收比对照高约60％。就上下文而言，此解离级别与相同MCF-7细胞模型的分支通道解离装置的最佳版本相当。
接下来，研究10和15μm膜与较大的25和50μm膜的组合。如前所述，两个过滤装置10串联耦接，但是现在在切向过滤下进行实验。与单个过滤装置10的实验一样，总流速保持恒定在12.5mL/min，从错流出口收集的样品在直接过滤模式下通过两个装置。使用60％的错流，发现单细胞、团簇和聚集体群体与使用相同的10和15μm膜的直接流式实验相似(图4D)。然而，从50-15膜组合中回收了少量聚集体。单细胞回收和活力的结果通常也由第二个较小的膜确定(图4E和4F)。因此，10μm孔径的单细胞数目与使用一个或两个过滤装置的直接流式实验相似。对于15μm的孔径，单细胞数目与直接过滤下的15-15膜组合相似，但现在的活力明显更高，与对照相当。目前尚不清楚这种变化是否与在上游过滤装置中使用更大的孔径、切向过滤模式或两者的组合有关。总体上，除了25-15组合以外，活单细胞数目比对照大约2倍(见图8A至8F)。注意，对于使用80％错流进行的切向过滤实验，获得了几乎相同的结果(见图8A至8F)。根据使用MCF-7细胞聚集模型获得的组合结果，可以得出结论，第二膜主要决定单细胞的回收和活力，这是由于它的较小孔径以及直接过滤模式的持续利用。在某些情况下，特别是对于15μm膜，在上游放置第二膜可能会改善结果，但是第一膜的孔径和操作模式不太重要。
使用鼠肾脏组织的优化
由于最终目标是将过滤装置用于复杂的组织，因此使用鼠肾脏组织样品评估性能。使用两个串联的微流体组织解离和过滤装置10，特别是较大的25或50μ0孔径，然后是较小的10或15然后孔径。第一次过滤是在直接或切向(60％错流)模式下进行的，总流速为12.5mL/min。获得新鲜的肾脏，用解剖刀切成组织学相似的切片，切成约1mm3的小块，称重。然后按照常规方案，用胶原酶消化样品，并通过涡旋和移液进行机械处理。最初使用仅用胶原酶短暂消化的组织样品评估装置性能，因为这将证明膜堵塞和解离能力最严格的测试。消化15min后，对于所有膜组合和过滤模式，装置处理都会使单细胞数目增加至少2倍(图5A)。对于直接过滤条件下的两种25μm孔径组合和切向过滤条件下的两种50μm孔径组合，最大结果均比对照高约4倍。将消化时间增加至30min可提高所有装置条件下的单细胞回收，这些条件现在比对照高至少5倍(图5B)。不管第一膜的尺寸或操作模式如何，对于15μm孔组合，结果通常都更大，这与MCF-7聚集体模型的发现是一致的。在15min和30min的消化时间中，均观察到大块组织被第一层膜捕获(图5A)，但是对于直接或切向过滤模式而言，膜结垢都不是问题，这很可能是因为使用了相对较小的组织样品(＜100mg)。
基于这些初步结果，决定使用流式细胞仪进一步评估细胞悬浮液。具体而言，使用一组染色剂来评估细胞活力并鉴定红细胞和白细胞。此外，由于较高的孔隙率和直接过滤模式，第一装置仅使用了50μm孔径，因为它更快，更容易执行。图5C中示出了每mg组织回收的单组织细胞的数目。在15min和30min消化时间的结果类似于图5A和5B中的细胞计数器数据，其中50-10和50-15的膜组合产生的单细胞比对照多5至10倍。消化60min导致单组织细胞数目急剧增加至～20,000/mg。50-10膜组合与对照相似，但50-15膜组合使回收提高了2.5倍。值得注意的是，在消化15min后，50-15膜组合在消化15min后也产生了与对照相似数量的单组织细胞。在15min和30min消化时间点的所有条件下，细胞活力均为～90％(图5D)。但是，消化60min会使对照的活力降低到～80％，而50-15μm过滤器组合的活力降低到～75％。分散信息还用于定量相对于单细胞的聚集体百分比(图5E)。请注意，在分析之前，将样品通过35μm细胞过滤，以防止细胞仪堵塞，因此结果可能仅反映细胞团簇。聚集体百分比随对照的消化时间而逐渐增加，从3％增至11％，这表明传统的解离方法无法有效地将组织减小到单细胞。对于50-15膜组合，聚集体百分比保持不变，但是50-10膜组合在30和60min的消化时间点使聚集体减少了约一半。图9A至图9D中示出了红细胞和白细胞的回收，并紧密反映了图5C中单组织细胞的回收结果。
