JP6291429B2 - 細胞培養装置および細胞培養方法 - Google Patents

Description

本発明は、細胞培養装置および細胞培養方法に関する。

細胞培養装置または細胞培養システムに関し、例えば以下の技術が知られている。例えば、特許文献１には、膜濾過分離装置と、培養装置、培地貯槽、濾液貯槽との間を液移送ポンプならびにバルブを挿入した液移送配管で連結した生物細胞の培養システムが記載されている。

特許文献２には、細胞の浮遊する培養液の一部を抜き取り、培養液と細胞とを濾過膜を介して分離し、細胞を新鮮培地とともに培養槽に戻して連続的に培地交換を行うことを可能とする培養装置が記載されている。

特開平２−１５０２７２号公報 特開平４−９９４８３号公報

例えば、肝疾患や心疾患などを、細胞移植によって治療するためには、１×１０^９個以上の分化細胞の移植がひとりの患者に必要であると考えられており、これを実現するためには、多能性幹細胞の大量培養技術の開発が不可欠である。

例えば、多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じる細胞塊（スフィア）のサイズが過大となると、細胞塊同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。従って、細胞塊のサイズが過大となることを防止するために、細胞の培養期間中の適切な時期に、細胞塊を分割する分割処理が必須となる。

上記の分割処理を含む細胞培養に必要とされる一連の処理を、閉鎖系において連続的に実施することにより大量の細胞を生産することを可能とした細胞培養装置についてこれまで提案された例はなく、動物細胞や幹細胞等の比較的増殖率の低い細胞の培養スケールを大きくすることは困難とされていた。培養スケールの増大に対応するべく、人手が介在され且つ培養スケールが小規模である細胞培養装置を並列に設置する対応も考えられるが、この場合、装置コストが高くなり、プロセスも煩雑となる。更に、装置間で培養環境に差が生じることから、培養された細胞の装置間における均質性が低下する。

本発明は、上記した点に鑑みてなされたものであり、分割処理を含む細胞培養に必要な一連の処理を、閉鎖系において連続的に実施することができる細胞培養装置およびそのような細胞培養装置を用いた細胞培養方法を提供することを目的とする。

本発明に係る細胞培養装置は、第１の流入口および第１の流出口を有する、細胞を培養するための培養容器と、第１の流出口と第１の流入口とを接続する第１の流路と、第１の流路内に設けられ、培養容器で培養される細胞を貯留するための貯留容器であって、第１の流出口に接続された第２の流入口および第１の流入口に接続された第２の流出口を有する第１の貯留容器と、第２の流出口と第１の流入口との間に位置する第１の流路内の第１の部位と、第２の流入口と第１の流出口との間に位置する第１の流路内の第２の部位と、を接続する第２の流路と、第２の流路内に設けられ、第１の部位を経由して第１の流路から流入する、培養容器で培養された細胞の塊である細胞塊を分割する分割処理を行い、分割処理が施された細胞を第２の部位を経由して第１の流路内に流出させる分割処理部と、第１の流路内に培地を供給する培地供給部と、を含む。

本発明に係る細胞培養装置は、第１の流路内において、第２の流出口と第１の流入口との間に設けられ、流入する流体を攪拌する第１の攪拌部を更に含み得る。本発明に係る細胞培養装置において、第１の攪拌部は、スタティックミキサを含んで構成されていてもよい。

本発明に係る細胞培養装置は、第２の流入口と第２の流出口とを接続する第３の流路内に設けられ、第２の流出口から流出する細胞および細胞に随伴する液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う第１のフィルタ部を更に含み得る。本発明に係る細胞培養装置において、第１のフィルタ部はタンジェンシャルフローフィルタを含んでいてもよい。

本発明に係る細胞培養装置は、第３の流出口と、第２の流入口に接続された第３の流入口と、を含む第２の貯留容器と、第３の流入口と第３の流出口とを接続する第４の流路内に設けられ、第３の流出口から流出する細胞および細胞に随伴する液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う第２のフィルタ部と、を更に含み得る。本発明に係る細胞培養装置において、第２のフィルタ部はタンジェンシャルフローフィルタを含んでいてもよい。本発明に係る細胞培養装置は、第１のフィルタ部による濃縮処理と、第２のフィルタ部による濃縮処理を交互に行い得る。

本発明に係る細胞培養装置は、第１の貯留容器の内部の圧力を調整する第１の圧力調整機構と、第２の貯留容器の内部の圧力を調整する第２の圧力調整機構と、を更に含み得る。

本発明に係る細胞培養装置において、分割処理部は、分割処理を行うための処理容器と、処理容器の内部の圧力を調整する圧力調整機構と、を有し得る。

本発明に係る細胞培養装置は、培地供給部と第１の流路とを接続する第５の流路内に設けられ、流入する流体を攪拌する第２の攪拌部を更に含み得る。

本発明に係る細胞培養装置は、第１の流路に培養容器で培養される細胞を供給する細胞供給部を更に含み得る。

本発明に係る細胞培養装置は、第５の流路における第２の攪拌部の下流側に接続され、培養容器で培養される細胞を第５の流路を経由して第１の流路に供給する細胞供給部と、第５の流路における細胞供給部が接続される部位の下流側に設けられ、流入する流体を攪拌する第３の攪拌部と、を更に含み得る。

本発明に係る細胞培養装置は、第２の流出口と第１の流入口との間に位置する第１の流路内の第３の部位に接続された細胞を凍結させる凍結部を更に含み得る。

本発明に係る細胞培養装置は、培養容器の内部の圧力を調整する圧力調整機構を更に含み得る。

本発明に係る細胞培養方法は、上記の細胞培養装置を用いた細胞培養方法であって、培養容器内で細胞の培養に使用された使用済みの培地を新たな培地に交換する培地交換処理と、培養容器で細胞を培養することによって形成された細胞塊を分割する分割処理と、を含む。培地交換処理は、培養容器で培養された細胞を使用済みの培地とともに第１の貯留容器に貯留するステップと、第１の貯留容器に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去するステップと、第１の貯留容器に貯留された細胞に新たな培地を培地供給部から供給するステップと、細胞および新たな培地を含む混合物を培養容器に収容するステップと、を含む。分割処理は、培養容器内において形成された細胞塊を分割処理部において分割するステップと、分割処理部において細胞塊を分割する前若しくは後に培養容器内で細胞の培養に使用された使用済みの培地を新たな培地に交換するステップと、分割された細胞および新たな培地を含む混合物を培養容器に収容するステップと、を含む。

本発明によれば、分割処理を含む細胞培養に必要な一連の処理を閉鎖系において連続的に実施することができる細胞培養装置およびそのような細胞培養装置を用いた細胞培養方法が提供される。

本発明の第１の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る細胞培養装置において継代処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る細胞培養装置において培地交換処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る細胞培養装置において分割処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る細胞培養装置において分割処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第１の実施形態に係る細胞培養装置において凍結処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の実施形態に係る細胞培養装置を用いた細胞培養方法の一例を示すフローチャートである。 本発明の第２の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る細胞培養装置において継代処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る細胞培養装置において培地交換処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る細胞培養装置において分割処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第２の実施形態に係る細胞培養装置において凍結処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の実施形態に係るフィルタ部におけるフィルトレーションの態様の一例を示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る細胞培養装置において継代処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る細胞培養装置において培地交換処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る細胞培養装置において分割処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第３の実施形態に係る細胞培養装置において凍結処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の第４の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の第４の実施形態に係る細胞培養装置において濃縮処理を実施する場合における細胞等の流れを示す図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。 本発明の他の実施形態に係る細胞培養装置の構成を示す図である。

