JP2023554196A - バイオプロセシングシステム - Google Patents

Abstract

本発明は、接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムに関する。システムは、細胞成長チャンバと、細胞成長チャンバと流体連通し、細胞出口を有する細胞トラップと、第１の動作モードと第２の動作モードとを選択的に切り替えるように構成された流体フローシステムと、を備える。第１の動作モードにおいて、流体フローシステムは、細胞成長チャンバからの細胞が細胞トラップに収集されるように、細胞成長チャンバを通って細胞トラップに流体を導くように構成され、第２の動作モードにおいて、流体フローシステムは、流体を細胞トラップに導いて細胞出口を通過させて、細胞トラップに収集された細胞を採取するように構成されている。

Description

本発明は、接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムおよびその使用に関する。本発明はまた、接着細胞の連続バイオプロセシングのための方法に関する。

再生医療、特に細胞治療技術は、目的とする細胞の型および用途の両面でレパートリーを増やし、幅広い疾患を治癒する可能性を高めていることはよく知られている。しかし、一部の治療では必要な細胞数が多いため (最大１０億個)、細胞製造の面では大きな課題がある。

さらに、最終製品は細胞自体であることが多いため、細胞治療製品に関する現行の規制の枠組みの下では、多くの要件を満たす必要がある。特に、細胞の拡大培養（expansion）に使用されるシステムは、現行の優良医薬品製造基準に準拠している必要がある。優良医薬品製造基準では、流体経路は、人の介入を最小限に抑えながら閉鎖的で無菌でなければならない。培養培地は化学的に定義されていなければならず、血清やその他の生体異物を含まないことが好ましい。また、プロセスは標準化され、再現可能であり、一般的に、商品の合理的なコストを維持しながら、プロセス全体を通して望ましい細胞表現型を維持する特性をもたなければならない。

そのため、細胞に対するこのような大きな需要を維持し、必要な条件を満たすために、生物製剤製造のための大規模哺乳類細胞培養用に以前開発された工業プロセスを導入し適応させることが試みられてきた。

これらのプロセスのうち、大量の接着細胞を得るための最も先進的な方法の１つは、自動化または灌流バイオリアクタを使用したマイクロキャリアをベースとする拡大培養である。マイクロキャリアの機能を向上させることで細胞収量の大幅な増加が達成される一方で、その他の重要な製造工程については、現在もまだ最適化が行われている。例えば、マイクロキャリア培養基質から拡大培養した細胞をより簡単、効果的、かつ低侵襲に回収するための細胞採取方法の改良が必要である。これらの理由と、コスト、マイクロキャリアの準備、２Ｄフラスコベースのプロトコルを３Ｄマイクロキャリア培養に変換するのに必要な時間やリソースなどの理由から、商業組織によるマイクロキャリアベースのシステムの普及は遅れている。

連続的なバイオプロセシング（連続バイオプロセシング）システムは、効率と規制遵守の両面から、治療用細胞の拡大培養に必要なすべての基準を満たすことができる。

連続バイオプロセシングは、３０年以上前に導入された概念で、絶えず流れてくる原料を、途切れることなく中間製品や最終製品に加工するように動作する閉鎖システムを指す。このようなシステムには、製造コストの削減や製造施設の小規模化に加え、最終製品の品質、再現性、標準化の向上などのメリットがある。

連続バイオプロセシングは、現在、（例えば、バイオ医薬品、組換えタンパク質、モノクローナル抗体の製造のために）バイオテクノロジーに応用されている。しかし、この手法は、適切な連続バイオプロセシング法がないことから、治療効果のある細胞の製造には現在実施されていない。

従って、本発明の目的は、接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムを提供することであって、この方法によると、細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムにおいて、最小限の人間の介入で接着細胞を培養および採取することが可能であり、それによって先行技術に関連するいくつかの問題を改善し得る。

本発明の第１の態様によると、
接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムであって、
細胞成長チャンバと、
前記細胞成長チャンバと流体連通し、細胞出口を有する細胞トラップと、
第１の動作モードと第２の動作モードとを選択的に切り替えるように構成された流体フローシステムと、を備え、
前記第１の動作モードにおいて、前記流体フローシステムは、前記細胞成長チャンバからの細胞が前記細胞トラップに収集されるように、前記細胞成長チャンバを通って前記細胞トラップに流体を導くように構成され、
前記第２の動作モードにおいて、前記流体フローシステムは、流体を前記細胞トラップに導いて前記細胞出口を通過させて、前記細胞トラップに収集された細胞を採取するように構成されている、システムが提供される。

本システムの細胞成長チャンバは、本明細書に記載の細胞成長チャンバの特徴のいずれかを有してもよい。

好適には、本システムは、前記流体フローシステムに流体を導入するための少なくとも１つのリザーバをさらに備える。

好適には、前記第１の動作モードにおいて、前記流体フローシステムは、前記細胞トラップからの流体を流体廃棄出口に導くか、または、前記細胞トラップからの流体を前記細胞成長チャンバを通るように戻すように構成されている。

好適には、本システムの前記細胞トラップはフィルタを備え、前記フィルタは、流体廃棄出口に向かう細胞の通過を防止するか、または前記細胞成長チャンバを通るように戻る細胞の通過を防止するように構成されている。

好適には、前記第２の動作モードにおいて、前記流体フローシステムは、流体が前記細胞成長チャンバをバイパスするように構成されている。

好適には、本システムは、前記第１の動作モードに対応する第１の構成と前記第２の動作モードに対応する第２の構成との間を選択的に切り替えるように構成されたバルブアセンブリをさらに備える。

好適には、前記第１の構成において、前記バルブアセンブリは、前記細胞成長チャンバを最初に通過することなく前記細胞トラップに直接流体を流すことを防止するように構成されている。

好適には、前記第１の構成において、前記バルブアセンブリは、流体リザーバから前記細胞成長チャンバへの流体の流れを可能にするように構成されている。

好適には、前記第１の構成において、前記バルブアセンブリは、成長チャンバ入口導管に沿った培地の通過が可能であり、バイパス導管に沿った培地の通過を防止するように構成されている。

前記第２の構成において、前記バルブアセンブリは、流体リザーバから前記細胞成長チャンバへの流体の流れを防止するように構成されている。

好適には、前記第２の構成において、前記バルブアセンブリは、流体リザーバから直接前記細胞トラップへの流体の流れを可能にするように構成されている。

好適には、前記第２の構成において、前記バルブアセンブリは、成長チャンバ入口導管に沿った培地の通過を防止し、バイパス導管に沿った培地の通過を防止するように構成されている。

好適には、前記バルブアセンブリは、前記細胞成長チャンバおよび前記細胞トラップへの流体の流れを選択的に制御するように構成された第１のバルブと、前記細胞出口を通る流体の流れを選択的に可能にするように構成された第２のバルブとを備える。

好適には、本システムは、流体リザーバから前記細胞トラップへ流体を通過させるために構成されたバイパス導管をさらに備える。

好適には、本システムは、流体リザーバから前記細胞成長チャンバへ流体を通過させるために構成された成長チャンバ入口導管をさらに備える。

好適には、本システムは、前記流体フローシステム内において流体を送る（pumping）ための少なくとも１つのポンプをさらに備える。

好適には、前記少なくとも１つのポンプは、前記細胞成長チャンバと前記細胞トラップとの間に位置していない。

好適には、本システムは、前記細胞トラップから採取された細胞を収集するために、前記細胞トラップに流体的に結合された収集容器をさらに備える。

好適には、前記収集容器は、前記システムから取り外し可能である。

好適には、本システムの前記細胞成長チャンバは、入口と、出口と、前記入口および前記出口の間に位置する１つまたは複数の細胞培養プレートと、を備える。

好適には、前記複数の細胞培養プレートは、前記細胞成長チャンバを通る複数の流路を規定する積層構成で配置され、前記複数の細胞培養プレートは、使用時に、細胞培養プレートから剥離した細胞が前記流路に沿って進み、前記出口を通過するように方向付けられている。

好適には、本システムは、前記システム内の流体の少なくとも１つの流体特性を監視するように構成された少なくとも１つのセンサをさらに備える。

好適には、本システムは、前記細胞トラップの内部の細胞の体積を監視するように構成されたセンサをさらに備える。

好適には、本システムは、前記第１の動作モードと前記第２の動作モードとの間で切り替えるように前記流体フローシステムを自動的に制御するように構成されたコントローラをさらに備える。

好適には、前記コントローラは、前記細胞トラップに収集された細胞の量が所定の閾値に達したときに、前記流体フローシステムを前記第２の動作モードに自動的に切り替えるように構成されている。

本発明の第２の態様によると、接着細胞の連続バイオプロセシングのための、上記のいずれかに記載のシステムの使用が提供される。

本発明の第３の態様によると、接着細胞の連続バイオプロセシングのための方法であって、前記方法は、
第１の動作モードと第２の動作モードとの間で、流体フローシステムを選択的に切り替えることを包含し、
前記第１の動作モードは、細胞成長チャンバを通過させて細胞トラップに流体を導くことと、前記細胞成長チャンバからの細胞を前記細胞トラップに収集することとを包含し、
前記第２の動作モードは、流体を前記細胞トラップに導いて細胞トラップ出口を通過させて、前記細胞トラップに収集された細胞を採取することを包含する、方法が提供される。