使用鼠器官及肿瘤组织的过滤装置集成和验证
基于50-15膜组合在从肾脏样品中回收的单组织细胞方面的优越性能，制造了一个含有两个膜24、28的单个微流体组织解离和过滤装置10，如图1A、图1G、图1H所示。首先使用消化60min的鼠肾脏样品来验证双膜装置10，并且在单组织细胞回收和活力方面的表现与通过串联耦接的两个单过滤装置获得的先前结果相当(见图9A至9D)。测试了新鲜切除的鼠肝脏样品，这些样品通常易于酶消化，但众所周知，肝细胞也很脆弱。短暂消化15min后，每mg肝脏组织获得约2500个单组织细胞作为对照，并且通过过滤装置处理使其增强了5倍(图6A)。在30min时，对照的单组织细胞增加了2倍，但装置处理保持不变，从而导致了较适度的2倍改善。消化60min后，对照条件和装置条件均更高，约为40000个单组织细胞/mg，表明肝脏组织已被酶消化完全分解。在所有条件下活力均保持大于90％(图6B)，考虑到肝细胞的脆弱性，这非常令人鼓舞。在所有消化时间，对照的聚集体含量均为～1％，尽管差异不显著，但通常通过装置处理使其降低(图6C)。作为最终评估，使用了在MMTV-PyMT转基因小鼠中自发出现的乳腺肿瘤。由于其异常的细胞外基质组成，通常认为肿瘤是最难解离的上皮组织。对于这些测试，通过添加对一般上皮标记EpCAM特异的抗体来对流式细胞术检测板进行修改。尽管可以同时包括正常细胞和肿瘤细胞，但这可以对上皮组织细胞进行阳性鉴定。对照条件在15和30min的消化时间点每mg肿瘤组织产生约1,000个单上皮细胞，并且在消化60min后仅增加到～2000个细胞/mg(图6D)。装置处理在所有时间点都使单细胞回收提高了约3倍。在所有条件下，上皮细胞活力仅为约40-50％(图6E)，可能表明肿瘤样品含有高度坏死的区域。在所有条件下都存在大量的聚集体，占总回收群体的15-20％(图6F)。这表明需要更多的解离能力以有效地从肿瘤释放所有细胞。对于肝脏和肿瘤样品，红细胞和白细胞的回收都遵循与单肝脏组织细胞和单上皮细胞数据相似的趋势(见图10A至10D)。
公开了一种新的微流体组织解离和过滤装置10，该装置简单且便宜，但是还可以快速有效地提高从消化的组织样品中获得的单细胞悬液的质量。这是使用具有清晰的微米级孔的
Figure BDA0002924341580000201
网状膜完成的，该孔可同时过滤较大的组织碎片并将较小的聚集体解离为单细胞。具体而言，证明了使用两个
Figure BDA0002924341580000202
网状膜；具有在25-50μm范围内的较大孔径的第一过滤膜24，然后具有在10-15μm范围内的较小孔径的第二过滤膜28，将聚集体解离成逐渐变小的尺寸，最终增强单细胞回收。解离作用可能是由于流体动力剪切力以及与
Figure BDA0002924341580000203
线的物理相互作用的结合。尽管这是有效的，但请注意必须留意防止细胞受损，特别是对于可能含有不同尺寸细胞的复杂组织。使用最终的双膜微流体组织解离和过滤装置10，在各自的过滤膜24、28中分别有50和15μm的孔径，通过切碎和消化的鼠肾脏、肝脏和肿瘤组织样品回收的单细胞数目增加至少3倍，有时超过10倍。此外，研究表明，短暂的15min消化和过滤装置处理可以产生与完全60min消化相当的单细胞数量，这具有令人兴奋的潜力，可以加速组织加工工作流程并保持细胞的自然表型状态。重要的是，对于所有组织类型和操作条件，甚至对于脆弱的肝脏细胞，都保持了细胞活力。
该设计还包括在切向模式下执行第一过滤(例如，使用过滤膜24)的选项，尽管发现这对于产生单细胞不是至关重要的。请注意，如果组织尺寸扩大到100mg以上，则切向过滤可能会变得更加重要。而且，微流体组织解离和过滤装置10可以与诸如在美国专利申请公开号2019/0070605中公开的那样的水切酶切消化装置集成，该文通过引用并入本文，以实现cm级组织样品的自动处理。微流体组织解离和过滤装置10也可以与分支通道解离装置集成在一起，诸如美国专利号9,580,678中公开的那样，以最大程度地增加单细胞的数目和纯度。该集成平台将能够以快速有效的方式处理完整的组织样品，直至单细胞的高纯度悬浮液。此外，微流体组织解离和过滤装置10可以与下游技术集成在一起，以实现单细胞的芯片上分选和分析，从而为组织样品创建即时诊断平台。
