KR20190009810A - 세포 현탁액의 막분리 방법 및 세포 배양 장치 - Google Patents
세포 현탁액의 막분리 방법 및 세포 배양 장치 Download PDFInfo
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- C12N2509/10—Mechanical dissociation
Abstract
본 개시는, 세포와 데브리스를 적절히 분리할 수 있는 세포 현탁액의 막분리 방법 및 세포 배양 장치를 제공한다. 즉, 한쪽 면에 형성된 입측의 개구와, 다른 쪽 면에 형성되고 또한 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구를 가지며, 입측의 개구와 출측의 개구가 막면과 평행한 방향에 있어서 어긋난 위치에 배치되어 있는 여과막을 이용하여, 세포 현탁액의 막분리 처리를 행한다.
Description
본 개시는, 세포 현탁액의 막분리 방법 및 세포 배양 장치에 관한 것이다.
필터를 이용한 세포 현탁액의 막분리 처리에 관한 기술로서, 이하의 기술이 알려져 있다. 예를 들면, 일본 공개특허공보 2013-042689호에는, 복수의 관통공이 형성된 금속 기판으로 이루어지고, 관통공의 개구 형상이, 단변의 길이가 5.0μm~15.0μm인 직사각형 또는 모서리가 둥근 직사각형인 암세포 농축 필터를 이용하여 혈중 순환 암세포를 포획하는 것이 기재되어 있다.
또, 일본 공개특허공보 2015-087382호에는, 단축 직경이 3.0μm 이상 15μm 이하이고, 장축 직경이, 단축 직경에 대하여 1.1배~3배인 타원형의 구멍을, 200개/mm2~40000개/mm2의 구멍 밀도로 포함하는 필터를 이용하여, 필터의 구멍에 대한 필터 처리 용량이 혈액으로 환산하여 6μl/구멍 이하가 되도록 혈액 검체를 필터 처리하여 희소 세포를 분리하는 것이 기재되어 있다.
세포의 배양에 있어서는, 배양 기간 중에 실시되는 배지 교환 처리 등에 있어서, 세포 현탁액으로부터, 죽은 세포, 세포 파쇄물, 세포 분비물 등의 데브리스를 복수의 개구를 갖는 여과막(필터)을 이용하여 제거하는 막분리 처리가 실시되고 있다. 그러나, 종래의 여과막을 이용한 막분리 처리에서는, 데브리스에 의하여 여과막의 개구가 폐색하는 막힘이 발생하여, 데브리스를 적절히 배출할 수 없을 가능성이 있었다. 또, 여과막에 막힘이 발생하면, 여과막에 접촉하는 세포 현탁액의 압력이 상승하여, 세포에 데미지를 줄 가능성이 있다. 여과막의 막힘을 방지하기 위하여 여과막의 개구 직경을 크게 하면, 회수해야 할 세포도 데브리스와 함께 여과막을 투과해 버린다.
또, 배성 줄기 세포(ES 세포: Embryonic Stem cell), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포: Induced pluripotent stem cell) 등의, 스피어로 불리는 세포의 응집체(이하, 세포 응집체라고 함)를 형성하는 세포에 있어서는, 죽은 세포, 세포 파쇄물, 세포 분비물 등의 데브리스 및 단일 세포(싱글 셀)를 복수의 개구를 갖는 여과막(필터)을 이용하여 제거하는 막분리 처리가 실시되고 있다. 그러나, 종래의 여과막을 이용한 막분리 처리에서는, 데브리스 및 단일 세포에 의하여 여과막의 개구가 폐색하는 막힘이 발생하여, 데브리스 및 단일 세포를 적절히 배출할 수 없을 가능성이 있었다. 또, 여과막에 막힘이 발생하면, 여과막에 접촉하는 세포 현탁액의 압력이 상승하여, 세포에 데미지를 줄 우려가 있다. 여과막의 막힘을 방지하기 위하여 여과막의 개구 직경을 크게 하면, 회수해야 할 세포 응집체도 데브리스 및 단일 세포와 함께 여과막을 투과해 버린다.
본 개시는, 세포 응집체와, 세포 응집체의 직경보다 작은 직경의 단일 세포 및 데브리스(죽은 세포, 세포 파쇄물, 세포 분비물 등)를 적절히 분리할 수 있는 세포 현탁액의 막분리 방법 및 세포 배양 장치를 제공한다.
또, 본 개시는, 단일 세포와, 단일 세포의 직경보다 작은 직경의 데브리스(죽은 세포, 세포 파쇄물, 세포의 분비물 등)를 적절히 분리할 수 있는 세포 현탁액의 막분리 방법 및 세포 배양 장치를 제공한다.
본 개시에 관한 제1 양태는, 세포 현탁액의 막분리 방법으로서, 제1 면에 형성된 입측(入側)의 개구와, 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 입측의 개구와 연통하는 출측(出側)의 개구를 가지며, 입측의 개구와 출측의 개구가 막면과 평행한 방향에 있어서 어긋난 위치에 배치되어 있는 여과막을 이용하여, 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 것을 포함한다.
본 개시에 관한 제2 양태는, 세포 현탁액의 막분리 방법으로서, 제1 면에 형성된 입측의 개구와, 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구를 가지며, 입측의 개구와 출측의 개구를 접속하는 경로가 비직선 형상인 여과막을 이용하여, 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 것을 포함한다.
본 개시에 관한 제3 양태는, 상기 양태에 있어서, 세포 현탁액이 세포 응집체, 단일 세포 및 데브리스를 포함하는 경우, 본 개시에 관한 막분리 방법은, 막분리 처리에 있어서 세포 응집체와, 단일 세포 및 데브리스를 여과막을 이용하여 분리하는 것을 포함하고 있어도 된다.
본 개시에 관한 제4 양태는, 상기 양태에 있어서, 세포 현탁액이, 단일 세포 및 데브리스를 포함하는 경우, 본 개시에 관한 막분리 방법은, 막분리 처리에 있어서, 단일 세포와 데브리스를 여과막을 이용하여 분리하는 것을 포함하고 있어도 된다.
본 개시에 관한 제5 양태는, 상기 제3 양태에 있어서, 여과막의 입측의 개구의 직경이, 세포 응집체의 직경의 0.01배 이상 3배 이하인 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제6 양태는, 상기 제4 양태에 있어서, 단일 세포가 인간 유래 세포인 경우, 여과막의 입측의 개구의 직경이, 단일 세포의 직경의 0.05배 이상 0.8배 이하인 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제7 양태는, 상기 제4 양태에 있어서, 단일 세포가 비인간 세포인 경우, 여과막의 입측의 개구의 직경이, 단일 세포의 직경의 0.1배 이상 2배 이하인 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제8 양태는, 상기 제4 양태, 제7 양태에 있어서, 단일 세포가 비인간 세포인 경우, 여과막의 개구 직경 분포의 평균값을 X, 표준 편차를 σ로 했을 때, 0<σ/X≤0.1을 충족시키는 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제9 양태는, 상기 제4 양태, 제7 양태, 제8 양태에 있어서, 단일 세포가 비인간 세포인 경우, 여과막의 막두께는 150μm 이하인 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제10 양태는, 상기 제4 양태, 제7 양태 내지 제9 양태에 있어서, 단일 세포가 비인간 세포인 경우, 여과막의 제1 면에 가해지는 게이지압이 -70킬로파스칼 이상 70킬로파스칼 이하인 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제11 양태는, 상기 제4 양태, 제7 양태 내지 제10 양태에 있어서, 단일 세포가 비인간 세포인 경우, 여과막을 투과한 여액에 포함되는 단일 세포의 개수 밀도가, 여과막을 투과하기 전의 세포 현탁액에 포함되는 단일 세포의 개수 밀도의 50% 이하인 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제12 양태는, 상기 제4 양태, 제7 양태 내지 제11 양태에 있어서, 단일 세포가 비인간 세포인 경우, 여과막을 투과한 여액에 포함되는, 단일 세포의 직경의 1/10 이상 1/2 이하의 직경의 데브리스의 개수 밀도가, 여과막을 투과하기 전의 세포 현탁액에 포함되는, 단일 세포의 직경의 1/10 이상 1/2 이하의 직경의 데브리스의 개수 밀도의 50% 이상 100% 이하인 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제13 양태는, 상기 제4 양태, 제7 양태 내지 제12 양태에 있어서, 단일 세포가 비인간 세포인 경우, 단일 세포의 직경이 5μm 이상 25μm 이하인 것이 바람직하다.
본 개시에 관한 제14 양태는, 상기 제4 양태, 제7 양태 내지 제13 양태에 있어서, 단일 세포는, CHO 세포여도 된다.
본 개시에 관한 제15 양태는, 상기 제3 양태에 있어서, 세포 응집체는 인간 유래 세포의 응집체이며, 단일 세포는 인간 유래 세포여도 된다.
본 개시에 관한 제16 양태 내지 제19 양태는, 상기 제6 양태, 제15 양태에 있어서, 세포 응집체 또는 단일 세포가 인간 유래 세포를 포함하는 경우, 인간 유래 세포는 줄기 세포 또는 거핵구여도 된다.
본 개시에 관한 제20 양태는, 상기 양태에 있어서, 여과막의 제1 면에 가해지는 압력과, 여과막의 제2 면에 가해지는 압력의 차를 0.01킬로파스칼 이상 60킬로파스칼 이하로 하여 막분리 처리를 행하는 것을 포함하고 있어도 된다.
본 개시에 관한 제21 양태는, 상기 양태에 있어서, 표면에 친수화 처리가 실시된 여과막을 이용하여 막분리 처리를 행하는 것을 포함하고 있어도 된다.
본 개시에 관한 제22 양태는, 상기 양태에 있어서, 여과막은, 섬유 형상 부재를 능첩직하여 형성된 메시를 포함하여 구성되어 있어도 된다. 또, 본 개시에 관한 제23 양태에 있어서, 메시는, 금속을 포함하여 구성되어 있어도 된다.
본 개시에 관한 제24 양태는, 상기 제1 양태 내지 제21 양태에 있어서, 각각이 관통공을 갖는 복수의 메시를, 관통공의 위치를 여과막의 막면과 평행한 방향으로 서로 어긋나게 하여 적층하여 구성된 여과막을 적합하게 이용할 수 있다. 또, 본 개시에 관한 제23 양태에 있어서, 복수의 메시는, 금속을 포함하여 구성되어 있어도 된다.
본 개시에 관한 제25 양태는, 상기 양태에 있어서, 세포 현탁액을, 여과막의 막면의 방향을 따라 흐르게 하여 막분리 처리를 행하는 것을 포함하고 있어도 된다. 본 개시에 관한 제26 양태는, 상기 제25 양태에 있어서, 세포 현탁액을, 여과막의 막면을 따라 왕복 이동시켜도 된다.
본 개시에 관한 제27 양태는, 막분리 방법으로서, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 제1 면에 형성된 입측의 개구와, 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구가 막면과 평행한 방향에 있어서 어긋난 위치에 배치되어 있는 여과막을 가지며, 배양 용기에서 배양된 세포가 유통하는 유로를 개재하여 배양 용기에 접속된 여과부를 포함하는 세포 배양 장치의 여과막을 이용하여 배양 용기로부터 공급된 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 것이며, 배양 용기 내의 세포 현탁액의 액량을 L로 하고, 막분리 처리에 있어서 여과막을 투과한 여액의 1일당 액량을 N으로 했을 때, 0.1≤N/L≤6을 충족시키도록 막분리 처리를 행한다고 하는 것이다.
본 개시에 관한 제28 양태는, 세포 배양 장치로서, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배양 용기에서 배양된 세포가 유통하는 유로를 개재하여 배양 용기에 접속된 여과부를 포함한다. 여과부는, 제1 면에 형성된 입측의 개구와, 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구를 갖는 여과막을 구비한다. 여과막에 있어서, 입측의 개구와 출측의 개구가 여과막의 막면과 평행한 방향에 있어서 어긋난 위치에 배치되어 있다.
본 개시에 관한 제29 양태는, 세포 배양 장치로서, 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 배양 용기에서 배양된 세포가 유통하는 유로를 개재하여 배양 용기에 접속된 여과부를 포함한다. 여과부는, 제1 면에 형성된 입측의 개구와, 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구를 갖는 여과막을 구비한다. 여과막에 있어서, 입측의 개구와 출측의 개구를 접속하는 경로가 비직선 형상이다.
본 개시에 관한 제30 양태는, 상기 제28 양태, 제29 양태에 있어서, 여과막의 표면에는, 친수화 처리가 실시되어 있어도 된다.
본 개시에 관한 제31 양태는, 상기 제28 양태 내지 제30 양태에 있어서, 여과막이, 섬유 형상 부재를 능첩직하여 형성된 메시를 포함하여 구성되어 있어도 된다.
본 개시에 관한 제32 양태는, 상기 제28 양태 내지 제30 양태에 있어서, 여과막이, 관통공을 갖는 복수의 메시를, 관통공의 위치를 여과막의 막면과 평행한 방향으로 서로 어긋나게 하여 적층하여 구성되어 있어도 된다.
본 개시의 상기 양태에 의하면, 세포에 주는 데미지를 경감하면서, 세포 응집체와, 세포 응집체의 직경보다 작은 직경의 단일 세포 및 데브리스(죽은 세포, 세포 파쇄물, 세포의 노폐물 및 세포로부터 분비된 단백질 등)를 분리하는 것이 가능해진다.
또, 본 개시에 상기 양태에 의하면, 세포에 주는 데미지를 경감하면서, 단일 세포와, 단일 세포의 직경보다 작은 직경의 데브리스(죽은 세포, 세포 파쇄물, 세포의 노폐물 및 세포로부터 분비된 단백질 등)를 분리하는 것이 가능해진다.
도 1은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 여과 장치의 모식적인 구성을 나타내는 도이다.
도 2는 본 예시적 실시형태에 관한 여과막의 전형적인 구조를 나타내는 단면도이다.
도 3a는 본 예시적 실시형태에 관한 여과막에 적합하게 이용할 수 있는 능첩직 메시의 구조를 나타내는 사시도이다.
도 3b는 능첩직 메시의 개구를 확대하여 나타내는 사시도이다.
도 3c는 능첩직 메시를 투과하는 유체의 흐름을 나타내는 도이다.
도 4는 본 예시적 실시형태에 관한 여과막에 적합하게 이용할 수 있는 적층 메시의 구조를 나타내는 도이다.
도 5는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 여과막의 막면 차압을 제어하는 제어계의 구성의 일례를 나타내는 도이다.
도 6은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 현탁액의 막분리 방법의 일례를 나타내는 플로차트이다.
도 7은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 현탁액의 막분리 방법의 일례를 나타내는 플로차트이다.
도 8은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 현탁액의 막분리 방법의 일례를 나타내는 플로차트이다.
도 9는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 여과 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 10은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 여과 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 11은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 12는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 계대 처리를 실시하는 경우에 있어서의, 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 13은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 배지 교환 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 14는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 분할 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 15는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 동결 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 16은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 제어부가 실행하는 세포 배양 프로그램에 있어서의 처리의 흐름을 나타내는 플로차트이다.
도 17은 본 개시의 다른 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 구성의 일례를 나타내는 도이다.
도 18a는 막분리 처리 전의 세포 현탁액의 현미경 사진이다.
도 18b는 표 1에 있어서의 실시예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 세포 현탁액의 현미경 사진이다.
도 18c는 표 1에 있어서의 실시예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 투과 측에 배출된 여액의 현미경 사진이다.
도 18d는 표 1에 있어서의 비교예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 투과 측에 배출된 여액의 현미경 사진이다.
도 2는 본 예시적 실시형태에 관한 여과막의 전형적인 구조를 나타내는 단면도이다.
도 3a는 본 예시적 실시형태에 관한 여과막에 적합하게 이용할 수 있는 능첩직 메시의 구조를 나타내는 사시도이다.
도 3b는 능첩직 메시의 개구를 확대하여 나타내는 사시도이다.
도 3c는 능첩직 메시를 투과하는 유체의 흐름을 나타내는 도이다.
도 4는 본 예시적 실시형태에 관한 여과막에 적합하게 이용할 수 있는 적층 메시의 구조를 나타내는 도이다.
도 5는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 여과막의 막면 차압을 제어하는 제어계의 구성의 일례를 나타내는 도이다.
도 6은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 현탁액의 막분리 방법의 일례를 나타내는 플로차트이다.
도 7은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 현탁액의 막분리 방법의 일례를 나타내는 플로차트이다.
도 8은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 현탁액의 막분리 방법의 일례를 나타내는 플로차트이다.
도 9는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 여과 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 10은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 여과 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 11은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 구성을 나타내는 도이다.
도 12는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 계대 처리를 실시하는 경우에 있어서의, 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 13은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 배지 교환 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 14는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 분할 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 15는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치가 동결 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다.
도 16은 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 제어부가 실행하는 세포 배양 프로그램에 있어서의 처리의 흐름을 나타내는 플로차트이다.
도 17은 본 개시의 다른 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치의 구성의 일례를 나타내는 도이다.
도 18a는 막분리 처리 전의 세포 현탁액의 현미경 사진이다.
도 18b는 표 1에 있어서의 실시예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 세포 현탁액의 현미경 사진이다.
도 18c는 표 1에 있어서의 실시예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 투과 측에 배출된 여액의 현미경 사진이다.
도 18d는 표 1에 있어서의 비교예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 투과 측에 배출된 여액의 현미경 사진이다.
이하, 본 개시의 예시적 실시형태의 일례를 도면을 참조하면서 설명한다. 또한, 각 도면에 있어서 동일 또는 등가의 구성 요소 및 부분에는 동일한 참조 부호를 붙여, 중복되는 설명은 생략한다.
[제1 예시적 실시형태]
본 개시의 예시적 실시형태에 관한 막분리 방법에 의하여 막분리 처리가 행해지는 대상은, 예를 들면, 단일 세포 및 세포의 응집체 중 적어도 한쪽을 포함하는 세포 현탁액이다.
"세포"로서는, 배양에 적합하면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 동물 세포, 곤충 세포, 효모 등을 들 수 있다. 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 막분리 방법이 적용되는 세포로서는, 인간 세포 또는 비인간 동물 세포가 바람직하다.
"인간 세포"로서는, 인간 유래의 세포 또는 조직이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 인간 외배엽계 세포, 인간 중배엽계 세포, 인간 내배엽계 세포, 인간 수정란으로부터 이들 세포로 분화하는 과정에 포함되는 세포, 인간 배성 줄기 세포 및 인간 체성 줄기 세포를 들 수 있다. 구체적인 예로서, 예를 들면, 인간 유래의, 근아 세포; (골수, 지방 조직, 말초혈, 피부, 모근, 근조직, 자궁 내막, 태반, 제대혈 유래의) 간엽 줄기 세포; 심근 세포; 섬유아 세포; 심장 줄기 세포; 배성 줄기 세포(ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포), Muse 세포(Multilineage-differentiating Stress Enduring Cell), 배성 종양 세포(EC 세포: Embryonal Carcinoma cell) 및 배성 생식 줄기 세포(EG 세포: Embryonic Germ Cell) 등의 다능성 줄기 세포; 다능성 줄기 세포 유래의 세포; 비점막 상피 세포; 망막 색소 상피 세포; 활막 세포; 연골 세포; 간(肝) 세포; 신장 세포; 부신(副腎) 세포; 췌도(膵島) 세포 등의 췌장 세포; 구강 점막 상피 세포 및 내피 세포 등의 상피 세포; 치근막 세포; 잇몸 세포; 골막 세포; 피부 세포; 거핵구 등의 조혈계 세포; 혈소판 등의 혈구 세포 등을 들 수 있으며, 다능성 줄기 세포, 다능성 줄기 세포 유래의 세포, 거핵구 및 혈소판이 바람직하고, 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포)가 보다 바람직하다.
"다능성 줄기 세포 유래의 세포"로서는, 다능성 줄기 세포에서 유래하는 세포이면 한정되지 않지만, 예를 들면, 분화 세포를 들 수 있다. "분화 세포"란, 다능성 줄기 세포가 분화하여 발생한 특정의 기능적 또는 형태적 특징을 갖는 낭세포를 의미한다. 분화 세포는 통상 안정되어 있으며, 그 증식능이 낮아, 다른 타입의 세포로 분화하는 것은 예외적으로밖에 일어나지 않는다.