接着細胞の連続的なバイオプロセス方法は、上述の特徴のいずれか、または本明細書に記載の細胞成長チャンバの特徴のいずれかを含む細胞成長チャンバを使用して実施され得ることが理解されるであろう。

好適には、前記第１の動作モードにおいて、前記細胞トラップを出る流体が、前記細胞成長チャンバを通るように再循環される。

好適には、前記第１の動作モードにおいて、前記細胞トラップを出る流体の少なくとも一部は、選択的に廃棄回路に導かれ、前記流体フローシステムから除去される。

本明細書には、接着細胞の連続バイオプロセシングのための細胞成長チャンバも記載されている。細胞成長チャンバは、
細胞成長チャンバの上端に位置し、細胞培養培地源に結合可能な入口と、
細胞成長チャンバの下端に位置する出口と、
入口および出口の間に位置する１つまたは複数の細胞培養プレートと、を備え、
１つまたは複数の細胞培養プレートは、細胞成長チャンバを通る複数の流路を規定する積層構成で配置され、細胞成長チャンバの上端と下端との間に延在する細胞成長チャンバの軸に対して０度から７５度の角度に方向付けられている。

好適には、軸は、上端および下端に対して実質的に垂直である。

好適には、１つまたは複数の細胞培養プレートは、軸に平行に方向付けられている。

好適には、入口および出口の間の方向は、流れ方向を規定し、流れ方向は、入口から出口まで実質的に直線的である。

好適には、１つまたは複数の細胞培養プレートは、流れ方向に対して０度から７５度の角度に方向付けられている。

好適には、複数の細胞培養プレートは、少なくとも１ミリメートルだけ間隔を空けて配置されている。

好適には、複数の細胞培養プレートは、等間隔に離間されている。

好適には、１つまたは複数の細胞培養プレートは、入口からの細胞培養培地の流れを邪魔するためのバッフルを形成する。

好適には、複数の細胞培養プレートの１つまたはそれぞれは、細胞成長チャンバの１つの側部から細胞成長チャンバの対向する側部まで延在している。

好適には、複数の細胞培養プレートの１つまたはそれぞれは、その上に細胞の付着を促進するためのコーティングを備える。

好適には、複数の細胞培養プレートの１つまたはそれぞれは、第１および第２の細胞培養表面を備える。

好適には、第１および第２の細胞培養表面は、実質的に平面である。

好適には、細胞成長チャンバは、１つまたは複数の細胞培養プレートから出口に向かって内向きに傾斜した（内向きに先細りした）テーパ状の出口部分をさらに備える。

好適には、テーパ状の出口部分は、１つまたは複数の細胞培養プレートと出口との間の円錐形のベース部である。

好適には、テーパ状の出口部分は、細胞成長チャンバの軸に対して２５度から６５度の角度で内向きに傾斜している。

好適には、細胞成長チャンバは、入口から１つまたは複数の細胞培養プレートに向かって外向きに傾斜したテーパ状の入口部分をさらに備える。

好適には、１つまたは複数の細胞培養プレートは、１ｍｍから１ｍの距離だけ入口から間隔をあけて配置されている。

好適には、１つまたは複数の細胞培養プレートは、１ｍｍから１ｍの距離だけ出口から間隔をあけて配置されている。

好適には、細胞成長チャンバは、１つまたは複数の細胞培養プレートから剥離した細胞を収集するように構成された細胞トラップをさらに備える。

本明細書には、接着細胞の連続バイオプロセシングのための細胞成長チャンバの使用も記載される。

本明細書には、本明細書に記載の細胞成長チャンバを用いた接着細胞の連続バイオプロセシングのための方法も記載されている。この方法は、
細胞培養培地を細胞成長チャンバの入口に通すこと、
細胞培養培地と、１つまたは複数の細胞培養プレートから剥離された細胞と、を含む流体を、細胞成長チャンバの出口から収集すること、および
収集された流体から細胞を分離すること、を包含する。

接着細胞の連続バイオプロセシングのための方法は、上述の特徴のいずれか、または本明細書に記載の細胞成長チャンバの特徴のいずれかを有する細胞成長チャンバを使用して実施され得ることが理解されるであろう。

例えば、第１の態様による接着細胞の連続バイオプロセシングのための細胞成長チャンバは、
細胞成長チャンバの上端に位置し、細胞培養培地源に結合可能な入口と、
細胞成長チャンバの下端に位置する出口と、
入口および出口の間に位置する１つまたは複数の細胞培養プレートと、を備え、
１つまたは複数の細胞培養プレートは、細胞成長チャンバを通る複数の流路を規定する積層構成で配置され、細胞成長チャンバの上端に位置する入口と下端に位置する出口との間に延在する細胞成長チャンバの軸に対して０度から７５度の角度に方向付けられている。

好適には、軸は、細胞成長チャンバの上端に配置された入口および下端に配置された出口に対して実質的に垂直である。

本発明の接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムによって、多くの利点が得られる。例えば、本システムは、最小限の人間の介入で接着細胞の増殖および採取（harvesting）を容易にする細胞成長チャンバを利用する。さらに、細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムは、閉鎖的で無菌であり、および／または、血清または他の生体異物を含まないため、優良製造基準を用いて細胞を製造することができる。さらに、細胞の連続的なバイオプロセスのためのシステムによると、細胞活性の低下など、細胞に望ましくない影響を与え得る細胞固定基質分解剤（トリプシンなど）に接着細胞を接触させる必要なく、接着細胞を採取することが可能になり得る。

以下、添付の図面を参照して、本発明の実施形態を例としてのみ説明する。
細胞成長チャンバの正面図である。 図１の細胞成長チャンバの側面図である。 他の細胞成長チャンバの分解図である。 図３ａの細胞成長チャンバの各構成要素の断面図である 図１および図２、または図３ａおよび図３ｂのいずれかの細胞成長チャンバを用いた、接着細胞の連続バイオプロセシングのための方法を示す図である。 第１の動作モードにおける接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムを示す図である。 第２の動作モードにおける図５ａのシステムを示す図である。 第１の動作モードにおける接着細胞の連続バイオプロセシングのための別のシステムを示す図である。 第２の動作モードにおける図６ａのシステムを示す図である。 図５ａおよび図５ｂ、または図６ａおよび図６ｂのいずれかのシステムを用いた、接着細胞の連続バイオプロセシングのための方法を示す図である。 図面において、同様の参照数字は、同様の部品を指す。

以下の説明では、特定の用語が便宜上使用されているが、限定するものではない。例えば、特に指定がない限り、「第１」、「第２」、「第３」等の序列形容詞の使用は、単に、同様の対象の異なる例が参照されていることを示すだけであり、そのように説明された対象が、時間的、空間的、順位的またはその他の方法のいずれかで、所定の順序でなければならないことを意味する意図はない。

本発明は、接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムに関する。本明細書で使用する「接着細胞」という用語は、インビトロで成長するために、表面への固定に依存する（anchorage dependent）、すなわち、表面への付着を必要とする、同種または異種の細胞集団を指す。好適には、本開示では、表面は、細胞培養プレートであってもよく、またはマイクロキャリア（例えば、バイオリアクタにおける接着細胞の成長を可能にする支持マトリックス）などの任意の他の適切な表面であってもよい。接着細胞は、インテグリンまたは他の細胞受容体のような固定基質を介して表面に付着する。表面（例えば、細胞培養プレートまたはマイクロキャリアなど）は、細胞の接着を促進する材料から作られてもよいし、またはその材料で処理されていてもよいことが理解されるであろう。細胞接着を促進する材料の例は、本開示の他の箇所に記載されている。好適には、接着細胞は、哺乳類細胞、例えば、ヒトであってもよい。好適には、接着細胞は、一次細胞または不死化細胞であってもよい。単に例として、一次細胞は、筋細胞、心筋細胞、上皮細胞、線維芽細胞、ケラチノサイト、メラノサイト、内皮細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、脂肪細胞および間葉系幹細胞からなる群から選択されてもよい。単に例として、不死化細胞は、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ ２９３細胞、３Ｔ３細胞、Ａ５４９細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ細胞、ＯＫ細胞、Ｃ２Ｃ１２およびＰｔｋ２細胞からなる群から選択され得る。

本明細書に記載されるシステムは、成長チャンバを備える。当業者には明らかなように、「成長チャンバ」は、接着細胞の成長に適した任意の適切なチャンバまたは表面を指す。このため、「成長チャンバ」は、任意の適切なタイプの表面および任意の適切なタイプの幾何学的形状を有し得る。適切な成長チャンバは当技術分野でよく知られており、適切な成長チャンバには、マイクロキャリア、細胞培養プレート、細胞培養容器、反応容器、およびバイオリアクタが含まれるが、これらに限定されない。このため、適切な成長チャンバとして、中空繊維（fibre）、攪拌槽、エアリフト、気泡塔または流動床反応容器／バイオリアクタが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本発明は、主に、成長チャンバが細胞培養プレートを備えるものとして以下に説明されるが、任意の適切な成長チャンバ（例えば、バイオリアクタ）も使用され得ることは明らかである。

