JP6291429B2 - 細胞培養装置および細胞培養方法 - Google Patents

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Description

本発明は、細胞培養装置および細胞培養方法に関する。
細胞培養装置または細胞培養システムに関し、例えば以下の技術が知られている。例えば、特許文献1には、膜濾過分離装置と、培養装置、培地貯槽、濾液貯槽との間を液移送ポンプならびにバルブを挿入した液移送配管で連結した生物細胞の培養システムが記載されている。
特許文献2には、細胞の浮遊する培養液の一部を抜き取り、培養液と細胞とを濾過膜を介して分離し、細胞を新鮮培地とともに培養槽に戻して連続的に培地交換を行うことを可能とする培養装置が記載されている。
特開平2−150272号公報 特開平4−99483号公報
例えば、肝疾患や心疾患などを、細胞移植によって治療するためには、1×10個以上の分化細胞の移植がひとりの患者に必要であると考えられており、これを実現するためには、多能性幹細胞の大量培養技術の開発が不可欠である。
例えば、多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じる細胞塊(スフィア)のサイズが過大となると、細胞塊同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。従って、細胞塊のサイズが過大となることを防止するために、細胞の培養期間中の適切な時期に、細胞塊を分割する分割処理が必須となる。
上記の分割処理を含む細胞培養に必要とされる一連の処理を、閉鎖系において連続的に実施することにより大量の細胞を生産することを可能とした細胞培養装置についてこれまで提案された例はなく、動物細胞や幹細胞等の比較的増殖率の低い細胞の培養スケールを大きくすることは困難とされていた。培養スケールの増大に対応するべく、人手が介在され且つ培養スケールが小規模である細胞培養装置を並列に設置する対応も考えられるが、この場合、装置コストが高くなり、プロセスも煩雑となる。更に、装置間で培養環境に差が生じることから、培養された細胞の装置間における均質性が低下する。
本発明は、上記した点に鑑みてなされたものであり、分割処理を含む細胞培養に必要な一連の処理を、閉鎖系において連続的に実施することができる細胞培養装置およびそのような細胞培養装置を用いた細胞培養方法を提供することを目的とする。
本発明に係る細胞培養装置は、第1の流入口および第1の流出口を有する、細胞を培養するための培養容器と、第1の流出口と第1の流入口とを接続する第1の流路と、第1の流路内に設けられ、培養容器で培養される細胞を貯留するための貯留容器であって、第1の流出口に接続された第2の流入口および第1の流入口に接続された第2の流出口を有する第1の貯留容器と、第2の流出口と第1の流入口との間に位置する第1の流路内の第1の部位と、第2の流入口と第1の流出口との間に位置する第1の流路内の第2の部位と、を接続する第2の流路と、第2の流路内に設けられ、第1の部位を経由して第1の流路から流入する、培養容器で培養された細胞の塊である細胞塊を分割する分割処理を行い、分割処理が施された細胞を第2の部位を経由して第1の流路内に流出させる分割処理部と、第1の流路内に培地を供給する培地供給部と、を含む。
本発明に係る細胞培養装置は、第1の流路内において、第2の流出口と第1の流入口との間に設けられ、流入する流体を攪拌する第1の攪拌部を更に含み得る。本発明に係る細胞培養装置において、第1の攪拌部は、スタティックミキサを含んで構成されていてもよい。
本発明に係る細胞培養装置は、第2の流入口と第2の流出口とを接続する第3の流路内に設けられ、第2の流出口から流出する細胞および細胞に随伴する液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う第1のフィルタ部を更に含み得る。本発明に係る細胞培養装置において、第1のフィルタ部はタンジェンシャルフローフィルタを含んでいてもよい。
本発明に係る細胞培養装置は、第3の流出口と、第2の流入口に接続された第3の流入口と、を含む第2の貯留容器と、第3の流入口と第3の流出口とを接続する第4の流路内に設けられ、第3の流出口から流出する細胞および細胞に随伴する液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う第2のフィルタ部と、を更に含み得る。本発明に係る細胞培養装置において、第2のフィルタ部はタンジェンシャルフローフィルタを含んでいてもよい。本発明に係る細胞培養装置は、第1のフィルタ部による濃縮処理と、第2のフィルタ部による濃縮処理を交互に行い得る。
本発明に係る細胞培養装置は、第1の貯留容器の内部の圧力を調整する第1の圧力調整機構と、第2の貯留容器の内部の圧力を調整する第2の圧力調整機構と、を更に含み得る。
本発明に係る細胞培養装置において、分割処理部は、分割処理を行うための処理容器と、処理容器の内部の圧力を調整する圧力調整機構と、を有し得る。
本発明に係る細胞培養装置は、培地供給部と第1の流路とを接続する第5の流路内に設けられ、流入する流体を攪拌する第2の攪拌部を更に含み得る。
本発明に係る細胞培養装置は、第1の流路に培養容器で培養される細胞を供給する細胞供給部を更に含み得る。
本発明に係る細胞培養装置は、第5の流路における第2の攪拌部の下流側に接続され、培養容器で培養される細胞を第5の流路を経由して第1の流路に供給する細胞供給部と、第5の流路における細胞供給部が接続される部位の下流側に設けられ、流入する流体を攪拌する第3の攪拌部と、を更に含み得る。
本発明に係る細胞培養装置は、第2の流出口と第1の流入口との間に位置する第1の流路内の第3の部位に接続された細胞を凍結させる凍結部を更に含み得る。
本発明に係る細胞培養装置は、培養容器の内部の圧力を調整する圧力調整機構を更に含み得る。
本発明に係る細胞培養方法は、上記の細胞培養装置を用いた細胞培養方法であって、培養容器内で細胞の培養に使用された使用済みの培地を新たな培地に交換する培地交換処理と、培養容器で細胞を培養することによって形成された細胞塊を分割する分割処理と、を含む。培地交換処理は、培養容器で培養された細胞を使用済みの培地とともに第1の貯留容器に貯留するステップと、第1の貯留容器に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去するステップと、第1の貯留容器に貯留された細胞に新たな培地を培地供給部から供給するステップと、細胞および新たな培地を含む混合物を培養容器に収容するステップと、を含む。分割処理は、培養容器内において形成された細胞塊を分割処理部において分割するステップと、分割処理部において細胞塊を分割する前若しくは後に培養容器内で細胞の培養に使用された使用済みの培地を新たな培地に交換するステップと、分割された細胞および新たな培地を含む混合物を培養容器に収容するステップと、を含む。
本発明によれば、分割処理を含む細胞培養に必要な一連の処理を閉鎖系において連続的に実施することができる細胞培養装置およびそのような細胞培養装置を用いた細胞培養方法が提供される。
本発明の第1の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の第1の実施形態に係る細胞培養装置において継代処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第1の実施形態に係る細胞培養装置において培地交換処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第1の実施形態に係る細胞培養装置において分割処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第1の実施形態に係る細胞培養装置において分割処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第1の実施形態に係る細胞培養装置において凍結処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置を用いた細胞培養方法の一例を示すフローチャートである。 本発明の第2の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の第2の実施形態に係る細胞培養装置において継代処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第2の実施形態に係る細胞培養装置において培地交換処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第2の実施形態に係る細胞培養装置において分割処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第2の実施形態に係る細胞培養装置において凍結処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第3の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の実施形態に係るフィルタ部におけるフィルトレーションの態様の一例を示す図である。 本発明の第3の実施形態に係る細胞培養装置において継代処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第3の実施形態に係る細胞培養装置において培地交換処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第3の実施形態に係る細胞培養装置において分割処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第3の実施形態に係る細胞培養装置において凍結処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第4の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の第4の実施形態に係る細胞培養装置において濃縮処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。
以下、本発明の実施形態の一例を図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。
[第1の実施形態]
図1は、本発明の第1の実施形態に係る細胞培養装置10の構成を示す図である。細胞培養装置10は、細胞供給部100、培地供給部110、希釈液供給部120および凍結液供給部130を備える。また、細胞培養装置10は、培養容器20、貯留容器30、分割処理部40、廃液回収容器16および凍結部17を備える。
細胞培養装置10は、細胞供給部100から供給される細胞を、培地供給部110から供給される培地(培養液)とともに培養容器20内に収容し、培養容器20内において細胞を培地中に例えば浮遊させた状態で培養する。
<細胞供給部>
細胞供給部100は、細胞培養装置10による培養の対象となる細胞を凍結させた状態で収容する細胞収容部101と、細胞収容部101に収容された細胞を、配管c1を含んで構成される流路F3に送出するポンプP1とを有する。また、細胞供給部110は、細胞収容部101と配管c1とを接続する配管の、ポンプP1の下流側に設けられた開閉バルブV1を有する。細胞収容部101に収容された細胞は、ポンプP1が駆動され、開閉バルブV1が開状態とされることにより流路F3に送出される。
本実施形態に係る細胞培養装置10による培養の対象となる細胞は、特に制限されず、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、プロトプラスト、樹立された細胞株、人為的に遺伝子改変が施された細胞、等のあらゆる細胞が対象となり得る。
培養対象となる細胞の一例は、幹細胞である。幹細胞は、自己複製能と分化能とを有する細胞であれば特に制限されず、多能性幹細胞でもよく、体性幹細胞でもよい。
多能性幹細胞は、自己複製能と、外胚葉、中胚葉および内胚葉のいずれにも分化し得る多分化能とを有する細胞である。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞(Embryonic Stem cell;ES細胞)、人工多能性幹細胞(induced Pluripotent Stem cell;iPS細胞)、胚性生殖細胞(Embryonic Germ cell;EG細胞)、胚性癌細胞(Embryonal Carcinoma cell;EC細胞)、多能性成体前駆細胞(Multipotent Adult Progenitor cell;MAP細胞)、成体多能性幹細胞(Adult Pluripotent Stem cell;APS細胞)、Muse細胞(Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell)などが挙げられる。