以下、本発明の実施形態の一例を図面を参照しつつ説明する。なお、各図面において同一または等価な構成要素および部分には同一の参照符号を付与している。

[第１の実施形態]
図１は、本発明の第１の実施形態に係る細胞培養装置１０の構成を示す図である。細胞培養装置１０は、細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０を備える。また、細胞培養装置１０は、培養容器２０、貯留容器３０、分割処理部４０、廃液回収容器１６および凍結部１７を備える。

細胞培養装置１０は、細胞供給部１００から供給される細胞を、培地供給部１１０から供給される培地（培養液）とともに培養容器２０内に収容し、培養容器２０内において細胞を培地中に例えば浮遊させた状態で培養する。

＜細胞供給部＞
細胞供給部１００は、細胞培養装置１０による培養の対象となる細胞を凍結させた状態で収容する細胞収容部１０１と、細胞収容部１０１に収容された細胞を、配管ｃ１を含んで構成される流路Ｆ３に送出するポンプＰ１とを有する。また、細胞供給部１１０は、細胞収容部１０１と配管ｃ１とを接続する配管の、ポンプＰ１の下流側に設けられた開閉バルブＶ１を有する。細胞収容部１０１に収容された細胞は、ポンプＰ１が駆動され、開閉バルブＶ１が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。

本実施形態に係る細胞培養装置１０による培養の対象となる細胞は、特に制限されず、動物細胞、植物細胞、真菌細胞、細菌細胞、プロトプラスト、樹立された細胞株、人為的に遺伝子改変が施された細胞、等のあらゆる細胞が対象となり得る。

培養対象となる細胞の一例は、幹細胞である。幹細胞は、自己複製能と分化能とを有する細胞であれば特に制限されず、多能性幹細胞でもよく、体性幹細胞でもよい。

多能性幹細胞は、自己複製能と、外胚葉、中胚葉および内胚葉のいずれにも分化し得る多分化能とを有する細胞である。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞（Embryonic Stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced Pluripotent Stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（Embryonic Germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（Embryonal Carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（Multipotent Adult Progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（Adult Pluripotent Stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（Multi-lineage differentiating Stress Enduring cell）などが挙げられる。

体性幹細胞としては、例えば、間葉系幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞などが挙げられる。

培養対象となる細胞の他の例は、生体を構成する体細胞、及びその前駆細胞である。具体的には、リンパ球、好中球、単球、巨核球、マクロファージ、線維芽細胞、基底細胞、ケラチノサイト、上皮前駆細胞、周皮細胞、内皮細胞、脂肪前駆細胞、筋芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、肝実質細胞、膵β細胞、グリア細胞、等が挙げられる。

培養対象となる細胞の他の例は、CHO（chinese hamster ovary）、COS、HeLa、HepG2、C127、3T3、BHK、HEK293、Bowesメラノーマ細胞等の動物細胞；ドロソフィラS2、スポドプテラSf9等の昆虫細胞；酵母、アスペルギルス等の真菌細胞；大腸菌、枯草菌等の細菌細胞；植物細胞、カルス；などである。これらの細胞は、タンパク質の大量発現を目的にタンパク質発現ベクターが導入された細胞であってもよい。

なお、培養容器２０内に予め細胞および培地を収容した状態で細胞培養を開始する場合などにおいては、細胞培養装置１０において細胞供給部１００を省略することが可能である。

＜培地供給部＞
培地供給部１１０は、細胞の培養に使用する培地（培養液）を収容する培地収容部１１１および１１４と、培地収容部１１１および１１４にそれぞれ収容された培地を、流路Ｆ３に送出するポンプP２およびP３と、ポンプＰ２およびＰ３からそれぞれ送出された培地を除菌するためのフィルタ１１３および１１６とを有する。また、培地供給部１１０は、培地収容部１１１と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１１３の下流側に設けられた開閉バルブＶ２と、培地収容部１１４と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１１６の下流側に設けられた開閉バルブＶ３とを有する。このように、本実施形態に係る培地供給部１１０は、培地収容部１１１、ポンプＰ２、フィルタ１１３および開閉バルブＶ２を含む第１の系統と、培地収容部１１４、ポンプＰ３、フィルタ１１６および開閉バルブＶ３を含む第２の系統と、からなる２系統の培地供給機能を備えており、互いに異なる２種類の培地が供給可能である。なお、培地供給部１１０における系統の数は、細胞の培養プロトコル等に応じて適宜増減することが可能である。すなわち、培地供給部１１０を、３種類以上の培地を供給可能とする構成としてもよいし、１種類の培地を供給可能とする構成としてもよい。培地収容部１１１に収容された培地は、ポンプＰ２が駆動され、開閉バルブＶ２が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。培地収容部１１４に収容された培地は、ポンプＰ３が駆動され、開閉バルブＶ３が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。

本実施形態に係る細胞培養装置１０による細胞培養において適用し得る培地は、特に制限されず、あらゆる培地を適用することができる。具体的には、哺乳動物細胞用の基本培地（例えば、DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、DMEM/F-12（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）、EMEM（Eagle's minimal essential medium）、BME（Basal Medium Eagle）、RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium）、E8 base medium、SkBM（Skeletal Muscle Cell Basal Medium）、MCDB104、MCDB153、199、L15）、市販品の幹細胞維持用培養液、昆虫細胞用の基本培地、酵母用培地、細菌用培地、等の液体培地である。

本実施形態に係る細胞培養装置１０による細胞培養において適用し得る培地は、細胞を継続的に浮遊させる目的、及び／又は、細胞同士の過度の密着を防ぐ目的で、細胞毒性を有しない高分子化合物が添加されていてもよい。上記目的で培地に添加される高分子化合物は、例えば、培地の比重を調整する高分子化合物、培地の粘度を調整する高分子化合物、培地中で三次元ネットワーク構造を形成する高分子化合物である。このような高分子化合物としては、セルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ジェランガム、脱アシル化ジェランガム、ヒアルロン酸、アルギン酸、カラギーナン、キサンタンガム、ダイユータンガム、デンプン、ペクチン等の多糖類；コラーゲン、ゼラチン等のタンパク質；ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン等の合成高分子；などが挙げられる。

本実施形態に係る細胞培養装置１０による細胞培養に適用し得る培地は、一般に添加可能な各種の成分、例えば、ペニシリン、ストレプトマイシン等の抗生物質；アスコルビン酸、レチノイン酸等のビタミン又はビタミン誘導体；グルコース等の糖源；アミノ酸；無機塩；血清、血清代替物；トランスフェリン等のタンパク質；インスリン等のホルモン；増殖因子；分化抑制因子；２−メルカプトエタノール、ジチオトレイトール等の抗酸化剤；カルシウムイオン、マグネシウムイオン、亜鉛イオン、鉄イオン、銅イオン等の金属イオン；などが添加されていてもよい。