本明細書に記載のシステムはまた、細胞トラップを備える。当業者には明らかなように、「細胞トラップ」は、細胞を捕捉（例えば、捕獲または拘束）するための任意の適切な手段を指す。また、「細胞トラップ」は、細胞分離デバイス、または、細胞の通過（移動）を防止する（細胞の通路を塞ぐ）ための手段としても説明され得る。好適な細胞トラップは、当業者であれば容易に特定可能である。例えば、細胞トラップとして、フィルタ（例えば、デッドエンドまたはクロスフロー／タンジェンシャル流体流濾過を使用）、遠心分離機、音響分離またはマイクロ流体ベースのシステムが挙げられる。したがって、本発明は、主に細胞トラップがフィルタを備えるものとして以下に説明されるが、任意の適切な細胞トラップも使用され得ることは明らかである。

図１および図２は、例示的な細胞成長チャンバ１００を示す。細胞成長チャンバ１００は、入口１０２および出口１０４を有する。入口１０２は、例えば外部リザーバ（図５に示す）からの細胞培養培地源に接続されるように適合されている。この例では、入口１０２は、例えば流体流導管に接続するためのルアーロックコネクタを備える。出口１０４は、例えば導管などの収集手段、または細胞トラップに接続されるように適合され得る。この例では、出口１０４は、ルアーロックコネクタを備える。このように、細胞成長チャンバ１００を、バイオプロセシングシステムの流体流路に組み込むことは容易である。

本明細書で使用する「細胞培養培地」という用語は、生きた細胞を培養して増殖させるための栄養溶液を指す。細胞培養培地は、完全な製剤、すなわち、細胞を培養するための補充を必要としない細胞培養培地であってもよいし、不完全な製剤、すなわち、補充を必要とする細胞培養培地であってもよいし、不完全な製剤を補充し得る培地であってもよいし、完全な製剤の場合、培養または培養結果を改善し得る培地であってもよい。様々な細胞培養培地が当業者に知られており、当業者はまた、培養される細胞型によって、使用されるべき培養培地の種類が決定され得ることも理解するであろう。

単なる例示であって限定するものではないが、細胞培養培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムのＦ－１２（Ｆ－１２）、ライボビッツのＬ－１５培地、ＲＰＭＩ－１６４０、メセンカルト(商標）基礎培地、最小必須培地（ＭＥＭ）、基礎培地イーグル（ＢＭＥ）、ハムのＦ－１０、α最小必須培地（αＭＥＭ）、グラスゴーの最小必須培地（Ｇ－ＭＥＭ）、およびイスコフの改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）からなる群、またはそれらの任意の組合せから選択されてもよい。市販されている（例えば、マサチューセッツ州ウォルサムのThermo Fisher Scientificより）他の培地、または当技術分野で知られている他の培地は、本開示では同等に使用され得る。また、単に例示であるが、培地は、２９３ ＳＦＭ、ＣＤ－ＣＨＯ培地、ＶＰ ＳＦＭ、ＢＧＪｂ培地、ブリンスターのＢＭＯＣ－３培地、細胞培養冷凍培地、ＣＭＲＬ培地、ＥＨＡＡ培地、ｅＲＤＦ培地、フィッシャーの培地、ガンボーグのＢ－５培地、ＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）補充培地、グレースの昆虫細胞培地、ＨＥＰＥＳ緩衝培地、リヒターの改変ＭＥＭ、ＩＰＬ－４１昆虫細胞培地、マッコイの５Ａ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、Ｍｅｄｉａ １９９、改変イーグル培地（ＭＥＭ）、培地ＮＣＴＣ－１０９、シュナイダーのショウジョウバエ培地、ＴＣ－１００昆虫培地、ウェイマウスのＭＢ ７５２／１培地、ウィリアムの培地Ｅ、プロテインフリーハイブリドーマ培地ＩＩ（ＰＦＨＭ ＩＩ）、ＡＩＭ Ｖ培地、ケラチノサイトＳＦＭ、定義されたケラチノサイトＳＦＭ、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標） ＳＦＭ、ＳＴＥＭＰＲＯ（登録商標）完全メチルセルロース培地、ヘプタザイムＳＦＭ、ニューロバサル（商標）培地、ニューロバサルＡ培地、ヒバーネート（商標）Ａ培地、ヒバーネートＥ培地、エンドセリアルＳＦＭ、ヒトエンドセリアルＳＦＭ、ハイブリドーマＳＦＭ、ＰＦＨＭ ＩＩ、Ｓｆ ９００培地、Ｓｆ ９００ ＩＩ ＳＦＭ、ＥＸＰＲＥＳＳ ＦＩＶＥ（登録商標）培地、ＣＨＯ－Ｓ－ＳＦＭ、ＡＭＩＮＯＭＡＸ－ＩＩ完全培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ－Ｃ１００完全培地、ＡＭＩＮＯＭＡＸ－Ｃ１４０基礎培地、ＰＵＢ－ＭＡＸ（商標）核型分析（karyotyping）培地、ＫＡＲＹＯＭＡＸ骨髄核型分析培地、ＫＮＯＣＫＯＵＴ Ｄ－ＭＥＭからなる群、またはこれらの組み合わせから選択され得る。

好適には、細胞培養培地は血清を含まなくてもよい。好適には、細胞培養培地はグルコースを含まなくてもよい。

入口１０２は、細胞成長チャンバ１００の上端１０６に位置し、出口１０４は、細胞成長チャンバ１００の下端１０８に位置する。このように、入口１０２は、細胞成長チャンバ１００の反対側の端部において、出口１０４から間隔をあけて配置される。使用時、細胞培養培地は、入口１０４から細胞成長チャンバ１００を通って出口１０６に流れ得る。したがって、入口１０４および出口１０６は、その間の流れ方向を規定する。いくつかの例では、細胞培養培地の流れが実質的に直線的になるように、入口１０４は出口１０６と一直線上にあってもよい。

細胞成長チャンバ１００は、細胞成長チャンバ１００の上端１０６と下端１０８との間に延在する軸１１０を有してもよい。軸１１０は、上端１０６および下端１０８に対して実質的に垂直であってもよい。このように、細胞成長チャンバ１００がその標準的な向きにあるとき、入口１０２は細胞成長チャンバ１００の上部に位置し、出口１０４は細胞成長チャンバ１００の下部に位置する。したがって、軸１００は、標準的な向きにおいて実質的に鉛直であってもよい。

細胞成長チャンバ１００は、入口１０４と出口１０６との間に位置する１つまたは複数の細胞培養プレート１１２を有する。複数の細胞培養プレート１１２は、２～１００枚のプレート、例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００枚、またはそれ以上のプレートを含み得る。細胞培養プレート１１２の数は、細胞成長チャンバ１００のサイズに依存し得ることが理解されるであろう。複数の細胞培養プレート１１２は、積み重ねられた構成（積層構成）で配置される。積層されたプレート１１２は、プレート１１２の各々の間に複数の流路１２０を規定する。言い換えれば、隣接するプレート１１２の各ペアは、それらの間に空間を有し、これにより、細胞培養培地が上記流れ方向に細胞成長チャンバ１００を通って流れることができる。この例では、流れ方向は、入口から出口までの実質的に直線状である。使用時、細胞培養培地は、入口１０２から細胞成長チャンバ１００に入り、その後、流路１２０を通って流れる。このようにして、複数の細胞培養プレート１１２は、入口１０４からの細胞培養培地の流れを邪魔する（disrupting）バッフルを形成し得る。

細胞培養プレート１１２の１つまたはそれぞれは、実質的に平面的なシートであってもよい。この例では、細胞培養プレート１１２の１つまたはそれぞれは、第１の細胞培養表面１１４および第２の細胞培養表面１１６を有する。複数の細胞培養プレート１１２を有する細胞成長チャンバ１００において、第１の細胞培養プレート１１２ａの第１の細胞培養表面１１４は、第２の、隣接する細胞培養プレート１１２ｂの第２の細胞培養表面１１６に対向し、その間に対応する流路１２０を有する。

１つまたは複数の細胞培養プレートは、細胞成長チャンバ１００の一側部から細胞成長チャンバ１００の反対側の(対向する）側部まで横方向に延在していてもよい。このようにして、各流路１２０は、細胞成長チャンバ１００の一側部から対向する側部までの間に延在していてもよい。