体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。
培養対象となる細胞の他の例は、生体を構成する体細胞、及びその前駆細胞である。具体的には、リンパ球、好中球、単球、巨核球、マクロファージ、線維芽細胞、基底細胞、ケラチノサイト、上皮前駆細胞、周皮細胞、内皮細胞、脂肪前駆細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝実質細胞、膵β細胞、グリア細胞、等が挙げられる。
培養対象となる細胞の他の例は、CHO(chinese hamster ovary)、COS、HeLa、HepG2、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞;ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞;酵母、アスペルギルス等の真菌細胞;大腸菌、枯草菌等の細菌細胞;植物細胞、カルス;などである。これらの細胞は、タンパク質の大量発現を目的にタンパク質発現ベクターが導入された細胞であってもよい。
なお、培養容器20内に予め細胞および培地を収容した状態で細胞培養を開始する場合などにおいては、細胞培養装置10において細胞供給部100を省略することが可能である。
<培地供給部>
培地供給部110は、細胞の培養に使用する培地(培養液)を収容する培地収容部111および114と、培地収容部111および114にそれぞれ収容された培地を、流路F3に送出するポンプP2およびP3と、ポンプP2およびP3からそれぞれ送出された培地を除菌するためのフィルタ113および116とを有する。また、培地供給部110は、培地収容部111と配管c1とを接続する配管の、フィルタ113の下流側に設けられた開閉バルブV2と、培地収容部114と配管c1とを接続する配管の、フィルタ116の下流側に設けられた開閉バルブV3とを有する。このように、本実施形態に係る培地供給部110は、培地収容部111、ポンプP2、フィルタ113および開閉バルブV2を含む第1の系統と、培地収容部114、ポンプP3、フィルタ116および開閉バルブV3を含む第2の系統と、からなる2系統の培地供給機能を備えており、互いに異なる2種類の培地が供給可能である。なお、培地供給部110における系統の数は、細胞の培養プロトコル等に応じて適宜増減することが可能である。すなわち、培地供給部110を、3種類以上の培地を供給可能とする構成としてもよいし、1種類の培地を供給可能とする構成としてもよい。培地収容部111に収容された培地は、ポンプP2が駆動され、開閉バルブV2が開状態とされることにより流路F3に送出される。培地収容部114に収容された培地は、ポンプP3が駆動され、開閉バルブV3が開状態とされることにより流路F3に送出される。
本実施形態に係る細胞培養装置10による細胞培養において適用し得る培地は、特に制限されず、あらゆる培地を適用することができる。具体的には、哺乳動物細胞用の基本培地(例えば、DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)、DMEM/F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12)、EMEM(Eagle's minimal essential medium)、BME(Basal Medium Eagle)、RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium)、E8 base medium、SkBM(Skeletal Muscle Cell Basal Medium)、MCDB104、MCDB153、199、L15)、市販品の幹細胞維持用培養液、昆虫細胞用の基本培地、酵母用培地、細菌用培地、等の液体培地である。
本実施形態に係る細胞培養装置10による細胞培養において適用し得る培地は、細胞を継続的に浮遊させる目的、及び/又は、細胞同士の過度の密着を防ぐ目的で、細胞毒性を有しない高分子化合物が添加されていてもよい。上記目的で培地に添加される高分子化合物は、例えば、培地の比重を調整する高分子化合物、培地の粘度を調整する高分子化合物、培地中で三次元ネットワーク構造を形成する高分子化合物である。このような高分子化合物としては、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、ダイユータンガム、デンプン、ペクチン等の多糖類;コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質;ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子;などが挙げられる。
本実施形態に係る細胞培養装置10による細胞培養に適用し得る培地は、一般に添加可能な各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質;アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体;グルコース等の糖源;アミノ酸;無機塩;血清、血清代替物;トランスフェリン等のタンパク質;インスリン等のホルモン;増殖因子;分化抑制因子;2−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤;カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン等の金属イオン;などが添加されていてもよい。
<希釈液供給部>
希釈液供給部120は、細胞の培養過程において適宜実施される希釈処理に用いられる希釈液を収容する希釈液収容部121と、希釈液収容部121に収容された希釈液を、流路F3に送出するポンプP4と、ポンプP4から送出された希釈液を除菌するためのフィルタ123とを有する。また、希釈液供給部120は、希釈液収容部121と配管c1とを接続する配管の、フィルタ123の下流側に設けられた開閉バルブV4を有する。希釈液収容部121に収容された希釈液は、ポンプP4が駆動され、開閉バルブV4が開状態とされることにより流路F3に送出される。
本実施形態に係る細胞培養装置10による細胞培養に適用し得る希釈液は、特に制限されず、例えば、哺乳動物細胞用の基本培地(例えば、DMEM、DMEM/F-12、MEM、DME、RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、L15、SkBM、Basal Medium、E8 base medium)を希釈液として使用することが可能である。なお、細胞培養過程において希釈処理が不要である場合には、希釈液供給部120を省略することが可能である。
<凍結液供給部>
凍結液供給部130は、培養された細胞を凍結部17において凍結保存する場合に用いられる凍結液を収容する凍結液収容部131と、凍結液収容部131に収容された凍結液を、流路F3に送出するポンプP5と、ポンプP5から送出された凍結液を除菌するためのフィルタ133とを有する。また、凍結液供給部130は、凍結液収容部131、ポンプP5およびフィルタ133を接続する配管の、フィルタ133の下流側に設けられた開閉バルブV5を含む。凍結液収容部131に収容された凍結液は、ポンプP5が駆動され、開閉バルブV5が開状態となることにより流路F3に送出される。なお、培養された細胞を凍結保存する必要がない場合には、細胞培養装置10において凍結液供給部130を省略することが可能である。
<培養容器>
培養容器20は、細胞供給部100から供給される細胞を、培地供給部110から供給される培地とともに収容し、収容された細胞を培養するための容器である。培養容器20の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器やプラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。培養容器20は、細胞および培地を培養容器20内に流入させるための流入口21と、培養容器20に収容された細胞および培地を培養容器20の外部に流出させるための流出口22と、を有する。
培養容器20は、例えば、温度30℃〜40℃(好ましくは37℃)且つCO濃度2%〜10%(好ましくは5%)に制御され且つ密閉されたインキュベータ24内に収容され得る。インキュベータ24は、培養容器20内に培地とともに収容された細胞に酸素(O)および二酸化炭素(CO)を供給するためのガス供給機構25を備える。また、インキュベータ24は、培養容器20内の圧力を調整する圧力調整機構26を備える。圧力調整機構26は、培養容器20内にエアーを導入することにより培養容器20内の雰囲気を加圧し、または、培養容器20内の雰囲気を外部に排出することにより培養容器20内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構26は、培養容器20内の圧力を、後述する循環流路F1内の圧力よりも高めることにより、培養容器20内に収容された細胞および培地を循環流路F1内に流出させる。
<循環流路>
細胞培養装置10は、培養容器20の流出口22と流入口21とを接続する配管a1〜a7を含んで構成される循環流路F1を有する。培養容器20に収容された細胞および培地は、培養過程において、循環流路F1内を循環する。循環流路F1内を流れる細胞および培地は、流入口21を経由して培養容器20内へ流入し、培養容器20の内部に収容された細胞および培地は、流出口22を経由して循環流路F1内に流出する。
培養容器20の流入口21に接続された循環流路F1を構成する配管a7には開閉バルブV11が設けられ、培養容器20の流出口22に接続された循環流路F1を構成する配管a1には開閉バルブV12が設けられている。開閉バルブV11は、循環流路F1から培養容器20内に細胞および培地を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。開閉バルブV12は、培養容器20内から循環流路F1内に細胞および培地を流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
細胞供給部100、培地供給部110、希釈液供給部120および凍結液供給部130に接続された配管c1によって構成される流路F3は、接続部位X3において循環流路F1に接続されている。すなわち、細胞収容部101に収容された細胞、培地収容部111および114にそれぞれ収容された培地、希釈液収容部121に収容された希釈液および凍結液収容部131に収容された凍結液は、流路F3および接続部位X3を経由して循環流路F1内に供給される。
流路F3を構成する配管c1には、接続部位X3の近傍において開閉バルブV6が設けられている。開閉バルブV6は、細胞供給部100、培地供給部110、希釈液供給部120および凍結液供給部130からそれぞれ、細胞、培地、希釈液および凍結液を循環流路F1内に供給する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
<貯留容器>
貯留容器30は、循環流路F1内、すなわち、循環流路F1の途中に設けられている。貯留容器30は、循環流路F1内を流れる細胞、培地、希釈液および凍結液を一時的に貯留するための容器であり、培養期間中に実施される後述する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理において使用される。貯留容器30の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
貯留容器30は、循環流路F1内を流れる細胞、培地、希釈液および凍結液を貯留容器30内に流入させるための流入口31と、貯留容器30に収容された細胞、培地、希釈液および凍結液を循環流路F1内に流出させるための流出口32を有する。貯留容器30の流入口31は、循環流路F1を構成する配管a1、a2およびa3によって培養容器20の流出口22に接続されている。貯留容器30の流出口32は、循環流路F1を構成する配管a4、a5、a6およびa7によって培養容器20の流入口21に接続されている。また、本実施形態においては、循環流路F1と流路F3とが接続される接続部位X3が貯留容器30の流入口31の近傍に配置されているが、循環流路F1と流路F3との接続位置は、循環流路F1内におけるあらゆる位置に配置することが可能である。
循環流路F1を構成する配管a2には、貯留容器30の流入口31の近傍において開閉バルブV13が設けられている。開閉バルブV13は、循環流路F1から貯留容器30内に細胞および培地等を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。また、循環流路F1を構成する配管a5には、貯留容器30の流出口32の近傍において開閉バルブV14が設けられている。開閉バルブV14は、貯留容器30内から循環流路F1内に細胞および培地等を培養容器20、分割処理部40および凍結部17に移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