＜希釈液供給部＞
希釈液供給部１２０は、細胞の培養過程において適宜実施される希釈処理に用いられる希釈液を収容する希釈液収容部１２１と、希釈液収容部１２１に収容された希釈液を、流路Ｆ３に送出するポンプＰ４と、ポンプＰ４から送出された希釈液を除菌するためのフィルタ１２３とを有する。また、希釈液供給部１２０は、希釈液収容部１２１と配管ｃ１とを接続する配管の、フィルタ１２３の下流側に設けられた開閉バルブＶ４を有する。希釈液収容部１２１に収容された希釈液は、ポンプＰ４が駆動され、開閉バルブＶ４が開状態とされることにより流路Ｆ３に送出される。

本実施形態に係る細胞培養装置１０による細胞培養に適用し得る希釈液は、特に制限されず、例えば、哺乳動物細胞用の基本培地（例えば、DMEM、DMEM/F-12、MEM、DME、RPMI1640、MCDB104、199、MCDB153、L15、SkBM、Basal Medium、E8 base medium）を希釈液として使用することが可能である。なお、細胞培養過程において希釈処理が不要である場合には、希釈液供給部１２０を省略することが可能である。

＜凍結液供給部＞
凍結液供給部１３０は、培養された細胞を凍結部１７において凍結保存する場合に用いられる凍結液を収容する凍結液収容部１３１と、凍結液収容部１３１に収容された凍結液を、流路Ｆ３に送出するポンプＰ５と、ポンプＰ５から送出された凍結液を除菌するためのフィルタ１３３とを有する。また、凍結液供給部１３０は、凍結液収容部１３１、ポンプＰ５およびフィルタ１３３を接続する配管の、フィルタ１３３の下流側に設けられた開閉バルブＶ５を含む。凍結液収容部１３１に収容された凍結液は、ポンプＰ５が駆動され、開閉バルブＶ５が開状態となることにより流路Ｆ３に送出される。なお、培養された細胞を凍結保存する必要がない場合には、細胞培養装置１０において凍結液供給部１３０を省略することが可能である。

＜培養容器＞
培養容器２０は、細胞供給部１００から供給される細胞を、培地供給部１１０から供給される培地とともに収容し、収容された細胞を培養するための容器である。培養容器２０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器やプラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。培養容器２０は、細胞および培地を培養容器２０内に流入させるための流入口２１と、培養容器２０に収容された細胞および培地を培養容器２０の外部に流出させるための流出口２２と、を有する。

培養容器２０は、例えば、温度３０℃〜４０℃（好ましくは３７℃）且つＣＯ_２濃度２％〜１０％（好ましくは５％）に制御され且つ密閉されたインキュベータ２４内に収容され得る。インキュベータ２４は、培養容器２０内に培地とともに収容された細胞に酸素（Ｏ_２）および二酸化炭素（ＣＯ_２）を供給するためのガス供給機構２５を備える。また、インキュベータ２４は、培養容器２０内の圧力を調整する圧力調整機構２６を備える。圧力調整機構２６は、培養容器２０内にエアーを導入することにより培養容器２０内の雰囲気を加圧し、または、培養容器２０内の雰囲気を外部に排出することにより培養容器２０内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構２６は、培養容器２０内の圧力を、後述する循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、培養容器２０内に収容された細胞および培地を循環流路Ｆ１内に流出させる。

＜循環流路＞
細胞培養装置１０は、培養容器２０の流出口２２と流入口２１とを接続する配管ａ１〜ａ７を含んで構成される循環流路Ｆ１を有する。培養容器２０に収容された細胞および培地は、培養過程において、循環流路Ｆ１内を循環する。循環流路Ｆ１内を流れる細胞および培地は、流入口２１を経由して培養容器２０内へ流入し、培養容器２０の内部に収容された細胞および培地は、流出口２２を経由して循環流路Ｆ１内に流出する。

培養容器２０の流入口２１に接続された循環流路Ｆ１を構成する配管ａ７には開閉バルブＶ１１が設けられ、培養容器２０の流出口２２に接続された循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１には開閉バルブＶ１２が設けられている。開閉バルブＶ１１は、循環流路Ｆ１から培養容器２０内に細胞および培地を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。開閉バルブＶ１２は、培養容器２０内から循環流路Ｆ１内に細胞および培地を流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。

細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０に接続された配管ｃ１によって構成される流路Ｆ３は、接続部位Ｘ３において循環流路Ｆ１に接続されている。すなわち、細胞収容部１０１に収容された細胞、培地収容部１１１および１１４にそれぞれ収容された培地、希釈液収容部１２１に収容された希釈液および凍結液収容部１３１に収容された凍結液は、流路Ｆ３および接続部位Ｘ３を経由して循環流路Ｆ１内に供給される。

流路Ｆ３を構成する配管ｃ１には、接続部位Ｘ３の近傍において開閉バルブＶ６が設けられている。開閉バルブＶ６は、細胞供給部１００、培地供給部１１０、希釈液供給部１２０および凍結液供給部１３０からそれぞれ、細胞、培地、希釈液および凍結液を循環流路Ｆ１内に供給する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。

＜貯留容器＞
貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内、すなわち、循環流路Ｆ１の途中に設けられている。貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内を流れる細胞、培地、希釈液および凍結液を一時的に貯留するための容器であり、培養期間中に実施される後述する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理において使用される。貯留容器３０の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。

貯留容器３０は、循環流路Ｆ１内を流れる細胞、培地、希釈液および凍結液を貯留容器３０内に流入させるための流入口３１と、貯留容器３０に収容された細胞、培地、希釈液および凍結液を循環流路Ｆ１内に流出させるための流出口３２を有する。貯留容器３０の流入口３１は、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１、ａ２およびａ３によって培養容器２０の流出口２２に接続されている。貯留容器３０の流出口３２は、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ４、ａ５、ａ６およびａ７によって培養容器２０の流入口２１に接続されている。また、本実施形態においては、循環流路Ｆ１と流路Ｆ３とが接続される接続部位Ｘ３が貯留容器３０の流入口３１の近傍に配置されているが、循環流路Ｆ１と流路Ｆ３との接続位置は、循環流路Ｆ１内におけるあらゆる位置に配置することが可能である。

循環流路Ｆ１を構成する配管ａ２には、貯留容器３０の流入口３１の近傍において開閉バルブＶ１３が設けられている。開閉バルブＶ１３は、循環流路Ｆ１から貯留容器３０内に細胞および培地等を流入させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。また、循環流路Ｆ１を構成する配管ａ５には、貯留容器３０の流出口３２の近傍において開閉バルブＶ１４が設けられている。開閉バルブＶ１４は、貯留容器３０内から循環流路Ｆ１内に細胞および培地等を培養容器２０、分割処理部４０および凍結部１７に移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。

貯留容器３０は、貯留容器３０内の圧力を調整する圧力調整機構３３を備える。圧力調整機構３３は、貯留容器３０内にエアーを導入することにより貯留容器３０内の雰囲気を加圧し、または、貯留容器３０内の雰囲気を外部に排出することにより貯留容器３０内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構３３は、貯留容器３０内の圧力を循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、貯留容器３０内に貯留された細胞、培地、希釈液および凍結液を、流出口３２から循環流路Ｆ１内に流出させる。