"비인간 동물 세포"로서는, 인간 이외의 동물 세포이면 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 차이니즈 햄스터 난소 유래의 CHO 세포; 베이비 햄스터 신장 유래의 BHK 세포; 인간 자궁 경부암 유래의 HeLa 세포; 마우스 유방암 유래의 C-127 세포; 마우스 섬유아 세포인 NIH/3T3, BALB3T3; 아프리카 녹색 원숭이 신장 유래의 VerotsS3 세포; 마우스 세포주 NS0(ATCC CRL-1827), SP2/0(ATCC CRL-1581); 마우스 미엘로마 유래의 SP2/0-Ag14 세포; 래트 미엘로마 유래의 Y3 Ag1.2.3. 세포(ATCC CRL-1631), YO 세포(ECACC No: 85110501), YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포, YB2/0 세포(ATCC CRL-1662); 시리안 햄스터 신장 조직 유래의 BHK-21 세포(ATCC CCL-10), MDCK(ATCC CCL-34) 등을 들 수 있으며, CHO 세포, BHK-21 세포 및 SP2/0-Ag14 세포가 바람직하고, CHO 세포가 보다 바람직하다.
본 개시의 예시적 실시형태에 관한 막분리 방법을 세포 응집체와, 단일 세포 및 데브리스의 분리에 이용하는 경우에는, 인간 세포가 바람직하고, 인간 유래의 다능성 줄기 세포 및 인간 유래의 다능성 줄기 세포 유래의 세포가 보다 바람직하며, 인간 유래의 인공 다능성 줄기 세포(hiPS 세포)가 더 바람직하다.
본 개시의 예시적 실시형태에 관한 막분리 방법을 단일 세포와, 데브리스의 분리에 이용하는 경우에는, 인간 세포 또는 비인간 세포가 바람직하고, 인간 유래의 인공 다능성 줄기 세포(hiPS 세포), 거핵구, 혈소판, CHO 세포, BHK-21 세포 및 SP2/0-Ag14 세포가 바람직하다. 다른 양태에 있어서는, 비인간 세포가 바람직하고, CHO 세포, BHK-21 세포 및 SP2/0-Ag14 세포가 보다 바람직하며, CHO 세포가 더 바람직하다.
본 개시의 예시적 실시형태에 관한 막분리 방법은, 거핵구(단일 세포)와, 거핵구의 분비물인 혈소판(데브리스)의 분리에 이용할 수도 있다.
"세포 응집체"란, 세포의 응집체이며, 스피어라고도 불린다.
"단일 세포"란, 응집체를 형성하고 있지 않는, 개별의 세포를 의미한다.
"데브리스"로서는, 예를 들면, 죽은 세포, 세포 파쇄물, 세포 분비물을 들 수 있다.
"세포 분비물"로서는, 예를 들면, 세포의 노폐물, 세포로부터 분비되는 단백질 및 세포로부터 분비되는, 상기 세포와 다른 세포(예를 들면, 혈소판 등)를 들 수 있다.
"거핵구"에는, 성숙한 거핵구 외, 거핵 전구 세포 또는 거핵 아구 세포 등이 포함된다. "거핵구”는, 성체 조직으로부터 채취한 거핵구 외, 다능성 줄기 세포, 조혈 전구 세포 또는 간엽계 세포 등의 분화능을 갖는 세포로부터 분화시킨 거핵구여도 된다.
도 1은, 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 현탁액의 막분리 방법을 실시하는 여과 장치(60)의 구성을 나타내는 모식도이다. 여과 장치(60)은, 세포 현탁액 중에 포함되는 세포 응집체와, 세포 응집체를 형성하지 않는 단일 세포 및 데브리스(죽은 세포, 세포 파쇄물, 세포의 노폐물 및 세포로부터 분비된 단백질 등)를 여과막(61)을 이용하여 분리하는 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 장치이다. 또, 여과 장치(60)은, 단일 세포와, 데브리스를 여과막(61)을 이용하여 분리하는 막분리 처리를 행하는 경우에도 이용할 수 있다. 여과 장치(60)은, 예를 들면, 세포의 배양에 사용한 데브리스를 포함하는 사용이 완료된 배지를, 신선한 배지로 교환하는 배지 교환 처리 등에 있어서 사용할 수 있다.
여과 장치(60)은, 용기(68)과, 용기(68) 내의 공간을 공급 측(62)와 투과 측(63)으로 이격하는 여과막(61)을 구비한다. 또, 여과 장치(60)은, 공급 측(62)에 있어서, 세포 현탁액이 유입되는 유입구(64)와 세포 현탁액이 유출되는 유출구(65)를 갖는다. 막분리 처리가 행해지는 세포 현탁액은, 유입구(64)로부터 용기(68)의 내부에 유입되어 유출구(65)로부터 용기(68)의 외부에 유출되는 동안에 여과막(61) 상을 통과한다. 세포 현탁액에 포함되는 비교적 사이즈가 작은 성분은, 배지 등의 액체와 함께 여과막(61)을 투과하여 투과 측(63)에 배출된다. 예를 들면, 여과 장치(60)에 의하여, 세포 응집체와, 단일 세포 및 데브리스를 분리하는 경우, 세포 응집체보다 사이즈가 작은 단일 세포 및 데브리스는, 여과막(61)을 투과하여 투과 측(63)에 배출된다. 또, 여과 장치(60)에 의하여, 단일 세포와, 데브리스를 분리하는 경우, 단일 세포보다 사이즈가 작은 데브리스는, 여과막(61)을 투과하여 투과 측(63)에 배출된다. 용기(68)의 투과 측(63)에는, 펌프(P11)이 마련된 배출 유로(67)이 접속되어 있으며, 투과 측(63)에 배출된 성분은, 배출 유로(67)을 경유하여 폐액 회수 용기(도시하지 않음)에 회수된다. 한편, 세포 현탁액에 포함되는 비교적 사이즈가 큰 성분(세포 응집체 또는 단일 세포)은, 여과막(61)을 투과하지 않고, 유출구(65)로부터 용기(68)의 외부에 유출되어 회수된다. 이와 같이, 여과 장치(60)은, 막분리 처리 대상인 세포 현탁액이, 여과막(61)의 막면을 따라 흐르는 크로스 플로(탄젠셜 플로) 방식에 의한 여과를 행하는 것이 가능하다. 이와 같이 크로스 플로 방식에 의한 여과를 행함으로써, 데드 엔드 방식에 의한 여과를 행하는 경우와 비교하여, 여과막(61)의 막힘을 억제할 수 있다. 그 결과, 막분리 처리 중에 있어서의 공급 측(62)의 압력 상승을 억제할 수 있으며, 막분리 처리 중에 세포가 받는 데미지를 경감할 수 있다.
도 2는, 본 예시적 실시형태에 관한 세포 현탁액의 막분리 방법에 적용할 수 있는 여과막(61)의 전형적인 구조를 나타내는 단면도이다. 또한, 도 2에는, 여과막(61)을 이용하여, 세포 응집체(C1)과, 단일 세포(C2) 및 데브리스(D)를 분리하는 경우가 예시되어 있다. 여과막(61)은, 공급 측(62)의 제1 면(FI1)에 형성된 입측의 개구(OP1)과, 투과 측의 제2 면(FI2)에 형성되고 또한 개구(OP1)과 연통하는 출측의 개구(OP2)를 갖는다. 개구(OP1)과 개구(OP2)는, 여과막(61)의 막면과 평행한 방향으로 서로 어긋난 위치에 배치되어 있다. 환언하면, 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이며, 굴곡 또는 만곡하고 있다. 본 예시적 실시형태에 있어서, 개구(OP1)과 개구(OP2)는, 서로 중첩되는 부분을 갖고 있지 않다. 즉, 여과막(61)은 제1 면(FI1)과 제2 면(FI2)의 사이를 직선적으로 관통하는 가시 구멍을 갖고 있지 않다. 또한, 개구(OP1)과 개구(OP2)가 부분적으로 중첩되어 있어도 된다. 여과막(61)은, 예를 들면, 금속 또는 플라스틱 등으로 이루어지는 섬유 형상 부재(70)을 편입함으로써 형성된 메시 형상의 필터막이어도 된다.
상기와 같은 구조를 갖는 여과막(61)을 이용함으로써, 여과 장치(60)의 용기(68)의 공급 측을 여과막(61)의 막면을 따라 흐르는 세포 응집체(C1)은, 공급 측의 개구(OP1)로부터 여과막(61)의 내부에 침입할 수 있다. 그러나, 여과막(61)의 투과 측의 개구(OP2)는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 어긋난 위치에 배치되어 있으므로, 혹은 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이므로, 여과막(61)의 내부에 침입한 세포 응집체(C1)은, 단일 세포(C2) 및 데브리스(D)와 비교하여 투과 측에 용이하게 유출할 수 없다.
한편, 세포 응집체를 형성하지 않는 단일 세포(C2) 및 데브리스(D)는, 세포 응집체(C1)의 사이즈보다 충분히 작기 때문에, 여과막(61)의 투과 측에 용이하게 유출할 수 있다. 또, 단일 세포(C2) 및 데브리스(D)는, 여과막(61)의 개구(OP1)에 침입한 세포 응집체(C)의 측면을 빠져나가 투과 측에 유출할 수도 있다. 또한, 세포 응집체(C1)의 직경으로서, 50μm~300μm 정도가 상정되고, 단일 세포(C2)의 직경으로서, 5μm~25μm 정도가 상정된다. 또, 데브리스(D)로서의 죽은 세포 및 세포 파쇄물의 직경은, 단일 세포(C2)의 직경보다 더 작고, 예를 들면 단일 세포(C2)의 직경의 2분의 1 정도가 상정된다.
예를 들면, 섬유 형상 부재를 평직함으로써 형성되는 단순한 메시 형상의 여과막을 이용하여 막분리 처리를 행한 경우에는, 세포 응집체는 변형함으로써 용이하게 여과막의 스티치를 빠져나가 투과 측에 유출된다. 세포 응집체의 투과 측으로의 유출을 방지하기 위하여, 여과막의 그물코의 사이즈를 작게 하면, 막힘이 발생하고, 또 여과막의 그물코에 의하여 세포 응집체가 분단되어, 투과 측에 유출된다. 이와 같이, 막분리 처리에 있어서, 평직 메시 등의 단순한 구조의 여과막을 이용한 경우에는, 여과막의 그물코의 사이즈를 적절히 선택해도, 세포 응집체와 데브리스의 분리를 적절히 행하는 것이 어렵다.
이에 대하여, 본 예시적 실시형태에 관한 여과막(61)에 의하면, 투과 측의 개구(OP2)는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 어긋난 위치에 배치되어 있으므로, 혹은 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이므로, 여과막(61)의 내부에 침입한 세포 응집체(C1)의 투과 측으로의 유출이 억제되어, 세포 응집체(C1)과, 단일 세포(C2) 및 데브리스(D)를 적절히 분리할 수 있다. 또, 본 예시적 실시형태에 관한 여과막(61)에 의하면, 세포 응집체(C1)은, 여과막(61)의 두께 방향에 있어서의 심부로까지 침입하는 것이 어려워지기 때문에, 여과막(61)의 폐색(막힘)을 억제할 수 있고, 또 막분리 처리에 있어서 세포가 받는 데미지를 작게 할 수 있다.
여과막(61)을 이용하여, 세포 응집체(C1)과, 단일 세포(C2) 및 데브리스(D)를 분리하는 경우, 여과막(61)의 개구(OP1 및 OP2)의 직경은, 세포 응집체(C1)의 직경의 0.01배 이상 3.0배 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.013배 이상 2.3배 이하, 더 바람직하게는 0.02배 이상 2.0배 이하이다. 개구(OP1 및 OP2)의 직경을 세포 응집체(C1)의 직경의 0.01배 이상으로 함으로써, 세포 현탁액 중에 포함되는 세포 응집체(C1), 단일 세포(C2) 및 데브리스(D) 중, 단일 세포(C1) 및 데브리스(D)를 적절히 투과 측에 배출할 수 있다. 개구(OP1 및 OP2)의 직경을 세포 응집체(C1)의 직경의 3.0배 이하로 함으로써, 여과막(61) 표면에 세포 응집체(C1)이 포착되는 것을 억제함과 함께, 세포 응집체(C1)의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다. 또한, 개구(OP1 및 OP2)의 직경이란, 개구(OP1 및 OP2)의 형상이 원형인 경우에는 그 직경을 의미하고, 개구(OP1 및 OP2)의 형상이 다각형인 경우에는 그 변의 길이를 의미한다. 세포 응집체(C1)의 직경으로서 원 상당 직경을 이용해도 된다. 원 상당 직경이란, 세포 응집체의 각각의 윤곽선에 의하여 획정되는 영역을, 동일한 면적을 갖는 원으로 간주한 경우의 원의 직경을 말한다.
이상의 설명에서는, 여과막(61)을 이용하여, 세포 응집체와, 단일 세포 및 데브리스를 분리하는 경우를 예시했지만, 여과막(61)을 이용하여, 단일 세포와 데브리스를 분리하는 것도 가능하다. 여과막(61)을 이용하여, 단일 세포와 데브리스를 분리하는 경우, 세포 응집체와, 단일 세포 및 데브리스를 분리하는 경우에 이용하는 여과막보다 개구(OP1 및 OP2)의 직경이 작은 여과막을 이용하여 막분리 처리를 행하는 것이 바람직하다. 단일 세포와 데브리스를 분리하는 막분리 처리에 있어서, 여과막(61)을 이용함으로써, 여과 장치(60)의 용기(68)의 공급 측을 여과막(61)의 막면을 따라 흐르는 단일 세포는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 여과막(61)의 내부에 침입할 수 있다. 그러나, 여과막(61)의 투과 측의 개구(OP2)는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 어긋난 위치에 배치되어 있으므로, 혹은 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이므로, 여과막(61)의 내부에 침입한 단일 세포는, 데브리스와 비교하여 투과 측에 용이하게 유출할 수 없다. 한편, 데브리스는, 단일 세포의 사이즈보다 작기 때문에, 여과막(61)의 투과 측에 용이하게 유출할 수 있다. 또, 데브리스는, 여과막(61)의 개구(OP1)에 침입한 단일 세포의 측면을 빠져나가 투과 측에 유출할 수도 있다. 본 예시적 실시형태에 관한 여과막(61)에 의하면, 투과 측의 개구(OP2)는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 어긋난 위치에 배치되어 있으므로, 혹은 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이므로, 여과막(61)의 내부에 침입한 단일 세포의 투과 측으로의 유출이 억제되어, 단일 세포와, 데브리스를 적절히 분리할 수 있다. 또, 본 예시적 실시형태에 관한 여과막(61)에 의하면, 단일 세포는, 여과막(61)의 두께 방향에 있어서의 심부로까지 침입하는 것이 어려워지기 때문에, 여과막(61)의 폐색(막힘)을 억제할 수 있으며, 또 막분리 처리에 있어서 세포가 받는 데미지를 작게 할 수 있다.
여과막(61)을 이용하여, 단일 세포와 데브리스를 분리하는 경우, 여과막(61)의 개구(OP1 및 OP2)의 직경은, 단일 세포의 직경의 0.05배 이상 0.8배 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.07배 이상 0.6배 이하, 더 바람직하게는 0.1배 이상 0.4배 이하이다. 개구(OP1 및 OP2)의 직경을 단일 세포의 직경의 0.2배 이상으로 함으로써, 세포 현탁액에 포함되는 단일 세포 및 데브리스 중, 데브리스를 적절히 투과 측에 배출할 수 있다. 개구(OP1 및 OP2)의 직경을 단일 세포의 직경의 0.4배 이하로 함으로써, 여과막(61) 표면에 단일 세포가 포착되는 것을 억제함과 함께, 단일 세포의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다.
또, 특히, 여과막(61)을 이용하여, 단일 세포와 데브리스를 분리하는 경우에는, 여과막(61)의 개구(OP1 및 OP2)의 직경의 균일성이 확보되어 있는 것이 바람직하다. 즉, 여과막(61)의 개구(OP1 및 OP2)의 직경의 분포에 있어서의 평균값을 X, 표준 편차를 σ로 했을 때, 0<σ/X≤0.1을 충족시키는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0<σ/X≤0.05, 더 바람직하게는 0<σ/X≤0.02이다. 0<σ/X≤0.1을 충족시킴으로써, 단일 세포의 투과 측으로의 배출을 억제하면서 데브리스를 투과 측에 배출시키는 것이 가능해진다. 또한, σ 및 X는, 수은 압입법에 의하여 측정하고, 기존의 통계 해석 수법에 의하여 구할 수 있다.
또, 여과막(61)의 제1 면(FI1) 및 제2 면(FI2)는, 친수화 처리가 실시되어 있거나, 친수기 수식되어 있는 것이 바람직하다. 이로써, 여과막(61)의 젖음성이 향상되어, 제1 면(FI1), 제2 면(FI2) 및 막 내에 기포가 체류하는 것을 억제할 수 있다. 또, 세포로부터 분비되는 단백질이나 세포 자신이 제1 면(FI1) 및 제2 면(FI2)에 부착하는 것을 억제할 수 있다. 그 결과, 크로스 플로 방식의 여과를 실시하는 경우에, 여과막(61)의 막면을 따라 균일한 흐름을 형성하는 것이 가능해지고, 여과막(61)의 제1 면(FI1) 및 제2 면(FI2) 전체를 유효하게 사용하는 것이 가능해진다.
여과막(61)에 대한 친수화 처리 또는 친수기 수식은, 예를 들면, 플라즈마 처리에 의하여 행할 수 있다. 또, 음이온성 친수기를 갖는 아크릴 수지 등의 친수성 수지를 여과막(61)에 도포해도 된다. 또, 여과막(61)에 산화 타이타늄 수지를 도입함으로써 발생하는 광촉매 작용을 이용하여 친수화 처리 또는 친수기 수식을 행해도 된다. 또, 여과막(61)을, 알칼리 규산염 수지, 실리콘 수지, 물 유리 등의 무기 재료로 코팅해도 된다.
여과막(61)로서, 예를 들면, 도 3a에 나타내는, 섬유 형상 부재를 능첩직하여 형성되는 능첩직 메시(61A)를 적합하게 이용할 수 있다. 능첩직 메시(61A)는, 인접하는 횡사(71)끼리가 밀접하며 또한 일정한 간격을 갖고 통과하는 종사(72)를 횡사(71)이, 예를 들면 n개씩 넘으면서 종사(72)에 얽히도록 편입된 구조를 갖는다. 또한, n은 2 이상의 자연수이다(n≥2). 능첩직 메시(61A)는, 그물코의 가시성이 없고, 횡사(71)과 종사(72)의 교차부에 형성되는 간극에 의하여 개구가 형성된다. 능첩직 메시(61A)에 이용되는 섬유 형상 부재는, 예를 들면 스테인리스 등의 금속 또는 폴리에스터 등의 수지로 구성되며, 스테인리스 등의 금속이 바람직하다.
도 3b는, 능첩직 메시(61A)의 개구(OP)를 확대하여 나타내는 사시도이다. 능첩직 메시(61A)의 개구(OP)는, 2개의 횡사(71)과 1개의 종사(72)의 방직에 의하여 발생하는 간극에 의하여 형성된다. 또한, 능첩직 메시(61A)의 개구(OP)의 직경은, 표준 입자에 의한 여과 시험을 행하여, 저지율 95%가 되는 입자경(즉, 입자 투과 시험에 의한 95% 분리 입자경)으로서 산출된다. 능첩직 메시(61A)를 여과막으로서 이용하여, 세포 응집체와, 단일 세포 및 데브리스를 분리하는 경우, 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경은, 4μm 이상 150μm 이하인 것이 바람직하다. 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경을 4μm 이상으로 함으로써, 단일 세포 및 데브리스를 적절히 투과 측에 배출할 수 있다. 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경을 150μm 이하로 함으로써 능첩 메시(61A)의 표면에 세포 응집체가 포착되는 것을 억제함과 함께, 세포 응집체의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다.