貯留容器30は、貯留容器30内の圧力を調整する圧力調整機構33を備える。圧力調整機構33は、貯留容器30内にエアーを導入することにより貯留容器30内の雰囲気を加圧し、または、貯留容器30内の雰囲気を外部に排出することにより貯留容器30内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構33は、貯留容器30内の圧力を循環流路F1内の圧力よりも高めることにより、貯留容器30内に貯留された細胞、培地、希釈液および凍結液を、流出口32から循環流路F1内に流出させる。
細胞培養装置10は、循環流路F1内における、貯留容器30の流出口32と培養容器20の流入口21との間に位置する接続部位X1と、循環流路F1内における、貯留容器30の流入口31と培養容器20の流出口22との間に位置する接続部位X2と、を接続する配管b1およびb2を含んで構成される流路F2を有する。循環流路F1内を流れる細胞および培地等は、接続部位X1を経由して流路F2内に流入することが可能である。また、流路F2内を流れる細胞および培地等は、接続部位X2を経由して循環流路F1内に流入することが可能である。
<分割処理部>
分割処理部40は、流路F2内、すなわち、流路F2の途中に設けられている。分割処理部40は、培養容器20内において細胞を培養することによって生じる細胞塊を分割する分割処理を行うための処理容器42を備える。処理容器42内において行われる分割処理は、機械的分割処理であってもよいし、細胞解離酵素を用いた酵素処理であってもよい。機械的分割処理が適用される場合には、処理容器42内には、メッシュフィルタが(図示せず)配置され得る。細胞塊をメッシュフィルタに通すことで、細胞塊はメッシュフィルタのメッシュサイズに応じたサイズに分割される。一方、酵素処理による分割処理が適用される場合には、処理容器42内には、トリプシン−EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid)等の細胞解離酵素が収容され得る。細胞塊を一定時間に亘り細胞解離酵素に浸漬することで、細胞塊が分割される。
分割処理部40は、循環流路F1から接続部位X1を経由して流路F2内に流入する細胞塊を処理容器42において分割する。分割処理が施された細胞は、接続部位X2を経由して循環流路F1内に流出する。
分割処理部40は、処理容器42に連通する圧力容器41と、圧力容器41および処理容器42内の圧力を調整する圧力調整機構43と、を備える。圧力調整機構43は、圧力容器41内にエアーを導入することにより圧力容器41および処理容器42内の雰囲気を加圧し、または、圧力容器41内の雰囲気を外部に排出することにより圧力容器41および処理容器42内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構43は、圧力容器41および処理容器42内の圧力を循環流路F1内の圧力よりも高めることにより、分割処理が施された細胞を循環流路F1内に流出させる。
流路F2を構成する、分割処理部40の上流側に配置される配管b1には、接続部位X1の近傍において開閉バルブV21が設けられている。開閉バルブV21は、貯留容器30から分割処理部40に細胞等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。一方、流路F2を構成する、分割処理部40の下流側に配置される配管b2には、接続部位X2の近傍に開閉バルブV22が設けられている。開閉バルブV22は、分割処理部40によって分割処理が施された細胞を循環流路F1内に流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
循環流路F1を構成する配管a1には、接続部位X2の近傍であって接続部位X2の上流側に開閉バルブV15が設けられている。開閉バルブV15は、培養容器20から貯留容器30に細胞および培地等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
<廃液回収容器>
細胞培養装置10は、循環流路F1内における、貯留容器30の流出口32と培養容器20の流入口21との間であって、接続部位X1よりも上流側(貯留容器30寄り)に位置する接続部位X4において、循環流路F1に接続された配管d1を含んで構成される流路F4を有する。流路F4の端部には、廃液回収容器16が設けられている。廃液回収容器16は、循環流路F1から接続部位X4を経由して流路F4内に流入する廃液を回収するための容器である。廃液回収容器16に回収される廃液には、使用済みの培地、使用済みの希釈液、細胞供給部100から凍結状態で供給される細胞に随伴する凍結液等が含まれる。廃液回収容器16の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。
流路F4を構成する配管d1には、接続部位X4の近傍において開閉バルブV31が設けられている。開閉バルブV31は、貯留容器30から流出する廃液を廃液回収容器16内に回収する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。
<凍結部>
細胞培養装置10は、接続部位X1において、循環流路F1に接続された配管e1を含んで構成される流路F5を有する。流路F5の端部には、凍結部17が設けられている。凍結部17は、循環流路F1から接続部位X1を経由して流路F5内に流入する細胞を凍結液供給部130から供給される凍結液とともに収容する保存容器17aを有する。保存容器17aは、例えば、バイアル、クライオチューブまたはバッグの形態を有するものであってもよい。凍結部17は保存容器17aに収容された細胞および凍結液を凍結させるフリーザを含んで構成され得る。また、凍結部17は、液体窒素を充填したタンクを備えていてもよく、タンク内に保存容器17aを収容し得るように構成されていてもよい。また、凍結部17は、例えば、太陽日酸社製のクライオライブラリー(登録商標)システムを含んで構成されていてもよい。流路F5を構成する配管e1には、接続部位X1の近傍において開閉バルブV41が設けられている。開閉バルブV41は、貯留容器30から凍結部17に細胞および凍結液を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。なお、流路F5と循環流路F1との接続位置は、貯留容器30の流出口32と培養容器20の流入口21と間であれば、いかなる位置であってもよい。また、細胞を凍結保存する必要がない場合には、凍結部17を省略することが可能である。
<制御部>
制御部18は、ポンプP1〜P5、開閉バルブV1〜V5、V11〜V16、V21、V22、V31およびV41、ガス供給機構25、圧力調整機構26、33および43の動作を統括的に制御する。これにより、所定の細胞培養プロトコルに沿った細胞の培養が、人手を介在させることなく、自動で実施される。なお、図1において、制御部18と、制御部18によって制御される上記の各構成要素との間の電気的な接続配線は、図面の煩雑さを回避する観点から図示を省略している。
なお、培養容器20は、本発明における培養容器の一例である。培養容器20の流入口21は、本発明における第1の流入口の一例である。培養容器20の流出口22は、本発明における第1の流出口の一例である。貯留容器30は、本発明における貯留容器の一例である。貯留容器30の流入口31は、本発明における第2の流入口の一例である。貯留容器30の流出口32は、本発明における第2の流出口の一例である。循環流路F1は、本発明における第1の流路の一例である。流路F2は、本発明における第2の流路の一例である。接続部位X1は、本発明における第1の部位の一例である。接続部位X2は、本発明における第2の部位の一例である。分割処理部40は、本発明における分割処理部の一例である。処理容器42は、本発明における処理容器の一例である。圧力調整機構43は、本発明における分割処理部が有する圧力調整機構の一例である。細胞供給部100は、本発明における細胞供給部の一例である。培地供給部110は、本発明における培地供給部の一例である。流路F3は、本発明における第5の流路の一例である凍結部17は、本発明における凍結部の一例である。
以下に、本実施形態に係る細胞培養装置10において実施され得る処理の一例を示す。細胞培養装置10は、例えば、以下に例示する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理を実施する。なお、以下に説明する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理は、制御部18が、開閉バルブV1〜V5、V11〜V16、V21、V22、V31およびV41、ポンプP1〜P5、圧力調整機構26、33および43の動作を制御することにより実現される。
<継代処理>
細胞培養装置10は、細胞収容部101に収容された細胞を、培地収容部111および114に収容された培地とともに培養容器20内に収容して細胞培養を開始する継代処理を以下のようにして実施する。なお、以下の説明では、分割処理部40における分割処理が機械的分割処理である場合を例示する。図2は、細胞培養装置10が継代処理を実施する場合における、細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図2において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS1において、開閉バルブV1、V4およびV6が開状態とされ、ポンプP1およびP4が駆動される。これにより、細胞収容部101において凍結状態で収容された細胞および希釈液収容部121に収容された希釈液が、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。
ステップS2において、貯留容器30内に貯留された細胞、細胞に随伴する凍結液および希釈液を含む混合物から凍結液および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。上記の濃縮処理は、例えば、貯留容器30内に希釈液とともに収容された細胞を、貯留容器30内において沈降させ(自然沈降)、希釈液および凍結液を含む上澄み液を除去することにより行われる。具体的には、細胞を貯留容器30内において沈降させた後、開閉バルブV14を短期間開状態とする。これにより、貯留容器30内に上澄み液を残しつつ、細胞を貯留容器30から流出させ、配管a5内に滞留させる。その後、開閉バルブV14を閉状態とし、開閉バルブV31を開状態とする。これにより貯留容器30内に残存する希釈液および凍結液を含む廃液が貯留容器30の流出口32から流出し、流路F4を経由して廃液回収容器16に回収される。なお、貯留容器30から配管a5への細胞の移送および貯留容器30から廃液回収容器16への希釈液および凍結液の移送は、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気を加圧することによって行われる。
ステップS3において、開閉バルブV2、V3およびV6が開状態とされ、ポンプP2およびP3が駆動される。これにより、培地収容部111および114に収容された培地Aおよび培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、培地Aおよび培地Bからなる混合培地は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞と合流する。
ステップS4において、開閉バルブV14、V16およびV21が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気が加圧される。これにより、配管a5内に滞留する細胞および培地が接続部位X1を経由して流路F2内に流入し、分割処理部40内に流入する。分割処理部40内に流入した細胞は、処理容器42内において分割処理が施される。なお、ここでの分割処理は、凍結状態とされた細胞を破砕する目的で行われる。
ステップS5において、開閉バルブV22およびV13が開状態とされる。また、圧力調整機構43によって圧力容器41および処理容器42内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、培地とともに接続部位X2を経由して循環流路F1内に流出し、貯留容器30内に移送される。
ステップS6において、開閉バルブV14、V16およびV11が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気が加圧される。これにより、貯留容器30内に貯留された細胞および培地が、循環流路F1を経由して培養容器20内に流入する。以上のステップS1〜S6の処理を経ることにより、継代処理が完了する。
なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