この例では、細胞培養プレート１１２は、細胞成長チャンバ１００の長手方向に沿って位置する。すなわち、細胞培養プレートの細胞培養表面１１４、１１６は、細胞成長チャンバ１００の上部１２６から細胞成長チャンバ１００の下部１２８まで長手方向に延在している。細胞培養プレート１１２は、入口および出口１０４の一方または両方から間隔を空けて配置されてもよい。これにより、流体が細胞培養プレート１１２にわたってより均等に分散するための空間が確保される。例えば、細胞培養プレート１１２は、入口１０２から１ミリメートルから１メートルの間に位置してもよい。好適には、細胞培養プレート１１２は、入口１０２から約１０ミリメートルから約１００ミリメートルの間、例えば約５０ミリメートルに位置してもよい。さらに、細胞培養プレート１１２は、出口１０４から１ミリメートルから１メートルの間に位置してもよい。好適には、細胞培養プレート１１２は、出口１０４から約１０ミリメートルから約１００ミリメートルの間、例えば約４４ミリメートルに位置してもよい。

細胞成長チャンバ１００の向きが通常（鉛直）であることで、重力を利用して細胞培養培地の出口へ向かう流れ方向を支持することにより、最適な細胞採取が可能となる。

細胞培養プレート１１２は、細胞がプレートの第１および第２の細胞培養表面１１４、１１６の両方に付着し得るように位置している。好適には、細胞培養プレートは、細胞成長チャンバ１００の上端１０６および下端１０８の間に延在する軸１１０から０度から７５度の角度に方向付けられて（配向されて）いる。適切には、細胞培養プレート１１２は、軸１１０から０度から４５度までの角度に方向付けられている。この例では、細胞培養プレート１１２は、軸１１０と実質的に揃えられている。すなわち、細胞培養プレート１１２は、軸１１０に対して０度の角度に方向付けられている。このように、１つまたは複数の細胞培養プレート１１２は、細胞培養培地の流れ方向と平行であってもよい。

好適には、細胞培養プレート１１２は、細胞成長チャンバの上端１０６と下端１０８との間に延在する軸１１０から０度超から７５度、例えば０度超から４５度の角度に方向付けられてもよい。単に例として、細胞培養プレートは、細胞成長チャンバ１００の上端１０６と下端１０８との間に延在する軸１１０から５度から７５度、または５度から４５度の角度に方向付けられてもよい。

１つまたは複数の細胞培養プレート１１２は、プレートの細胞培養表面、または積層体（スタック）内の第１のプレート１１２ａの細胞培養表面が細胞成長チャンバ１００の壁１２２に平行になるように、細胞成長チャンバ１００内に配置されてもよい。したがって、細胞成長チャンバ１００の壁１２２と、プレート、またはスタック内の第１の細胞培養プレート１１２とは、それらの間に流路１２０を規定することもできる。同様に、プレートの細胞培養表面、またはスタック内の最後のプレート１１２ｃの細胞培養表面は、細胞成長チャンバ１００の壁１２２の反対側の部分と平行である。したがって、細胞成長チャンバ１００の壁１２２と、プレート、またはスタック内の最後の細胞培養プレート１１２ｃとは、それらの間に流路１２０を規定することもできる。

細胞培養プレート１１２ａ～１１２ｃは、互いに実質的に等しい間隔を空けて配置されてもよい。すなわち、１つの細胞培養プレート１１２ａの第１の細胞培養表面１１４と隣接する細胞培養プレート１１２ｂの対向する第２の細胞培養表面１１６との間の距離は、プレート間で一定であってもよい。これにより、その間の流路１２０が、流路１２０の長さに沿って一定の断面積を有し得る。この例では、細胞培養プレートは、約０．１ミリメートルから１０ミリメートルの間隔をあけて配置されてもよい。適切には、細胞培養プレート１１２は、約１ミリメートルから５ミリメートルの間隔をあけて配置される。細胞培養プレート１１２は、細胞成長チャンバ１１０内の各流体流路を通る流速が実質的に等しくなるように、それぞれ等しい間隔をあけて配置されてもよい。あるいは、細胞培養プレート１１２ａ～１１２ｃは、等間隔に配置されていなくてもよい。好適には、細胞培養プレート１１２ａ～１１２ｃが等距離に配置されていない場合、細胞培養プレート１１２ａ～１１２ｃ間の間隔は、中央または実質的に中央の細胞培養プレート１１２から増加（例えば、徐々に増加）してもよい。ここでは、中央の細胞培養プレートは、軸１１０に最も近い位置にあるプレートであってよい。

細胞成長チャンバ１００内の各流体流路を通る流速が、過度のせん断応力をもたらさないようなものであってよいことは、当業者には理解されるであろう。本明細書で使用する「過度のせん断応力」という用語は、静的細胞培養で成長させた細胞と比較して、細胞増殖（cell proliferation）の阻害または減少、細胞損傷、細胞死、および／または細胞剥離率の増加をもたらすせん断応力を指す。ここでは、「静的細胞培養」は、本明細書に記載の細胞成長チャンバ内の流体流路を通る流れの速度（流速）がある「フロー細胞培養」とは対照的に、細胞成長チャンバ内に流れの速度が無い場合の細胞培養を指す。

好適には、過度なせん断応力は、約０．１Ｐａ超、約０．２Ｐａ超、約０．３Ｐａ超、約０．４Ｐａ超、または約０．５Ｐａ超であってよい。より好適には、過度なせん断応力は約０．１Ｐａ超であってもよい。したがって、細胞培養成長チャンバ１１０は、使用時に、せん断応力が０．１Ｐａ以下、０．２Ｐａ以下、０．３Ｐａ以下、０．４Ｐａ以下、または０．５Ｐａ以下となるように構成され得る。また、過度のせん断応力が細胞型に依存し得ることも、当業者に理解されるであろう。

細胞培養プレート１１２は、細胞がそこに付着して増殖することができる環境を提供するように構成さている。細胞培養プレート１１２は、ガラスまたはプラスチックから作られてもよい。好適には、細胞培養プレート１１２は、細胞接着を促進する材料を含み得る。ここで、そのように細胞接着を促進する材料を「接着性材料」と呼ぶことがある。

単に例として、細胞接着を促進する材料は、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリアルキレン、ポリフルオロクロロエチレン、ポリ塩化ビニル、フッ化ビニル樹脂、ポリスチレン、ポリスルホン、ポリウレタン、ポリエチレンテレフタレート、セルロース、ガラス繊維、セラミック粒子、マトリゲル、細胞外マトリックス成分、コラーゲン、ポリＬ乳酸、デキストラン、不活性金属繊維、シリカ、ナトロンガラス、ホウケイ酸ガラス、キトサン、および、植物スポンジからなる群から選択され得る。好適には、セルロースは、酢酸セルロースであってもよい。細胞外マトリックス成分は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、コンドロネクチン、およびラミニンのうちの１つまたは複数であってもよい。好適には、接着性材料は静電的に帯電している。好適には、接着性材料は、コラーゲンまたはゼラチンで被覆されていてもよい。好適には、接着性材料は、MiottoらのDeveloping a Continuous Bioprocessing Approach to Stromal Manufacture, ACS Applied Materials & Interfaces, (2017), 9 (47), pp.41131-41142に記載されているような両親媒性ペプチド（peptide amphiphile）（ＰＡ）を含んでいてもよい。この例では、接着性材料は、その細胞培養プレートまたは各細胞培養プレートの第１の細胞培養表面１１４および第２の細胞培養表面１１６に付与されてもよい。同じ細胞成長チャンバ１００内で、細胞培養プレート１１２および／または細胞培養表面１１４、１１６の一部または全部が、同じまたは異なる接着性材料を含んでもよいことは理解されるであろう。

細胞培養プレート１１２は、細胞成長チャンバ１００内に置かれる前に、接着細胞で播種されてもよい。好適には、接着細胞は、細胞培養プレートの片面または両面に播種されてもよい。

細胞培養プレート１１２が細胞成長チャンバ１００内に置かれると、第１の細胞培養表面１１４と第２の細胞培養表面１１６とは共に細胞培養培地にさらされ、細胞培養プレート１１２の一方または両方の表面で接着細胞が成長することができる。細胞が細胞培養プレート１１２から剥離すると、細胞培養培地中を流路に沿って出口１０４に向かって流れる。

いくつかの例では、細胞成長チャンバ１００は、細胞トラップ（例えば図５ａに別個に示す）を備えてもよい。細胞トラップは、フィルタ要素を用いて、細胞培養プレートから剥離した細胞を捕捉するように構成されている。フィルタ要素は、細胞培養培地を通過させるが、剥離した細胞の通過を阻止するように構成されている。細胞トラップは、図５ａを参照して詳細に説明される。

細胞成長チャンバは、テーパ状の出口部分１３０を有してもよい。テーパ状出口部分１３０は、１つまたは複数の細胞培養プレート１１２ａ～１１２ｃから出口１０４に向かって内向きに傾斜（先細り）している。このように、テーパ状出口部分１３０は、剥離した細胞および細胞培養培地を出口の方へ導く。このことは、細胞成長チャンバ１００の底壁上に剥離した細胞が蓄積されるのを回避して細胞の収集性を改善させるのに有用であり得る。この例では、テーパ状出口部分１３０は、細胞成長チャンバの壁と一体化している。テーパ状出口部分１３０は、軸１１０に対して２５度から６５度の角度で内向きに傾斜してもよい。いくつかの例では、テーパ状出口部分１３０は、図３ａに示すように、別個の部品であってよい。例えば、テーパ状出口部分１３０は、円錐形のベース部分３３０を有してもよい。