한편, 능첩직 메시(61A)를 여과막으로서 이용하여, 단일 세포와 데브리스를 분리하는 경우, 단일 세포가 인간 세포일 때에는, 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경은, 1μm 이상 5μm 이하인 것이 바람직하다. 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경을 1μm 이상으로 함으로써, 데브리스를 적절히 투과 측에 배출할 수 있다. 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경을 5μm 이하로 함으로써 능첩 메시(61A)의 표면에 단일 세포가 포착되는 것을 억제함과 함께, 세포 응집체의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다.
단일 세포와 데브리스를 분리하는 경우, 단일 세포가 비인간 세포일 때에는, 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경은, 1μm 이상 20μm 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2μm 이상 12μm 이하, 더 바람직하게는 3μm 이상 7μm 이하이다. 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경을 1μm 이상으로 함으로써, 데브리스를 적절히 투과 측에 배출할 수 있다. 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경을 20μm 이하로 함으로써, 능첩 메시(61A)의 표면에 데브리스가 포착되는 것을 억제함과 함께, 단일 세포의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다.
단일 세포와 데브리스를 분리하는 경우, 단일 세포가 거핵구이며, 데브리스가 혈소판일 때에는, 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경은, 1μm 이상 20μm 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 2μm 이상 12μm 이하, 더 바람직하게는 3μm 이상 7μm 이하이다. 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경을 1μm 이상으로 함으로써, 데브리스를 적절히 투과 측에 배출할 수 있다. 능첩직 메시(61A)의 95% 분리 입자경을 20μm 이하로 함으로써 능첩 메시(61A)의 표면에 단일 세포가 포착되는 것을 억제함과 함께, 세포 응집체의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다.
도 3c는, 능첩직 메시(61A)의 단면 구조를 나타내는 도이다. 도 3c에는, 능첩직 메시(61A)를 투과하는 유체의 흐름이 화살표로 나타나 있다. 능첩직 메시(61A)는, 두께 방향으로 직선적으로 관통하는 가시 구멍을 갖지 않기 때문에, 능첩직 메시(61A)를 투과하는 유체는, 흐름 방향을 변경하면서 투과 측을 향하여 흐른다. 따라서, 유체에 포함되는 비교적 직경이 큰 입자는, 투과 측에 유출되지 않고 공급 측에 남기 쉽다. 즉, 능첩직 메시(61A)를 여과막(61)로서 사용함으로써, 도 2에 나타내는 전형 구조의 경우와 같이, 세포 현탁액의 막분리 처리에 있어서, 세포 응집체의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다.
또, 여과막(61)로서, 예를 들면, 도 4에 나타내는, 2매의 평직 메시(61b, 61c)를 적층함으로써 형성되는 적층 메시(61D)를 이용할 수 있다. 평직 메시(61b, 61c)는, 각각의 관통공(H)의 위치가 서로 어긋나도록 하여 적층된다. 적층 메시(61D)를 이용하는 경우에서도, 세포 현탁액의 막분리 처리에 있어서, 세포 응집체 또는 단일 세포의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다. 또한, 3매 이상의 평직 메시를 적층하여 적층 메시(61D)를 구성해도 된다. 평직 메시(61b, 61c)에 이용되는 섬유 형상 부재는, 예를 들면 스테인리스 등의 금속 또는 폴리에스터 등의 수지로 구성되며, 스테인리스 등의 금속이 바람직하다.
여과 장치(60)을 이용하여 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하고 있는 동안, 여과막(61)의 공급 측(62)의 제1 면(FI1)에 가해지는 압력과, 여과막(61)의 투과 측(63)의 제2 면(FI2)에 가해지는 압력의 차분(이하, 막면 차압이라고 함)을, 0.01킬로파스칼 이상 60킬로파스칼 이하로 하는 것이 바람직하다. 여과막(61)의 막면 차압을 0.01킬로파스칼 이상으로 함으로써, 데브리스를 공급 측으로부터 투과 측에 적절히 배출하는 것이 가능해진다. 또, 여과막(61)의 막면 차압을 60킬로파스칼 이하로 함으로써, 세포 응집체 또는 단일 세포의 여과막에 의한 분할(파쇄)을 억제하면서 막분리 처리를 행할 수 있다.
도 5는, 세포 현탁액의 막분리 처리 시의 여과막(61)의 막면 차압을 제어하는 제어계(80)의 구성의 일례를 나타내는 도이다. 제어계(80)은, 압력 센서(81, 82, 83) 및 펌프 제어부(84)를 포함하여 구성되어 있다. 압력 센서(81)은, 여과 장치(60)의 유입구(64) 근방의 압력(M1)을 검출하고, 검출한 압력(M1)의 크기를 나타내는 검출 신호를 펌프 제어부(84)에 공급한다. 압력 센서(82)는, 여과 장치(60)의 유출구(65) 근방의 압력(M2)를 검출하고, 검출한 압력(M2)의 크기를 나타내는 검출 신호를 펌프 제어부(84)에 공급한다. 압력 센서(83)은, 여과 장치(60)의 배출 유로(67) 내의 압력(M3)을 검출하고, 검출한 압력(M3)의 크기를 나타내는 검출 신호를 펌프 제어부(84)에 공급한다. 펌프 제어부(84)는, 압력 센서(81, 82, 83)으로부터 각각 공급되는 검출 신호에 의하여 나타나는 압력(M1, M2, M3)에 근거하여, 배출 유로(67) 상에 마련된 펌프(P11)의 단위 시간당 회전수를 제어한다.
여기에서, 막분리 처리 중에 있어서의 여과막(61)의 막면 차압 ΔM은, 하기의 (1) 식에 의하여 나타난다.
ΔM=(M1＋M2)/2-M3 ···(1)
또한, (M1＋M2)/2는, 여과 장치(60)의 공급 측(62)의 압력의 평균값을 의미한다. 펌프 제어부(84)는, 압력 센서(81, 82, 83)에 의하여 검출된 압력(M1, M2, M3)을, 상기의 (1) 식에 대입함으로써 막면 차압 ΔM을 산출한다. 펌프 제어부(84)는, 막면 차압 ΔM이, 5킬로파스칼 이상 60킬로파스칼 이하의 범위 내에 있어서의 소정값이 되도록 펌프(P11)의 단위 시간당 회전수를 제어한다. 또한, 펌프(P11)은, 투과 측(63)에 배출된 데브리스를 포함하는 액체를, 배출 유로(67)을 개재하여 여과 장치(60)의 외부에 배출하는 흐름을 형성하도록 동작한다. 펌프(P11)의 단위 시간당 회전수가 커질수록, 투과 측(63)의 압력은 작아지고, 막면 차압 ΔM은 커지는 방향으로 변화한다.
여과 장치(60)을 이용하여 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하고 있는 동안, 여과막(61)의 막힘을 해소하기 위한 처리를 적절히 행해도 된다. 도 6은, 여과막(61)의 막힘을 해소하기 위한 처리를 포함하는, 세포 현탁액의 막분리 방법의 일례를 나타내는 플로차트이다.
막분리 공정 A1에 있어서, 세포 현탁액을 여과막(61)의 막면의 방향을 따라 흐르게 하여 세포 현탁액의 막분리 처리를 행한다. 이때, 세포 현탁액의 유속을 속도 V1로 한다. 막분리 공정 A1에 있어서, 여과막(61)의 막면에는, 기포, 세포, 세포로부터 분비된 단백질 등이 부착되는 경우가 있다. 이들은, 여과막(61)의 막힘의 원인이 된다.
판정 공정 A2에 있어서, 막분리 처리를 계속할지 아닐지를 판정하며, 막분리 처리를 계속하지 않는 경우에는 처리는 종료가 되고, 막분리 처리를 계속하는 경우에는, 처리를 배출 공정 A3으로 이행한다.
배출 공정 A3에 있어서, 속도 V1보다 큰 속도 V2로, 세포 현탁액 또는 세정용의 액체를 여과막(61)의 막면의 방향을 따라 흐르게 한다. 이와 같이, 여과막(61)의 막면 상에 비교적 유속이 큰 액류를 발생시킴으로써, 여과막(61)에 부착한 기포, 세포, 단백질 등이 스크레이핑되어, 여과막(61)의 막힘이 해소된다.
상기의 배출 공정 A3을, 도 7에 나타내는 바와 같이, 역세 공정 A4로 대체해도 된다. 역세 공정 A4에서는, 여과 장치(60)의 배출 유로(67) 상에 마련된 펌프(P11)을 정지시킴과 함께 용기(68)의 투과 측(63)에 배지 등의 세정용의 액체 또는 기체를 주입하여 투과 측(63)으로부터 공급 측(62)을 향하는 액류 또는 기류를 발생시킨다. 환언하면, 여과막(61)의 투과 측(63)의 제2 면(FI2)에 가해지는 압력을 공급 측의 제1 면(FI1)에 가해지는 압력보다 크게 한다. 즉, 역세 공정 A4에서는, 여과막(61)의 제1 면(FI1) 및 제2 면(FI2)에 가해지는 압력의 대소 관계가, 막분리 공정 A1과는 반대가 된다. 이와 같이, 투과 측(63)으로부터 공급 측(62)을 향하는 액류 또는 기류를 발생시킴으로써, 여과막(61)에 부착한 기포, 세포, 단백질 등이 여과막(61)로부터 제거되어, 여과막(61)의 막힘이 해소된다.
도 8은, 여과 장치(60)을 이용한 세포 현탁액의 막분리 방법의 다른 예를 나타내는 플로차트이다. 제1 막분리 공정 B1에 있어서, 세포 현탁액을 여과막(61)의 막면을 따라 유입구(64)로부터 유출구(65)를 향하여 흐르게 하는 크로스 플로 방식에 의한 여과를 행한다. 이어서, 제2 막분리 공정 B2에 있어서, 유출구(65)를 폐쇄한 상태에서, 제1 막분리 공정 B1에 의한 막분리 처리가 실시된 세포 현탁액을, 재차 유입구(64)로부터 유입시킨다. 이로써, 제2 막분리 공정 B2에 있어서는, 세포 현탁액의 흐름 방향이 여과막(61)의 막면에 대하여 직교하는 데드 엔드 플로 방식에 의한 여과가 된다.
크로스 플로 방식에 의한 여과에 의하면, 여과막(61)의 막힘을 억제하고, 또 세포가 받는 데미지를 억제할 수 있지만, 세포 현탁액을 고농도로 농축하는 것이 용이하지 않다. 한편, 데드 엔드 플로 방식에 의하면, 여과막(61)의 막힘을 발생시키기 쉽고, 세포에 데미지가 미칠 우려가 있지만, 세포 현탁액의 고농도 농축이 가능해진다. 따라서, 크로스 플로 방식에 의한 여과와 데드 엔드 플로 방식에 의한 여과를 병용함으로써, 여과막(61)의 막힘 및 세포에 대한 데미지를 최소한으로 억제하면서, 세포 현탁액을 원하는 농도로까지 농축하는 것이 용이해진다.
도 9는, 본 개시의 다른 예시적 실시형태에 관한 여과 장치(60A)의 구성을 나타내는 도이다. 여과 장치(60A)에 있어서, 공급 측(62)에 있어서의 세포 현탁액의 유로의 단면적은, 유로의 상류 측(유입구(64) 측)으로부터 하류 측(유출구(65) 측)을 향하여 서서히 작아지고 있다.
여기에서, 유입구(64)로부터 유입되는 단위 시간당 액량을 Q1, 유출구(65)로부터 유출되는 단위 시간당 액량을 Q2, 배출 유로(67)로부터 배출되는 단위 시간당 액량을 Q3으로 하면, Q1, Q2, Q3의 사이에는, 하기의 (2) 식에 의하여 나타나는 관계가 성립한다.
Q2=Q1-Q3 ···(2)
즉, 유출구(65)로부터 유출되는 액량 Q2는, 유입구(64)로부터 유입되는 액량 Q1보다 적다. 따라서, 세포 현탁액의 유로의 단면적을 일정하게 한 경우에는, 유로의 하류 측(유출구(65) 측)의 유속이, 상류 측(유입구(64) 측)의 유속보다 작아진다. 이 경우, 유속이 작아지는 하류 측에 있어서, 여과막(61) 상에 세포 응집체 또는 단일 세포가 퇴적하기 쉬워진다. 이것을 회피하기 위하여, 하류 측에 있어서의 유속의 저하를 예측하여 상류 측의 유속을 크게 해 두는 대응이 생각된다. 그러나, 이 경우, 세포가 받는 데미지가 커질 우려가 있어, 바람직하지 않다.
본 예시적 실시형태에 관한 여과 장치(60A)에 의하면, 세포 현탁액의 유로의 단면적이 상류 측(유입구(64) 측)으로부터 하류 측(유출구(65) 측)을 향하여 서서히 작아지고 있으므로, 유로의 상류 측과 하류 측에서 세포 현탁액의 유속이 대략 일정해진다. 즉, 여과 장치(60A)에 의하면, 세포가 받는 데미지를 억제하면서 유로의 하류 측에 있어서의 유속 저하가 억제되고, 여과막(61) 상에 있어서의 세포 응집체 또는 단일 세포의 퇴적을 억제할 수 있다.
도 10은, 본 개시의 다른 예시적 실시형태에 관한 여과 장치(60B)의 구성을 나타내는 도이다. 여과 장치(60B)는, 도 1에 나타내는 여과 장치(60)의 유입구(64) 및 유출구(65)에 각각 대응하는 제1 유통구(64A) 및 제2 유통구(65A)를 갖는다. 또 여과 장치(60B)는, 제1 유통구(64A)에 접속된 제1 저류 용기(91) 및 제2 유통구(65A)에 접속된 제2 저류 용기(92)를 갖는다. 제1 저류 용기(91)에는, 제1 저류 용기(91)의 내부의 압력을 조정하기 위한 압력 조정 기구(95)가 마련되어 있다. 마찬가지로, 제2 저류 용기(92)에는, 제2 저류 용기(92)의 내부의 압력을 조정하기 위한 압력 조정 기구(97)이 마련되어 있다. 제1 유통구(64A)와 제1 저류 용기(91)의 사이를 연결하는 유로 상 및 제2 유통구(65A)와 제2 저류 용기(92)의 사이를 연결하는 유로 상에는 각각 개폐 밸브(93 및 94)가 마련되어 있다.
제1 저류 용기(91) 및 제2 저류 용기(92)는, 막분리 처리를 행하는 세포 현탁액을 저류해 두기 위한 용기이다. 세포 현탁액이 제1 저류 용기(91)과 제2 저류 용기(92)의 사이를 이동함으로써, 세포 현탁액은, 여과막(61)의 막면을 따라 흘러, 막분리 처리된다. 세포 현탁액은, 제1 저류 용기(91)와 제2 저류 용기(92)의 사이를 왕복 이동함으로써, 원하는 농도로까지 농축된다. 원하는 농도로까지 농축된 세포 현탁액은, 제1 저류 용기(91) 또는 제2 저류 용기(92)에 회수된다.
세포 현탁액을 제1 저류 용기(91)로부터 제2 저류 용기(92)로 이동시키는 경우, 제1 저류 용기(91)에 저류된 세포 현탁액의 액면을 압력 조정 기구(95)에 의하여 가압함과 함께 개폐 밸브(93 및 94)를 개방 상태로 한다. 한편, 세포 현탁액을 제2 저류 용기(92)로부터 제1 저류 용기(91)로 이동시키는 경우, 제2 저류 용기(92)에 저류된 세포 현탁액의 액면을 압력 조정 기구(97)에 의하여 가압함과 함께 개폐 밸브(93 및 94)를 개방 상태로 한다. 압력 조정 기구(95 및 97)은, 세포 현탁액의 액면을, 예를 들면 청정한 에어로 가압하는 기구를 갖는다. 압력 조정 기구(95 및 97)은, 제1 저류 용기(91)와 제2 저류 용기(92)의 사이에 압력차를 발생시킴으로써, 세포 현탁액의 액류를 발생시킨다.
본 예시적 실시형태에 관한 여과 장치(60B)에 의하면, 세포에 대한 데미지가 우려되는 튜브 펌프 등의, 튜브의 스퀴즈 동작에 의하여 액류를 발생시키는 타입의 펌프의 사용이 불필요해진다. 즉, 본 예시적 실시형태에 관한 여과 장치(60B)에 의하면, 세포에 데미지를 주지 않고 세포 현탁액의 막분리 처리에 필요한 액류를 발생시키는 것이 가능해진다.
[세포 배양 장치]
도 11은, 여과 장치(60)을 포함하는 본 개시의 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)의 구성을 나타내는 도이다. 세포 배양 장치(1)은, 여과 장치(60) 외에, 세포 공급부(100), 배지 공급부(110), 희석액 공급부(120) 및 동결액 공급부(130)을 구비한다. 또, 세포 배양 장치(1)은, 배양 용기(20), 저류 용기(30), 분할 처리부(40), 폐액 회수 용기(16) 및 동결부(17)을 구비한다.
세포 배양 장치(1)은, 세포 공급부(100)으로부터 공급되는 세포를, 배지 공급부(110)으로부터 공급되는 배지(배양액)와 함께 배양 용기(20) 내에 수용하고, 배양 용기(20) 내에 있어서 세포를 배지 중에 예를 들면 부유시킨 상태에서 배양한다.
<세포 공급부>
세포 공급부(100)은, 세포 배양 장치(1)에 의한 배양의 대상이 되는 다능성 줄기 세포를 동결시킨 상태에서 수용하는 세포 수용부(101)과, 세포 수용부(101)에 수용된 세포를, 배관(c1)을 포함하여 구성되는 유로(F3)에 송출하는 펌프(P1)을 갖는다. 또, 세포 공급부(100)은, 세포 수용부(101)과 배관(c1)을 접속하는 배관의, 펌프(P1)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V1)을 갖는다. 세포 수용부(101)에 수용된 세포는, 펌프(P1)이 구동되어, 개폐 밸브(V1)이 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다.
<배지 공급부>
배지 공급부(110)은, 세포의 배양에 사용하는 배지(배양액)를 수용하는 배지 수용부(111 및 114)와, 배지 수용부(111 및 114)에 각각 수용된 배지를, 유로(F3)에 송출하는 펌프(P2 및 P3)과, 펌프(P2 및 P3)으로부터 각각 송출된 배지를 제균하기 위한 필터(113 및 116)을 갖는다. 또, 배지 공급부(110)은, 배지 수용부(111)과 배관(c1)을 접속하는 배관의, 필터(113)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V2)와 배지 수용부(114)와 배관(c1)을 접속하는 배관의, 필터(116)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V3)을 갖는다. 이와 같이, 배지 공급부(110)은, 배지 수용부(111), 펌프(P2), 필터(113) 및 개폐 밸브(V2)를 포함하는 제1 계통과, 배지 수용부(114), 펌프(P3), 필터(116) 및 개폐 밸브(V3)을 포함하는 제2 계통으로 이루어지는 2계통의 배지 공급 기능을 구비하고 있어, 서로 다른 2종류의 배지가 공급 가능하다. 또한, 배지 공급부(110)에 있어서의 계통의 수는, 세포의 배양 프로토콜 등에 따라 적절히 증감시키는 것이 가능하다. 즉, 배지 공급부(110)을, 3종류 이상의 배지를 공급 가능하게 하는 구성으로 해도 되고, 1종류의 배지를 공급 가능하게 하는 구성으로 해도 된다. 배지 수용부(111)에 수용된 배지는, 펌프(P2)가 구동되어, 개폐 밸브(V2)가 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다. 배지 수용부(114)에 수용된 배지는, 펌프(P3)이 구동되어, 개폐 밸브(V3)이 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다.
본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)에 의한 세포 배양에 있어서 적용할 수 있는 배지는, 특별히 제한되지 않으며, 모든 배지를 적용할 수 있다. 구체적으로는, 포유 동물 세포용의 기본 배지(예를 들면, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), EMEM(Eagle's minimal essential medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI 1640 Medium(Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium), E8 base medium, SkBM(Skeletal Muscle Cell Basal Medium), MCDB104, MCDB153, 199, L15), 시판품의 줄기 세포 유지용 배양액, 곤충 세포용의 기본 배지, 효모용 배지, 세균용 배지 등의 액체 배지이다.