<培地交換処理>
細胞培養においては、細胞から分泌される代謝物などによって培地が変質する。そのため、培養期間内における適切な時期に、培養容器20内における使用済みの培地を、新たな培地に交換する培地交換処理が必要とされる。本実施形態に係る細胞培養装置10は、上記の培地交換処理を、以下のようにして実施する。図3は、細胞培養装置10が培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図3において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS11において、開閉バルブV12、V15およびV13が開状態とされる。また、圧力調整機構26によって培養容器20内の雰囲気が加圧される。これにより、培養容器20内に収容された細胞および使用済みの培地が、循環流路F1内に流出し、貯留容器30内に移送される。
ステップS12において、貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップS2における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器16内に回収され、細胞は、配管a5内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器30内に導入してもよい。
ステップS13において、開閉バルブV2、V3およびV6が開状態とされ、ポンプP2およびP3が駆動される。これにより、培地収容部111および114に収容された新たな培地Aおよび新たな培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、培地Aおよび培地Bを含む新たな培地は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞と合流する。
ステップS14において、開閉バルブV14、V16およびV11が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気が加圧される。これにより、配管a5内に滞留する細胞および新たな培地が培養容器20内に流入する。培養容器20内に収容された細胞は、新たな培地によって培養される。以上のステップS11〜S14の処理を経ることにより、培地交換処理が完了する。
<分割処理(機械的分割処理)>
例えば、多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じる細胞塊(スフィア)のサイズが過大となると、細胞塊同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。従って、細胞塊のサイズが過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、細胞塊を分割する分割処理が必要となる場合がある。本実施形態に係る細胞培養装置10は、上記の分割処理を、以下のようにして実施する。なお、以下の説明では、分割処理部40における分割処理が機械的分割処理である場合を例示する。図4は、細胞培養装置10が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図4において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS21において、開閉バルブV12、V15およびV13が開状態とされる。また、圧力調整機構26によって培養容器20内の雰囲気が加圧され、培養容器20内に生じた細胞塊および使用済みの培地が、循環流路F1内に流出し、貯留容器30内に移送される。
ステップS22において、貯留容器30内に貯留された細胞塊および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップS2における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器16内に回収され、細胞塊は、配管a5内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器30内に導入してもよい。
ステップS23において、開閉バルブV2、V3およびV6が開状態とされ、ポンプP2およびP3が駆動される。これにより、培地収容部111および114に収容された新たな培地Aおよび新たな培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、培地Aおよび培地Bを含む新たな培地は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞塊と合流する。
ステップS24において、開閉バルブV14、V16およびV21が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気が加圧される。これにより、配管a5内に滞留する細胞塊および培地が接続部位X1を経由して流路F2内に流入し、分割処理部40内に流入する。分割処理部40内に流入した細胞は、処理容器42内において分割処理が施される。
ステップS25において、開閉バルブV22およびV13が開状態とされる。また、圧力調整機構43によって圧力容器41内および処理容器42内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、培地とともに接続部位X2を経由して循環流路F1内に流出し、貯留容器30内に移送される。
ステップS26において、開閉バルブV14、V16およびV11が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気が加圧される。これにより、貯留容器30内に貯留された分割処理が施された細胞および新たな培地が、培養容器20内に流入する。培養容器20内において、分割処理が施された細胞の培養が継続される。以上のステップS21〜S26の処理を経ることにより、分割処理が完了する。
なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
<分割処理(酵素処理)>
図5は、分割処理部40における分割処理が、上記した細胞解離酵素を用いた酵素処理を含む場合の、細胞培養装置10が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図5において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
図5におけるステップS31〜S33の処理は、上記したステップS21〜S23の処理と同様であるので、重複する説明は省略する。
ステップS34において、開閉バルブV14、V16およびV21が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気が加圧される。これにより、配管a5内に滞留する細胞塊および培地が接続部位X1を経由して流路F2内に流入し、分割処理部40内に流入する。分割処理部40内に流入した細胞は、処理容器42内において細胞解離酵素を用いた分割処理が施される。
ステップS35において、開閉バルブV22およびV13が開状態とされる。また、圧力調整機構43によって圧力容器41および処理容器42内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、細胞解離酵素を含む培地とともに接続部位X2を経由して循環流路F1内に流出し、貯留容器30内に移送される。
ステップS36において、開閉バルブV4およびV6が開状態とされ、ポンプP4が駆動される。これにより、希釈液収容部121に収容された希釈液が、流路F3および循環流路F1を経由して、貯留容器30内に流入する。貯留容器30に収容された細胞および細胞解離酵素を含む培地に希釈液を添加することで、細胞解離酵素による細胞解離作用が停止される。
ステップS37において、貯留容器30内に貯留された細胞、細胞解離酵素を含む培地および希釈液を含む混合物から細胞解離酵素を含む培地および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップS2における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、細胞解離酵素を含む培地および希釈液は、廃液回収容器16内に回収され、細胞は、配管a5内に滞留する。
ステップS38において、開閉バルブV2、V3およびV6が開状態とされ、ポンプP2およびP3が駆動される。これにより、培地収容部111および114に収容された新たな培地Aおよび新たな培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、培地Aおよび培地Bを含む新たな培地は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞と合流する。
ステップS39において、開閉バルブV14、V16およびV11が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気が加圧される。これにより、配管a5内に滞留する分割処理が施された細胞および新たな培地が培養容器20内に流入する。培養容器20内において、分割処理が施された細胞の培養が継続される。以上のステップS31〜S39の処理を経ることにより、分割処理が完了する。
なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
<凍結処理>
培養された細胞を回収して保存する場合、細胞を保存容器内に回収して凍結保存することが一般的である。本実施形態に係る細胞培養装置10は、培養された細胞を回収して凍結させる凍結処理を、以下のようにして実施する。図6は、細胞培養装置10が凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図6において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS41において、開閉バルブV12、V15およびV13が開状態とされる。また、圧力調整機構26によって培養容器20内の雰囲気が加圧される。これにより、培養容器20内に収容された細胞および使用済みの培地が循環流路F1内に流出し、貯留容器30内に移送される。
ステップS42において、貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップS2における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器16内に回収され、細胞は、配管a5内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器30内に導入してもよい。
ステップS43において、開閉バルブV5およびV6が開状態とされ、ポンプP5が駆動される。これにより、凍結液収容部131に収容された凍結液が、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、凍結液は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞と合流する。
ステップS44において、開閉バルブV14、V16およびV41が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって貯留容器30内の雰囲気が加圧される。これにより、配管a5内に滞留する細胞および凍結液が流路F5を経由して凍結部17の保存容器17a内に収容される。凍結部17は、保存容器17a内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。以上のステップS41〜S44の処理を経ることにより、分割処理が完了する。
なお、細胞を凍結保存する方法として、例えば、特許第4705473号に記載の方法を適用してもよい。この方法では、ジメチルスルホキシド(DMSO)、プロピレングリコール、アセトアミド及び培地を所定量含む媒体中で、細胞を急速凍結させる工程、を含む。また、特許第4223961号に記載の方法を適用してもよい。この方法は、所定濃度の、ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびポリビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも一つを凍結保護剤として含有する凍結保存液を利用した細胞の凍結保存方法であって、細胞を凍結保存液に懸濁する工程と、所定の冷却速度で凍結保存液を−80℃以下まで冷却し凍結させる冷却工程と、凍結保存液を-80℃以下で保存する保存工程を含む。
なお、上記の継代処理、培地交換処理および分割処理においては培地供給部110から2種類の培地Aおよび培地Bを供給する場合を例示しているが、使用する培地の種類は、細胞の培養プロトコルに応じて適宜変更することが可能である。すなわち、使用する培地は、培養プロトコルに応じて1種類であってもよいし、3種類以上であってもよい。