細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間に位置する接続部位Ｘ１と、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流入口３１と培養容器２０の流出口２２との間に位置する接続部位Ｘ２と、を接続する配管ｂ１およびｂ２を含んで構成される流路Ｆ２を有する。循環流路Ｆ１内を流れる細胞および培地等は、接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入することが可能である。また、流路Ｆ２内を流れる細胞および培地等は、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流入することが可能である。

＜分割処理部＞
分割処理部４０は、流路Ｆ２内、すなわち、流路Ｆ２の途中に設けられている。分割処理部４０は、培養容器２０内において細胞を培養することによって生じる細胞塊を分割する分割処理を行うための処理容器４２を備える。処理容器４２内において行われる分割処理は、機械的分割処理であってもよいし、細胞解離酵素を用いた酵素処理であってもよい。機械的分割処理が適用される場合には、処理容器４２内には、メッシュフィルタが（図示せず）配置され得る。細胞塊をメッシュフィルタに通すことで、細胞塊はメッシュフィルタのメッシュサイズに応じたサイズに分割される。一方、酵素処理による分割処理が適用される場合には、処理容器４２内には、トリプシン−ＥＤＴＡ（ethylenediaminetetraacetic acid）等の細胞解離酵素が収容され得る。細胞塊を一定時間に亘り細胞解離酵素に浸漬することで、細胞塊が分割される。

分割処理部４０は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入する細胞塊を処理容器４２において分割する。分割処理が施された細胞は、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出する。

分割処理部４０は、処理容器４２に連通する圧力容器４１と、圧力容器４１および処理容器４２内の圧力を調整する圧力調整機構４３と、を備える。圧力調整機構４３は、圧力容器４１内にエアーを導入することにより圧力容器４１および処理容器４２内の雰囲気を加圧し、または、圧力容器４１内の雰囲気を外部に排出することにより圧力容器４１および処理容器４２内の雰囲気を大気に解放する。圧力調整機構４３は、圧力容器４１および処理容器４２内の圧力を循環流路Ｆ１内の圧力よりも高めることにより、分割処理が施された細胞を循環流路Ｆ１内に流出させる。

流路Ｆ２を構成する、分割処理部４０の上流側に配置される配管ｂ１には、接続部位Ｘ１の近傍において開閉バルブＶ２１が設けられている。開閉バルブＶ２１は、貯留容器３０から分割処理部４０に細胞等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。一方、流路Ｆ２を構成する、分割処理部４０の下流側に配置される配管ｂ２には、接続部位Ｘ２の近傍に開閉バルブＶ２２が設けられている。開閉バルブＶ２２は、分割処理部４０によって分割処理が施された細胞を循環流路Ｆ１内に流出させる場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。

循環流路Ｆ１を構成する配管ａ１には、接続部位Ｘ２の近傍であって接続部位Ｘ２の上流側に開閉バルブＶ１５が設けられている。開閉バルブＶ１５は、培養容器２０から貯留容器３０に細胞および培地等を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。

＜廃液回収容器＞
細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間であって、接続部位Ｘ１よりも上流側（貯留容器３０寄り）に位置する接続部位Ｘ４において、循環流路Ｆ１に接続された配管ｄ１を含んで構成される流路Ｆ４を有する。流路Ｆ４の端部には、廃液回収容器１６が設けられている。廃液回収容器１６は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ４を経由して流路Ｆ４内に流入する廃液を回収するための容器である。廃液回収容器１６に回収される廃液には、使用済みの培地、使用済みの希釈液、細胞供給部１００から凍結状態で供給される細胞に随伴する凍結液等が含まれる。廃液回収容器１６の形態は、特に限定されず、例えば、ガラス製またはステンレス製の容器、プラスチック製のバッグの形態を有する容器を使用することが可能である。

流路Ｆ４を構成する配管ｄ１には、接続部位Ｘ４の近傍において開閉バルブＶ３１が設けられている。開閉バルブＶ３１は、貯留容器３０から流出する廃液を廃液回収容器１６内に回収する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。

＜凍結部＞
細胞培養装置１０は、接続部位Ｘ１において、循環流路Ｆ１に接続された配管ｅ１を含んで構成される流路Ｆ５を有する。流路Ｆ５の端部には、凍結部１７が設けられている。凍結部１７は、循環流路Ｆ１から接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ５内に流入する細胞を凍結液供給部１３０から供給される凍結液とともに収容する保存容器１７ａを有する。保存容器１７ａは、例えば、バイアル、クライオチューブまたはバッグの形態を有するものであってもよい。凍結部１７は保存容器１７ａに収容された細胞および凍結液を凍結させるフリーザを含んで構成され得る。また、凍結部１７は、液体窒素を充填したタンクを備えていてもよく、タンク内に保存容器１７ａを収容し得るように構成されていてもよい。また、凍結部１７は、例えば、太陽日酸社製のクライオライブラリー（登録商標）システムを含んで構成されていてもよい。流路Ｆ５を構成する配管ｅ１には、接続部位Ｘ１の近傍において開閉バルブＶ４１が設けられている。開閉バルブＶ４１は、貯留容器３０から凍結部１７に細胞および凍結液を移送する場合に開状態とされ、それ以外の場合には閉状態とされる。なお、流路Ｆ５と循環流路Ｆ１との接続位置は、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１と間であれば、いかなる位置であってもよい。また、細胞を凍結保存する必要がない場合には、凍結部１７を省略することが可能である。

＜制御部＞
制御部１８は、ポンプＰ１〜Ｐ５、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ガス供給機構２５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を統括的に制御する。これにより、所定の細胞培養プロトコルに沿った細胞の培養が、人手を介在させることなく、自動で実施される。なお、図１において、制御部１８と、制御部１８によって制御される上記の各構成要素との間の電気的な接続配線は、図面の煩雑さを回避する観点から図示を省略している。

なお、培養容器２０は、本発明における培養容器の一例である。培養容器２０の流入口２１は、本発明における第１の流入口の一例である。培養容器２０の流出口２２は、本発明における第１の流出口の一例である。貯留容器３０は、本発明における貯留容器の一例である。貯留容器３０の流入口３１は、本発明における第２の流入口の一例である。貯留容器３０の流出口３２は、本発明における第２の流出口の一例である。循環流路Ｆ１は、本発明における第１の流路の一例である。流路Ｆ２は、本発明における第２の流路の一例である。接続部位Ｘ１は、本発明における第１の部位の一例である。接続部位Ｘ２は、本発明における第２の部位の一例である。分割処理部４０は、本発明における分割処理部の一例である。処理容器４２は、本発明における処理容器の一例である。圧力調整機構４３は、本発明における分割処理部が有する圧力調整機構の一例である。細胞供給部１００は、本発明における細胞供給部の一例である。培地供給部１１０は、本発明における培地供給部の一例である。流路Ｆ３は、本発明における第５の流路の一例である凍結部１７は、本発明における凍結部の一例である。

以下に、本実施形態に係る細胞培養装置１０において実施され得る処理の一例を示す。細胞培養装置１０は、例えば、以下に例示する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理を実施する。なお、以下に説明する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を制御することにより実現される。