还应当理解，本发明不必限于具有两个过滤膜24、28。在一些实施例中，可能仅需要单个过滤膜24。另外，即使装置10可以具有多个过滤膜(例如24、28、32)，也可以分流流体以避免位于装置10中的一个或多个过滤膜。这可以通过堵塞或阻塞出口18、26、38之一中的流动来实现。类似地，微流体组织解离和过滤装置10的其他实施例可以具有两个以上的过滤，诸如图1C所示的实施例。
实验
装置制造。微流体装置是由ALine(阿莱)公司(加利福尼亚州多明格斯农场(Rancho Dominguez))制造的。简而言之，使用CO2激光将流体通道、通孔以及用于膜和软管倒钩的开口蚀刻到聚对苯二甲酸乙二酯(PET)层中。
Figure BDA0002924341580000211
网状膜购自Amazon SmallParts(亚马逊小部)(孔径分别为10、15、25和50μm；华盛顿州西雅图)或EMD Millipore(EMD默克)(5μm；马萨诸塞州伯灵顿)，为大的薄片，并使用CO2激光切割成一定尺寸。然后组装装置层、
Figure BDA0002924341580000212
网状膜和软管倒钩，使用粘合剂粘结，并加压层压以形成单个整体式装置10。
细胞培养物聚集体模型和鼠组织样品。MCF-7人乳腺癌细胞系购自ATCC(马纳萨斯(Manassas)，弗吉尼亚州)。使用含有10％FBS、非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、2mM L-谷氨酰胺、100μ0/mL链霉素、100U/mL青霉素和44U/L Novolin(诺和灵)R胰岛素的DMEM培养基(Thermo Fisher(赛默飞世尔)，沃尔瑟姆(Waltham)，马萨诸塞州)在组织培养瓶中于37℃和5％CO2培养细胞。在实验之前，用胰蛋白酶-EDTA将融合的单层膜短暂消化5min，从而释放出具有大量聚集体的细胞。然后将细胞悬浮液离心并重悬于含有1％BSA的PBS(PBS+)中。从刚处死的BALB/c或C57B/6小鼠(杰克逊实验室，巴尔港(Bar Harbor)，缅因州)获得肾脏和肝脏，这些小鼠确定为来自经加利福尼亚大学尔湾市机构动物护理和使用委员会批准的一项研究的废物(由安吉拉G.弗莱施曼(Angela G.Fleischman)博士提供)。从刚处死的MMTV-PyMT小鼠(杰克逊实验室，巴尔港，缅因州)中获得乳腺肿瘤。对于肾脏，使用手术刀准备约1cm长×约1mm直径的组织条，每个条都含有髓质和皮质的组织学相似部分。然后用手术刀将每个组织条进一步切碎至～1mm3块。用手术刀将肝脏和乳腺肿瘤均匀切碎至～1mm3。然后将切碎的组织样品称重，与300μL的0.25％I型胶原酶(干细胞技术，不列颠哥伦比亚省温哥华)一起放入微量离心管中，在振荡式培养箱中于37℃在温和搅拌下消化15、30或60min，并通过反复移液和涡旋机械解聚。最后，用100单位的DNase I(脱氧核糖核酸酶I)(罗氏(Roche)，印第安纳波利斯，印第安纳州)将细胞悬浮液在37℃下处理10min，并通过离心至PBS+中进行洗涤。
解离和过滤研究。通过将0.05”ID的管路(圣戈班(Saint-Gobain)，马尔文(Malvern)，宾夕法尼亚州)固定在装置的入口和出口软管倒钩上来制备微流体过滤装置。实验之前，将装置与超级块(SuperBlock)(PBS)封闭缓冲液(赛默飞世尔科学，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)在室温下孵育15min，以减少细胞与膜和通道壁的非特异性结合，并用PBS+洗涤。将MCF-7细胞或消化的鼠组织样品装入注射器中，并使用注射泵(哈佛仪器，霍利斯顿，马萨诸塞州)以0.25至12.5mL/min的总流速通过该装置。对于切向过滤实验，以抽出模式使用两个注射泵，每个注射泵连接到错流出口和流出出口。调节抽出速率以达到给定的错流流速，而总流速始终保持在12.5mL/min。初次通过后，将从错流出口收集的样品以12.5mL/min的速度直接通过膜，并从流出物出口收集。在所有实验之后，用1mL PBS+洗涤装置以冲洗掉所有剩余的细胞，并将所有流出物合并为一个样品。使用Moxi Z自动细胞计数器和S型盒(Orflo(奥斐罗)，黑利(Hailey)，爱达荷州)获得细胞计数。