<細胞培養処理>
細胞培養装置10は、制御部18が以下に例示する細胞培養処理プログラムを実行することにより、細胞培養を、人手を介在させることなく自動で行うことが可能である。図7は、制御部18が実行する細胞培養プログラムにおける処理の流れを示すフローチャートである。
ステップS101において、制御部18は、上記の継代処理を実行することにより、細胞供給部100から供給される細胞および培地供給部110から供給される培地を培養容器20内に収容し、細胞培養を開始する。
ステップS102において、制御部18は、細胞培養を開始してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理(1回目)を実施することにより、培養容器20内の使用済みの培地を、培地収容部111および114に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。
ステップS103において、制御部18は、1回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理(2回目)を実施することにより、培養容器20内の使用済みの培地を、培地収容部111内および114内に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。
ステップS104において、制御部18は、2回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の分割処理を実施することにより、細胞塊を分割して細胞培養を継続する。
ステップS105において、制御部18は、上記のステップS102〜S104における処理を1サイクルとする培養サイクルのサイクル数が、所定数に達したか否かを判定する。制御部18は、培養サイクルのサイクル数が所定数に達していないと判定した場合には、処理をステップS102に戻す。一方、制御部18は、培養サイクルのサイクル数が所定のサイクル数に達したと判定した場合には、処理をステップS106に進める。培養サイクルの進行とともに、細胞の培養スケールは増大する。
ステップS106において、制御部18は、上記の凍結処理を実施することによって培養された細胞を凍結部17の保存容器17a内に収容して凍結保存する
なお、上記の例では、培養サイクルの1サイクル内において、培地交換処理を2回実施しているが、培養サイクルの1サイクル内における培地交換処理の実施回数は、適宜変更することが可能である。
以上の説明から明らかなように、本実施形態に係る細胞培養装置10は、培養容器20の流入口21と流出口22とを接続する循環流路F1を有する。また、細胞培養装置10は、循環流路F1内に設けられた貯留容器30を有する。貯留容器30は、培養容器20の流出口22に接続された流入口31および培養容器20の流入口21に接続された流出口32を有する。貯留容器30は、上記の継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理において実施される濃縮処理等の用に供される。また、細胞培養装置10は、貯留容器30の流出口32と培養容器20の流入口21との間に位置する循環流路F1内の接続部位X1と、貯留容器30の流入口31と培養容器20の流出口22との間に位置する循環流路F1内の接続部位X2と、を接続する流路F2を有する。細胞培養装置10は、流路F2内に設けられ、接続部位X1を経由して循環流路F1から流入する細胞塊を分割し、分割した細胞塊を、接続部位X2を経由して循環流路F1内に流出させる分割処理部40を有する。また、細胞培養装置10は、循環流路F1内に培地を供給する培地供給部110を有する。
細胞培養装置10を上記のように構成することで、培地交換処理や分割処理等の細胞培養において必要とされる一連の処理を閉鎖系において連続的に実施することが可能となる。これにより、均質な細胞の大量生産が可能となる。本実施形態に係る細胞培養装置10によれば、継代処理から凍結処理までの細胞培養に必要な一連の処理を人手を介在させることなく行うことが可能である。
また、本実施形態に係る細胞培養装置10によれば、培養容器20から貯留容器30への細胞の移送、貯留容器30から分割処理部40および培養容器20への細胞の移送、分割処理部40から貯留容器30への細胞の移送は、いずれも圧力調整機構26、33および43による圧送により行われる。これにより、ダイヤフラムポンプ、チューブポンプ、ペリスタリックポンプおよびモーノポンプ等の接液ポンプを用いて細胞の移送を行う場合と比較して細胞に与えるダメージを軽減することができ、細胞の生存率の低下を抑制することが可能となる。なお、本実施形態に係る細胞培養装置10は、制御部18が、開閉バルブV1〜V5、V11〜V16、V21、V22、V31およびV41、ポンプP1〜P5、圧力調整機構26、33および43の動作を制御することにより、継代処理から凍結処理までを自動化する場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。開閉バルブV1〜V5、V11〜V16、V21、V22、V31およびV41、ポンプP1〜P5、圧力調整機構26、33および43を、ユーザが手動で操作してもよい。
[第2の実施形態]
図8は、本発明の第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aの構成を示す図である。細胞培養装置10Aは、上記した第1の実施形態に係る細胞培養装置10に攪拌部50、51および52を加えた構成を有する。攪拌部50、51および52は、それぞれ、流入する流体を攪拌する機能を有する。攪拌部50、51および52は、駆動部を有しない所謂スタティックミキサとしての構成を有していることが好ましく、例えば、管状体と、管状体の内部に固定設置され、管状体の内部にらせん状の流路を形成する攪拌エレメントと、を含んで構成され得る。なお、スタティックミキサを構成する管状体の内部の流路は、必ずしもらせん状であることを要しない。スタティックミキサは、管状体の内部を通過する流体を攪拌し得るように、管状体の内部に流路を形成する板状部材が管状体の内部に適宜配置された構造や管状体の内径を部分的に変化させた構造を有するものであってもよい。
攪拌部50は、循環流路F1内における、貯留容器30の流出口32と培養容器20の流入口21との間に設けられている。より具体的には、攪拌部50は、循環流路F1内において、貯留容器30の流出口32と接続部位X1との間に設けられている。なお、攪拌部50は、循環流路F1内において、接続部位X1と培養容器20の流入口21との間に設けられていてもよい。攪拌部51は、流路F3内における、培地供給部110と細胞供給部100との間に設けられている。一方、攪拌部52は、流路F3における、細胞供給部100からの配管が接続される部位の下流側に設けられている。
なお、攪拌部50は、本発明における第1の攪拌部の一例である。攪拌部51は、本発明における第2の攪拌部の一例である。攪拌部52は、本発明における第3の攪拌部の一例である。
以下に、第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aにおいて実施され得る継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理について説明する。なお、以下に説明する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理は、制御部18が、開閉バルブV1〜V5、V11〜V16、V21、V22、V31およびV41、ポンプP1〜P5、圧力調整機構26、33および43の動作を制御することにより実現される。
<継代処理>
以下において、第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aによる継代処理について説明する。以下の説明では、分割処理部40における分割処理が、上記した機械的分割処理である場合を例示する。また、以下の説明において、第1の実施形態に係る継代処理と重複する事項については、適宜省略する。図9は、細胞培養装置10Aが継代処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第1の実施形態に係る図2に対応する。なお、図9において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS1において、細胞収容部101において凍結状態で収容された細胞および希釈液収容部121に収容された希釈液が、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。細胞および希釈液は、流路F3内において攪拌部52を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップS2において、貯留容器30内に貯留された細胞、細胞に随伴する凍結液および希釈液を含む混合物から凍結液および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理により、凍結液および希釈液は廃液回収容器16内に回収され、細胞は、配管a5内に滞留する。
ステップS3において、培地収容部111および114に収容された培地Aおよび培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。培地Aおよび培地Bは、流路F3内において攪拌部51および52を通過する。培地Aおよび培地Bは、攪拌部51および52を通過することで、攪拌され、混合される。浮遊培養においては、培地Aおよび培地Bは、互いに粘度差を有している場合が想定される。培地Aおよび培地Bを攪拌部51および52によって攪拌することで、細胞と混合される前に均一な粘度の混合培地を得ることができる。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、培地Aおよび培地Bを含む混合培地は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞と合流する。
ステップS4において、配管a5内に滞留する細胞および培地が、分割処理部40内に移送される。分割処理部40内に流入した細胞は、処理容器42内において分割処理が施される。これにより、凍結状態の細胞が分割される。ステップS5において、分割処理が施された細胞が培地とともに貯留容器30内に移送される。
ステップS6において、貯留容器30内に貯留された細胞および培地が、攪拌部50を経由して培養容器20内に流入する。細胞および培地は、攪拌部50を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化される。
このように、本実施形態に係る細胞培養装置10Aによる継代処理によれば、細胞供給部100から供給された細胞が、培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器20内に収容される。なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
<培地交換処理>
以下において、第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aによる培地交換処理について説明する。なお、以下の説明において、第1の実施形態に係る培地交換処理と重複する事項については、適宜省略する。図10は、細胞培養装置10Aが培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第1の実施形態に係る図3に対応する。なお、図10において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS11において、培養容器20から貯留容器30内に細胞および使用済みの培地が移送される。ステップS12において、貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器16内に回収され、細胞は、配管a5内に滞留する。
ステップS13において、培地収容部111および114に収容された新たな培地Aおよび新たな培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。培地Aおよび培地Bは、流路F3内において攪拌部51および52を通過する。培地Aおよび培地Bは、攪拌部51および52を通過することで、攪拌され、混合される。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、培地Aおよび培地Bを含む新たな培地は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞と合流する。