＜継代処理＞
細胞培養装置１０は、細胞収容部１０１に収容された細胞を、培地収容部１１１および１１４に収容された培地とともに培養容器２０内に収容して細胞培養を開始する継代処理を以下のようにして実施する。なお、以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が機械的分割処理である場合を例示する。図２は、細胞培養装置１０が継代処理を実施する場合における、細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図２において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ１において、開閉バルブＶ１、Ｖ４およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ１およびＰ４が駆動される。これにより、細胞収容部１０１において凍結状態で収容された細胞および希釈液収容部１２１に収容された希釈液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。

ステップＳ２において、貯留容器３０内に貯留された細胞、細胞に随伴する凍結液および希釈液を含む混合物から凍結液および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。上記の濃縮処理は、例えば、貯留容器３０内に希釈液とともに収容された細胞を、貯留容器３０内において沈降させ（自然沈降）、希釈液および凍結液を含む上澄み液を除去することにより行われる。具体的には、細胞を貯留容器３０内において沈降させた後、開閉バルブＶ１４を短期間開状態とする。これにより、貯留容器３０内に上澄み液を残しつつ、細胞を貯留容器３０から流出させ、配管ａ５内に滞留させる。その後、開閉バルブＶ１４を閉状態とし、開閉バルブＶ３１を開状態とする。これにより貯留容器３０内に残存する希釈液および凍結液を含む廃液が貯留容器３０の流出口３２から流出し、流路Ｆ４を経由して廃液回収容器１６に回収される。なお、貯留容器３０から配管ａ５への細胞の移送および貯留容器３０から廃液回収容器１６への希釈液および凍結液の移送は、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気を加圧することによって行われる。

ステップＳ３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された培地Ａおよび培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂからなる混合培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。

ステップＳ４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ２１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および培地が接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入し、分割処理部４０内に流入する。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において分割処理が施される。なお、ここでの分割処理は、凍結状態とされた細胞を破砕する目的で行われる。

ステップＳ５において、開閉バルブＶ２２およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構４３によって圧力容器４１および処理容器４２内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、培地とともに接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ６において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞および培地が、循環流路Ｆ１を経由して培養容器２０内に流入する。以上のステップＳ１〜Ｓ６の処理を経ることにより、継代処理が完了する。

なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。

＜培地交換処理＞
細胞培養においては、細胞から分泌される代謝物などによって培地が変質する。そのため、培養期間内における適切な時期に、培養容器２０内における使用済みの培地を、新たな培地に交換する培地交換処理が必要とされる。本実施形態に係る細胞培養装置１０は、上記の培地交換処理を、以下のようにして実施する。図３は、細胞培養装置１０が培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図３において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ１１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって培養容器２０内の雰囲気が加圧される。これにより、培養容器２０内に収容された細胞および使用済みの培地が、循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ１２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。

ステップＳ１３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。

ステップＳ１４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および新たな培地が培養容器２０内に流入する。培養容器２０内に収容された細胞は、新たな培地によって培養される。以上のステップＳ１１〜Ｓ１４の処理を経ることにより、培地交換処理が完了する。

＜分割処理（機械的分割処理）＞
例えば、多能性幹細胞の培養においては、細胞を培養することによって生じる細胞塊（スフィア）のサイズが過大となると、細胞塊同士が接着融合し、細胞が分化を開始したり、細胞塊の中心部の細胞が壊死したりするといった問題が生じ得る。従って、細胞塊のサイズが過大となることを防止するために、培養期間中の適切な時期に、細胞塊を分割する分割処理が必要となる場合がある。本実施形態に係る細胞培養装置１０は、上記の分割処理を、以下のようにして実施する。なお、以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が機械的分割処理である場合を例示する。図４は、細胞培養装置１０が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図４において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ２１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって培養容器２０内の雰囲気が加圧され、培養容器２０内に生じた細胞塊および使用済みの培地が、循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ２２において、貯留容器３０内に貯留された細胞塊および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞塊は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。

ステップＳ２３において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞塊と合流する。

ステップＳ２４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ２１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞塊および培地が接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入し、分割処理部４０内に流入する。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において分割処理が施される。

ステップＳ２５において、開閉バルブＶ２２およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構４３によって圧力容器４１内および処理容器４２内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、培地とともに接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ２６において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、貯留容器３０内に貯留された分割処理が施された細胞および新たな培地が、培養容器２０内に流入する。培養容器２０内において、分割処理が施された細胞の培養が継続される。以上のステップＳ２１〜Ｓ２６の処理を経ることにより、分割処理が完了する。

なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。

＜分割処理（酵素処理）＞
図５は、分割処理部４０における分割処理が、上記した細胞解離酵素を用いた酵素処理を含む場合の、細胞培養装置１０が分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図５において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

図５におけるステップＳ３１〜Ｓ３３の処理は、上記したステップＳ２１〜Ｓ２３の処理と同様であるので、重複する説明は省略する。

ステップＳ３４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ２１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞塊および培地が接続部位Ｘ１を経由して流路Ｆ２内に流入し、分割処理部４０内に流入する。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において細胞解離酵素を用いた分割処理が施される。

ステップＳ３５において、開閉バルブＶ２２およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構４３によって圧力容器４１および処理容器４２内の雰囲気が加圧される。これにより、分割処理が施された細胞が、細胞解離酵素を含む培地とともに接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ３６において、開閉バルブＶ４およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ４が駆動される。これにより、希釈液収容部１２１に収容された希釈液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して、貯留容器３０内に流入する。貯留容器３０に収容された細胞および細胞解離酵素を含む培地に希釈液を添加することで、細胞解離酵素による細胞解離作用が停止される。

ステップＳ３７において、貯留容器３０内に貯留された細胞、細胞解離酵素を含む培地および希釈液を含む混合物から細胞解離酵素を含む培地および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、細胞解離酵素を含む培地および希釈液は、廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。

ステップＳ３８において、開閉バルブＶ２、Ｖ３およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ２およびＰ３が駆動される。これにより、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。

ステップＳ３９において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ１１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する分割処理が施された細胞および新たな培地が培養容器２０内に流入する。培養容器２０内において、分割処理が施された細胞の培養が継続される。以上のステップＳ３１〜Ｓ３９の処理を経ることにより、分割処理が完了する。

なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。

＜凍結処理＞
培養された細胞を回収して保存する場合、細胞を保存容器内に回収して凍結保存することが一般的である。本実施形態に係る細胞培養装置１０は、培養された細胞を回収して凍結させる凍結処理を、以下のようにして実施する。図６は、細胞培養装置１０が凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図である。なお、図６において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ４１において、開閉バルブＶ１２、Ｖ１５およびＶ１３が開状態とされる。また、圧力調整機構２６によって培養容器２０内の雰囲気が加圧される。これにより、培養容器２０内に収容された細胞および使用済みの培地が循環流路Ｆ１内に流出し、貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ４２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理は、上記した継代処理のステップＳ２における処理と同様の手順で行われる。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。なお、細胞の沈降を促進させるために、希釈液を貯留容器３０内に導入してもよい。

ステップＳ４３において、開閉バルブＶ５およびＶ６が開状態とされ、ポンプＰ５が駆動される。これにより、凍結液収容部１３１に収容された凍結液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、凍結液は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。