いくつかの例では、細胞成長チャンバ１００は、テーパ状入口部分１３２も備えてもよい。テーパ状入口部分１３２は、入口１０２から１つまたは複数の細胞培養プレートに向かって外向きに傾斜している。テーパ状入口部分１３２は、入口１０２から細胞成長チャンバ１００に入る細胞培養培地をより均等に分配するのに有用であり得る。

図３ａおよび図３ｂは、細胞成長チャンバ１００のアセンブリのさらなる例を示す。例えば、細胞培養プレート１１２は、細胞チャンバ１００の各側部の保持要素３３４で所定の位置に保持されてもよい。保持要素３３４は、複数の細胞培養プレート１１２を、間隔を空けて保持することができる。保持要素３３４は、１つまたは複数の細胞培養プレートを受け入れるための１つまたは複数のスロット３３６を有してもよい。スロット３３６の幅は、細胞培養プレート１１２の幅に対応してもよい。このように、保持要素３３４の各スロットは、対応する細胞培養プレート１１２を所定の位置に保つことができる。保持要素３３４は、例えばシリコンのような任意の適切な材料であってよい。

図３ａに示すように、細胞成長チャンバ１００は、細胞培養プレート１１２にアクセスできるように構成されてもよい。このようにして、チャンバ内を洗浄したり、細胞培養プレートを所望に応じて交換したりすることができる。

この例では、細胞成長チャンバは、本体部分３４０と、取り外し可能な側壁部分３３８とを備える。取り外し可能な側壁部分３３８は、本体部分３４０と結合して、その間に内部チャンバ容積を規定するように構成される。例えば、本体部分３４０はキャビティ３４２を有してもよく、側壁部分３３８はキャビティ３４２を閉じるための蓋を形成してもよい。

側壁部分３３８は、例えば、ねじなどの任意の適切な手段を介して本体部分３４０と取り外し可能に結合してもよい。この例では、シール要素３４４がキャビティ３４２の周辺部に位置し、側壁部分３３８が本体部分３４０と結合されたときに内部チャンバ容積を流体的に密封する。シール要素３４４は、例えば、シリコンＯリングであってもよい。いくつかの例では、側壁部分３３８と本体部分３４０とは、細胞成長チャンバ１００の温度調節を容易にするために断熱されていてもよい。

円錐形ベース部分３３０は、キャビティ３４２の内部でチャンバの出口に隣接して位置してもよい。円錐形ベース部分３３０は、本体部分３４０と取り外し可能な側壁部分３３８との間の摩擦嵌合によって所定位置に保持されてもよい。円錐形ベース部分３３０の上面は、また、チャンバの両側の保持要素３３４に当接するように構成された、実質的に平面の第１および第２の当接面を有してもよい。このようにして、円錐形ベース部分３３０は、チャンバの出口１０４に隣接する位置に保持され得る。

細胞培養プレート１１２は、キャビティ３４２内に位置し、上述のように保持要素３３４を用いて間隔を空けた構成で所定の場所に保持される。使用時には、細胞培養培地は、入口１０２から導入され、細胞培養プレート１１２の表面を通過しながらキャビティ３４２を流れ、その後、円錐形ベース部分３３０によって出口１０４の方に導かれる。

図４は、接着細胞の連続バイオプロセシングのための方法の一例を示す。最初のステップＳ４５０として、細胞培養培地を、細胞成長チャンバ１００の入口１０２に通過させる。その後、細胞培養培地は、流路１２０を出口に向かって通過する。一部の細胞は細胞培養プレート１１２から剥離し、細胞培養培地内を出口に向かって流れる。この液体は、その後、ステップＳ４５２において、出口１０４から収集され得る。

ステップＳ４５４において、細胞は流体から分離される。すなわち、剥離した細胞は、細胞トラップまたは他の適切な収集機構によって収集され得る。この例では、出口１０４から出力された流体は、培地の再循環（リサイクル）中に細胞トラップを通過し、細胞トラップは、剥離した細胞が細胞成長チャンバに再侵入することを防止する。したがって、剥離した細胞は、細胞トラップに集められ、流体から分離され得る。その後、流体は、入口１０２に戻され、再び細胞成長チャンバ１００を通過してもよい。すなわち、細胞培養培地は再循環されてもよい。再循環の際に、さらなる培地および／または栄養剤を細胞培養培地に添加してもよい。

図５Ａおよび図５Ｂは、接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステム５００を示す。システム５００は、細胞成長チャンバ５６０と細胞トラップ５６２とを備える。細胞トラップ５６２は、細胞成長チャンバ５６０と流体連通している。細胞成長チャンバ５６０は、上述の細胞成長チャンバ１００と同様に構成されてもよく、または細胞の成長のための別の適切なチャンバであってもよい。

システム５００は、流体リザーバ５６４をさらに備える。流体リザーバ５６４は、細胞培地リザーバであってもよく、細胞成長チャンバ５６０および細胞トラップ５６２に流体的に接続されている。このようにして、例えば細胞培養培地のような流体が、システム５００を通過するように導かれ得る。この例では、流体リザーバ５６４、細胞成長チャンバ５６０、および細胞トラップ５６２は、導管５６８ａ～５６８ｄを介して流体的に接続される。他の例では、流体リザーバ５６４、細胞成長チャンバ５６０、および細胞トラップ５６２の１つ以上は、間に延びる導管５６８ａ～５６８ｄを必要とせずに、直接流体的に接続されてもよい。

システム５００は、図５ａに示すような第１の動作モードと、図５ｂに示すような第２の動作モードで動作するように構成される。第１の動作モードでは、チャンバ５６０内での細胞の成長が可能であり、第２の動作モードでは、細胞トラップ５６２に収集された細胞の採取が可能である。システム５００は、第１の動作モードと第２の動作モードとの間を選択的に切り替えるように構成される。

図５ａに図示される第１の動作モードでは、システムは、細胞成長チャンバ５６０を通過するように流体を導くように構成される。使用時には、流体は、矢印Ａで示されるように、流体リザーバ５６４から細胞成長チャンバ５６０に流れる。流体は、その後、成長チャンバ５６０を通過し、矢印Ｂで示されるように細胞トラップ５６２に流れる。その後、矢印Ｃで示されるように、流体は細胞トラップ５６２を出て、システム５００内の再循環（リサイクル）に備えてもよい。代わりに、システム５００は、図６ａおよび図６ｂを参照して後述するように、少なくとも一部の流体を細胞トラップ５６２から流体廃棄回路５６５に導くように構成されてもよい。

システム５００はまた、システム５００内の循環流体の所望の体積を維持するために、必要に応じてリザーバ５６４から追加の流体をシステムに入れるように構成されてもよい。

図５ｂに示される第２の動作モードでは、システム５００は、流体リザーバ５６４からの流体が細胞成長チャンバ５６０をバイパスするように構成される。すなわち、システムは、矢印Ｄで示されるように、流体リザーバ５６４から、細胞成長チャンバ５６０を通過させずに、直接細胞トラップ５６２に流体を導くように構成される。その後、細胞トラップ５６２に集められた細胞は、矢印Ｅによって示されるように、細胞培養培地と共に、細胞出口５７２を介して細胞トラップ５６２から排出され得る。このようにして、細胞トラップ５６２およびシステム５００から、周期的に細胞を採取することができる。

ここで図６ａおよび図６ｂを参照しながら、システム５００をより詳細に示す。図６ａは、第１の動作モードにおけるシステム５００を示し、図６ｂは、第２の動作モードにおけるシステム５００を示す。

第１の動作モードでは、システム５００は、流体リザーバ５６４から細胞培養チャンバ５６０に向かって流体を送るように構成される。この例では、流体リザーバ５６４は、別個のグルコースリザーバ５６４ａおよび細胞培養培地リザーバ５６４ｂを含む。

システムは、流体をシステム全体（around）に導くように構成された少なくとも１つのポンプを備える。この例では、システムは、複数のポンプ５７６ａ～５７６ｅを備える。ポンプの各々は、例えば灌流ポンプなどの任意の適切なポンプであってよい。

この例では、システム５００は、グルコースリザーバ５６４ａから細胞培養チャンバ５６０に向けてグルコースを導くためのグルコースポンプ５７６ａ、細胞培養培地リザーバ５６４ｂから細胞培養チャンバ５６０または細胞トラップ５７０のいずれかに向けて細胞培地を導くための細胞培地ポンプ５７６ｂ、細胞トラップ５６２とリザーバ５６４の間の再循環ポンプ５７６ｃ、ＰＢＳポンプ５７６ｄ（後述）、および廃棄回路５６５に流体を導くための廃棄物ポンプ５７６ｅを備える。流体の流れを方向付けるために、任意の数のポンプをシステムに組み込むことができることが理解されるであろう。好適には、剥離した細胞がポンプを通って流れないように、細胞成長チャンバ５６０と細胞トラップ５６２との間には流体ポンプが存在しない。剥離した細胞がポンプを通って流れると、細胞に損傷を与える可能性がある。いくつかの例では、ポンプは、細胞成長チャンバ５６０への流体流をパルス化してもよい。パルスレートは、例えば、連続的なものから１日に１回のものまで様々であり得る。好適には、グルコースポンプのパルスレートは、細胞培養培地中のグルコースのレベルが維持されるようなものであってよい。パルスレートは、細胞培養プレート１１２のサイズおよび数、細胞数、細胞型、および／またはグルコースセンサ５８８によって消費されるグルコースの量に依存し得ることが理解されるであろう。