ステップS14において、配管a5内に滞留する細胞および新たな培地が、攪拌部50を経由して培養容器20内に流入する。細胞および新たな培地は、攪拌部50を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化される。このように、本実施形態に係る細胞培養装置10Aによる培地交換処理によれば、培養容器20から取り出された細胞が、新たな培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器20内に戻される。
<分割処理>
以下において、第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aによる分割処理について説明する。なお、以下の説明では、分割処理部40における分割処理が、上記した機械的分割処理である場合を例示する。また、以下の説明において、第1の実施形態に係る分割処理と重複する事項については、適宜省略する。図11は、細胞培養装置10Aが分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第1の実施形態に係る図4に対応する。なお、図11において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS21において、培養容器20から貯留容器30内に細胞および使用済みの培地が移送される。ステップS22において、貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器16内に回収され、細胞は、配管a5内に滞留する。
ステップS23において、培地収容部111および114に収容された新たな培地Aおよび新たな培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して流入口31から貯留容器30内に流入する。培地Aおよび培地Bは、流路F3内において攪拌部51および52を通過することで、攪拌され、混合される。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、培地Aおよび培地Bを含む新たな培地は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞と合流する。
ステップS24において、配管a5内に滞留する細胞および培地が、分割処理部40内に移送され、分割処理部40内において細胞塊に対する分割処理が施される。ステップS25において、分割処理が施された細胞が培地とともに貯留容器30内に移送される。
ステップS26において、貯留容器30内に貯留された細胞および培地が、攪拌部50を経由して流入口21から培養容器20内に流入する。細胞および培地は、攪拌部50を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化される。
このように、本実施形態に係る細胞培養装置10Aによる分割処理によれば、培養容器20から取り出された細胞が、分割処理され、新たな培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器20に戻される。なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。
<凍結処理>
以下において、第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aによる凍結処理について説明する。なお、以下の説明において、第1の実施形態に係る凍結処理と重複する事項については、適宜省略する。図12は、細胞培養装置10Aが凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第1の実施形態に係る図6に対応する。なお、図12において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS41において、培養容器20から貯留容器30内に細胞および使用済みの培地が移送される。ステップS42において、貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器16内に回収され、細胞は、配管a5内に滞留する。
ステップS43において、凍結液収容部131に収容された凍結液が、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。凍結液は、流路F3内において攪拌部51および52を通過することで、攪拌される。その後、開閉バルブV14が開状態とされ、凍結液は、貯留容器30から流出し、配管a5内に滞留している細胞と合流する。
ステップS44において、配管a5内に滞留する細胞および凍結液が、攪拌部50および流路F5を経由して凍結部17の保存容器17a内に収容される。細胞および凍結液は、攪拌部50を通過することで、攪拌され、混合される。凍結部17は、保存容器17a内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。
以上のように、第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aにおいて、攪拌部50は、貯留容器30の流出口32と培養容器20の流入口21の間に設けられている。これにより、継代処理、培地交換処理および分割処理において、細胞および培地が、培養容器20内に収容される直前に攪拌部50によって攪拌され、混合される。これにより、細胞を、新たな培地内において細胞間の距離を均一化させた状態で培養容器20に収容することが可能となる。細胞間の距離を均一化することにより、細胞死や細胞分化の原因となる細胞塊同士の融合を抑制することが可能となり、また、細胞塊のサイズや成長速度を均一化することが可能となる。また、細胞を新たな培地内において細胞間の距離を均一化させた状態で培養容器20に収容することにより、培養容器20内においては、細胞に対するダメージの原因となる攪拌が不要となるか、または最小限の動力による攪拌で培養環境を整えることができる。従って、本実施形態に係る細胞培養装置10Aは、細胞を培地内に浮遊させた状態で静置する静置培養を行う場合に、特に好適に用いることができる。
[第3の実施形態]
図13は、本発明の第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bの構成を示す図である。細胞培養装置10Bは、上記した第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aに流路F6、フィルタ部60およびポンプP10を加えた構成を有する。なお、廃液回収容器16はフィルタ部60に接続されている。
流路F6は、貯留容器30の流入口31と流出口32とを接続する流路であり、接続部位X5において循環流路F1に接続された配管f1と、接続部位X6において循環流路F1に接続された配管f2と、を含んで構成されている。
フィルタ部60は、流路F6内(すなわち、流路F6の途中)に設けられている。フィルタ部60は、貯留容器30から供給される細胞と、培地、希釈液および凍結液等の液体と、を含む混合物から、上記の液体を除去する濃縮処理を行う機能を有する。
フィルタ部60は、例えば、所謂タンジェンシャルフローフィルタの構成を有していてもよく、フィルタ部60内において、細胞および培地等の液体を含む混合物が、濾過膜の表面に沿って流れるように構成されている。図14は、フィルタ部60によるフィルトレーションの態様の一例を示す図である。フィルタ部60は、例えば、中空糸からなる濾過膜Mを有する。濾過膜Mは、多孔質膜であってもよく、濾過膜Mの材質は、金属、ポリマーまたはセラミックス焼結体などであってもよい。例えば、濾過膜Mをポリマーで構成することにより、ガンマ線滅菌が可能となり、また、シングルユース可能となるため、好ましい。細胞Cおよび培地等の液体Lを含む混合物が濾過膜Mの内側に流入すると、液体Lは、濾過膜Mの外側に排出されて廃液回収容器16内に収容される。一方、細胞Cは、濾過膜Mの内側を通過して貯留容器30内に回収される。タンジェンシャルフローによるフィルトレーションを行うことで、細胞に与えるダメージを最小限にすることができる。なお、フィルタ部60は、細胞および培地等を含む混合物の流れ方向が、濾過膜の膜面に対して交差する方向となるデッドエンドフローフィルタの構成を有していてもよい。
流路F6を構成する配管f2内に配置されたポンプP10は、細胞および培地等を含む混合物を、貯留容器30からフィルタ部60に移送する場合およびフィルタ部60から貯留容器30に移送する場合に駆動される。
流路F6を構成する配管f1内には、接続部位X5の近傍において開閉バルブV51が設けられている。また、流路F6を構成する配管f2内には、接続部位X6の近傍において開閉バルブV52が設けられている。開閉バルブV51およびV52は、フィルタ部60において濃縮処理を実施して細胞を貯留容器30内に回収するまでの間、開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。
なお、流路F6は、本発明における第3の流路の一例である。フィルタ部60は、本発明における第1のフィルタ部の一例である。
以下に、第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bにおいて実施され得る継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理について説明する。なお、以下に説明する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理は、制御部18が、開閉バルブV1〜V5、V11〜V16、V21、V22、V31、V41、V51およびV52、ポンプP1〜P5およびP10、圧力調整機構26および43の動作を制御することにより実現される。
<継代処理>
以下において、第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bによる継代処理について説明する。以下の説明では、分割処理部40における分割処理が、上記した機械的分割処理である場合を例示する。また、以下の説明において、第1の実施形態に係る継代処理と重複する事項については、適宜省略する。図15は、細胞培養装置10Bが継代処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第1の実施形態に係る図2に対応する。なお、図15において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS1において、細胞収容部101において凍結状態で収容された細胞および希釈液収容部121に収容された希釈液が、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入する。細胞および希釈液は、流路F3内において攪拌部52を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップS2において、開閉バルブ51および52が開状態とされ、ポンプP10が駆動される。これにより、貯留容器30内に貯留された細胞、細胞に付随する凍結液および希釈液を含む混合物がフィルタ部60内に流入する。フィルタ部60は、細胞、凍結液および希釈液を含む混合物から凍結液および希釈液を除去する濃縮処理を行う。凍結液および希釈液は、廃液回収容器16内に回収され、濃縮処理が施された細胞は、貯留容器30内に回収される。
ステップS3において、培地収容部111および114に収容された培地Aおよび培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入し、貯留容器30内に貯留された細胞と合流する。培地Aおよび培地Bは、攪拌部51および52を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップS4において、貯留容器30内に貯留された細胞および培地が、攪拌部50を経由して分割処理部40内に移送される。分割処理部40内に流入した細胞は、処理容器42内において分割処理が施される。これにより、凍結状態の細胞が分割される。ステップS5において、分割処理が施された細胞が培地とともに貯留容器30内に移送される。
ステップS6において、貯留容器30内に貯留された細胞および培地が、攪拌部50を経由して培養容器20内に流入する。細胞および培地は、攪拌部50を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞供給部100から供給された細胞が、培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器20に収容される。
なお、上記の例では、フィルタ部60における濃縮処理を1回のみとしているが、必要に応じて、細胞および使用済みの培地を含む混合物を貯留容器30とフィルタ部60との間で繰り返し循環させることにより、濃縮処理の実施回数を2回以上としてもよい。また、上記の例では、フィルタ部における濃縮処理および新たな培地の供給を、分割処理前に実施しているが、フィルタ部における濃縮処理および新たな培地の供給を、分割処理後に実施してもよい。