본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)에 의한 세포 배양에 있어서 적용할 수 있는 배지는, 세포를 계속적으로 부유시킬 목적, 및/또는 세포끼리의 과도한 밀착을 방지할 목적으로, 세포 독성을 갖지 않는 고분자 화합물이 첨가되어 있어도 된다. 상기 목적으로 배지에 첨가되는 고분자 화합물은, 예를 들면, 배지의 비중을 조정하는 고분자 화합물, 배지의 점도를 조정하는 고분자 화합물, 배지 중에서 3차원 네트워크 구조를 형성하는 고분자 화합물이다. 이와 같은 고분자 화합물로서는, 셀룰로스, 메틸셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 젤란 검, 탈아실화 젤란 검, 히알루론산, 알진산, 카라지난, 잔탄 검, 디우탄 검, 전분, 펙틴 등의 다당류; 콜라젠, 젤라틴 등의 단백질; 폴리에틸렌글라이콜, 폴리바이닐피롤리돈 등의 합성 고분자; 등을 들 수 있다.
본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)에 의한 세포 배양에 적용할 수 있는 배지는, 일반적으로 첨가 가능한 각종 성분, 예를 들면, 페니실린, 스트렙토마이신 등의 항생 물질; 아스코브산, 레티노산 등의 비타민 또는 비타민 유도체; 글루코스 등의 당원; 아미노산; 무기염; 혈청, 혈청 대체물; 트랜스페린 등의 단백질; 인슐린 등의 호르몬; 증식 인자; 분화 억제 인자; 2-머캅토에탄올, 다이싸이오트레이톨 등의 항산화제; 칼슘 이온, 마그네슘 이온, 아연 이온, 철 이온, 구리 이온 등의 금속 이온; 등이 첨가되어 있어도 된다.
<희석액 공급부>
희석액 공급부(120)은, 세포의 배양 과정에 있어서 적절히 실시되는 희석 처리에 이용되는 희석액을 수용하는 희석액 수용부(121)과, 희석액 수용부(121)에 수용된 희석액을 유로(F3)에 송출하는 펌프(P4)와, 펌프(P4)로부터 송출된 희석액을 제균하기 위한 필터(123)을 갖는다. 또, 희석액 공급부(120)은, 희석액 수용부(121)과 배관(c1)을 접속하는 배관의, 필터(123)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V4)를 갖는다. 희석액 수용부(121)에 수용된 희석액은, 펌프(P4)가 구동되어, 개폐 밸브(V4)가 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다.
본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)에 의한 세포 배양에 적용할 수 있는 희석액은, 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 포유 동물 세포용의 기본 배지(예를 들면, DMEM, DMEM/F-12, MEM, DME, RPMI1640, MCDB104, 199, MCDB153, L15, SkBM, Basal Medium, E8 base medium)를 희석액으로서 사용하는 것이 가능하다. 또한, 세포 배양 과정에 있어서 희석 처리가 불필요한 경우에는, 희석액 공급부(120)을 생략하는 것이 가능하다.
<동결액 공급부>
동결액 공급부(130)은, 배양된 세포를 동결부(17)에 있어서 동결 보존하는 경우에 이용되는 동결액을 수용하는 동결액 수용부(131)과, 동결액 수용부(131)에 수용된 동결액을, 유로(F3)에 송출하는 펌프(P5)와, 펌프(P5)로부터 송출된 동결액을 제균하기 위한 필터(133)을 갖는다. 또, 동결액 공급부(130)은, 동결액 수용부(131), 펌프(P5) 및 필터(133)을 접속하는 배관의, 필터(133)의 하류 측에 마련된 개폐 밸브(V5)를 포함한다. 동결액 수용부(131)에 수용된 동결액은, 펌프(P5)가 구동되어, 개폐 밸브(V5)가 개방 상태가 됨으로써 유로(F3)에 송출된다. 또한, 배양된 세포를 동결 보존할 필요가 없는 경우에는, 세포 배양 장치(1)에 있어서 동결액 공급부(130)을 생략하는 것이 가능하다.
<배양 용기>
배양 용기(20)은, 세포 공급부(100)으로부터 공급되는 세포를, 배지 공급부(110)으로부터 공급되는 배지와 함께 수용하고, 수용된 세포를 배양하기 위한 용기이다. 배양 용기(20)의 형태는, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 유리제 또는 스테인리스제의 용기나 플라스틱제의 백의 형태를 갖는 용기를 사용하는 것이 가능하다. 배양 용기(20)은, 세포 및 배지를 배양 용기(20) 내에 유입시키기 위한 유입구(21)과, 배양 용기(20)에 수용된 세포 및 배지를 배양 용기(20)의 외부에 유출시키기 위한 유출구(22)를 갖는다.
배양 용기(20)은, 예를 들면, 온도 30℃~40℃(바람직하게는 37℃)이고 또한 CO2 농도 2%~10%(바람직하게는 5%)에 제어되며 또한 밀폐된 인큐베이터(24) 내에 수용될 수 있다. 인큐베이터(24)는, 배양 용기(20) 내에 배지와 함께 수용된 세포에 산소(O2) 및 이산화 탄소(CO2)를 공급하기 위한 가스 공급 기구(25)를 구비한다. 또, 인큐베이터(24)는, 배양 용기(20) 내의 압력을 조정하는 압력 조정 기구(26)을 구비한다. 압력 조정 기구(26)은, 배양 용기(20) 내에 에어를 도입함으로써 배양 용기(20) 내의 분위기를 가압하거나, 또는 배양 용기(20) 내의 분위기를 외부에 배출함으로써 배양 용기(20) 내의 분위기를 대기에 해방시킨다. 압력 조정 기구(26)은, 배양 용기(20) 내의 압력을, 후술하는 순환 유로(F1) 내의 압력보다 높임으로써, 배양 용기(20) 내에 수용된 세포 및 배지를 순환 유로(F1) 내에 유출시킨다.
<순환 유로>
세포 배양 장치(1)은, 배양 용기(20)의 유출구(22)와 유입구(21)을 접속하는 배관(a1~a7)을 포함하여 구성되는 순환 유로(F1)을 갖는다. 배양 용기(20)에 수용된 세포 및 배지는, 배양 과정에 있어서 실시되는 후술하는 각 처리에 있어서, 순환 유로(F1) 내를 순환한다. 순환 유로(F1) 내를 흐르는 세포 및 배지는, 유입구(21)을 경유하여 배양 용기(20) 내에 유입되고, 배양 용기(20)의 내부에 수용된 세포 및 배지는, 유출구(22)를 경유하여 순환 유로(F1) 내에 유출된다.
배양 용기(20)의 유입구(21)에 접속된 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a7)에는 개폐 밸브(V11)이 마련되고, 배양 용기(20)의 유출구(22)에 접속된 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a1)에는 개폐 밸브(V12)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V11)은, 순환 유로(F1)로부터 배양 용기(20) 내에 세포 및 배지를 유입시키는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다. 개폐 밸브(V12)는, 배양 용기(20) 내로부터 순환 유로(F1) 내에 세포 및 배지를 유출시키는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다.
세포 공급부(100), 배지 공급부(110), 희석액 공급부(120) 및 동결액 공급부(130)에 접속된 배관(c1)에 의하여 구성되는 유로(F3)은, 접속 부위(X3)에 있어서 순환 유로(F1)에 접속되어 있다. 즉, 세포 수용부(101)에 수용된 세포, 배지 수용부(111 및 114)에 각각 수용된 배지, 희석액 수용부(121)에 수용된 희석액 및 동결액 수용부(131)에 수용된 동결액은, 유로(F3) 및 접속 부위(X3)을 경유하여 순환 유로(F1) 내에 공급된다.
유로(F3)을 구성하는 배관(c1)에는, 접속 부위(X3)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V6)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V6)은, 세포 공급부(100), 배지 공급부(110), 희석액 공급부(120) 및 동결액 공급부(130)으로부터 각각, 세포, 배지, 희석액 또는 동결액을 순환 유로(F1) 내에 공급하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태가 된다.
<저류 용기>
저류 용기(30)은, 순환 유로(F1) 내, 즉, 순환 유로(F1)의 도중에 마련되어 있다. 저류 용기(30)은, 순환 유로(F1) 내를 흐르는 세포, 배지, 희석액 또는 동결액을 일시적으로 저류하기 위한 용기이며, 배양 기간 중에 실시되는 후술하는 계대 처리, 배지 교환 처리, 분할 처리 및 동결 처리에 있어서 사용된다. 저류 용기(30)의 형태는, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 유리제 또는 스테인리스제의 용기, 플라스틱제의 백의 형태를 갖는 용기를 사용하는 것이 가능하다.
저류 용기(30)은, 순환 유로(F1) 내를 흐르는 세포, 배지, 희석액 또는 동결액을 저류 용기(30) 내에 유입시키기 위한 유입구(31)과, 저류 용기(30)에 수용된 세포, 배지, 희석액 또는 동결액을 순환 유로(F1) 내에 유출시키기 위한 유출구(32)를 갖는다. 저류 용기(30)의 유입구(31)은, 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a1, a2 및 a3)에 의하여 배양 용기(20)의 유출구(22)에 접속되어 있다. 저류 용기(30)의 유출구(32)는, 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a4, a5, a6 및 a7)에 의하여 배양 용기(20)의 유입구(21)에 접속되어 있다. 또, 본 예시적 실시형태에 있어서는, 순환 유로(F1)과 유로(F3)이 접속되는 접속 부위(X3)이 저류 용기(30)의 유입구(31)의 근방에 배치되어 있지만, 순환 유로(F1)과 유로(F3)의 접속 위치는, 순환 유로(F1) 내에 있어서의 모든 위치에 배치하는 것이 가능하다.
순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a2)에는, 저류 용기(30)의 유입구(31)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V13)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V13)은, 순환 유로(F1)로부터 저류 용기(30) 내에 세포 및 배지 등을 유입시키는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다. 또, 순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a5)에는, 저류 용기(30)의 유출구(32)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V14)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V14)는, 저류 용기(30)으로부터 세포 및 배지 등을 배양 용기(20), 분할 처리부(40) 또는 동결부(17)에 이송하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다.
저류 용기(30)은, 저류 용기(30) 내의 압력을 조정하는 압력 조정 기구(33)을 구비한다. 압력 조정 기구(33)은, 저류 용기(30) 내에 에어를 도입함으로써 저류 용기(30) 내의 분위기를 가압하거나, 또는 저류 용기(30) 내의 분위기를 외부에 배출함으로써 저류 용기(30) 내의 분위기를 대기에 해방시킨다. 압력 조정 기구(33)은, 저류 용기(30) 내의 압력을 순환 유로(F1) 내의 압력보다 높임으로써, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포, 배지, 희석액 또는 동결액을, 유출구(32)로부터 순환 유로(F1) 내에 유출시킨다.
세포 배양 장치(1)은, 순환 유로(F1) 내에 있어서의, 저류 용기(30)의 유출구(32)와 배양 용기(20)의 유입구(21)의 사이에 위치하는 접속 부위(X1)과, 순환 유로(F1) 내에 있어서의, 저류 용기(30)의 유입구(31)와 배양 용기(20)의 유출구(22)의 사이에 위치하는 접속 부위(X2)를 접속하는 배관(b1 및 b2)를 포함하여 구성되는 유로(F2)를 갖는다. 순환 유로(F1) 내를 흐르는 세포 및 배지 등은, 접속 부위(X1)을 경유하여 유로(F2) 내에 유입되는 것이 가능하다. 또, 유로(F2) 내를 흐르는 세포 및 배지 등은, 접속 부위(X2)를 경유하여 순환 유로(F1) 내에 유입되는 것이 가능하다.
<분할 처리부>
분할 처리부(40)은, 유로(F2) 내, 즉, 유로(F2)의 도중에 마련되어 있다. 분할 처리부(40)은, 배양 용기(20) 내에 있어서 세포를 배양함으로써 형성되는 세포 응집체를 분할하는 분할 처리를 행하기 위한 처리 용기(42)를 구비한다. 처리 용기(42) 내에 있어서 행해지는 분할 처리는, 기계적 분할 처리여도 되고, 세포 해리 효소를 이용한 효소 처리여도 된다. 기계적 분할 처리가 적용되는 경우에는, 처리 용기(42) 내에는, 메시 필터가(도시하지 않음) 배치될 수 있다. 세포 응집체를 메시 필터에 통과시킴으로써, 세포 응집체는 메시 필터의 메시 사이즈에 따른 사이즈로 분할된다. 한편, 효소 처리에 의한 분할 처리가 적용되는 경우에는, 처리 용기(42) 내에는, 트립신 EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid) 등의 세포 해리 효소가 수용될 수 있다. 세포 응집체를 일정 시간에 걸쳐 세포 해리 효소에 침지함으로써, 세포 응집체가 분할된다.
분할 처리부(40)은, 순환 유로(F1)로부터 접속 부위(X1)을 경유하여 유로(F2) 내에 유입되는 세포 응집체를 처리 용기(42) 내에서 분할한다. 분할 처리가 실시된 세포는, 접속 부위(X2)를 경유하여 순환 유로(F1) 내에 유출된다.
분할 처리부(40)은, 처리 용기(42)에 연통하는 압력 용기(41)과, 압력 용기(41) 및 처리 용기(42) 내의 압력을 조정하는 압력 조정 기구(43)을 구비한다. 압력 조정 기구(43)은, 압력 용기(41) 내에 에어를 도입함으로써 압력 용기(41) 및 처리 용기(42) 내의 분위기를 가압하거나, 또는 압력 용기(41) 내의 분위기를 외부에 배출함으로써 압력 용기(41) 및 처리 용기(42) 내의 분위기를 대기에 해방시킨다. 압력 조정 기구(43)은, 압력 용기(41) 및 처리 용기(42) 내의 압력을 순환 유로(F1) 내의 압력보다 높임으로써, 분할 처리가 실시된 세포를 순환 유로(F1) 내에 유출시킨다.
유로(F2)를 구성하는 배관(b1)에는, 접속 부위(X1)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V21)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V21)은, 저류 용기(30)으로부터 분할 처리부(40)에 세포 등을 이송하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다. 한편, 유로(F2)를 구성하는 배관(b2)에는, 접속 부위(X2)의 근방에 개폐 밸브(V22)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V22)는, 분할 처리부(40)에 의하여 분할 처리가 실시된 세포를 순환 유로(F1) 내에 유출시키는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다.
순환 유로(F1)을 구성하는 배관(a1)에는, 접속 부위(X2)의 근방이고 접속 부위(X2)의 상류 측에 개폐 밸브(V15)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V15)는, 배양 용기(20)으로부터 저류 용기(30)에 세포 및 배지 등을 이송하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태가 된다.
<교반부>
교반부(50, 51 및 52)는, 각각, 유입되는 유체를 교반하는 기능을 갖는다. 교반부(50, 51 및 52)는, 구동부를 갖지 않는 이른바 스태틱 믹서로서의 구성을 갖고 있는 것이 바람직하고, 예를 들면, 관 형상체와, 관 형상체의 내부에 고정 설치되어, 관 형상체의 내부에 나사 형상의 유로를 형성하는 교반 엘리먼트를 포함하여 구성될 수 있다. 또한, 스태틱 믹서를 구성하는 관 형상체의 내부의 유로는, 반드시 나사 형상인 것을 필요로 하지는 않는다. 스태틱 믹서는, 관 형상체의 내부를 통과하는 유체를 교반할 수 있도록, 관 형상체의 내부에 유로를 형성하는 판 형상 부재가 관 형상체의 내부에 적절히 배치된 구조나 관 형상체의 내경을 부분적으로 변화시킨 구조를 갖는 것이어도 된다.
교반부(50)은, 순환 유로(F1) 내에 있어서의, 저류 용기(30)의 유출구(32)와 배양 용기(20)의 유입구(21)의 사이에 마련되어 있다. 보다 구체적으로는, 교반부(50)은, 순환 유로(F1) 내에 있어서, 저류 용기(30)의 유출구(32)와 접속 부위(X1)의 사이에 마련되어 있다. 또한, 교반부(50)은, 순환 유로(F1) 내에 있어서, 접속 부위(X1)과 배양 용기(20)의 유입구(21)의 사이에 마련되어 있어도 된다. 교반부(51)은, 유로(F3) 내에 있어서의, 배지 공급부(110)과 세포 공급부(100)의 사이에 마련되어 있다. 교반부(52)는, 유로(F3)에 있어서의, 세포 공급부(100)으로부터의 배관이 접속되는 부위의 하류 측에 마련되어 있다.
<여과 장치>
세포 배양 장치(1)은, 저류 용기(30)의 유입구(31)과 유출구(32)를 접속하는 유로(F6)을 갖는다. 유로(F6)은, 접속 부위(X5)에 있어서 순환 유로(F1)에 접속된 배관(f1)과, 접속 부위(X6)에 있어서 순환 유로(F1)에 접속된 배관(f2)를 포함하여 구성되어 있다.
여과 장치(60)은, 유로(F6) 내, 즉, 유로(F6)의 도중에 마련되어 있다. 여과 장치(60)의 유입구(64)는, 배관(f2)를 개재하여 저류 용기(30)의 유출구(32)에 접속되고, 여과 장치(60)의 유출구(65)는, 배관(f1)을 개재하여 저류 용기(30)의 유입구(31)에 접속되어 있다. 여과 장치(60)의 배출 유로(67)에는, 폐액 회수 용기(16)이 접속되어 있다. 배관(f2) 내에 배치된 펌프(P10, P11)은, 여과 장치(60)에 있어서 막분리 처리를 행하는 경우에 구동된다. 막분리 처리에 의하여 여과 장치(60)의 투과 측에 배출된 데브리스를 포함하는 액체는, 폐액 회수 용기(16)에 회수된다.
유로(F6)을 구성하는 배관(f1) 내에는, 접속 부위(X5)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V51)이 마련되어 있다. 또, 유로(F6)을 구성하는 배관(f2) 내에는, 접속 부위(X6)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V52)가 마련되어 있다. 개폐 밸브(V51 및 V52)는, 여과 장치(60)에 있어서 막분리 처리가 실시되어, 막분리된 세포 현탁액이 저류 용기(30) 내에 회수될 때까지, 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우는 폐쇄 상태가 된다.
폐액 회수 용기(16)에 회수되는 폐액에는, 사용이 완료된 배지, 사용이 완료된 희석액, 세포 공급부(100)으로부터 동결 상태에서 공급되는 세포에 수반되는 동결액 등이 포함된다. 폐액 회수 용기(16)의 형태는, 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면, 유리제 또는 스테인리스제의 용기, 플라스틱제의 백의 형태를 갖는 용기를 사용하는 것이 가능하다.
<동결부>
세포 배양 장치(1)은, 접속 부위(X1)에 있어서, 순환 유로(F1)에 접속된 배관(e1)을 포함하여 구성되는 유로(F5)를 갖는다. 유로(F5)의 단부에는, 동결부(17)이 마련되어 있다. 동결부(17)은, 순환 유로(F1)로부터 접속 부위(X1)을 경유하여 유로(F5) 내에 유입되는 세포를 동결액 공급부(130)으로부터 공급되는 동결액과 함께 수용하는 보존 용기(17a)를 갖는다. 보존 용기(17a)는, 예를 들면, 바이알, 크라이오튜브 또는 백의 형태를 갖는 것이어도 된다. 동결부(17)은 보존 용기(17a)에 수용된 세포 및 동결액을 동결시키는 프리저를 포함하여 구성될 수 있다. 또, 동결부(17)은, 액체 질소를 충전한 탱크를 구비하고 있어도 되고, 탱크 내에 보존 용기(17a)를 수용할 수 있도록 구성되어 있어도 된다. 또, 동결부(17)은, 예를 들면, 다이요 닛산사제의 크라이오라이브러리(등록 상표) 시스템을 포함하여 구성되어 있어도 된다. 유로(F5)를 구성하는 배관(e1)에는, 접속 부위(X1)의 근방에 있어서 개폐 밸브(V41)이 마련되어 있다. 개폐 밸브(V41)은, 저류 용기(30)으로부터 동결부(17)에 세포 및 동결액을 이송하는 경우에 개방 상태가 되고, 그 이외의 경우에는 폐쇄 상태가 된다. 또한, 유로(F5)와 순환 유로(F1)의 접속 위치는, 저류 용기(30)의 유출구(32)와 배양 용기(20)의 유입구(21)의 사이이면, 어떠한 위치여도 된다. 또, 세포를 동결 보존할 필요가 없는 경우에는, 동결부(17)을 생략하는 것이 가능하다.