この例では、システム５００は、流体リザーバ５６４と細胞培養チャンバ５６０の間にガス交換器を備える。使用時、流体リザーバからの流体は、細胞培養チャンバ５６０に到達する前にガス交換器５８４を通過する。ガス交換器５８４により、細胞成長チャンバ５６０に入る細胞培養培地が、細胞培養チャンバ５６０内の細胞成長をサポートするために適切に通気され、かつ／または適切なｐＨを有することを確実にすることができる。好適には、ガス交換器５８４は、細胞培養培地内の酸素レベルを増加させてもよいし、および／または細胞培養成長チャンバ５６０に入る細胞培養培地内の二酸化炭素レベルを減少させてもよい。

流体が細胞成長チャンバ５６０を通過することで、細胞培養プレート１１２に緩く付着している、またはもはや付着していない細胞を除去しやすくなる。除去された細胞は、流体中で成長チャンバ出口１０４の方へ運ばれる。そのため、細胞成長チャンバ５６０を出る流体は、細胞培養プレートから剥離した細胞を含み得る。

この例では、細胞成長チャンバは、入口１０２と、出口１０４と、入口１０２および出口１０４の間に配置された１つまたは複数の細胞培養プレート１１２と、を備える。複数の細胞培養プレート１１２は、細胞成長チャンバを通る複数の流路１２０を規定する積層構成で配置される。細胞培養プレート１１２は、細胞培養プレートから剥離した細胞が流路１２０に沿って移動し、出口１０４を通るように方向付けられている。使用時、システム５００は、出口１０４が入口１０２の鉛直下方に配置されるように方向付けられてもよく、これにより、重力を利用して流体の方向性のある流れを促進することができる。さらに、重力によって、細胞培養プレート１１２からの細胞の剥離、特に、細胞培養プレート１１２に緩く付着している細胞、および／または、細胞培養プレート１１２から剥離したが、細胞培養プレート１１２に付着した他の接着細胞に付着している細胞の剥離を促進し得る。

成長チャンバ５６０を通って流体を連続的に循環させることにより、連続的な細胞成長が可能になる。すなわち、培養プレートに付着した（または、例えばバイオリアクタにおいては、マイクロキャリアに付着した）細胞が増殖してコンフルエント（confluency）に達すると、細胞の一部が、細胞培養プレート１１２（または、例えばバイオリアクタにおいては、マイクロキャリア）により緩く付着するか、またはそこから剥離し、それによって、接着細胞が増殖を継続するためのスペースが提供され得る。

細胞は、例えば、発現低下および／または細胞固定基質の分解（degradation）の結果として、細胞培養プレート１１２からより緩く付着または剥離し得る。一般的に言えば、継代数の多い細胞は、継代数の少ない細胞と比較して、発現が低下したり、および／または細胞固定基質の分解が増加したりし得る。このような発現低下および／または分解増加により、継代数の多い細胞が、継代数の少ない細胞に細胞培養プレート１１２上のスペースを奪い取られる可能性がある。また、細胞が細胞固定基質分解剤と接触した結果、細胞が細胞培養プレート１１２により緩く付着したり、剥離したりする可能性がある。例として、細胞固定基質分解剤は、トリプシン、パパイン、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼタイプ１、コラゲナーゼタイプ２、コラゲナーゼタイプ３、コラゲナーゼタイプ４、ディスパーゼ、オールトランスレチン酸、またはそれらの組合せでもよい。培地中にオールトランスレチノイン酸が存在すると、細胞固定タンパク質ＭＭＰ１が分解され得る。細胞固定基質の分解は経時的に着実に起こり得る。このため、分解剤に長期間曝された細胞は、曝されなかった細胞や短期間曝された細胞と比較して、緩く剥離または剥離し得る。同時に、分解剤に曝露されていない、またはより短い時間曝露された細胞は、付着したまま増殖し得る。システムは、細胞成長チャンバ５６０の出口を細胞トラップ５６２の細胞入口５７１に流体的に接続するための細胞輸送導管５６８ｂを備えてもよい。使用時、剥離した細胞は、細胞成長チャンバ５６０から細胞輸送導管５６８ｂを介して細胞トラップ５６２へ流体内を流れてもよい。この例では、細胞成長チャンバ５６０と細胞トラップ５６２との間の導管５６８ｂに沿った流体流は、背圧および任意に重力によって促進される。このようにして、より速い流体の流れによって引き起こされ得る細胞への損傷を回避することができる。

細胞トラップ５６２は、剥離した細胞を捕捉(トラップ）しながら、流体を通過させるように構成される。例えば、細胞トラップ５６２は、剥離した細胞の通過を阻止するように構成されたフィルタ５７０を備えてもよい。フィルタ５７０は、流体の通過を可能にし、剥離した細胞の通過を防止するサイズの開口を有する、メッシュ、または他の適切なフィルタ材であってもよい。これにより、剥離した細胞が収集され得る。また、剥離した細胞が、例えば流体ポンプを通過する際に損傷する可能性のある、システム内を再循環することを防止し得る。さらに、細胞トラップ５６２は、細胞トラップ内に収集された細胞が細胞トラップの下部に沈降（settle）するように構成され得る。細胞トラップ５７４は、細胞入口５７１に対してフィルタの反対側に配置された流体出口５７７をさらに有する。

システムは、フィルタ５７０を通過した流体が廃棄回路５６５に向かって流れるか、または細胞成長チャンバ５６０を通って再循環されるように構成される。ｐＨセンサは、細胞トラップの流体出口５７７に隣接する流体通路に配置されてもよい。流体はｐＨセンサを通過してもよく、ｐＨセンサは、流体のｐＨが、流体が細胞成長チャンバ５６０を通って再循環するのに十分なレベルであるかどうかを決定してもよい。例えば、許容可能なレベルのｐＨは、流体が細胞成長チャンバ内の細胞の増殖を妨げないようにするために、７から８、好適には７．２から７．６、より好適には約７．４であり得る。ｐＨが許容レベル内であれば、液体は細胞成長チャンバ５６０を通って再循環される。システムは、細胞トラップ５７０の流体出口と細胞成長チャンバ５６０との間の流体経路に位置する再循環ポンプ５７６ｃを備えてもよい。流体の再循環が望まれるとき（例えば、ｐＨが適切なレベルにあるとき）、再循環ポンプ５７６ｃを選択的に作動させて、細胞成長チャンバ５６０を通るように流体を戻すように導くのを助けてもよい。

ｐＨが許容範囲外であると決定された場合、システム５００は、細胞トラップ５７０から廃棄回路５６５に向かって流体を導くように構成される。例えば、システム５００は、ｐＨが許容範囲外であることに応答して、廃棄物ポンプ５７６ｅを選択的に起動するように構成されてもよい。廃棄物ポンプ５７６ｅは、流体の少なくとも一部を細胞トラップ５７０の流体出口５７７から廃棄回路５６５に導くように構成される。廃棄回路５６５は、オプションでグルコースセンサ５８８を備えてもよい。システム５００は、バルブ５９２を選択的に作動させて、流体を廃棄物収集チャンバ５７８に直接導くか、またはグルコースセンサ５８８を通過させるように構成されている。

グルコースセンサは、酵素ベースであっても非酵素ベースであってもよい。酵素ベースのグルコースセンサとしては、例えば、グルコースを酸化し、Ｏ_２、ＣＯ_２、またはＨ_２Ｏなどの検出可能な化合物を生成するグルコースオキシダーゼ酵素（ＧＯｘ）を使用することができる。酵素ベースのグルコースセンサの他の例は、当業者に知られているであろう。流体がグルコースセンサ５８８を通過したときに、システム５００は、フラッシュプロトコルを起動してもよい。すなわち、システム５００は、ＰＢＳポンプ５７６ｄを作動させて、リン酸緩衝生理食塩水緩衝液（ＰＢＳ）を、センサを通るように導いてもよい。

フラッシュプロトコルは、グルコースセンサ５８８の寿命を延長することができる。特に、酵素ベースのグルコースセンサの寿命を延ばすことができる。これは、フラッシュプロトコルは、細胞培養培地がグルコースセンサと接触したままになって酵素と反応することを防ぐからである。グルコースセンサ５８８からのデータによって、システム５００は、グルコースリザーバに関連するグルコースポンプ５７６ａをオン／オフしてシステム内の流体にグルコースを加えることで、流体内のグルコースレベルを変更してもよい。