<培地交換処理>
以下において、第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bによる培地交換処理について説明する。なお、以下の説明において、第1の実施形態に係る培地交換処理と重複する事項については、適宜省略する。図16は、細胞培養装置10Bが培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第1の実施形態に係る図3に対応する。なお、図16において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS11において、培養容器20から細胞および使用済みの培地が貯留容器30内に移送される。ステップS12において、開閉バルブ51および52が開状態とされ、ポンプP10が駆動される。これにより、貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物が、フィルタ部60内に流入する。フィルタ部60は、細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器16内に回収され、濃縮処理が施された細胞は、貯留容器30内に回収される。
ステップS13において、培地収容部111および114に収容された新たな培地Aおよび新たな培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入し、貯留容器30内に貯留された細胞と合流する。培地Aおよび培地Bは、攪拌部51および52を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップS14において、貯留容器30に貯留された細胞および新たな培地が、攪拌部50を経由して培養容器20内に流入する。細胞および新たな培地は、攪拌部50を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞は、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化された状態で培養容器20内に収容される。
なお、上記の例では、フィルタ部60における濃縮処理を1回のみとしているが、必要に応じて、細胞および使用済みの培地を含む混合物を貯留容器30とフィルタ部60との間で繰り返し循環させることにより、濃縮処理の実施回数を2回以上としてもよい。
<分割処理>
以下において、第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bによる分割処理について説明する。以下の説明では、分割処理部40における分割処理が、上記した機械的分割処理である場合を例示する。また、以下の説明において、第1の実施形態に係る分割処理と重複する事項については、適宜省略する。図17は、細胞培養装置10Bが分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第1の実施形態に係る図4に対応する。なお、図17において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS21において、培養容器20から細胞および使用済みの培地が貯留容器30内に移送される。ステップS22において、開閉バルブ51および52が開状態とされ、ポンプP10が駆動される。これにより、貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物が、フィルタ部60内に流入する。フィルタ部60は、細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器16内に回収され、濃縮処理が施された細胞は、貯留容器30内に回収される。
ステップS23において、培地収容部111および114に収容された新たな培地Aおよび新たな培地Bが、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入し、貯留容器30内に貯留された細胞と合流する。培地Aおよび培地Bは、攪拌部51および52を通過することで、攪拌され、混合される。
ステップS24において、貯留容器30内に貯留された細胞および新たな培地は、分割処理部40内に移送され、分割処理部40内において細胞塊に対する分割処理が施される。ステップS25において、分割処理が施された細胞が、培地とともに貯留容器30内に移送される。
ステップS26において、貯留容器30内に貯留された細胞および培地が、攪拌部50を経由して培養容器20内に流入する。細胞および培地は、攪拌部50を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞は、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化された状態で培養容器20内に収容される。
なお、上記の例では、フィルタ部60における濃縮処理を1回のみとしているが、必要に応じて、細胞および使用済みの培地を含む混合物を貯留容器30とフィルタ部60との間で繰り返し循環させることにより、濃縮処理の実施回数を2回以上としてもよい。また、上記の例では、フィルタ部における濃縮処理および新たな培地の供給を、分割処理前に実施しているが、フィルタ部における濃縮処理および新たな培地の供給を、分割処理後に実施してもよい。
<凍結処理>
以下において、第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bによる凍結処理について説明する。なお、以下の説明において、第1の実施形態に係る凍結処理と重複する事項については、適宜省略する。図18は、細胞培養装置10Bが凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第1の実施形態に係る図6に対応する。なお、図18において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS41において、培養容器20から細胞および使用済みの培地が貯留容器30内に移送される。ステップS42において、開閉バルブ51および52が開状態とされ、ポンプP10が駆動される。これにより、貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物が、フィルタ部60内に流入する。フィルタ部60は、細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器16内に回収され、濃縮処理が施された細胞は、貯留容器30内に回収される。
ステップS43において、凍結液収容部131に収容された凍結液が、流路F3および循環流路F1を経由して貯留容器30内に流入し、貯留容器30内に貯留された細胞と合流する。凍結液は、攪拌部51および52を通過することで、攪拌される。
ステップS44において、貯留容器30に貯留された細胞および凍結液が、攪拌部50および流路F5を経由して凍結部17の保存容器17a内に収容される。細胞および凍結液は、攪拌部50を通過することで、攪拌され、混合される。凍結部17は、保存容器17a内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。
なお、上記の例では、フィルタ部60における濃縮処理を1回のみとしているが、必要に応じて、細胞および使用済みの培地を含む混合物を貯留容器30とフィルタ部60との間で繰り返し循環させることにより、濃縮処理の実施回数を2回以上としてもよい。
以上のように、第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bにおいては、細胞および培地等を含む混合物を、フィルタ部60に通過させることにより濃縮処理が行われる。従って、細胞を貯留容器30内で沈降させる沈降処理が不要となる。従って、第1および第2の実施形態に係る細胞培養装置10および10Aと比較して、濃縮処理の効率化を図ることが可能となる。
[第4の実施形態]
図19は、本発明の第4の実施形態に係る細胞培養装置10Cの構成を示す図である。細胞培養装置10Cは、第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bに第2の貯留容器35および第2のフィルタ部61を加えた構成を有する。また、第2のフィルタ部61には、廃液回収容器19が接続されている。なお、細胞培養装置10Cにおける第1の貯留容器および第1のフィルタ部60は、第3の実施形態に係る貯留容器30およびフィルタ部60に相当する。
第2の貯留容器35は、第1の貯留容器30と同じ構成を有し、流入口36および流出口37を有する。第2の貯留容器35の流入口36は、接続部位X7において循環流路F1に接続された配管g1を介して第1の貯留容器30の流入口31に接続されている。流路F7は、第2の貯留容器35の流入口36と流出口37とを接続する流路であり、配管h1およびh2を含んで構成されている。
第2のフィルタ部61は、流路F7内(すなわち、流路F7の途中)に設けられている。第2のフィルタ部61は、第1のフィルタ部60と同様、第2の貯留容器35から供給される細胞と細胞に随伴する培地等の液体とを含む混合物から上記液体を除去する濃縮処理を行う機能を有する。第2のフィルタ部61は、第1のフィルタ部60と同様、タンジェンシャルフローフィルタの構成を有するものであってもよい。第2のフィルタ部61から排出された培地等の廃液は、廃液回収容器19に回収される。
流路F7を構成する配管h1には、接続部位X7の近傍において開閉バルブV61が設けられている。また、流路F7を構成する配管h2には、第2の貯留容器35の流出口37の近傍において開閉バルブV62が設けられている。
また、本実施形態に係る細胞培養装置10Cは、第1の貯留容器30および第1のフィルタ部60から細胞および培地等を含む混合物を移送する手段としてポンプは使用されず、第1の貯留容器30が備える圧力調整機構33が使用される。同様に、第2の貯留容器35および第2のフィルタ部61から細胞および培地等を含む混合物を移送する手段としてポンプは使用されず、第2の貯留容器35が備える圧力調整機構38が使用される。
なお、第1の貯留容器30は、本発明における第1の貯留容器の一例である。第2の貯留容器35は、本発明における第2の貯留容器の一例である。第2の貯留容器35の流入口36は、本発明における第3の流入口の一例である。第2の貯留容器35の流出口37は、本発明における第3の流出口の一例である。第2のフィルタ部61は、本発明における第2のフィルタ部の一例である。流路F7は、本発明における第4の流路の一例である。圧力調整機構33は、本発明における第1の貯留容器が有する第1の圧力調整機構の一例である。圧力調整機構38は、本発明における第2の貯留容器が有する第2の圧力調整機構の一例である。
本実施形態に係る細胞培養装置10Cは、第1の貯留容器30と第1のフィルタ部60とを含んで構成される第1の濃縮処理ユニットと、第2の貯留容器35と第2のフィルタ部61とを含んで構成される第2の濃縮処理ユニットとを交互に使用することによって濃縮処理を連続的に行うことが可能である。
以下に、第4の実施形態に係る細胞培養装置10Cによる濃縮処理について説明する。以下の説明では、一例として、培地交換処理の中で行われる濃縮処理を例示する。図20は、本実施形態に係る細胞培養装置10Cが濃縮処理を実施する場合における細胞および培地の流れを示す図である。なお、図20において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。
ステップS51において、培養容器20から細胞および使用済みの培地が第1の貯留容器30内に移送される。ステップS52において、開閉バルブ51および52が開状態とされる。また、圧力調整機構33によって第1の貯留容器30内の雰囲気が加圧される。一方、圧力調整機構38によって第2の貯留容器35内の雰囲気は大気に解放される。これにより、第1の貯留容器30内の気圧が上昇し、第1の貯留容器30内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物は、第1のフィルタ部60内に流入する。第1のフィルタ部60による濃縮処理によって細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地の一部が除去され、廃液回収容器16内に回収される。その後、細胞および残存する使用済みの培地を含む混合物は、配管g1を経由して第2の貯留容器35内に流入する。