ステップＳ４４において、開閉バルブＶ１４、Ｖ１６およびＶ４１が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。これにより、配管ａ５内に滞留する細胞および凍結液が流路Ｆ５を経由して凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容される。凍結部１７は、保存容器１７ａ内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。以上のステップＳ４１〜Ｓ４４の処理を経ることにより、分割処理が完了する。
なお、細胞を凍結保存する方法として、例えば、特許第４７０５４７３号に記載の方法を適用してもよい。この方法では、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロピレングリコール、アセトアミド及び培地を所定量含む媒体中で、細胞を急速凍結させる工程、を含む。また、特許第４２２３９６１号に記載の方法を適用してもよい。この方法は、所定濃度の、ジメチルスルホキシド、グリセリン、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびポリビニルピロリドンからなる群から選ばれる少なくとも一つを凍結保護剤として含有する凍結保存液を利用した細胞の凍結保存方法であって、細胞を凍結保存液に懸濁する工程と、所定の冷却速度で凍結保存液を−８０℃以下まで冷却し凍結させる冷却工程と、凍結保存液を-８０℃以下で保存する保存工程を含む。

なお、上記の継代処理、培地交換処理および分割処理においては培地供給部１１０から２種類の培地Ａおよび培地Ｂを供給する場合を例示しているが、使用する培地の種類は、細胞の培養プロトコルに応じて適宜変更することが可能である。すなわち、使用する培地は、培養プロトコルに応じて１種類であってもよいし、３種類以上であってもよい。

＜細胞培養処理＞
細胞培養装置１０は、制御部１８が以下に例示する細胞培養処理プログラムを実行することにより、細胞培養を、人手を介在させることなく自動で行うことが可能である。図７は、制御部１８が実行する細胞培養プログラムにおける処理の流れを示すフローチャートである。

ステップＳ１０１において、制御部１８は、上記の継代処理を実行することにより、細胞供給部１００から供給される細胞および培地供給部１１０から供給される培地を培養容器２０内に収容し、細胞培養を開始する。

ステップＳ１０２において、制御部１８は、細胞培養を開始してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理（１回目）を実施することにより、培養容器２０内の使用済みの培地を、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。

ステップＳ１０３において、制御部１８は、１回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の培地交換処理（２回目）を実施することにより、培養容器２０内の使用済みの培地を、培地収容部１１１内および１１４内に収容された新たな培地に交換し、細胞培養を継続する。

ステップＳ１０４において、制御部１８は、２回目の培地交換処理を実施してから所定期間経過後に、上記の分割処理を実施することにより、細胞塊を分割して細胞培養を継続する。

ステップＳ１０５において、制御部１８は、上記のステップＳ１０２〜Ｓ１０４における処理を１サイクルとする培養サイクルのサイクル数が、所定数に達したか否かを判定する。制御部１８は、培養サイクルのサイクル数が所定数に達していないと判定した場合には、処理をステップＳ１０２に戻す。一方、制御部１８は、培養サイクルのサイクル数が所定のサイクル数に達したと判定した場合には、処理をステップＳ１０６に進める。培養サイクルの進行とともに、細胞の培養スケールは増大する。

ステップＳ１０６において、制御部１８は、上記の凍結処理を実施することによって培養された細胞を凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容して凍結保存する

なお、上記の例では、培養サイクルの１サイクル内において、培地交換処理を２回実施しているが、培養サイクルの１サイクル内における培地交換処理の実施回数は、適宜変更することが可能である。

以上の説明から明らかなように、本実施形態に係る細胞培養装置１０は、培養容器２０の流入口２１と流出口２２とを接続する循環流路Ｆ１を有する。また、細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内に設けられた貯留容器３０を有する。貯留容器３０は、培養容器２０の流出口２２に接続された流入口３１および培養容器２０の流入口２１に接続された流出口３２を有する。貯留容器３０は、上記の継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理において実施される濃縮処理等の用に供される。また、細胞培養装置１０は、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間に位置する循環流路Ｆ１内の接続部位Ｘ１と、貯留容器３０の流入口３１と培養容器２０の流出口２２との間に位置する循環流路Ｆ１内の接続部位Ｘ２と、を接続する流路Ｆ２を有する。細胞培養装置１０は、流路Ｆ２内に設けられ、接続部位Ｘ１を経由して循環流路Ｆ１から流入する細胞塊を分割し、分割した細胞塊を、接続部位Ｘ２を経由して循環流路Ｆ１内に流出させる分割処理部４０を有する。また、細胞培養装置１０は、循環流路Ｆ１内に培地を供給する培地供給部１１０を有する。

細胞培養装置１０を上記のように構成することで、培地交換処理や分割処理等の細胞培養において必要とされる一連の処理を閉鎖系において連続的に実施することが可能となる。これにより、均質な細胞の大量生産が可能となる。本実施形態に係る細胞培養装置１０によれば、継代処理から凍結処理までの細胞培養に必要な一連の処理を人手を介在させることなく行うことが可能である。

また、本実施形態に係る細胞培養装置１０によれば、培養容器２０から貯留容器３０への細胞の移送、貯留容器３０から分割処理部４０および培養容器２０への細胞の移送、分割処理部４０から貯留容器３０への細胞の移送は、いずれも圧力調整機構２６、３３および４３による圧送により行われる。これにより、ダイヤフラムポンプ、チューブポンプ、ペリスタリックポンプおよびモーノポンプ等の接液ポンプを用いて細胞の移送を行う場合と比較して細胞に与えるダメージを軽減することができ、細胞の生存率の低下を抑制することが可能となる。なお、本実施形態に係る細胞培養装置１０は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を制御することにより、継代処理から凍結処理までを自動化する場合を例示したが、この態様に限定されるものではない。開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３を、ユーザが手動で操作してもよい。

［第２の実施形態］
図８は、本発明の第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａの構成を示す図である。細胞培養装置１０Ａは、上記した第１の実施形態に係る細胞培養装置１０に攪拌部５０、５１および５２を加えた構成を有する。攪拌部５０、５１および５２は、それぞれ、流入する流体を攪拌する機能を有する。攪拌部５０、５１および５２は、駆動部を有しない所謂スタティックミキサとしての構成を有していることが好ましく、例えば、管状体と、管状体の内部に固定設置され、管状体の内部にらせん状の流路を形成する攪拌エレメントと、を含んで構成され得る。なお、スタティックミキサを構成する管状体の内部の流路は、必ずしもらせん状であることを要しない。スタティックミキサは、管状体の内部を通過する流体を攪拌し得るように、管状体の内部に流路を形成する板状部材が管状体の内部に適宜配置された構造や管状体の内径を部分的に変化させた構造を有するものであってもよい。

攪拌部５０は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間に設けられている。より具体的には、攪拌部５０は、循環流路Ｆ１内において、貯留容器３０の流出口３２と接続部位Ｘ１との間に設けられている。なお、攪拌部５０は、循環流路Ｆ１内において、接続部位Ｘ１と培養容器２０の流入口２１との間に設けられていてもよい。攪拌部５１は、流路Ｆ３内における、培地供給部１１０と細胞供給部１００との間に設けられている。一方、攪拌部５２は、流路Ｆ３における、細胞供給部１００からの配管が接続される部位の下流側に設けられている。

なお、攪拌部５０は、本発明における第１の攪拌部の一例である。攪拌部５１は、本発明における第２の攪拌部の一例である。攪拌部５２は、本発明における第３の攪拌部の一例である。

以下に、第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａにおいて実施され得る継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理について説明する。なお、以下に説明する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１およびＶ４１、ポンプＰ１〜Ｐ５、圧力調整機構２６、３３および４３の動作を制御することにより実現される。