通过显微镜定量细胞聚集体。通过显微镜评估单细胞和聚集体。简而言之，MCF-7细胞悬液用霍夫曼相衬显微镜和4倍物镜成像。然后使用MATLAB将原始图像转换为二进制图像，并使用ImageJ(图像J)识别、勾勒和计算所有连续细胞单元的面积。然后根据面积将每个单元分类为单细胞(20至80像素2或75至300μm2)、团簇(80至200像素2或300至750μm2)、小聚集体(200至300像素2或750至1120μm2)、或大聚集体(>300像素2或>1120μm2)。回到显微照片，团簇相当于～2至3个细胞，小聚集体相当于～4至10个细胞，大聚集体相当于>10个细胞。
流式细胞仪。遵循先前为组织悬浮液开发的流式细胞术方案。简而言之，将细胞悬液与2.5μg/mL抗小鼠CD45-PE单克隆抗体(克隆30-F11，BioLegend(生物传奇)，圣地亚哥，加利福尼亚州)和0.5X CellMask Green(绿色细胞面罩)(赛默飞世尔，沃尔瑟姆，马萨诸塞州)在37℃下共染色20min。然后将样品使用PBS+离心洗涤两次，与5μ/mL 7-AAD(BDBiosciences(BD生物科学)，圣何塞，加利福尼亚州)和12.5μ2DRAQ5(BioLegend)在冰上共染色至少15min，并在Accuri C6流式细胞仪(BD Biosciences)上进行分析。使用FlowJo软件(FlowJo，俄勒冈州阿什兰)对流式细胞仪数据进行补偿和分析，并使用顺序门控方案从白细胞、红细胞、非细胞碎片和细胞聚集体中鉴定活的和死的单组织细胞。
统计。数据表示为平均值±标准误差。误差棒代表来自至少三个独立实验的标准误差。使用标准t检验从至少三个独立实验中计算出P值。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，但是在不脱离本发明的范围的情况下可以进行各种修改。例如，微流体组织解离和过滤装置10已经被图示为包括一个、两个或三个过滤膜24、28、32。在其他实施例中，可以使用附加的过滤膜(例如4、5、6、7、8、9、10个等)。同样，在另一个替代实施例中，在其他实施例中，可以关闭或完全省略用于收集错流溶液(其不直接通过过滤膜)的出口16。因此，除了以下权利要求及其等同物之外，本发明不应受到限制。

Claims (21)

1.一种微流体组织解离和过滤装置，包括：
入口，在上游位置处耦接至第一微流体通道，所述第一微流体通道在下游位置处耦接至第一出口；
第一过滤膜，介于所述第一微流体通道和第二微流体通道之间，其中，所述第二微流体通道经由所述第一过滤膜与所述第一微流体通道流体连通；以及
第二出口，耦接至所述第二微流体通道的下游位置。
2.根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜的孔径在约10μm至约1000μm的范围内。
3.根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜的孔径在约5μm至约100μm的范围内。
4.根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述微流体组织解离和过滤装置包括由多个层形成的层压结构，其中，所述第一微流体通道和所述第二微流体通道形成在不同的层中。
5.根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置，还包括泵，所述泵耦接至所述入口、所述第一出口和所述第二出口中的一个或多个。
6.根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜包括单层的编织网状聚合物线。