ステップS53において、開閉バルブV61およびV62が開状態とされる。また、圧力調整機構38によって第2の貯留容器35内の雰囲気が加圧される。一方、圧力調整機構33によって第1の貯留容器30内の雰囲気は大気圧に開放される。これにより、第2の貯留容器35内の気圧が上昇し、第2の貯留容器35内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物は、第2のフィルタ部61内に流入する。第2のフィルタ部61による濃縮処理によって細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地の一部が除去され、廃液回収容器19内に回収される。その後、細胞および残存する使用済みの培地を含む混合物は、配管g1を経由して第1の貯留容器30内に流入する。
その後、必要に応じて、ステップS52およびS53の処理が繰り返し実施される。これにより、細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地が除去される。濃縮処理が施された細胞は、ステップS54において第1の貯留容器30内に貯留される。
以上の説明では、培地交換処理の中で行われる濃縮処理を例示したが、上記の濃縮処理は、継代処理、分割処理および凍結処理の中で行われる濃縮処理に適用することも可能である。
第4の実施形態に係る細胞培養装置10Cによれば、濃縮処理は、第1のフィルタ部60および第2のフィルタ部61において行われるので、細胞を貯留容器内で沈降させる沈降処理が不要となる。また、細胞培養装置10Cによれば、第1の濃縮処理ユニットと第2の濃縮処理ユニットとを交互に使用して濃縮処理を行うので、第1の濃縮処理ユニットと第2の処理ユニットとの間での細胞および培地等の移送を、圧力調整機構33および38による圧送により行うことが可能となる。従って、接液ポンプを使用することなく濃縮処理を行うことが可能となり、接液ポンプを使用する場合と比較して細胞に対するダメージを軽減することが可能である。なお、本実施形態では、第1の濃縮処理ユニットと第2の濃縮処理ユニットを交互に使用する場合を例示したが、第1の濃縮処理ユニットと第2の濃縮処理ユニットとを同時に使用してもよい。すなわち、この場合、第1の濃縮処理ユニットと第2の濃縮処理ユニットにおいて濃縮処理が並行して行われる。
[第1の変形例]
上記第1〜第4の実施形態に係る細胞培養装置の構成に対して様々な変形が可能である。
図21は、第1の変形例に係る細胞培養装置10Dの構成を示す図である。細胞培養装置10Dは、培養容器20から貯留容器30に細胞および培地を移送する手段として、ポンプP20を有する。
例えば、培養容器20がプラスチック製のバッグの形態を有する場合には、容器本体の耐圧性能に起因して、圧力調整機構26によって培養容器20の内部雰囲気を加圧することが困難となり得る。ポンプP20は、このように培養容器20の内部雰囲気の加圧が困難である場合に適用され得る。
ポンプP20は、図21に示すように、循環流路F1内における培養容器20の流出口22と接続部位X2との間に配置されることが好ましい。細胞は、分割処理部40における分割処理によってダメージを受けていると考えられる。また、分割処理の直後に細胞に更なるダメージを与えると、細胞の生存率が低下するおそれがある。すなわち、分割処理後の細胞がポンプを経由することによりダメージが蓄積され、細胞の生存率が低下するおそれがある。本変形例に係る細胞培養装置10Dによれば、ポンプP20が培養容器20の流出口22と接続部位X2との間に配置されているので、分割処理部40において分割処理が施された細胞は、ポンプを経由することなく培養容器20内に収容される。
なお、図21においては、ポンプP20を、第2の実施形態に係る細胞培養装置10Aに適用した場合が示されているが、第1、第3および第4の実施形態に係る細胞培養装置10、10Bおよび10Dに適用することも可能である。
[第2の変形例]
図22は、第2の変形例に係る細胞培養装置10Eの構成を示す図である。細胞培養装置10Eは、第3の実施形態に係る細胞培養装置10Bにおけるフィルタ部60を、遠心沈降部70に置き換えた構成を有する。
遠心沈降部70は、フィルタ部60と同様、細胞および使用済みの培地等の液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う機能を有する。遠心沈降部70は、細胞と培地等の液体との比重差を利用して細胞と培地等の液体とを遠心分離させ、培地等の液体を廃液回収容器16に排出する。
なお、遠心沈降部70とフィルタ部60とを併設し、これらを選択的に使用できる構成としてもよい。また、第4の実施形態に係る細胞培養装置10Cにおける第1のフィルタ部60および第2のフィルタ部61をそれぞれ遠心沈降部70に置き換えてもよい。
[第3の変形例]
図23は、第3の変形例に係る細胞培養装置10Fの構成を示す図である。細胞培養装置10Fは、循環流路F1および流路F2を構成する各配管の構成が上記した第1〜第4の実施形態に係る細胞培養装置10、10A〜10Cと異なる。
細胞培養装置10Fにおいて、培養容器20の流入口21と流出口22とを接続する循環流路F1は、配管a1〜a7および配管b5を含んで構成されている。培養容器20、貯留容器30および攪拌部50は、循環流路F1内に設けられている。
流路F2は、循環流路F1内における、貯留容器30の流出口32と培養容器20の流入口21との間に位置する接続部位X11と、循環流路F1内における、貯留容器30の流入口31と培養容器20の流出口22との間に位置する接続部位X12と、を接続する配管b3〜b6を含んで構成されている。循環流路F1内を流れる細胞および培地等は、接続部位X11を経由して流路F2内に流入することが可能である。また、流路F2内を流れる細胞および培地等は、接続部位X12を経由して循環流路F1内に流入することが可能である。分割処理部40は、流路F2内に設けられている。
なお、循環流路F1は、本発明における第1の流路の一例である。流路F2は、本発明における第2の流路の一例である。接続部位X11は、本発明における第1の部位の一例である。接続部位X12は、本発明における第2の部位の一例である。
細胞培養装置10Fによれば、上記した第1および第2の実施形態に係る細胞培養装置10および10Aと同様の継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理を行うことが可能である。細胞培養装置10Fにおける配管構成を、第3および第4の実施形態に係る細胞培養装置10Bおよび10Cに適用することも可能である。
10、10A〜10F 細胞培養装置
17 凍結部
20 培養容器
21 流入口
22 流出口
30 貯留容器、第1の貯留容器
31 流入口
32 流出口
33、38、43 圧力調整機構
35 第2の貯留容器
36 流入口
37 流出口
40 分割処理部
42 処理容器
50〜52 攪拌部
60 フィルタ部、第1のフィルタ部
61 第2のフィルタ部
100 細胞供給部
110 培地供給部
F1 循環流路F1
F2〜F7 流路
X1〜X6、X11、X12 接続部位

Claims (16)

  1. 第1の流入口および第1の流出口を有する、細胞を培養するための培養容器と、
    前記第1の流出口と前記第1の流入口とを接続する第1の流路と、
    前記第1の流路内に設けられ、前記培養容器で培養される細胞を貯留するための貯留容器であって、前記第1の流出口に接続された第2の流入口および前記第1の流入口に接続された第2の流出口を有する第1の貯留容器と、
    前記第2の流出口と前記第1の流入口との間に位置する前記第1の流路内の第1の部位と、前記第2の流入口と前記第1の流出口との間に位置する前記第1の流路内の第2の部位と、を接続する第2の流路と、
    前記第2の流路内に設けられ、前記第1の部位を経由して前記第1の流路から流入する、前記培養容器で培養された細胞の塊である細胞塊を分割する分割処理を行い、前記分割処理が施された細胞を前記第2の部位を経由して前記第1の流路内に流出させる分割処理部と、
    前記第1の流路内に培地を供給する培地供給部と、
    を含む細胞培養装置。
  2. 前記第1の流路内において、前記第2の流出口と前記第1の流入口との間に設けられ、流入する流体を攪拌する第1の攪拌部を更に含む
    請求項1に記載の細胞培養装置。
  3. 前記第1の攪拌部は、スタティックミキサを含む
    請求項2に記載の細胞培養装置。
  4. 前記第2の流入口と前記第2の流出口とを接続する第3の流路内に設けられ、前記第2の流出口から流出する細胞および細胞に随伴する液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う第1のフィルタ部を更に含む
    請求項1から請求項3のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
  5. 前記第1のフィルタ部はタンジェンシャルフローフィルタを含む
    請求項4に記載の細胞培養装置。
  6. 第3の流出口と、前記第2の流入口に接続された第3の流入口と、を含む第2の貯留容器と、
    前記第3の流入口と前記第3の流出口とを接続する第4の流路内に設けられ、前記第3の流出口から流出する細胞および細胞に随伴する液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う第2のフィルタ部と、
    を更に含む請求項4または請求項5に記載の細胞培養装置。
  7. 前記第2のフィルタ部はタンジェンシャルフローフィルタを含む
    請求項6に記載の細胞培養装置。
  8. 前記第1のフィルタ部による濃縮処理と、前記第2のフィルタ部による濃縮処理を交互に行う請求項6または請求項7に記載の細胞培養装置。
  9. 前記第1の貯留容器の内部の圧力を調整する第1の圧力調整機構と、
    前記第2の貯留容器の内部の圧力を調整する第2の圧力調整機構と、
    を更に含む請求項6から請求項8のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
  10. 前記分割処理部は、前記分割処理を行うための処理容器と、前記処理容器の内部の圧力を調整する圧力調整機構と、を有する
    請求項1から請求項9のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
  11. 前記培地供給部と前記第1の流路とを接続する第5の流路内に設けられ、流入する流体を攪拌する第2の攪拌部を更に含む
    請求項1から請求項10のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
  12. 前記第1の流路に前記培養容器で培養される細胞を供給する細胞供給部を更に含む
    請求項1から請求項11のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
  13. 前記第5の流路における前記第2の攪拌部の下流側に接続され、前記培養容器で培養される細胞を前記第5の流路を経由して前記第1の流路に供給する細胞供給部と、
    前記第5の流路における前記細胞供給部が接続される部位の下流側に設けられ、流入する流体を攪拌する第3の攪拌部と、
    を更に含む請求項11に記載の細胞培養装置。
  14. 前記第2の流出口と前記第1の流入口との間に位置する前記第1の流路内の第3の部位に接続された、細胞を凍結させる凍結部を更に含む、
    請求項1から請求項13のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
  15. 前記培養容器の内部の圧力を調整する圧力調整機構を更に含む
    請求項1から請求項14のいずれか1項に記載の細胞培養装置。
  16. 請求項1から請求項15のいずれか1項に記載の細胞培養装置を用いた細胞培養方法であって、
    前記培養容器内で細胞の培養に使用された使用済みの培地を新たな培地に交換する培地交換処理と、
    前記培養容器で細胞を培養することによって形成された細胞塊を分割する分割処理と、を含み、
    前記培地交換処理は、
    前記培養容器で培養された細胞を使用済みの培地とともに前記第1の貯留容器に貯留するステップと、
    前記第1の貯留容器に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去するステップと、
    前記第1の貯留容器に貯留された細胞に新たな培地を前記培地供給部から供給するステップと、
    細胞および新たな培地を含む混合物を前記培養容器に収容するステップと、を含み、
    前記分割処理は、
    前記培養容器内において形成された細胞塊を前記分割処理部において分割するステップと、
    前記分割処理部において細胞塊を分割する前若しくは後に前記培養容器内で細胞の培養に使用された使用済みの培地を新たな培地に交換するステップと、
    分割された細胞および新たな培地を含む混合物を前記培養容器に収容するステップと、を含む
    細胞培養方法。
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