＜継代処理＞
以下において、第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａによる継代処理について説明する。以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が、上記した機械的分割処理である場合を例示する。また、以下の説明において、第１の実施形態に係る継代処理と重複する事項については、適宜省略する。図９は、細胞培養装置１０Ａが継代処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第１の実施形態に係る図２に対応する。なお、図９において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ１において、細胞収容部１０１において凍結状態で収容された細胞および希釈液収容部１２１に収容された希釈液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。細胞および希釈液は、流路Ｆ３内において攪拌部５２を通過することで、攪拌され、混合される。

ステップＳ２において、貯留容器３０内に貯留された細胞、細胞に随伴する凍結液および希釈液を含む混合物から凍結液および希釈液を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理により、凍結液および希釈液は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。

ステップＳ３において、培地収容部１１１および１１４に収容された培地Ａおよび培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。培地Ａおよび培地Ｂは、流路Ｆ３内において攪拌部５１および５２を通過する。培地Ａおよび培地Ｂは、攪拌部５１および５２を通過することで、攪拌され、混合される。浮遊培養においては、培地Ａおよび培地Ｂは、互いに粘度差を有している場合が想定される。培地Ａおよび培地Ｂを攪拌部５１および５２によって攪拌することで、細胞と混合される前に均一な粘度の混合培地を得ることができる。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む混合培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。

ステップＳ４において、配管ａ５内に滞留する細胞および培地が、分割処理部４０内に移送される。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において分割処理が施される。これにより、凍結状態の細胞が分割される。ステップＳ５において、分割処理が施された細胞が培地とともに貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ６において、貯留容器３０内に貯留された細胞および培地が、攪拌部５０を経由して培養容器２０内に流入する。細胞および培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化される。

このように、本実施形態に係る細胞培養装置１０Ａによる継代処理によれば、細胞供給部１００から供給された細胞が、培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０内に収容される。なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。

＜培地交換処理＞
以下において、第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａによる培地交換処理について説明する。なお、以下の説明において、第１の実施形態に係る培地交換処理と重複する事項については、適宜省略する。図１０は、細胞培養装置１０Ａが培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第１の実施形態に係る図３に対応する。なお、図１０において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ１１において、培養容器２０から貯留容器３０内に細胞および使用済みの培地が移送される。ステップＳ１２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。

ステップＳ１３において、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。培地Ａおよび培地Ｂは、流路Ｆ３内において攪拌部５１および５２を通過する。培地Ａおよび培地Ｂは、攪拌部５１および５２を通過することで、攪拌され、混合される。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。

ステップＳ１４において、配管ａ５内に滞留する細胞および新たな培地が、攪拌部５０を経由して培養容器２０内に流入する。細胞および新たな培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化される。このように、本実施形態に係る細胞培養装置１０Ａによる培地交換処理によれば、培養容器２０から取り出された細胞が、新たな培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０内に戻される。

＜分割処理＞
以下において、第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａによる分割処理について説明する。なお、以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が、上記した機械的分割処理である場合を例示する。また、以下の説明において、第１の実施形態に係る分割処理と重複する事項については、適宜省略する。図１１は、細胞培養装置１０Ａが分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第１の実施形態に係る図４に対応する。なお、図１１において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ２１において、培養容器２０から貯留容器３０内に細胞および使用済みの培地が移送される。ステップＳ２２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。

ステップＳ２３において、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して流入口３１から貯留容器３０内に流入する。培地Ａおよび培地Ｂは、流路Ｆ３内において攪拌部５１および５２を通過することで、攪拌され、混合される。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、培地Ａおよび培地Ｂを含む新たな培地は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。

ステップＳ２４において、配管ａ５内に滞留する細胞および培地が、分割処理部４０内に移送され、分割処理部４０内において細胞塊に対する分割処理が施される。ステップＳ２５において、分割処理が施された細胞が培地とともに貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ２６において、貯留容器３０内に貯留された細胞および培地が、攪拌部５０を経由して流入口２１から培養容器２０内に流入する。細胞および培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化される。

このように、本実施形態に係る細胞培養装置１０Ａによる分割処理によれば、培養容器２０から取り出された細胞が、分割処理され、新たな培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０に戻される。なお、上記の例では、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理前に実施しているが、濃縮処理および新たな培地の供給を分割処理後に実施してもよい。

＜凍結処理＞
以下において、第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａによる凍結処理について説明する。なお、以下の説明において、第１の実施形態に係る凍結処理と重複する事項については、適宜省略する。図１２は、細胞培養装置１０Ａが凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第１の実施形態に係る図６に対応する。なお、図１２において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ４１において、培養容器２０から貯留容器３０内に細胞および使用済みの培地が移送される。ステップＳ４２において、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理が実施される。濃縮処理により、使用済みの培地は廃液回収容器１６内に回収され、細胞は、配管ａ５内に滞留する。

ステップＳ４３において、凍結液収容部１３１に収容された凍結液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。凍結液は、流路Ｆ３内において攪拌部５１および５２を通過することで、攪拌される。その後、開閉バルブＶ１４が開状態とされ、凍結液は、貯留容器３０から流出し、配管ａ５内に滞留している細胞と合流する。

ステップＳ４４において、配管ａ５内に滞留する細胞および凍結液が、攪拌部５０および流路Ｆ５を経由して凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容される。細胞および凍結液は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。凍結部１７は、保存容器１７ａ内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。

以上のように、第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａにおいて、攪拌部５０は、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１の間に設けられている。これにより、継代処理、培地交換処理および分割処理において、細胞および培地が、培養容器２０内に収容される直前に攪拌部５０によって攪拌され、混合される。これにより、細胞を、新たな培地内において細胞間の距離を均一化させた状態で培養容器２０に収容することが可能となる。細胞間の距離を均一化することにより、細胞死や細胞分化の原因となる細胞塊同士の融合を抑制することが可能となり、また、細胞塊のサイズや成長速度を均一化することが可能となる。また、細胞を新たな培地内において細胞間の距離を均一化させた状態で培養容器２０に収容することにより、培養容器２０内においては、細胞に対するダメージの原因となる攪拌が不要となるか、または最小限の動力による攪拌で培養環境を整えることができる。従って、本実施形態に係る細胞培養装置１０Ａは、細胞を培地内に浮遊させた状態で静置する静置培養を行う場合に、特に好適に用いることができる。

［第３の実施形態］
図１３は、本発明の第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂの構成を示す図である。細胞培養装置１０Ｂは、上記した第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａに流路Ｆ６、フィルタ部６０およびポンプＰ１０を加えた構成を有する。なお、廃液回収容器１６はフィルタ部６０に接続されている。

流路Ｆ６は、貯留容器３０の流入口３１と流出口３２とを接続する流路であり、接続部位Ｘ５において循環流路Ｆ１に接続された配管ｆ１と、接続部位Ｘ６において循環流路Ｆ１に接続された配管ｆ２と、を含んで構成されている。

フィルタ部６０は、流路Ｆ６内（すなわち、流路Ｆ６の途中）に設けられている。フィルタ部６０は、貯留容器３０から供給される細胞と、培地、希釈液および凍結液等の液体と、を含む混合物から、上記の液体を除去する濃縮処理を行う機能を有する。