7.根据权利要求6所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜由聚酰胺线形成。
8.一种微流体组织解离和过滤装置，包括：
入口，在上游位置处耦接至第一微流体通道，所述第一微流体通道在下游位置处耦接至第一出口，其中，所述第一微流体通道设置在所述微流体组织解离和过滤装置的第一层中；
第二微流体通道，位于所述微流体组织解离和过滤装置的第二层中；
第一过滤膜，介于所述第一微流体通道和所述第二微流体通道之间，其中，所述第二微流体通道通过连接通路与所述第一微流体通道流体连通，所述连接通路容纳所述第一过滤膜；
第二出口，耦接至所述第二微流体通道的下游位置；以及
第二过滤膜，介于所述第二出口和所述第二微流体通道之间。
9.根据权利要求8所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜包括直径为d1的孔，并且其中，所述第二过滤膜包括直径为d2的孔，其中，d1＞d2。
10.根据权利要求9所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜的孔径为约50μm，而所述第二过滤膜的孔径为约15μm。
11.根据权利要求9所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜具有的孔径大于15μm且小于1000μm，而所述第二过滤膜的孔径大于5μm且小于或等于100μm。
12.根据权利要求11所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述连接通路形成在第三层中或更多个附加层中。
13.根据权利要求8所述的微流体组织解离和过滤装置，还包括泵，所述泵耦接至所述入口、所述第一出口和所述第二出口中的一个或多个。
14.根据权利要求8所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜和所述第二过滤膜包括单层的编织网状聚合物线。
15.根据权利要求14所述的微流体组织解离和过滤装置，其中，所述第一过滤膜和所述第二过滤膜由聚酰胺线形成。
16.一种使用根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置的方法，所述方法包括：使含有切碎的组织样品的溶液流入到所述入口中。
17.一种使用根据权利要求8所述的微流体组织解离和过滤装置的方法，所述方法包括：使含有切碎的组织样品的溶液流入到所述入口中。
18.使用根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置的方法，其中，所述第一出口的输出物被再循环到所述入口。
19.使用根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置的方法，其中，来自所述第一出口和所述第二出口中的至少一个出口的输出物包括活细胞。
20.使用根据权利要求1所述的微流体组织解离和过滤装置的方法，其中，来自所述第一出口和所述第二出口中的至少一个出口的输出物包括活细胞。
21.一种微流体组织解离和过滤装置，包括：
入口，在上游位置处耦接至第一微流体通道，所述第一微流体通道在下游位置处耦接至第一出口，其中，所述第一微流体通道设置在所述微流体组织解离和过滤装置的第一层中；
第二微流体通道，位于所述微流体组织解离和过滤装置的第二层中；
第一过滤膜，介于所述第一微流体通道和所述第二微流体通道之间，其中，所述第二微流体通道通过连接通路与所述第一微流体通道流体连通，所述连接通路容纳所述第一过滤膜；
第二出口，耦接至所述第二微流体通道的下游位置；
第二过滤膜，介于所述第二出口和所述第二微流体通道之间；以及
一个或多个附加的微流体通道，设置在所述微流体组织解离和过滤装置的不同层中，其中，所述一个或多个附加的微流体通道中的每一个微流体通道均具有与该微流体通道耦接的相应的出口以及介于相邻的微流体通道之间的相应的过滤膜。
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