<제어부>
제어부(18)은, 펌프(P1~P5, P10, P11), 개폐 밸브(V1~V6, V11~V16, V21, V22, V41, V51, V52), 가스 공급 기구(25), 압력 조정 기구(26, 33 및 43)의 동작을 통괄적으로 제어한다. 이로써, 소정의 세포 배양 프로토콜을 따른 세포의 배양이, 사람의 손을 거치지 않고, 자동으로 실시된다. 또한, 도 11에 있어서, 제어부(18)과, 제어부(18)에 의하여 제어되는 상기의 각 구성 요소의 사이의 전기적인 접속 배선은, 도면의 번잡함을 회피하는 관점에서 도시를 생략하고 있다.
이하에, 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)에 있어서 실시될 수 있는 처리의 일례를 나타낸다. 세포 배양 장치(1)은, 예를 들면, 이하에 예시하는 계대 처리, 배지 교환 처리, 분할 처리 및 동결 처리를 실시한다. 또한, 이하에 설명하는 계대 처리, 배지 교환 처리, 분할 처리 및 동결 처리는, 제어부(18)이, 개폐 밸브(V1~V6, V11~V16, V21, V22, V41, V51, V52), 펌프(P1~P5, P10, P11), 압력 조정 기구(26, 33 및 43)의 동작을 제어함으로써 실현된다.
<계대 처리>
세포 배양 장치(1)은, 세포 수용부(101)에 수용된 세포를, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 배지와 함께 배양 용기(20) 내에 수용하여 세포 배양을 개시하는 계대 처리를 이하와 같이 하여 실시한다. 또한, 이하의 설명에서는, 분할 처리부(40)에 있어서의 분할 처리가 기계적 분할 처리인 경우를 예시한다. 도 12는, 세포 배양 장치(1)이 계대 처리를 실시하는 경우에 있어서의, 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다. 또한, 도 12에 있어서, 세포 및 배지 등의 흐름과, 이하에 나타내는 각 처리 스텝의 대응이 나타나 있다.
스텝 S1에 있어서, 세포 수용부(101)에 있어서 동결 상태에서 수용된 세포 및 희석액 수용부(121)에 수용된 희석액이, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저류 용기(30) 내에 유입된다. 세포 및 희석액은, 유로(F3) 내에 있어서 교반부(52)를 통과함으로써, 교반되어 혼합된다.
스텝 S2에 있어서, 개폐 밸브(V51 및 V52)가 개방 상태가 되고, 펌프(P10 및 P11)이 구동된다. 이로써, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포, 세포에 부수하는 동결액 및 희석액을 포함하는 세포 현탁액이 여과 장치(60) 내에 유입된다. 여과 장치(60)은, 세포, 동결액 및 희석액을 포함하는 세포 현탁액으로부터 동결액 및 희석액을 제거하는 막분리 처리를 행한다. 동결액 및 희석액은, 폐액 회수 용기(16) 내에 회수되고, 막분리 처리가 실시된 세포는 저류 용기(30) 내에 회수된다.
스텝 S3에 있어서, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 배지 A 및 배지 B가, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저류 용기(30) 내에 유입되어, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포와 합류한다. 배지 A 및 배지 B는, 교반부(51 및 52)를 통과함으로써, 교반되어 혼합된다.
스텝 S4에 있어서, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포 및 배지가, 교반부(50)을 경유하여 분할 처리부(40) 내에 이송된다. 분할 처리부(40) 내에 유입된 세포는, 처리 용기(42) 내에 있어서 분할 처리가 실시된다. 이로써, 동결 상태의 세포가 분할된다. 스텝 S5에 있어서, 분할 처리가 실시된 세포가 배지와 함께 저류 용기(30) 내에 이송된다.
스텝 S6에 있어서, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포 및 배지가, 교반부(50)을 경유하여 배양 용기(20) 내에 유입된다. 세포 및 배지는, 교반부(50)을 통과함으로써, 교반되어 혼합된다. 이로써, 세포 공급부(100)으로부터 공급된 세포가, 배지 내에 있어서 세포 간의 거리가 균일화된 상태에서 배양 용기(20)에 수용된다.
또한, 상기의 예에서는, 여과 장치(60)에 있어서의 막분리 처리를 1회만으로 하고 있지만, 필요에 따라, 세포 현탁액을 저류 용기(30)과 여과 장치(60)의 사이에서 반복 순환시킴으로써, 막분리 처리의 실시 횟수를 2회 이상으로 해도 된다.
<배지 교환 처리>
세포 배양에 있어서는, 세포로부터 분비되는 단백질 등의 대사물이나 죽은 세포 등에 의하여 배지가 변질된다. 이로 인하여, 배양 기간 내에 있어서의 적절한 시기에, 배양 용기(20) 내에 있어서의 사용이 완료된 배지를, 새로운 배지로 교환하는 배지 교환 처리가 필요해진다. 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)은, 상기의 배지 교환 처리를, 이하와 같이 하여 실시한다. 도 13은, 세포 배양 장치(1)이 배지 교환 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다. 또한, 도 13에 있어서, 세포 및 배지 등의 흐름과, 이하에 나타내는 각 처리 스텝과의 대응이 나타나 있다.
스텝 S11에 있어서, 배양 용기(20)으로부터 세포 및 데브리스를 포함하는 사용이 완료된 배지가 저류 용기(30) 내에 이송된다. 스텝 S12에 있어서, 개폐 밸브(V51 및 V52)가 개방 상태가 되고, 펌프(P10 및 P11)이 구동된다. 이로써, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 여과 장치(60) 내에 유입된다. 여과 장치(60)은, 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액으로부터, 데브리스를 포함하는 사용이 완료된 배지를 제거하는 막분리 처리를 행한다. 사용이 완료된 배지는, 폐액 회수 용기(16) 내에 회수되고, 막분리 처리가 실시된 세포는 저류 용기(30) 내에 회수된다.
스텝 S13에 있어서, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 새로운 배지 A 및 새로운 배지 B가, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저류 용기(30) 내에 유입되어, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포와 합류한다. 배지 A 및 배지 B는, 교반부(51 및 52)를 통과함으로써, 교반되어 혼합된다.
스텝 S14에 있어서, 저류 용기(30)에 저류된 세포 및 새로운 배지가, 교반부(50)을 경유하여 배양 용기(20) 내에 유입된다. 세포 및 새로운 배지는, 교반부(50)을 통과함으로써, 교반되어 혼합된다. 이로써, 세포는, 배지 내에 부유하는 세포 간의 거리가 균일화된 상태에서 배양 용기(20) 내에 수용된다.
또한, 상기의 예에서는, 여과 장치(60)에 있어서의 막분리 처리를 1회만으로 하고 있지만, 필요에 따라, 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액을, 저류 용기(30)과 여과 장치(60)의 사이에서 반복 순환시킴으로써, 막분리 처리의 실시 횟수를 2회 이상으로 해도 된다.
<분할 처리>
다능성 줄기 세포의 배양에 있어서는, 세포를 배양함으로써 발생하는 스피어로 불리는 세포 응집체의 사이즈가 과대해지면, 세포 응집체끼리가 접착 융합하여, 세포가 분화를 개시하거나, 세포 응집체의 중심부의 세포가 괴사하거나 하는 등의 문제가 발생할 수 있다. 따라서, 세포 응집체의 사이즈가 과대해지는 것을 방지하기 위하여, 배양 기간 중의 적절한 시기에, 세포 응집체를 분할하는 분할 처리가 필요해지는 경우가 있다. 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)은, 상기의 분할 처리를, 이하와 같이 하여 실시한다. 또한, 이하의 설명에서는, 분할 처리부(40)에 있어서의 분할 처리가 기계적 분할 처리인 경우를 예시한다. 도 14는, 세포 배양 장치(1)이 분할 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다. 또한, 도 14에 있어서, 세포 및 배지 등의 흐름과, 이하에 나타내는 각 처리 스텝과의 대응이 나타나 있다.
스텝 S21에 있어서, 배양 용기(20)으로부터 세포 및 사용이 완료된 배지가 저류 용기(30) 내에 이송된다. 스텝 S22에 있어서, 개폐 밸브(V51 및 V52)가 개방 상태가 되고, 펌프(P10 및 P11)이 구동된다. 이로써, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 여과 장치(60) 내에 유입된다. 여과 장치(60)은, 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액으로부터 사용이 완료된 배지를 제거하는 막분리 처리를 행한다. 사용이 완료된 배지는, 폐액 회수 용기(16) 내에 회수되고, 막분리 처리가 실시된 세포는 저류 용기(30) 내에 회수된다.
스텝 S23에 있어서, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 새로운 배지 A 및 새로운 배지 B가, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저류 용기(30) 내에 유입되어, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포와 합류한다. 배지 A 및 배지 B는, 교반부(51 및 52)를 통과함으로써, 교반되어 혼합된다.
스텝 S24에 있어서, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포 및 새로운 배지는, 분할 처리부(40) 내에 이송되어, 분할 처리부(40) 내에 있어서 세포 응집체에 대한 분할 처리가 실시된다. 스텝 S25에 있어서, 분할 처리가 실시된 세포가, 배지와 함께 저류 용기(30) 내에 이송된다.
스텝 S26에 있어서, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포 및 배지가, 교반부(50)을 경유하여 배양 용기(20) 내에 유입된다. 세포 및 배지는, 교반부(50)을 통과함으로써, 교반되어 혼합된다. 이로써, 세포는, 배지 내에 부유하는 세포 간의 거리가 균일화된 상태에서 배양 용기(20) 내에 수용된다.
또한, 상기의 예에서는, 여과 장치(60)에 있어서의 막분리 처리를 1회만으로 하고 있지만, 필요에 따라, 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액을 저류 용기(30)과 여과 장치(60)의 사이에서 반복 순환시킴으로써, 막분리 처리의 실시 횟수를 2회 이상으로 해도 된다. 또, 상기의 예에서는, 여과 장치(60)에 있어서의 막분리 처리 및 새로운 배지의 공급을, 분할 처리 전에 실시하고 있지만, 여과 장치(60)에 있어서의 막분리 처리 및 새로운 배지의 공급을, 분할 처리 후에 실시해도 된다.
<동결 처리>
배양된 세포를 회수하여 보존하는 경우, 세포를 보존 용기 내에 회수하여 동결 보존하는 것이 일반적이다. 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)은, 배양된 세포를 회수하여 동결시키는 동결 처리를, 이하와 같이 하여 실시한다. 도 15는, 세포 배양 장치(1)이 동결 처리를 실시하는 경우에 있어서의 세포 및 배지 등의 흐름을 나타내는 도이다. 또한, 도 15에 있어서, 세포 및 배지 등의 흐름과, 이하에 나타내는 각 처리 스텝과의 대응이 나타나 있다.
스텝 S41에 있어서, 배양 용기(20)으로부터 세포 및 사용이 완료된 배지가 저류 용기(30) 내에 이송된다. 스텝 S42에 있어서, 개폐 밸브(V51 및 V52)가 개방 상태가 되고, 펌프(P10 및 P11)이 구동된다. 이로써, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액이, 여과 장치(60) 내에 유입된다. 여과 장치(60)은, 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액으로부터 사용이 완료된 배지를 제거하는 막분리 처리를 행한다. 사용이 완료된 배지는, 폐액 회수 용기(16) 내에 회수되고, 막분리 처리가 실시된 세포는 저류 용기(30) 내에 회수된다.
스텝 S43에 있어서, 동결액 수용부(131)에 수용된 동결액이, 유로(F3) 및 순환 유로(F1)을 경유하여 저류 용기(30) 내에 유입되어, 저류 용기(30) 내에 저류된 세포와 합류한다. 동결액은, 교반부(51 및 52)를 통과함으로써, 교반된다.
스텝 S44에 있어서, 저류 용기(30)에 저류된 세포 및 동결액이, 교반부(50) 및 유로(F5)를 경유하여 동결부(17)의 보존 용기(17a) 내에 수용된다. 세포 및 동결액은, 교반부(50)을 통과함으로써, 교반되어 혼합된다. 동결부(17)은, 보존 용기(17a) 내에 수용된 세포를 동결액과 함께 동결시킨다.
또한, 상기의 예에서는, 여과 장치(60)에 있어서의 막분리 처리를 1회만으로 하고 있지만, 필요에 따라, 세포 및 사용이 완료된 배지를 포함하는 세포 현탁액을 저류 용기(30)과 여과 장치(60)의 사이에서 반복 순환시킴으로써, 막분리 처리의 실시 횟수를 2회 이상으로 해도 된다.
<세포 배양 처리>
세포 배양 장치(1)은, 제어부(18)이 이하에 예시하는 세포 배양 처리 프로그램을 실행함으로써, 세포 배양을, 사람의 손을 거치지 않고 자동으로 행하는 것이 가능하다. 도 16은, 제어부(18)이 실행하는 세포 배양 프로그램에 있어서의 처리의 흐름을 나타내는 플로차트이다.
스텝 S101에 있어서, 제어부(18)은, 상기의 계대 처리를 실행함으로써, 세포 공급부(100)으로부터 공급되는 세포 및 배지 공급부(110)으로부터 공급되는 배지를 배양 용기(20) 내에 수용하고, 세포 배양을 개시한다.
스텝 S102에 있어서, 제어부(18)은, 세포 배양을 개시하고 나서 소정 기간 경과 후에, 상기의 배지 교환 처리(1회째)를 실시함으로써, 배양 용기(20) 내의 사용이 완료된 배지를, 배지 수용부(111 및 114)에 수용된 새로운 배지로 교환하고, 세포 배양을 계속한다.
스텝 S103에 있어서, 제어부(18)은, 1회째의 배지 교환 처리를 실시하고 나서 소정 기간 경과 후에, 상기의 배지 교환 처리(2번째)를 실시함으로써, 배양 용기(20) 내의 사용이 완료된 배지를, 배지 수용부(111 및 114) 내에 수용된 새로운 배지로 교환하고, 세포 배양을 계속한다.
스텝 S104에 있어서, 제어부(18)은, 2번째의 배지 교환 처리를 실시하고 나서 소정 기간 경과 후에, 상기의 분할 처리를 실시함으로써, 세포 응집체를 분할하여 세포 배양을 계속한다.
스텝 S105에 있어서, 제어부(18)은, 상기의 스텝 S102~S104에 있어서의 처리를 1사이클로 하는 배양 사이클의 사이클 수가, 소정 수에 도달했는지 아닌지를 판정한다. 제어부(18)은, 배양 사이클의 사이클 수가 소정 수에 도달하지 않았다고 판정한 경우에는, 처리를 스텝 S102로 되돌린다. 한편, 제어부(18)은, 배양 사이클의 사이클 수가 소정의 사이클 수에 도달했다고 판정한 경우에는, 처리를 스텝 S106으로 진행시킨다. 배양 사이클의 진행과 함께, 세포의 배양 스케일은 증대된다.
스텝 S106에 있어서, 제어부(18)은, 상기의 동결 처리를 실시함으로써 배양된 세포를 동결부(17)의 보존 용기(17a) 내에 수용하여 동결 보존한다.
또한, 상기의 예에서는, 배양 사이클의 1사이클 내에 있어서, 배지 교환 처리를 2회 실시하고 있지만, 배양 사이클의 1사이클 내에 있어서의 배지 교환 처리의 실시 횟수는, 적절히 변경하는 것이 가능하다.
본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)에 의하면, 배지 교환 처리나 분할 처리 등의 세포 배양에 있어서 필요로 하는 일련의 처리를 폐쇄계에 있어서 연속적으로 실시하는 것이 가능해진다. 이로써, 균질한 세포의 대량 생산이 가능해진다. 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)에 의하면, 계대 처리부터 동결 처리까지의 세포 배양에 필요한 일련의 처리를 사람의 손을 거치지 않고 행하는 것이 가능하다. 또한, 본 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(1)을, 다능성 줄기 세포 이외의 세포, 및 다능성 줄기 세포 유래의 세포 이외의 세포의 배양에 이용하는 것도 가능하다.
[제2 예시적 실시형태]
본 개시에 관한 막분리 방법은, 비인간 세포에 있어서, 항체를 발현시키기 위한 세포 배양에 적용할 수 있다. 본 개시에 관한 막분리 방법을 이용하여, 배양 용기 내에서 배양되고 있는 비인간 세포를 포함하는 세포 현탁액으로부터 데브리스를 제거함으로써, 항체의 발현 효율을 높일 수 있다.
항체의 발현에 이용하는 세포로서는, 특별히 한정되지 않지만, 동물 세포(비인간 세포), 식물 세포, 효모 등의 진핵 세포, 고초균 등의 원핵 세포 및 대장균 등을 들 수 있다. CHO 세포, BHK-21 세포 및 SP2/0-Ag14 세포 등의 동물 세포(비인간 세포)가 바람직하고, CHO 세포가 보다 바람직하다.
비인간 세포에 있어서, 발현시키는 항체로서는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 항IL-6 리셉터 항체, 항IL-6 항체, 항글리피칸-3 항체, 항CD3 항체, 항CD20 항체, 항GPIIb/IIIa 항체, 항TNF 항체, 항CD25 항체, 항EGFR 항체, 항Her2/neu 항체, 항RSV 항체, 항CD33 항체, 항CD52 항체, 항IgE 항체, 항CD11a 항체, 항VEGF 항체 및 항VLA4 항체 등을 들 수 있다. 항체로서는, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 토끼 및 원숭이 등의 동물 유래의 모노클로널 항체뿐만 아니라, 키메라 항체, 인간화 항체 및 bispecific 항체 등 인위적으로 개변한 항체도 포함한다.
얻어진 항체 또는 그 단편은, 균일하게까지 정제할 수 있다. 항체 또는 그 단편의 분리 및 정제는 통상의 폴리펩타이드로 사용되고 있는 분리 및 정제 방법을 사용하면 된다. 예를 들면, 어피니티 크로마토그래피 등의 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외 여과, 염석, 투석, SDS 폴리아크릴아마이드 젤 전기 영동 및 등전점 전기 영동 등을 적절히 선택, 조합하면, 항체를 분리 및 정제할 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다. 얻어진 항체의 농도 측정은 흡광도의 측정 또는 효소 결합 면역 흡착 검정법(Enzyme-linked immunosorbent assay; ELISA) 등에 의하여 행할 수 있다.
도 17은, 막분리 처리를 적절히 실시하면서, 비인간 세포에 있어서 항체를 발현시키기 위한 세포 배양을 행하는, 본 개시의 제2 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(2)의 구성의 일례를 나타내는 도이다. 세포 배양 장치(2)는, 여과 장치(60C), 세포 배양 용기(610), 배지 수용부(620), 회수 용기(630)을 포함하여 구성되어 있다.
여과 장치(60C)의 기본 구성은, 상기한 제1 예시적 실시형태에 관한 여과 장치(60)(도 1 참조)과 동일하다. 여과 장치(60C)는, 항체를 발현할 수 있는 단일 세포로서의 비인간 세포와, 데브리스를 여과막(600)을 이용하여 분리하는 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 장치이다.
여과 장치(60C)는, 용기 내의 공간을 공급 측(604)과 투과 측(605)로 이격하는 여과막(600)을 구비한다. 여과막(600)의 전형 구조는, 도 2에 나타나는 여과막(61)의 구조와 동일하다. 이하, 여과막(600)의 구조에 대하여 언급하는 경우에 도 2를 적절히 참조한다. 여과막(600)으로서, 예를 들면, 도 3a에 나타내는, 섬유 형상 부재를 능첩직하여 형성되는 능첩직 메시(61A)를 적합하게 이용할 수 있다. 또, 여과막(600)으로서, 도 4에 나타내는, 2매의 평직 메시(61b, 61c)를 적층함으로써 형성되는 적층 메시(61D)를 적합하게 이용할 수 있다.