次に図６Ｂを参照すると、細胞トラップ５６２に収集された細胞を採取するために、システム５００は、第２の動作モードに切り替えるように構成される。第２の動作モードでは、システムは、細胞培養培地リザーバ５６４ｂから細胞トラップ５７０に、そして細胞出口５７２を通るように細胞培養培地を導き、細胞トラップ５７０で収集された細胞を採取するように構成されている。

第１の動作モードと第２の動作モードとを切り替えるために、システム５００は、第１のバルブ５６６を有するバルブアセンブリを備えてもよい。バルブアセンブリは、第１の動作モードに対応する第１の構成と、第２の動作モードに対応する第２の構成との間で選択的に切り替えるように構成されている。

この例では、第１のバルブ５６６は、第１の構成において、細胞培養培地リザーバ５６４ｂから細胞成長チャンバ５６０を通過せずに細胞トラップ５７０に直接向かう流体の流れを防止するように構成されている。第１の構成では、第１のバルブ５６６によって、細胞トラップ５７０または細胞培養培地リザーバ５６４ｂのいずれかから細胞培養チャンバ５６０に向かって流体を流すことができる。

この例では、第１のバルブ５６６は、３つの導管の間の接合部に配置される。第１の導管５６８ａは、バルブ５６６と細胞成長チャンバ５６０との間に延在し、成長チャンバ入口導管と呼ばれることがある。第２の導管５６８ｄは、バルブ５６６と細胞トラップ５７０の流体入口５７９との間に延在し、バイパス導管と呼ばれることがある。第３の導管５６８ｃは、細胞トラップ５７０の流体出口５７７とバルブ５６６との間に延在し、再循環導管と呼ばれることがある。

第１の構成と第２の構成とを切り替えるために、バルブは、３つの導管５６８ａ、５６８ｂ、５６８ｄのうちの２つの導管の間の流体流を可能にする一方で、３つの導管５６８ａ、５６８ｂ、５６８ｄのうちのもう１つの導管への流体流を防止するように構成されてもよい。例えば、図６ａに示す第１の構成では、バルブ５６６は、再循環導管５６８ｃから成長チャンバ入口導管５６８ａへの流体流を可能にする一方、バイパス導管５６８ｄへの流体流を防止するように構成されている。

図６ｂに示す第２の構成では、バルブ５６６は、成長チャンバ入口導管５６８ａに沿った流体流を防止し、バイパス導管５６８ｄに沿った流体流を可能にするように構成されている。このようにして、バルブ５６６は、リザーバ５６４と細胞成長チャンバ５６０との間に延在する成長チャンバ入口導管５６８ａを閉鎖する一方で、バイパス導管５６８ｄを開いて細胞トラップ５６２をリザーバ５６４に直接連結することにより、リザーバ５６４からの流れを直接細胞トラップに導くことができる。このように、流体は、細胞トラップ５６２に直接流れることができる。この流体の流れによって、剥離した細胞を収集容器５７４に導くのを助けることができる。

バルブアセンブリは、細胞トラップ５６２と収集容器５７４との間に第２のバルブ５７３をさらに備えてもよい。第１の動作モードでは、第２のバルブは、収集容器５７４と細胞トラップ５６２との間の流体連通を防止する。第２の動作モードでは、第２のバルブ５７３が開かれ、これによって、細胞トラップ５６２が収集容器５７４と流体連通する。したがって、第２の構成では、細胞培養培地リザーバ５６４からの流体は、細胞が細胞トラップから細胞出口５７２を介して収集容器５７４に流入することを促進する。使用時には、いくつかの例では、リザーバ５６４からの流体流に加えて、重力が、細胞を収集容器５７４に導くのを助けるように、収集容器５７４が細胞トラップ５６２の下に位置してもよい。

収集チャンバ５７４は、システム５００から適宜取り外し可能である。例えば、収集チャンバ５７４との接続のために、第２のバルブ５７３に隣接してルアーロックコネクタを設けてもよい。第２のバルブ５７３が（図６ａに示すように）閉じた構成にあるとき、例えば容量に達したときなど、所望に応じて収集容器５７４を切り離して交換することができる。

いくつかの例では、細胞トラップ５６２は、アクチュエータ５８６をさらに備えてもよい。アクチュエータは、細胞トラップ５６２に機械的振動を付与し、それによって細胞が細胞出口５７２に向かって移動することを促進するように構成されてもよい。アクチュエータは、圧電変換器であってもよい。アクチュエータは、第２の動作モードで動作するように構成されてもよく、選択的に作動するように構成されてもよい。

細胞トラップ５６２は、細胞トラップ５６２に収集された細胞の量を監視することができるセンサ（図示せず）を備えてもよい。細胞の量が所定の閾値に達すると、システム５００は、第１の動作モードから第２の動作モードに切り替えてもよい。

システム５００は、コントローラ（図示せず）を備えてもよい。コントローラは、システム５００内に分布するセンサの少なくとも１つからデータを収集し、動作モードを変更することによって、および／または、バルブ、ポンプおよびアクチュエータの１つ以上を作動させることによって反応するように構成されてもよい。したがって、コントローラは、システムコンポーネントからデータを受信するための受信機と、決定モジュールとを備えてもよい。同様に、センサ、バルブ、ポンプ、およびアクチュエータの各々は、データを送受信するための送信機および受信機を備えてもよい。いくつかの例では、システムは、全体的または部分的にワイヤレスで制御されてもよい。したがって、コントローラは、例えばｐＨ、グルコース濃度などの循環流体の特性を所定の許容範囲内に維持するように作用してもよい。さらに、システム５００は、動作モード間の選択的な切り替えが自動的に行われるように自動化されてもよい。このように、システム５００は、最小限の人間の入力で動作可能であり得る。

次に図７を参照すると、システム５００の動作方法が示されている。第１のステップＳ７０１において、システム５００は、第１の動作モードで動作するように選択的に切り替えられる。ステップＳ７０３において、システム内の流体は、細胞成長チャンバ５６０を通って細胞トラップに向かう方向に導かれる。流体が細胞成長チャンバ５６０を通るように導かれると、細胞培養プレート１１２に緩く付着した細胞または細胞培養プレート１１２から剥離した細胞が、細胞成長チャンバ５６０から細胞トラップ５６２に除去されやすくなる。ステップＳ７０５において、細胞が細胞トラップ５６２に収集される。このプロセスを、Ｓ７０７で繰り返してもよい。第１の動作モードの間、流体の特性を監視してもよい（例えば、ｐＨおよびグルコース濃度）。システム５００は、入力部（例えば、グルコースおよび細胞培養培地）を選択的に作動させてもよく、細胞トラップから流体を再循環させるか、廃棄回路に流体を流すかを切り替えてもよい。

その後、ステップＳ７０９において、システム５００は、第２の動作モードで動作するように選択的に切り替えられる。選択的スイッチＳ７０９は、例えば、細胞トラップ５６２内に収集された細胞の体積が所定の閾値に達すると、トリガーされ得る。その後、細胞トラップ５６２内に含まれる細胞をＳ７１１で採取できるように、細胞トラップ５６２を通過するように流体が導かれる。例えば、細胞は、細胞出口５７２を通過し、収集チャンバ５７４に入る。いくつかの例では、細胞は、重力によって収集チャンバ５７４に移され得る。その後、全プロセスをＳ７１３で繰り返してもよい。

特許請求の範囲から逸脱することなく、上記のような詳細な構成に対する様々な変更が可能である。

上記では、単一の入口と出口を有すると説明したが、細胞成長チャンバは、上部および下部にそれぞれ複数の入口および／または複数の出口を有してもよい。このように、細胞成長チャンバは、１つのシステム内に隣接して積み重ねられた複数の「ミニチャンバ」を備えてもよい。

細胞トラップは、細胞成長チャンバとは別個の構成要素として上述したが、細胞トラップは、細胞トラップと細胞成長チャンバとの間に延在する導管を必要せず、細胞成長チャンバと一体であってもよいし、細胞成長チャンバに直接流体的に接続されてもよいことが理解されるであろう。

細胞成長のための所望の条件に応じて、システムは、グルコースリザーバおよび細胞培養培地リザーバに対する追加的または代替的なリザーバを備えてもよい。

採取された細胞は、ロボット液体処理装置を使用して個々のウェルに播種されてもよい。いくつかの例では、採取された細胞は、異なる成長条件に曝されてもよい。単に例として、採取された細胞が幹細胞である場合、幹細胞の分化につながり得る培養条件に曝されてもよい。

細胞培養プレートは、実質的に平面状の第１および第２の細胞培養表面を有するものとして上述したが、平面的な表面は必須ではなく、細胞培養表面は、例えば、湾曲していたり、起伏を含んでいたりしてもよいことが理解されるであろう。

本発明の文脈では、グルコースリザーバの目的は、システム内の流体にグルコースを添加し、それによって細胞にエネルギを補給することであろう。しかしながら、例えばガラクトースなどのグルコース以外のエネルギ補給物で細胞を培養することが望ましい場合があることは、当業者であれば容易に理解できるであろう。したがって、本明細書に記載の細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムは、エネルギ補給リザーバ５６４ａと、それぞれのエネルギ補給ポンプ５７６ａおよびエネルギ補給センサ５８８とを備えてもよい。