여과 장치(60C)는, 공급 측(604)에 세포 현탁액을 유입 및 유출시키기 위한 유통구(601 및 602)를 갖고, 투과 측(605)에 배출된 데브리스를 회수 용기(630)에 배출시키기 위한 배출구(603)을 갖는다. 유통구(601)에는, 배관(T2)의 일단이 접속되어 있으며, 배관(T2)의 타단은 세포 배양 용기(610)에 접속되어 있다. 또, 유통구(602)에는, 배관(T1)의 일단이 접속되어 있으며, 배선(T1)의 타단은 왕복동 펌프(P101)에 접속되어 있다. 배출구(603)에는, 배관(T3)의 일단이 접속되어 있으며, 배관(T3)의 타단은, 회수 용기(603)에 접속되어 있다. 배관(T3) 상에는 인출 펌프(P103)이 마련되어 있다. 세포 배양 용기(610)과 배지 수용부(620)은 배관(T4)에 의하여 접속되어 있으며, 배관(T4) 상에는 액송 펌프(P102)가 마련되어 있다. 배관(T1~T4)는, 예를 들면, 실리콘 튜브 등의 관 형상 부재로 구성되어 있다.
세포 배양 장치(2)는, 압력 센서(701~703)을 구비하고, 각부의 게이지압이 모니터된다. 압력 센서(701)에 의하여, 배관(T1) 내의 유통구(602) 근방의 게이지압이 모니터된다. 압력 센서(702)에 의하여, 배관(T2) 내의 유통구(601) 근방의 게이지압이 모니터된다. 압력 센서(703)에 의하여, 배관(T3) 내의 배출구(603) 근방의 게이지압이 모니터된다. 즉, 압력 센서(701 및 702)에 의하여 여과막(600)의 공급 측(604)의 막면에 가해지는 게이지압이 모니터되고, 압력 센서(703)에 의하여 여과막(600)의 투과 측(605)의 막면에 가해지는 게이지압이 모니터된다.
세포 배양 용기(610)에서는, 항체를 발현할 수 있는 단일 세포로서의 비인간 세포가 배양된다. 여과 장치(60C)는, 세포 배양 용기(610) 내에서 배양된 비인간 세포 및 데브리스를 포함하는 세포 현탁액의 막분리 처리를 행한다.
왕복동 펌프(P101), 액송 펌프(P102) 및 인출 펌프(P103)이 가동함으로써, 세포 배양 용기(610) 내의 세포 현탁액이 유통구(601)로부터 여과 장치(60C)의 내부에 유입된다. 왕복동 펌프(P101)의 왕복 동작에 의하여, 여과 장치(60C)의 내부에 유입된 세포 현탁액은, 여과막(600)의 공급 측(604)의 막면을 따라 왕복 이동한다. 세포 현탁액이, 여과막(600) 상을 흐르는 동안, 세포 현탁액에 포함되는 비교적 사이즈가 작은 데브리스는, 배지 등의 액체와 함께 여과막(600)을 투과하여 투과 측(605)에 배출된다. 투과 측(605)에 배출된 데브리스는, 배관(T3)을 경유하여 회수 용기(630)에 회수된다. 한편, 세포 현탁액에 포함되는 비교적 사이즈가 큰 단일 세포로서의 비인간 세포는, 여과막(600)을 투과하지 않고, 세포 배양 용기(610) 내에 회수된다. 배지 수용부(620)으로부터는, 회수 용기(630)에 회수된 여액의 양에 따른 양의 신선 배지가 세포 배양 용기(610)에 공급된다.
단일 세포로서의 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 막분리 처리에 있어서, 여과막(600)을 이용함으로써, 여과 장치(60C)의 공급 측(604)를 여과막(600)의 막면을 따라 흐르는 비인간 세포는, 공급 측의 개구(OP1)(도 2 참조)로부터 여과막(600)의 내부에 침입할 수 있다. 그러나, 여과막(600)의 투과 측의 개구(OP2)(도 2 참조)는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 어긋난 위치에 배치되어 있으므로, 혹은 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이므로, 여과막(600)의 내부에 침입한 비인간 세포는, 데브리스와 비교하여 투과 측에 용이하게 유출할 수 없다. 한편, 데브리스는, 비인간 세포의 사이즈보다 작기 때문에, 여과막(600)의 투과 측에 용이하게 유출할 수 있다. 또, 데브리스는 여과막(600)의 개구(OP1)에 침입한 비인간 세포의 측면을 빠져나가 투과 측에 유출할 수도 있다. 본 예시적 실시형태에 관한 여과막(600)에 의하면, 투과 측의 개구(OP2)는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 어긋난 위치에 배치되어 있으므로, 혹은 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이므로, 여과막(600)의 내부에 침입한 비인간 세포의 투과 측으로의 유출이 억제되어, 비인간 세포와, 데브리스를 적절히 분리할 수 있다. 또, 본 예시적 실시형태에 관한 여과막(600)에 의하면, 비인간 세포는, 여과막(600)의 두께 방향에 있어서의 심부로까지 침입하는 것이 어려워지기 때문에, 여과막(600)의 폐색(막힘)을 억제할 수 있으며, 또, 막분리 처리에 있어서 비인간 세포가 받는 데미지를 작게 할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 경우, 여과막(600)의 개구(OP1 및 OP2)(도 2 참조)의 직경은, 비인간 세포의 직경의 0.1배 이상 2배 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.15배 이상 1배 이하, 더 바람직하게는 0.2배 이상 0.8배 이하이다. 개구(OP1 및 OP2)의 직경을 비인간 세포의 직경의 0.1배 이상으로 함으로써, 세포 현탁액 중에 포함되는 비인간 세포 및 데브리스 중, 데브리스를 적절히 투과 측에 배출할 수 있다. 개구(OP1 및 OP2)의 직경을 비인간 세포의 직경의 2배 이하로 함으로써, 여과막(600) 표면에 비인간 세포가 포착되는 것을 억제함과 함께, 비인간 세포의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 경우에는, 여과막(600)의 개구(OP1 및 OP2)(도 2 참조)의 직경의 균일성이 확보되어 있는 것이 바람직하다. 즉, 여과막(600)의 개구(OP1 및 OP2)의 직경의 분포에 있어서의 평균값을 X, 표준 편차를 σ로 했을 때, σ/X로 나타나는 변동률은, 0<σ/X≤0.1을 충족시키는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0<σ/X≤0.05, 더 바람직하게는 0<σ/X≤0.02이다. 0<σ/X≤0.1을 충족시킴으로써, 비인간 세포의 투과 측으로의 배출을 억제하면서 데브리스를 투과 측에 배출시키는 것이 가능해진다. 또한, σ 및 X는, 수은 압입법에 의하여 측정하고, 기존의 통계 해석 수법에 의하여 구할 수 있다.
여과 장치(600)을 이용하여 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하고 있는 동안, 여과막(600)의 공급 측(604)의 면에 가해지는 압력과, 여과막(600)의 투과 측(605)의 면에 가해지는 압력의 차분인 막면 차압을, 0.01킬로파스칼 이상 60킬로파스칼 이하로 하는 것이 바람직하다. 여과막(600)의 막면 차압을 0.01킬로파스칼 이상으로 함으로써, 데브리스를 공급 측으로부터 투과 측에 적절히 배출하는 것이 가능해진다. 또, 여과막(600)의 막면 차압을 60킬로파스칼 이하로 함으로써, 비인간 세포의 여과막에 의한 분할(파쇄)을 억제하면서 막분리 처리를 행할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 경우에는, 여과막(600)의 막두께는, 150μm 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100μm 이하이며, 더 바람직하게는 80μm 이하이다. 여과막(600)의 막두께를 150μm 이하로 함으로써, 세포가 여과막(600)에 의하여 보충됨으로써, 막힘이 발생할 리스크 및 세포가 데미지를 받을 리스크를 경감할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 경우에는, 여과막(600)의 공급 측(604)에 가해지는 게이지압이 -70킬로파스칼 이상 70킬로파스칼 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 -40킬로파스칼 이상 40킬로파스칼 이하이며, 더 바람직하게는 -20킬로파스칼 이상 20킬로파스칼 이하이다. 여과막(600)의 공급 측(604)에 가해지는 게이지압을 -70킬로파스칼 이상 70킬로파스칼 이하로 함으로써, 비인간 세포가 데미지를 받을 리스크를 경감할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 경우에는, 단일 세포로서의 비인간 세포의 직경은, 5μm 이상 25μm 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 7μm 이상 22μm 이하이며, 더 바람직하게는 8μm 이상 20μm 이하이다. 비인간 세포의 직경을, 5μm 이상 25μm 이하로 함으로써, 비인간 세포와 데브리스의 막분리가 용이해진다.
여과막(600)을 이용하여, 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 경우에는, 여과막(600)을 투과한 여액에 포함되는, 비인간 세포의 개수 밀도[개/ml]가, 여과막(600)을 투과하기 전의 세포 현탁액에 포함되는, 비인간 세포의 개수 밀도[개/ml]의 50% 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 20% 이하이며, 더 바람직하게는 5% 이하이다.
여과막(600)을 이용하여, 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 경우에는, 여과막(600)을 투과한 여액에 포함되는, 비인간 세포의 직경의 1/10 이상 1/2 이하의 직경의 데브리스의 개수 밀도[개/ml]가, 여과막(600)을 투과하기 전의 세포 현탁액에 포함되는, 비인간 세포의 직경의 1/10 이상 1/2 이하의 직경의 데브리스의 개수 밀도[개/ml]의 50% 이상 100% 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 70% 이상 100% 이하이며, 더 바람직하게는 80% 이상 100% 이하이다.
또, 도 17에 나타내는 세포 배양 장치(2)에 있어서, 세포 배양 용기(610) 내의 세포 현탁액의 액량을 L로 하고, 막분리 처리에 있어서 여과막(600)을 투과한 여액의 1일당 액량을 N으로 했을 때에, 0.1≤N/L≤6을 충족시키는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.15≤N/L≤5이며, 더 바람직하게는 0.2≤N/L≤4.5이다. 0.1≤N/L≤6을 충족시킴으로써, 세포 배양 용기(610)에 수용된 세포 현탁액으로부터 데브리스를 효율적으로 추출할 수 있으며, 세포가 데미지를 받을 리스크를 경감할 수 있다.
[제3 예시적 실시형태]
본 개시에 관한 막분리 방법은, 거핵구 세포에 있어서, 혈소판을 산생시키기 위한 세포 배양에 적용할 수 있다. 본 개시에 관한 막분리 방법을 이용하여, 배양 용기 내에서 배양되어 있는 거핵구 세포 및 혈소판을 포함하는 세포 현탁액으로부터 혈소판을 분리함으로써, 혈소판을 분리 회수할 수 있다. 혈소판 분리 후의 배양 용기 내에서 혈소판 산생능을 갖는 거핵구 세포를 배양함으로써, 배양 후에 얻어지는 총 혈소판 용량을 높일 수 있다.
거핵구 및 혈소판은, 성체 조직으로부터 채취한 거핵구 및 혈소판이어도 되고, 다능성 줄기 세포, 조혈 전구 세포 또는 간엽계 세포 등의 분화능을 갖는 세포로부터 분화시킨 거핵구 및 혈소판이어도 되며, 통상의 방법에서는 거핵구로의 분화능을 갖지 않는 세포에 다이렉트 리프로그래밍 기술을 이용함으로써 제작된 거핵구 및 혈소판이어도 되고, 상기를 조합한 것이어도 된다.
거핵구 및 혈소판이 유래하는 생물종은 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 포유 동물(예를 들면, 인간, 마우스, 래트, 햄스터, 모르모트, 양, 돼지, 원숭이 등)이며, 보다 바람직하게는 인간이다.
다능성 줄기 세포로서는, 배성 줄기 세포(ES 세포), 핵이식 배성 줄기 세포(ntES 세포), 및 인공 다능성 줄기 세포(iPS 세포) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
조혈 전구 세포로서는, 골수 유래, 제대혈 유래, 동원(G-CSF) 말초혈, ES 세포 유래 중폐엽계 세포 또는 말초혈 유래 세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 이들 조혈 전구 세포로서는, 예를 들면, CD34 양성인 것(예를 들면 CD34＋ 세포, CD133＋ 세포, SP 세포, CD34＋CD38- 세포, c-kit＋ 세포 혹은 CD3-, CD4-, CD8- 및 CD34＋ 세포인 것)을 들 수 있다(국제 공개 WO2004/110139).
간엽계 세포로서는, 예를 들면, 간엽계 간세포 및 지방 전구 세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
통상의 방법에서는 거핵구로의 분화능을 갖지 않는 세포로서는, 예를 들면, 섬유아 세포 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
다능성 줄기 세포, 조혈 전구 세포 또는 간엽계 세포 등의 분화능을 갖는 세포를 분화시킴으로써 거핵구 및 혈소판을 산생하는 방법은, 당업자에게 일반적으로 알려진 방법에 따라 행하면 되고, 특별히 한정되지 않는다. 분화능을 갖는 세포를, 거핵구로 분화시키는 데에 적합한 분화 유도 배지를 이용하여 적절한 배양 조건하에 있어서 배양함으로써, 분화능을 갖는 세포를 거핵구로 분화시킬 수 있으며, 거핵구로부터 나아가 혈소판이 산생되게 된다. 통상의 방법에서는 거핵구로의 분화능을 갖지 않는 세포에 다이렉트 리프로그래밍 기술을 이용함으로써 거핵구 및 혈소판을 산생하는 방법으로서는, 거핵구로의 유도 유전자를 발현하도록 유전자 도입하거나, 또는 특정의 핵산, 단백질 혹은 저분자 화합물 등을 배양액 중에 첨가함으로써, 통상의 방법에서는 거핵구로의 분화능을 갖지 않는 세포를 거핵구로 분화함으로써 거핵구로 분화시킬 수 있다.
도 17은, 막분리 처리를 적절히 실시하면서, 거핵구 세포에 있어서 혈소판을 산생시키기 위한 세포 배양을 행하는, 본 개시의 제3 예시적 실시형태에 관한 세포 배양 장치(2)의 구성의 일례를 나타내는 도이다. 세포 배양 장치(2)는, 여과 장치(60C), 세포 배양 용기(610), 배지 수용부(620), 회수 용기(630)을 포함하여 구성되어 있다.
여과 장치(60C)의 기본 구성은, 상기한 제1 예시적 실시형태에 관한 여과 장치(60)(도 1 참조)과 동일하다. 여과 장치(60C)는, 혈소판을 산생할 수 있는 단일 세포로서의 거핵구 세포와, 혈소판을 여과막(600)을 이용하여 분리하는 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 장치이다.
여과 장치(60C)는, 용기 내의 공간을 공급 측(604)와 투과 측(605)로 이격하는 여과막(600)을 구비한다. 여과막(600)의 전형 구조는, 도 2에 나타나는 여과막(61)의 구조와 동일하다. 이하, 여과막(600)의 구조에 대하여 언급하는 경우에 도 2를 적절히 참조한다. 여과막(600)으로서, 예를 들면, 도 3a에 나타내는, 섬유 형상 부재를 능첩직하여 형성되는 능첩직 메시(61A)를 적합하게 이용할 수 있다. 또, 여과막(600)으로서, 도 4에 나타내는, 2매의 평직 메시(61b, 61c)를 적층함으로써 형성되는 적층 메시(61D)를 적합하게 이용할 수 있다.
여과 장치(60C)는, 공급 측(604)에 세포 현탁액을 유입 및 유출시키기 위한 유통구(601 및 602)를 갖고, 투과 측(605)에 배출된 혈소판을 회수 용기(630)에 배출시키기 위한 배출구(603)을 갖는다. 유통구(601)에는, 배관(T2)의 일단이 접속되어 있으며, 배관(T2)의 타단은 세포 배양 용기(610)에 접속되어 있다. 또, 유통구(602)에는, 배관(T1)의 일단이 접속되어 있으며, 배선(T1)의 타단은 왕복동 펌프(P101)에 접속되어 있다. 배출구(603)에는, 배관(T3)의 일단이 접속되어 있으며, 배관(T3)의 타단은, 회수 용기(603)에 접속되어 있다. 배관(T3) 상에는 인출 펌프(P103)이 마련되어 있다. 세포 배양 용기(610)과 배지 수용부(620)은 배관(T4)에 의하여 접속되어 있으며, 배관(T4) 상에는 액송 펌프(P102)가 마련되어 있다. 배관(T1~T4)는, 예를 들면, 실리콘 튜브 등의 관 형상 부재로 구성되어 있다.
세포 배양 장치(2)는, 압력 센서(701~703)을 구비하고, 각부의 게이지압이 모니터된다. 압력 센서(701)에 의하여, 배관(T1) 내의 유통구(602) 근방의 게이지압이 모니터된다. 압력 센서(702)에 의하여, 배관(T2) 내의 유통구(601) 근방의 게이지압이 모니터된다. 압력 센서(703)에 의하여, 배관(T3) 내의 배출구(603) 근방의 게이지압이 모니터된다. 즉, 압력 센서(701 및 702)에 의하여 여과막(600)의 공급 측(604)의 막면에 가해지는 게이지압이 모니터되고, 압력 센서(703)에 의하여 여과막(600)의 투과 측(605)의 막면에 가해지는 게이지압이 모니터된다.
세포 배양 용기(610)에서는, 혈소판을 산생할 수 있는 단일 세포로서의 거핵구 세포가 배양된다. 여과 장치(60C)는, 세포 배양 용기(610) 내에서 배양된 거핵구 세포 및 혈소판을 포함하는 세포 현탁액의 막분리 처리를 행한다.
왕복동 펌프(P101), 액송 펌프(P102) 및 인출 펌프(P103)이 가동함으로써, 세포 배양 용기(610) 내의 세포 현탁액이 유통구(601)로부터 여과 장치(60C)의 내부에 유입된다. 왕복동 펌프(P101)의 왕복 동작에 의하여, 여과 장치(60C)의 내부에 유입된 세포 현탁액은, 여과막(600)의 공급 측(604)의 막면을 따라 왕복 이동한다. 세포 현탁액이, 여과막(600) 상을 흐르는 동안, 세포 현탁액에 포함되는 비교적 사이즈가 작은 혈소판은, 배지 등의 액체와 함께 여과막(600)을 투과하여 투과 측(605)에 배출된다. 투과 측(605)에 배출된 혈소판은, 배관(T3)을 경유하여 회수 용기(630)에 회수된다. 한편, 세포 현탁액에 포함되는 비교적 사이즈가 큰 단일 세포로서의 거핵구 세포는, 여과막(600)을 투과하지 않고, 세포 배양 용기(610) 내에 회수된다. 배지 수용부(620)으로부터는, 회수 용기(630)에 회수된 여액의 양에 따른 양의 신선 배지가 세포 배양 용기(610)에 공급된다.
단일 세포로서의 거핵구 세포와 혈소판을 분리하는 막분리 처리에 있어서, 여과막(600)을 이용함으로써, 여과 장치(60C)의 공급 측(604)를 여과막(600)의 막면을 따라 흐르는 거핵구 세포는, 공급 측의 개구(OP1)(도 2 참조)로부터 여과막(600)의 내부에 침입할 수 있다. 그러나, 여과막(600)의 투과 측의 개구(OP2)(도 2 참조)는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 어긋난 위치에 배치되어 있으므로, 혹은 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이므로, 여과막(600)의 내부에 침입한 거핵구는, 혈소판과 비교하여 투과 측에 용이하게 유출할 수 없다. 한편, 혈소판은, 거핵구 세포의 사이즈보다 작기 때문에, 여과막(600)의 투과 측에 용이하게 유출할 수 있다. 또, 혈소판은 여과막(600)의 개구(OP1)에 침입한 거핵구 세포의 측면을 빠져나가 투과 측에 유출할 수도 있다. 본 예시적 실시형태에 관한 여과막(600)에 의하면, 투과 측의 개구(OP2)는, 공급 측의 개구(OP1)로부터 어긋난 위치에 배치되어 있으므로, 혹은 개구(OP1)과 개구(OP2)를 접속하는 경로가 비직선 형상이므로, 여과막(600)의 내부에 침입한 거핵구 세포의 투과 측으로의 유출이 억제되어, 거핵구 세포와 혈소판을 적절히 분리할 수 있다. 또, 본 예시적 실시형태에 관한 여과막(600)에 의하면, 거핵구 세포는, 여과막(600)의 두께 방향에 있어서의 심부로까지 침입하는 것이 어려워지기 때문에, 여과막(600)의 폐색(막힘)을 억제할 수 있으며, 또, 막분리 처리에 있어서 거핵구 세포가 받는 데미지를 작게 할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 거핵구 세포와 혈소판을 분리하는 경우, 여과막(600)의 개구(OP1 및 OP2)(도 2 참조)의 직경은, 거핵구 세포의 직경의 0.05배 이상 2배 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.1배 이상 1배 이하, 더 바람직하게는 0.1배 이상 0.8배 이하이다. 개구(OP1 및 OP2)의 직경을 거핵구 세포의 직경의 0.05배 이상으로 함으로써, 세포 현탁액 중에 포함되는 거핵구 세포 및 혈소판 중, 혈소판을 적절히 투과 측에 배출할 수 있다. 개구(OP1 및 OP2)의 직경을 거핵구 세포의 직경의 2배 이하로 함으로써, 여과막(600) 표면에 거핵구 세포가 포착되는 것을 억제함과 함께, 거핵구 세포의 투과 측으로의 유출을 억제할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 거핵구 세포와 혈소판을 분리하는 경우에는, 여과막(600)의 개구(OP1 및 OP2)(도 2 참조)의 직경의 균일성이 확보되어 있는 것이 바람직하다. 즉, 여과막(600)의 개구(OP1 및 OP2)의 직경의 분포에 있어서의 평균값을 X, 표준 편차를 σ로 했을 때에, σ/X로 나타나는 변동률은, 0<σ/X≤0.1을 충족시키는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0<σ/X≤0.05, 더 바람직하게는 0<σ/X≤0.02이다. 0<σ/X≤0.1을 충족시킴으로써, 거핵구 세포의 투과 측으로의 배출을 억제하면서 혈소판을 투과 측에 배출시키는 것이 가능해진다. 또한, σ 및 X는, 수은 압입법에 의하여 측정하고, 기존의 통계 해석 수법에 의하여 구할 수 있다.
여과 장치(600)을 이용하여 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하고 있는 동안, 여과막(600)의 공급 측(604)의 면에 가해지는 압력과, 여과막(600)의 투과 측(605)의 면에 가해지는 압력의 차분인 막면 차압을, 0.01킬로파스칼 이상 60킬로파스칼 이하로 하는 것이 바람직하다. 여과막(600)의 막면 차압을 0.01킬로파스칼 이상으로 함으로써, 혈소판을 공급 측으로부터 투과 측에 적절히 배출하는 것이 가능해진다. 또, 여과막(600)의 막면 차압을 60킬로파스칼 이하로 함으로써, 거핵구 세포의 여과막에 의한 분할(파쇄)을 억제하면서 막분리 처리를 행할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 거핵구 세포와 혈소판을 분리하는 경우에는, 여과막(600)의 막두께는, 150μm 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 100μm 이하이며, 더 바람직하게는 80μm 이하이다. 여과막(600)의 막두께를 150μm 이하로 함으로써, 세포가 여과막(600)에 의하여 보충됨으로써, 막힘이 발생할 리스크 및 세포가 데미지를 받을 리스크를 경감할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 거핵구 세포와 혈소판을 분리하는 경우에는, 여과막(600)의 공급 측(604)에 가해지는 게이지압이 -70킬로파스칼 이상 70킬로파스칼 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 -40킬로파스칼 이상 40킬로파스칼 이하이며, 더 바람직하게는 -20킬로파스칼 이상 20킬로파스칼 이하이다. 여과막(600)의 공급 측(604)에 가해지는 게이지압을 -70킬로파스칼 이상 70킬로파스칼 이하로 함으로써, 거핵구 세포가 데미지를 받을 리스크를 경감할 수 있다.
여과막(600)을 이용하여, 거핵구 세포와 혈소판을 분리하는 경우에는, 단일 세포로서의 거핵구 세포의 직경은, 5μm 이상 40μm 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 7μm 이상 30μm 이하이다. 혈소판의 직경은, 1μm 이상 5μm 이하가 바람직하고, 보다 바람직하게는 2μm 이상 4μm 이하이다.
여과막(600)을 이용하여, 거핵구 세포와 혈소판을 분리하는 경우에는, 여과막(600)을 투과한 여액에 포함되는, 거핵구 세포의 개수 밀도[개/ml]가, 여과막(600)을 투과하기 전의 세포 현탁액에 포함되는, 거핵구 세포의 개수 밀도[개/ml]의 10% 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 5% 이하이며, 더 바람직하게는 1% 이하이다.
여과막(600)을 이용하여, 거핵구 세포와 혈소판을 분리하는 경우에는, 여과막(600)을 투과한 여액에 포함되는, 혈소판의 개수 밀도[개/ml]가, 여과막(600)을 투과하기 전의 세포 현탁액에 포함되는, 혈소판의 개수 밀도[개/ml]의 50% 이상 100% 이하인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 80% 이상 100% 이하이며, 더 바람직하게는 90% 이상 100% 이하이다.
또, 도 17에 나타내는 세포 배양 장치(2)에 있어서, 세포 배양 용기(610) 내의 세포 현탁액의 액량을 L로 하고, 막분리 처리에 있어서 여과막(600)을 투과한 여액의 1일당 액량을 N으로 했을 때, 0.1≤N/L≤6을 충족시키는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 0.15≤N/L≤5이며, 더 바람직하게는 0.2≤N/L≤4.5이다. 0.1≤N/L≤6을 충족시킴으로써, 세포 배양 용기(610)에 수용된 세포 현탁액으로부터 혈소판을 효율적으로 추출할 수 있으며, 세포가 데미지를 받을 리스크를 경감할 수 있다.
이하에 실시예와 비교예를 들어 본 개시에 대하여 더 구체적으로 설명한다. 이하의 각 실시예에 나타내는 재료, 사용량, 비율, 처리 내용, 처리 절차 등은, 본 개시의 취지를 일탈하지 않는 한 적절히 변경할 수 있다. 따라서, 본 개시의 범위는 이하에 나타내는 구체예에 의하여 한정적으로 해석되지 않는다.
실시예 1
실시예 1은, 세포 응집체, 단일 세포 및 데브리스를 포함하는 세포 현탁액에 막분리 처리를 실시함으로써, 세포 응집체와, 단일 세포 및 데브리스를 분리하는 경우에 관한 것이다.
하기에 있어서, 물질 농도에 관하여 "M"은 몰 농도를 나타내며, 1M=1mol/L이다.
하기에 있어서, "PBS"란, 인산 완충액(phosphate buffered saline)을 의미하고, "IMDM"이란, 이스코브 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium)를 의미한다.
하기에 있어서, "스피어"란, 구상의 세포 응집체를 의미한다.
<재료>
[인간 인공 다능성 줄기 세포주(hiPS 세포주)]
·253G1. 가부시키가이샤 iPS 포털(일본 교토후 교토시 가미교구 가와라마치도오리 이마데가와 사가루 가지쵸 448번지 5)로부터 분양.
[기본 배지 및 배지 첨가제]
·TeSR-E8, STEMCELL Technologies사의 모델 번호 ST-05940.
·3% 메틸셀룰로스액(IMDM 중. 메틸셀룰로스 농도는 w/v%), R&D Systems사의 모델 번호 HSC001.
·10mM Y-27632액. Y-27632(ROCK 저해제, Sigma-Aldrich의 모델 번호 Y0503)를 둘베코 PBS(Ca, Mg 불포함)에 용해시킨 용액.
[배지]
·배지 1: TeSR-E8 450mL에 3% 메틸셀룰로스액 50mL를 첨가하여 잘 교반하고, 10mM Y-27632액을, Y-27632의 종농도(終濃度)가 10μM가 되는 양을 첨가하여 조제했다.
·배지 2: TeSR-E8 450mL에 3% 메틸셀룰로스액 50mL를 첨가하여 잘 교반하여 조제했다.
[배양 디시 및 원심 튜브]
·Ultra-Low Attachment Plate, Corning사의 모델 번호 Costar3471. 6웰, 덮개 장착.
·15mL 원심 튜브, Thermo Scientific사의 모델 번호 339650.
<평면으로부터의 박리 및 스피어의 제작>
70% 콘플루언트 상태에 평면 배양된 hiPS 세포주 253G1을, 둘베코 PBS(Ca, Mg 불포함)에 의하여 린스한 후, 0.5M의 EDTA(에틸렌다이아민 사아세트산) 용액에 의하여 평면으로부터 박리했다. 이어서, 배지 1에 의하여 치환하고, Ultra-Low Attachment Plate에 세포를 배지째 이동시켜, 37℃, CO2 가스 농도 5%의 인큐베이터 내에 정치했다.
배양 개시부터 1일 후 내지 2일 후에 배지 2를 이용하여 배지 교환을 행하고, 직경 50~300μm의 스피어를 포함하는 세포 현탁액을 300mL 제작했다. Ultra-Low Attachment Plate를 인큐베이터로부터 취출하여, 평면 상에서 세로 및 가로로 움직여 스피어를 웰 내에서 균일하게 분산시켰다. 그 후, 300mL의 스피어를 포함하는 세포 현탁액을 1mL의 튜브로 이동시켜, 이것에 700μl의 TeSR-E8를 첨가하고 4000rpm, 3분의 원심 분리 처리를 행하여, 상등액을 제거했다. 그 후, 세포 현탁액에 300μL의 TrypLE Select(GIBCO사제 모델 번호 12563)를 첨가하여, 볼텍스 믹서로 교반하고, 37℃의 분위기 중에 3분간 정치한 후, 재차 볼텍스 믹서로 교반했다. 도 17a는, 이상의 처리에 의하여 얻어진 세포 현탁액의 현미경 사진이다. 이상의 처리에 의하여 얻어진 세포 현탁액을 뉴클레오카운터(chemometec사제 모델 번호 NC200)에 의하여 세포 수를 측정한바 1.5×106개/mL였다. 또, 세포의 Viability는, 92.2%였다.
<막분리 처리>
이상의 처리에 의하여 얻어진 세포 현탁액을 표 1에 나타내는 각 조건으로 막분리 처리를 행했다. 막분리 처리는, 밀폐 공간을 형성하는 멸균된 여과 모듈을 이용하여 행했다. 여과 모듈 내에는, 여과막이 배치되어 있다. 여과 모듈의 유입구로부터 유출구를 향하여 여과막의 막면을 따라 세포 현탁액을 흐르게 하는 탄젠셜 플로 방식에 의한 막분리 처리를 행했다.
튜브 커넥터의 일단에 여과 모듈의 투과 측(여과 측)을 접속하고, 튜브 커넥터의 타단에 루어락 타입의 튜브 커넥터를 개재하여 시린지(데루모사제 모델 번호 SS50-LZ)를 접속했다. 시린지 펌프(Harvard사제 모델 번호 PHD-2000)를 이용하여 시린지의 흡인 속도를 제어함으로써 여과 유속을 변화시키고, 여과막의 막면 차압을 변화시켰다. 여과막은 표 1에 나타내는 메시, 개구 직경을 갖는 것을 사용했다. 여과막의 개구 직경은 표준 입자에 의한 여과 시험을 행하고, 저지율 95%가 되는 입자경(즉, 입자 투과 시험에 의한 95% 분리 입자경)으로 하여 구했다.
<각 실시예의 차이점>
각 실시예에 있어서, 여과막 및 막 간 차압을 표 1과 같이 상위시켰다. 실시예 1-1~1-9 및 참고예 1-1~1-2에서는 능첩직 메시로 구성된 여과막을 이용했다. 실시예 1-10에서는, 2매의 평직 메시를, 그물코 위치를 서로 어긋나게 하여 적층하여 구성된 여과막을 이용했다. 비교예 1-1, 1-2에서는, 1매의 평직 메시로 구성된 여과막을 이용했다. 실시예 1-1~1-10, 비교예 1-1~1-2, 참고예 1-1~1-2에 있어서 여과막으로서 사용한 메시의 소재는 스테인리스강재 SUS316이다.
<막 간 차압의 측정>
여과 모듈의 유입구의 압력(M1), 유출구의 압력(M2), 투과 측(여액 측)의 압력(M3)을 압력 센서(스펙트럼사제 모델 번호 ACPM49903N)로 측정하고, (1) 식을 이용하여 여과막의 막면 차압 ΔM을 산출했다.
<세포 직경의 측정>
막분리 처리 전의 세포 현탁액을 채취하고, BECKMAN COULTER사의 Vi-CELL에 의하여 세포의 평균 직경을 구했다.
<막분리 처리의 판정>
막분리 처리에 의하여 얻어진 농축액, 투과 측에 배출된 여액 및 막분리 처리 후의 여과막의 표면을 위상차 현미경(Olympus사제 모델 번호 IX73)에 의하여, 배율 10배로 관찰했다. 또한 여과 면적은 50cm2였다.
각 조건에 의하여 막분리 처리를 행한 경우의 종합 판정의 결과를 표 1에 나타낸다. 종합 판정 A, B, C 및 D의 판정 기준을 이하와 같이 했다. 또한, 표 1에 있어서, MESH란, 여과막을 구성하는 메시의 횡사의 24.5mm(1인치) 간의 그물코 수를 의미한다. 표 1에 있어서, 최대 막 간 차압이란, 막분리 처리 중에 있어서의 여과막의 막 간 차압의 최댓값을 의미한다.
A: 막분리 처리 후의 스피어의 형상은 유지되며, 여과막 상에 변형 세포는 확인되지 않는다. 투과 측(여액 측)에는 데브리스가 존재하고, 분할된 스피어는 존재하지 않는다.
B: 막분리 처리 후의 스피어의 형상은 유지되지만, 여과막 상에 변형된 스피어가 존재한다. 투과 측(여액 측)에는 데브리스가 존재하고, 분할된 스피어는 존재하지 않는다.
C: 막분리 처리 후의 스피어의 형상은 유지되지만, 여과막 상에 변형된 스피어가 존재한다. 투과 측(여액 측)에 분할된 스피어가 약간 존재한다.
D: 막분리 처리 후의 스피어의 형상이 붕괴되어 있으며, 투과 측(여액 측)에 다수의 분할된 스피어가 존재한다.
[표 1]
표 1에 나타내는 바와 같이, 여과막으로서 능첩직 메시를 사용한 경우(실시예 1-1~실시예 1-8) 및 2매의 평직 메시를 그물코 위치를 어긋나게 하여 적층한 것을 사용한 경우(실시예 1-10)에, 양호한 종합 판정 결과를 얻을 수 있었다. 또, 여과막으로서 능첩직 메시를 사용함으로써, 종합 판정 A 또는 B를 취득할 수 있는 여과막의 그물코 사이즈 및 막 간 차압의 범위가 광범위하게 걸쳐 있는 것을 확인할 수 있었다.
도 18a는, 막분리 처리 전의 세포 현탁액의 현미경 사진이다. 도 18b는, 표 1에 있어서의 실시예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 세포 현탁액의 현미경 사진이다. 세포 현탁액이 농축되고, 데브리스가 제거되어 있다. 도 18c는, 표 1에 있어서의 실시예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 투과 측에 배출된 여액의 현미경 사진이다. 여액에는 데브리스가 존재하지만, 분할된 스피어는 존재하지 않는다. 도 18d는, 표 1에 있어서의 비교예 1-1의 조건으로 막분리 처리를 행한 후의 투과 측에 배출된 여액의 현미경 사진이다. 여액에는 분할된 스피어가 다수 존재하고 있다.
실시예 2
실시예 2는, 단일 세포 및 데브리스를 포함하는 세포 현탁액에 막분리 처리를 실시함으로써, 단일 세포와, 데브리스를 분리하는 경우에 관한 것이다.
<단일 세포의 작성>
상기의 실시예 1에 기재된 절차에 따라, hiPS 세포주 253G1로부터 제작한 300μm 정도의 스피어를 포함하는 세포 현탁액을 50g, 2분으로 원심 분리하여, 상등액을 제거한 후, TrypLE Select(GIBCO사제 모델 번호 12563)를 첨가하여, 볼텍스 믹서로 교반하고, 37℃의 분위기 중에 3분간 정치한 후, 재차 볼텍스 믹서로 교반하여, 단일 세포를 포함하는 세포 현탁액을 제작했다. 세포 수는, TrypLE Select 및 TeSR-E8 배양 배지량을 변화시킴으로써 조정했다.
<막분리 처리>
이상의 처리에 의하여 얻어진 세포 현탁액을 표 2에 나타내는 각 조건으로 막분리 처리를 행했다. 막분리 처리는, 밀폐 공간을 형성하는 멸균된 여과 모듈을 이용하여 행했다. 여과 모듈 내에는, 여과막이 배치되어 있다. 여과 모듈의 유입구로부터 유출구를 향하여 여과막의 막면을 따라 세포 현탁액을 흐르게 하는 탄젠셜 플로 방식에 의한 막분리 처리를 행했다.
튜브 커넥터의 일단에 여과 모듈의 투과 측(여과 측)을 접속하고, 튜브 커넥터의 타단에 루어락 타입의 튜브 커넥터를 개재하여 시린지(데루모사제 모델 번호 SS50-LZ)를 접속했다. 시린지 펌프(Harvard사제 모델 번호 PHD-2000)를 이용하여 시린지의 흡인 속도를 제어함으로써 여과 유속을 변화시켜, 여과막의 막면 차압을 변화시켰다.
여과막은 표 2에 나타내는 메시, 개구 직경, 개구 직경 분포(변동 계수 σ/X)를 갖는 것을 사용했다. 여과막의 개구 직경은 표준 입자에 의한 여과 시험을 행하여, 저지율 95%가 되는 입자경(즉, 입자 투과 시험에 의한 95% 분리 입자경)으로 하여 구했다. 여과막의 개구 직경 분포(변동 계수 σ/X)는, 수은 압입법에 의하여 측정하고, 기존의 통계 해석 수법에 의하여 평균값 X, 표준 편차 σ를 구했다.
<각 실시예의 차이점>
각 실시예에 있어서, 여과막 및 막 간 차압을 표 1과 같이 상위시켰다. 실시예 2-1~2-2 및 참고예 2-1~2-2에서는 능첩직 메시로 구성된 여과막을 이용했다. 실시예 2-3에서는, 2매의 평직 메시를, 그물코 위치를 서로 어긋나게 하여 적층하여 구성된 여과막을 이용했다. 비교예 2-1, 2-2에서는, 1매의 평직 메시로 구성된 여과막을 이용했다. 실시예 2-1~2-3, 비교예 2-1~2-2, 참고예 2-1~2-2에 있어서 여과막으로서 사용한 메시의 소재는 스테인리스강재 SUS316이다.
<막 간 차압의 측정>
여과 모듈의 유입구의 압력(M1), 유출구의 압력(M2), 투과 측(여액 측)의 압력(M3)을 압력 센서(스펙트럼사제 모델 번호 ACPM49903N)로 측정하고, (1) 식을 이용하여 여과막의 막면 차압 ΔM을 산출했다.
<세포 직경의 측정>
막분리 처리 전의 세포 현탁액을 채취하고, BECKMAN COULTER사의 Vi-CELL에 의하여 세포의 평균 직경을 구했다.
<막분리 처리의 판정>
막분리 처리에 의하여 얻어진 농축액, 투과 측에 배출된 여액 및 막분리 처리 후의 여과막의 표면을 위상차 현미경(Olympus사제 모델 번호 IX73)에 의하여, 배율 10배로 관찰했다. 또한 여과 면적은 50cm2였다.
각 조건에 의하여 막분리 처리를 행한 경우의 종합 판정의 결과를 표 2에 나타낸다. 종합 판정 A, B 및 C의 판정 기준을 이하와 같이 했다.
A: 막분리 처리 후의 단일 세포의 형상은 유지되며, 투과 측(여액 측)에는 데브리스가 존재하고, 투과 측(여액 측)에 배출된 단일 세포는 존재하지 않는다.
B: 막분리 처리 후의 단일 세포의 형상은 유지되며, 투과 측(여액 측)에는 데브리스 및 조금 단일 세포가 확인된다.
C: 투과 측(여액 측)에는 데브리스 및 다수의 단일 세포가 확인된다.