第１の動作モードおよび第２の動作モードを有する上述のシステムによると、細胞培養チャンバ内で継続的に細胞を増殖させて、システムから定期的に採取することができる、接着細胞の連続バイオプロセシングが可能になる。本開示の他の箇所で触れたように、本発明は、人間の介入を最小限にするなどの多くの有利な点を有し得る。本発明の文脈では、このような最小限の人間の介入は、細胞を剥離するために通常オペレータの入力を必要とする、細胞採取のステップにも当てはまる。例えば、成長チャンバでは、接着細胞が増殖し、コンフルエントに達した時点で、重力および細胞培養培地の流れの力により徐々に剥離することが可能である。有益なことに、細胞の剥離には、細胞固定（anchoring）基質分解剤（トリプシンなど）を必要としない。さらに、成長チャンバは、閉鎖的で無菌であり、かつ／または血清もしくは他の生体異物を含まない、細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムで使用され得る。これにより、優良製造基準を用いて細胞を製造することが可能となる。

上述した実施形態のいずれかに関連して説明した特徴は、異なる実施形態間で互換的に適用できることは、当業者にとって明らかであろう。上述した実施形態は、本発明の様々な特徴を説明するための例である。

本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、「comprise（備える、有する）」および「contain（含む）」ならびにそれらの変形は、「含むが限定されない」ことを意味し、それらは、他の部位、添加剤、成分、整数またはステップを除外することを意図しない（および除外しない）。本明細書の説明および特許請求の範囲を通じて、文脈上別段の要求がない限り、単数は複数を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、文脈上別段の要求がない限り、単数形と同様に複数形を企図するものとして理解されるべきである。

本発明の特定の態様、実施形態または実施例と関連して記載された特徴、整数、特性、化合物、化学部分または基は、それと両立しない場合を除き、本明細書に記載された他の態様、実施形態または実施例に適用可能であると理解されるべきである。本明細書（添付の請求項、要約および図面を含む）に開示された特徴のすべて、および／またはそのように開示された方法もしくはプロセスのすべてのステップは、そのような特徴および／またはステップの少なくとも一部が相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本発明は、任意の前述の実施形態の詳細に限定されるものではない。本発明は、本明細書（添付の特許請求の範囲、要約および図面を含む）に開示された特徴の任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせ、あるいはそのように開示された任意の方法またはプロセスのステップの任意の新規なもの、または任意の新規な組み合わせに及ぶ。

本願に関連して本明細書と同時またはそれ以前に提出され、本明細書とともに公衆の閲覧に供されるすべての論文および文書に読者は留意するものとし、そのようなすべての論文および文書の内容は、参照によりここに組み込まれる。

Claims (27)

1. 接着細胞の連続バイオプロセシングのためのシステムであって、
   細胞成長チャンバと、
   前記細胞成長チャンバと流体連通し、細胞出口を有する細胞トラップと、
   第１の動作モードと第２の動作モードとを選択的に切り替えるように構成された流体フローシステムと、を備え、
   前記第１の動作モードにおいて、前記流体フローシステムは、前記細胞成長チャンバからの細胞が前記細胞トラップに収集されるように、前記細胞成長チャンバを通って前記細胞トラップに流体を導くように構成され、
   前記第２の動作モードにおいて、前記流体フローシステムは、流体を前記細胞トラップに導いて前記細胞出口を通過させて、前記細胞トラップに収集された細胞を採取するように構成されている、システム。
2. 前記流体フローシステムに流体を導入するための少なくとも１つのリザーバをさらに備える、請求項１に記載のシステム。
3. 前記第１の動作モードにおいて、前記流体フローシステムは、前記細胞トラップからの流体を流体廃棄出口に導くか、または、前記細胞トラップからの流体を前記細胞成長チャンバを通るように戻すように構成されている、請求項１または２に記載のシステム。
4. 前記細胞トラップはフィルタを備え、前記フィルタは、流体廃棄出口への細胞の通過を防止するか、または前記細胞成長チャンバを通るように戻る細胞の通過を防止するように構成されている、請求項１から３のいずれか１つに記載のシステム。
5. 前記第２の動作モードにおいて、前記流体フローシステムは、流体が前記細胞成長チャンバをバイパスするように構成されている、請求項１から４のいずれか１つに記載のシステム。
6. 前記第１の動作モードに対応する第１の構成と前記第２の動作モードに対応する第２の構成との間を選択的に切り替えるように構成されたバルブアセンブリをさらに備える、請求項１から５のいずれか１つに記載のシステム。
7. 前記第１の構成において、前記バルブアセンブリは、前記細胞成長チャンバを最初に通過することなく前記細胞トラップに直接流体を流すことを防止するように構成されている、請求項６に記載のシステム。
8. 前記第１の構成において、前記バルブアセンブリは、流体リザーバから前記細胞成長チャンバへの流体の流れを可能にするように構成されている、請求項６または７に記載のシステム。
9. 前記第２の構成において、前記バルブアセンブリは、流体リザーバから前記細胞成長チャンバへの流体の流れを防止するように構成されている、請求項６から８のいずれか１つに記載のシステム。
10. 前記第２の構成において、前記バルブアセンブリは、流体リザーバから直接前記細胞トラップへの流体の流れを可能にするように構成されている、請求項９に記載のシステム。
11. 前記バルブアセンブリは、前記細胞成長チャンバおよび前記細胞トラップへの流体の流れを選択的に制御するように構成された第１のバルブと、前記細胞出口を通る流体の流れを選択的に可能にするように構成された第２のバルブとを備える、請求項６から１０のいずれか１つに記載のシステム。
12. 流体リザーバから前記細胞トラップへ流体を通過させるために構成されたバイパス導管をさらに備える、請求項１から１１のいずれか１つに記載のシステム。
13. 流体リザーバから前記細胞成長チャンバへ流体を通過させるために構成された成長チャンバ入口導管をさらに備える、請求項１から１２のいずれか１つに記載のシステム。
14. 前記流体フローシステム内において流体を送るための少なくとも１つのポンプをさらに備える、請求項１から１３のいずれか１つに記載のシステム。
15. 前記少なくとも１つのポンプは、前記細胞成長チャンバと前記細胞トラップとの間に位置していない、請求項１４に記載のシステム。
16. 前記細胞トラップから採取された細胞を収集するために、前記細胞トラップに流体的に結合された収集容器をさらに備える、請求項１から１５のいずれか１つに記載のシステム。
17. 前記収集容器は、前記システムから取り外し可能である、請求項１６に記載のシステム。
18. 前記細胞成長チャンバは、入口と、出口と、前記入口および前記出口の間に位置する１つまたは複数の細胞培養プレートと、を備える、請求項１から１７のいずれか１つに記載のシステム。
19. 前記複数の細胞培養プレートは、前記細胞成長チャンバを通る複数の流路を規定する積層構成で配置され、前記複数の細胞培養プレートは、使用時に、細胞培養プレートから剥離した細胞が前記流路に沿って進み、前記出口を通るように方向付けされている、請求項１８に記載のシステム。
20. 前記システム内の流体の少なくとも１つの流体特性を監視するように構成された少なくとも１つのセンサをさらに備える、請求項１から１９のいずれか１つに記載のシステム。
21. 前記細胞トラップの内部の細胞の体積を監視するように構成されたセンサをさらに備える、請求項１から２０のいずれか１つに記載のシステム。
22. コントローラをさらに備え、前記コントローラは、前記第１の動作モードと前記第２の動作モードとの間で切り替えるように前記流体フローシステムを自動的に制御するように構成されている、請求項１から２１のいずれか１つに記載のシステム。
23. 前記コントローラは、前記細胞トラップに収集された細胞の量が所定の閾値に達したときに、前記流体フローシステムを前記第２の動作モードに自動的に切り替えるように構成されている、請求項２２に記載のシステム。
24. 接着細胞の連続バイオプロセシングのための、請求項１から２３のいずれか１つに記載のシステムの使用。
25. 接着細胞の連続バイオプロセシングのための方法であって、
    前記方法は、第１の動作モードと第２の動作モードとの間で、流体フローシステムを選択的に切り替えることを包含し、
    前記第１の動作モードは、細胞成長チャンバを通過させて細胞トラップに流体を導くことと、前記細胞成長チャンバからの細胞を前記細胞トラップに収集することとを包含し、
    前記第２の動作モードは、流体を前記細胞トラップに導いて細胞トラップ出口を通過させて、前記細胞トラップに収集された細胞を採取することを包含する、方法。
26. 前記第１の動作モードにおいて、前記細胞トラップを出る流体が、前記細胞成長チャンバを通るように再循環される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記第１の動作モードにおいて、前記細胞トラップを出る流体の少なくとも一部は、選択的に廃棄回路に導かれ、前記流体フローシステムから除去される、請求項２５または２６に記載の方法。

Images