[표 2]
표 2에 나타내는 바와 같이, 여과막으로서 능첩직 메시를 사용한 경우(실시예 2-1, 실시예 2-2) 및 2매의 평직 메시를 그물코 위치를 어긋나게 하여 적층한 것을 사용한 경우(실시예 2-3)에, 양호한 종합 판정 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 3
실시예 3은, 단일 세포로서의 비인간 세포 및 데브리스를 포함하는 세포 현탁액에 막분리 처리를 실시함으로써, 비인간 세포와 데브리스를 분리하는 경우에 관한 것이다.
<재료>
세포: 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포를 사용했다.
배지: 무혈청 배지(Life technologies사 CD Opti CHO AGT Medium)를 배지로서 사용했다.
<세포의 배치(batch) 배양>
1L의 배지가 들어 있는 배양 용기에 세포를 파종하고, 세포 농도가 5×105개/ml가 되도록 조정했다. 이어서, 배양 용기 내에서, 37℃, 스터러 교반 속도 100rpm, AIR 유량 47.5ml/min, O2 유량 8ml/min, CO2 유량 2.5ml/min로 5일간 배양 용기 내에서 배치 배양했다. 5일 후의 세포 농도는 1×107개/ml, 세포의 바이어빌리티는 95%였다.
<여과·관류 배양>
다음으로, 여과 모듈의 공급 측의 한쪽의 유통구가 배양 용기에 튜브 접속되고, 다른 한쪽의 유통구가 왕복동 가능한 다이아프램 펌프(Refine Technology사, ATF2system)와 튜브 접속된 여과 모듈을 이용하여 막분리 처리를 행했다. 다이아프램 펌프를 운전하여 배양 용기 내의 세포 현탁액을 여과 모듈 내에 공급했다. 다이아프램 펌프는 1L/min의 유량으로 5초마다 왕복동을 반복하도록 설정하고, 세포 현탁액이 여과막과 평행이고 또한 교대로 액이 흐르도록 했다. 여과막은 표 3에 나타내는 메시, 개구 직경, 개구 직경 분포(변동 계수 σ/X), 막두께를 갖는 것을 사용했다. 여과막의 개구 직경은 표준 입자에 의한 여과 시험을 행하여, 저지율 95%가 되는 입자경(즉, 입자 투과 시험에 의한 95% 분리 입자경)으로 하여 구했다. 여과막의 개구 직경 분포(변동 계수 σ/X)는, 수은 압입법에 의하여 측정하고, 기존의 통계 해석 수법에 의하여 평균값 X, 표준 편차 σ를 구했다. 또 여과막의 막두께는 접촉식 막두께 측정계(안리쓰제)로 구했다.
데브리스 및 항체의 회수 탱크와 튜브 접속된 여과 모듈의 투과 측의 배출구로부터, 튜브 펌프(Cole Parmer사, 마스터 플렉스 튜브 펌프)로 여액을 추출했다. 여액의 추출 유량은, 배양 용기 내의 세포 현탁액의 총 액량을 L, 여액의 1일당 추출 유량을 N으로 했을 때에 N/L이 1이 되도록 여과 조건을 설정했다. 또 배양 용기 내의 세포 현탁액량이 일정해지도록, 배양 용기 내와 튜브 접속된 배지 공급 탱크로부터, 여액의 추출액량과 동일한 유량으로, 배지를 튜브 펌프(Cole Parmer사, 마스터 플렉스 튜브 펌프)에 의하여 공급했다.
<각 실시예의 차이점>
각 실시예에 있어서, 세포 종류, 여과막, 여과 조건, 압력(여과 조건에 의하여 조정)을 표 3과 같이 상위시켰다. 실시예 3-1~3-8, 실시예 3-11~3-18에서는 능첩직 메시로 구성된 여과막을 이용했다. 실시예 3-9~3-10에서는, 2매의 평직 메시를, 그물코 위치를 서로 어긋나게 하여 적층하여 구성된 여과막을 이용했다. 비교예 3-1에서는, 1매의 평직 메시로 구성된 여과막을 이용했다. 비교예 3-2에서는 MF(Microfiltration Membrane)막으로 구성된 여과막을 이용했다. 비교예 3-3에서는 소결 다공질 필터로 구성된 여과막을 이용했다. 비교예 3-4에서는, 세라믹 필터로 구성된 여과막을 이용했다. 실시예 3-1~3-18, 비교예 3-1에 있어서 여과막으로서 사용한 메시의 소재는 스테인리스강재 SUS316이다.
<측정>
1일간, 여과·관류 배양을 행한 후, 하기의 측정을 행했다.
<압력의 측정>
여과 모듈의 공급 측의 다이아프램 펌프 측에 마련된 유통구의 압력(M1)과, 여과 모듈의 공급 측의 배양 용기 측에 마련된 유통구의 압력(M2)와, 여과 모듈의 투과 측의 압력(M3)을 측정했다. 압력은 Spectrum Laboratories사의 KrosFlo 디지털 압력 모니터로 측정했다. (1) 식을 이용하여 여과막의 막면 차압 ΔM을 산출했다.
<세포 직경의 측정>
배양 용기 내로부터 세포 현탁액을 채취하고, BECKMAN COULTER사의 Vi-CELL에 의하여 세포의 평균 직경을 구했다.
<세포의 개수 농도·바이어빌리티>
배양 용기 내로부터 세포 현탁액을 채취하고, 여과 모듈의 투과 측으로부터 여액을 채취하며, 각각 BECKMAN COULTER사의 Vi-CELL에 의하여 생세포의 개수 농도와 바이어빌리티를 구했다.
<데브리스의 개수 농도>
배양 용기 내로부터 세포 현탁액을 채취하고, 여과 모듈의 여과 측으로부터 여액을 채취하며, BECKMAN COULTER사의 Multisizer4에 의하여, 데브리스의 개수 농도를 구했다. 데브리스는, 세포의 평균 직경의 1/10 이상 1/2 이하의 직경인 것으로 했다.
<여과의 판정>
여과의 종합 판정으로서, 이하 기준으로 평가를 행했다.
A: 세포의 개수 밀도의 투과 측(여액 측)과 공급 측의 비율이 5% 이하이고, 또한 데브리스의 개수 밀도의 투과 측(여액 측)과 공급 측의 비율이 80% 이상이며, 또한 세포의 바이어빌리티가 90% 이상
B: 세포의 개수 밀도의 투과 측(여액 측)과 공급 측의 비율이 20% 이하이고, 또한 데브리스의 개수 밀도의 투과 측(여액 측)과 공급 측의 비율이 70% 이상이며, 또한 세포의 바이어빌리티가 80% 이상
C: 세포의 개수 밀도의 투과 측(여액 측)과 공급 측의 비율이 50% 이하이고, 또한 데브리스의 개수 밀도의 투과 측(여과 측)과 공급 측의 비율이 50% 이상이며, 또한 세포의 바이어빌리티가 70% 이상
D: 세포의 개수 밀도의 투과 측(여액 측)과 공급 측의 비율이 50%를 초과하거나, 혹은 데브리스의 개수 밀도의 투과 측(여액 측)과 공급 측의 비율이 50% 미만이거나, 혹은, 세포의 바이어빌리티가 70% 미만
[표 3]
표 3에 나타내는 바와 같이, 실시예 3-1~3-18에 있어서, 비교예 3-1~3-4와 비교하여 양호한 종합 판정 결과를 얻을 수 있었다.
실시예 4
실시예 4는, 단일 세포로서의 인간 거핵구 및 데브리스로서의 인간 혈소판을 포함하는 세포 현탁액에 막분리 처리를 실시함으로써, 인간 거핵구와, 인간 혈소판을 분리하는 경우에 관한 것이다.
<재료>
배지: RPMI1640(Life Technologies사) 450ml에 소혈청(Life Technologies사) 50ml를 첨가한 것을 사용했다.
거핵구: MEG-01(ATCC사)를 거핵구로서 사용했다. 이것을 배지와 혼합함으로써, 세포 현탁액(6×105cells/ml)을 조제했다.
혈소판: 래트 말초혈로부터 단리한 것을 혈소판으로서 사용했다. 시트르산-덱스트로스 용액(ACD)(sigma-aldrich사)가 들어 있는 15ml 원심 분리용 코니컬 튜브(Falcon사)에 래트로부터 채혈한 전혈(whole blood) 10ml를 회수했다. 300×g, 실온에서 7분간 원심하고, 원심 후의 Plasma층 및 Bufffy coat층을 회수했다. 회수액을과 동일하게 원심 분리를 행하여, Plasma층만을 회수한 후에, 1800×g, 실온에서 5분간 원심하고, 상등액을 회수함으로써 혈소판을 얻었다. 이것을 배지와 혼합함으로써, 세포 현탁액(6×107cells/ml)을 조제했다.
거핵구액과 혈소판액을 등량 혼합함으로써, 세포 현탁액으로서 세포 분리 시험에 사용했다.
<세포 여과 시험>
여과 모듈(ADVANTEC사, KS-47)의 공급 측의 한쪽의 유통구가 세포 현탁액을 포함하는 시린지(데루모사)에 튜브 접속된 여과 모듈을 이용하여 막분리 처리를 행했다. 시린지를 시린지 펌프(HARVARD APPARATUS사, PHD ULTRA 4400)에 설치하고, 1ml/min의 유량으로 세포 현탁액이 여과 모듈 내의 여과막에 대하여 직교하는 데드 엔드 방식으로 공급되도록, 시린지 펌프를 운전했다. 여과 모듈의 투과 측의 배출구로부터 배출된 여액을 회수했다.
여과막은 표 4에 나타내는 메시, 개구 직경, 개구 직경 분포(변동 계수 σ/X), 막두께를 갖는 것을 사용했다. 여과막의 개구 직경은 표준 입자에 의한 여과 시험을 행하여, 저지율 95%가 되는 입자경(즉, 입자 투과 시험에 의한 95% 분리 입자경)으로 하여 구했다. 여과막의 개구 직경 분포(변동 계수 σ/X)는, 수은 압입법에 의하여 측정하고, 기존의 통계 해석 수법에 의하여 평균값 X, 표준 편차 σ를 구했다. 또 여과막의 막두께는 접촉식 막두께 측정계(안리쓰제)로 구했다.
<각 실시예의 차이점>
각 실시예에 있어서, 여과막을 표 4와 같이 상위시켰다. 실시예 4-1~4-3에서는 능첩직 메시로 구성된 여과막을 이용했다. 비교예 4-1~4-4에서는, 평직 메시로 구성된 여과막을 이용했다. 여과막으로서 사용한 메시의 소재는 스테인리스강재 SUS316이다.
<측정>
여액을 회수한 후, 하기의 측정을 행했다.
<거핵구의 개수 농도>
여과 모듈의 투과 측으로부터 여액을 채취하고, BECKMAN COULTER사의 Vi-CELL에 의하여 거핵구 농도를 구했다. 이하의 식으로부터 얻은 거핵구 저지율을 구했다.
거핵구 저지율(%)=100-(여액 중의 거핵구 농도/원액 중의 거핵구 농도)×100
<혈소판의 개수 농도>
여과 모듈의 투과 측으로부터 여액을 채취하고, 시스멕스사의 XT-2000iv에 의하여 혈소판 농도를 구했다. 이하의 식으로부터 얻은 혈소판 투과율을 구했다.
혈소판 투과율(%)=(여액 중의 혈소판 농도/원액 중의 혈소판 농도)×100
<여과의 판정>
여과의 종합 판정으로서, 이하 기준으로 평가를 행했다.
A: 거핵구 저지율이 5% 미만이고, 또한 혈소판 투과율이 90% 이상
B: 거핵구 저지율이 10% 미만이고, 또한 혈소판 투과율이 90% 이상
C: 거핵구 저지율이 10% 이상이거나, 혹은 혈소판 투과율이 90% 미만
[표 4]
표 4에 나타내는 바와 같이, 실시예 4-1~4-3에 있어서, 비교예 4-1~4-4와 비교하여 양호한 종합 판정 결과를 얻을 수 있었다.
일본 출원 2016-130579, 및 일본 출원 2017-095673의 개시는, 그 전체가 참조로서 본 명세서에 원용된다.
본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격이 참조에 의하여 원용되는 것이 구체적이고 또한 개개에 기록된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조로서 원용된다.
Claims (32)
- 제1 면에 형성된 입측의 개구와, 상기 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 상기 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구를 가지며, 상기 입측의 개구와 상기 출측의 개구가 막면과 평행한 방향에 있어서 어긋난 위치에 배치되어 있는 여과막을 이용하여, 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 세포 현탁액의 막분리 방법.
- 제1 면에 형성된 입측의 개구와, 상기 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 상기 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구를 가지며, 상기 입측의 개구와 상기 출측의 개구를 접속하는 경로가 비직선 형상인 여과막을 이용하여, 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 세포 현탁액의 막분리 방법.
- 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 세포 현탁액은, 세포 응집체, 단일 세포 및 데브리스를 포함하고,
상기 막분리 처리에 있어서, 상기 세포 응집체와, 상기 단일 세포 및 상기 데브리스를 상기 여과막을 이용하여 분리하는, 막분리 방법. - 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
상기 세포 현탁액은, 단일 세포 및 데브리스를 포함하고,
상기 막분리 처리에 있어서, 상기 단일 세포와 상기 데브리스를 상기 여과막을 이용하여 분리하는, 막분리 방법. - 청구항 3에 있어서,
상기 여과막의 상기 입측의 개구의 직경은, 상기 세포 응집체의 직경의 0.01배 이상 3.0배 이하인, 막분리 방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 단일 세포는 인간 유래 세포이며,
상기 여과막의 상기 입측의 개구의 직경은, 상기 단일 세포의 직경의 0.05배 이상 0.8배 이하인, 막분리 방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 단일 세포는 비인간 세포이며,
상기 여과막의 상기 입측의 개구의 직경은, 상기 단일 세포의 직경의 0.1배 이상 2배 이하인, 막분리 방법. - 청구항 4 또는 청구항 7에 있어서,
상기 단일 세포는 비인간 세포이며,
상기 여과막의 개구 직경 분포의 평균값을 X, 표준 편차를 σ로 했을 때, 0<σ/X≤0.1을 충족시키는, 막분리 방법. - 청구항 4, 청구항 7 및 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단일 세포는 비인간 세포이며,
상기 여과막의 막두께는 150μm 이하인, 막분리 방법. - 청구항 4 및 청구항 7 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단일 세포는 비인간 세포이며,
상기 여과막의 상기 제1 면에 가해지는 게이지압은, -70킬로파스칼 이상 70킬로파스칼 이하인, 막분리 방법. - 청구항 4 및 청구항 7 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단일 세포는 비인간 세포이며,
상기 여과막을 투과한 여액에 포함되는 상기 단일 세포의 개수 밀도는, 상기 여과막을 투과하기 전의 세포 현탁액에 포함되는 상기 단일 세포의 개수 밀도의 50% 이하인, 막분리 방법. - 청구항 4 및 청구항 7 내지 청구항 11 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단일 세포는 비인간 세포이며,
상기 여과막을 투과한 여액에 포함되는, 상기 단일 세포의 직경의 1/10 이상 1/2 이하의 직경의 데브리스의 개수 밀도는, 상기 여과막을 투과하기 전의 세포 현탁액에 포함되는, 상기 단일 세포의 직경의 1/10 이상 1/2 이하의 직경의 데브리스의 개수 밀도의 50% 이상 100% 이하인, 막분리 방법. - 청구항 4 및 청구항 7 내지 청구항 12 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단일 세포는 비인간 세포이며,
상기 단일 세포의 직경은 5μm 이상 25μm 이하인, 막분리 방법. - 청구항 4 및 청구항 7 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 단일 세포는 CHO 세포인, 막분리 방법. - 청구항 3에 있어서,
상기 세포 응집체는 인간 유래 세포의 응집체이며, 상기 단일 세포는 인간 유래 세포인, 막분리 방법. - 청구항 6 또는 청구항 15에 있어서,
상기 인간 유래 세포는 줄기 세포인, 막분리 방법. - 청구항 4에 있어서,
상기 단일 세포는 인간 유래 세포인, 막분리 방법. - 청구항 17에 있어서,
상기 인간 유래 세포는 줄기 세포인, 막분리 방법. - 청구항 17에 있어서,
상기 인간 유래 세포는 거핵구인, 막분리 방법. - 청구항 1 내지 청구항 19 중 어느 한 항에 있어서,
상기 여과막의 상기 제1 면에 가해지는 압력과, 상기 여과막의 상기 제2 면에 가해지는 압력의 차를 0.01킬로파스칼 이상 60킬로파스칼 이하로 하여 상기 막분리 처리를 행하는, 막분리 방법. - 청구항 1 내지 청구항 20 중 어느 한 항에 있어서,
표면에 친수화 처리가 실시된 상기 여과막을 이용하여 상기 막분리 처리를 행하는, 막분리 방법. - 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
상기 여과막은, 섬유 형상 부재를 능첩직하여 형성된 메시를 포함하여 구성되어 있는, 막분리 방법. - 청구항 1 내지 청구항 21 중 어느 한 항에 있어서,
상기 여과막은, 각각이 관통공을 갖는 복수의 메시를, 관통공의 위치를 상기 여과막의 막면과 평행한 방향으로 서로 어긋나게 하여 적층하여 구성되어 있는, 막분리 방법. - 청구항 22 또는 청구항 23에 있어서,
상기 메시는 금속으로 구성되어 있는, 막분리 방법. - 청구항 1 내지 청구항 24 중 어느 한 항에 있어서,
상기 세포 현탁액을, 상기 여과막의 막면의 방향을 따라 흐르게 하여 상기 막분리 처리를 행하는, 막분리 방법. - 청구항 25에 있어서,
상기 세포 현탁액을, 상기 여과막의 막면을 따라 왕복 이동시켜 상기 막분리 처리를 행하는, 막분리 방법. - 세포를 배양하기 위한 배양 용기와, 제1 면에 형성된 입측의 개구와, 상기 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 상기 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구가 막면과 평행한 방향에 있어서 어긋난 위치에 배치되어 있는 여과막을 갖고, 상기 배양 용기에서 배양된 세포가 유통하는 유로를 개재하여 상기 배양 용기에 접속된 여과부를 포함하는 세포 배양 장치의 상기 여과막을 이용하여 상기 배양 용기로부터 공급된 세포 현탁액의 막분리 처리를 행하는 막분리 방법으로서,
상기 배양 용기 내의 세포 현탁액의 액량을 L로 하고, 상기 막분리 처리에 있어서 상기 여과막을 투과한 여액의 1일당 액량을 N으로 했을 때,
0.1≤N/L≤6을 충족시키는 막분리 방법. - 세포를 배양하기 위한 배양 용기와,
제1 면에 형성된 입측의 개구와, 상기 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 상기 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구가 막면과 평행한 방향에 있어서 어긋난 위치에 배치되어 있는 여과막을 가지며, 상기 배양 용기에서 배양된 세포가 유통하는 유로를 개재하여 상기 배양 용기에 접속된 여과부를 포함하는 세포 배양 장치. - 세포를 배양하기 위한 배양 용기와,
제1 면에 형성된 입측의 개구와, 상기 제1 면과는 반대 측의 제2 면에 형성되고 또한 상기 입측의 개구와 연통하는 출측의 개구를 가지며, 상기 입측의 개구와 상기 출측의 개구를 접속하는 경로가 비직선 형상인 여과막을 구비하고, 상기 배양 용기에서 배양된 세포가 유통하는 유로를 개재하여 상기 배양 용기에 접속된 여과부를 포함하는 세포 배양 장치. - 청구항 28 또는 청구항 29에 있어서,
상기 여과막의 표면에는 친수화 처리가 실시되어 있는, 세포 배양 장치. - 청구항 28 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
상기 여과막은, 섬유 형상 부재를 능첩직하여 형성된 메시를 포함하여 구성되어 있는, 세포 배양 장치. - 청구항 28 내지 청구항 30 중 어느 한 항에 있어서,
상기 여과막은, 관통공을 갖는 복수의 메시를, 관통공의 위치를 상기 여과막의 막면과 평행한 방향으로 서로 어긋나게 하여 적층하여 구성되어 있는, 세포 배양 장치.
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