フィルタ部６０は、例えば、所謂タンジェンシャルフローフィルタの構成を有していてもよく、フィルタ部６０内において、細胞および培地等の液体を含む混合物が、濾過膜の表面に沿って流れるように構成されている。図１４は、フィルタ部６０によるフィルトレーションの態様の一例を示す図である。フィルタ部６０は、例えば、中空糸からなる濾過膜Ｍを有する。濾過膜Ｍは、多孔質膜であってもよく、濾過膜Ｍの材質は、金属、ポリマーまたはセラミックス焼結体などであってもよい。例えば、濾過膜Ｍをポリマーで構成することにより、ガンマ線滅菌が可能となり、また、シングルユース可能となるため、好ましい。細胞Ｃおよび培地等の液体Ｌを含む混合物が濾過膜Ｍの内側に流入すると、液体Ｌは、濾過膜Ｍの外側に排出されて廃液回収容器１６内に収容される。一方、細胞Ｃは、濾過膜Ｍの内側を通過して貯留容器３０内に回収される。タンジェンシャルフローによるフィルトレーションを行うことで、細胞に与えるダメージを最小限にすることができる。なお、フィルタ部６０は、細胞および培地等を含む混合物の流れ方向が、濾過膜の膜面に対して交差する方向となるデッドエンドフローフィルタの構成を有していてもよい。

流路Ｆ６を構成する配管ｆ２内に配置されたポンプＰ１０は、細胞および培地等を含む混合物を、貯留容器３０からフィルタ部６０に移送する場合およびフィルタ部６０から貯留容器３０に移送する場合に駆動される。

流路Ｆ６を構成する配管ｆ１内には、接続部位Ｘ５の近傍において開閉バルブＶ５１が設けられている。また、流路Ｆ６を構成する配管ｆ２内には、接続部位Ｘ６の近傍において開閉バルブＶ５２が設けられている。開閉バルブＶ５１およびＶ５２は、フィルタ部６０において濃縮処理を実施して細胞を貯留容器３０内に回収するまでの間、開状態とされ、それ以外の場合は閉状態とされる。

なお、流路Ｆ６は、本発明における第３の流路の一例である。フィルタ部６０は、本発明における第１のフィルタ部の一例である。

以下に、第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂにおいて実施され得る継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理について説明する。なお、以下に説明する継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理は、制御部１８が、開閉バルブＶ１〜Ｖ５、Ｖ１１〜Ｖ１６、Ｖ２１、Ｖ２２、Ｖ３１、Ｖ４１、Ｖ５１およびＶ５２、ポンプＰ１〜Ｐ５およびＰ１０、圧力調整機構２６および４３の動作を制御することにより実現される。

＜継代処理＞
以下において、第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂによる継代処理について説明する。以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が、上記した機械的分割処理である場合を例示する。また、以下の説明において、第１の実施形態に係る継代処理と重複する事項については、適宜省略する。図１５は、細胞培養装置１０Ｂが継代処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第１の実施形態に係る図２に対応する。なお、図１５において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ１において、細胞収容部１０１において凍結状態で収容された細胞および希釈液収容部１２１に収容された希釈液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入する。細胞および希釈液は、流路Ｆ３内において攪拌部５２を通過することで、攪拌され、混合される。

ステップＳ２において、開閉バルブ５１および５２が開状態とされ、ポンプＰ１０が駆動される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞、細胞に付随する凍結液および希釈液を含む混合物がフィルタ部６０内に流入する。フィルタ部６０は、細胞、凍結液および希釈液を含む混合物から凍結液および希釈液を除去する濃縮処理を行う。凍結液および希釈液は、廃液回収容器１６内に回収され、濃縮処理が施された細胞は、貯留容器３０内に回収される。

ステップＳ３において、培地収容部１１１および１１４に収容された培地Ａおよび培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入し、貯留容器３０内に貯留された細胞と合流する。培地Ａおよび培地Ｂは、攪拌部５１および５２を通過することで、攪拌され、混合される。

ステップＳ４において、貯留容器３０内に貯留された細胞および培地が、攪拌部５０を経由して分割処理部４０内に移送される。分割処理部４０内に流入した細胞は、処理容器４２内において分割処理が施される。これにより、凍結状態の細胞が分割される。ステップＳ５において、分割処理が施された細胞が培地とともに貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ６において、貯留容器３０内に貯留された細胞および培地が、攪拌部５０を経由して培養容器２０内に流入する。細胞および培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞供給部１００から供給された細胞が、培地内において細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０に収容される。

なお、上記の例では、フィルタ部６０における濃縮処理を１回のみとしているが、必要に応じて、細胞および使用済みの培地を含む混合物を貯留容器３０とフィルタ部６０との間で繰り返し循環させることにより、濃縮処理の実施回数を２回以上としてもよい。また、上記の例では、フィルタ部における濃縮処理および新たな培地の供給を、分割処理前に実施しているが、フィルタ部における濃縮処理および新たな培地の供給を、分割処理後に実施してもよい。

＜培地交換処理＞
以下において、第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂによる培地交換処理について説明する。なお、以下の説明において、第１の実施形態に係る培地交換処理と重複する事項については、適宜省略する。図１６は、細胞培養装置１０Ｂが培地交換処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第１の実施形態に係る図３に対応する。なお、図１６において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ１１において、培養容器２０から細胞および使用済みの培地が貯留容器３０内に移送される。ステップＳ１２において、開閉バルブ５１および５２が開状態とされ、ポンプＰ１０が駆動される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物が、フィルタ部６０内に流入する。フィルタ部６０は、細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器１６内に回収され、濃縮処理が施された細胞は、貯留容器３０内に回収される。

ステップＳ１３において、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入し、貯留容器３０内に貯留された細胞と合流する。培地Ａおよび培地Ｂは、攪拌部５１および５２を通過することで、攪拌され、混合される。

ステップＳ１４において、貯留容器３０に貯留された細胞および新たな培地が、攪拌部５０を経由して培養容器２０内に流入する。細胞および新たな培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞は、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０内に収容される。

なお、上記の例では、フィルタ部６０における濃縮処理を１回のみとしているが、必要に応じて、細胞および使用済みの培地を含む混合物を貯留容器３０とフィルタ部６０との間で繰り返し循環させることにより、濃縮処理の実施回数を２回以上としてもよい。

＜分割処理＞
以下において、第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂによる分割処理について説明する。以下の説明では、分割処理部４０における分割処理が、上記した機械的分割処理である場合を例示する。また、以下の説明において、第１の実施形態に係る分割処理と重複する事項については、適宜省略する。図１７は、細胞培養装置１０Ｂが分割処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第１の実施形態に係る図４に対応する。なお、図１７において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ２１において、培養容器２０から細胞および使用済みの培地が貯留容器３０内に移送される。ステップＳ２２において、開閉バルブ５１および５２が開状態とされ、ポンプＰ１０が駆動される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物が、フィルタ部６０内に流入する。フィルタ部６０は、細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器１６内に回収され、濃縮処理が施された細胞は、貯留容器３０内に回収される。

ステップＳ２３において、培地収容部１１１および１１４に収容された新たな培地Ａおよび新たな培地Ｂが、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入し、貯留容器３０内に貯留された細胞と合流する。培地Ａおよび培地Ｂは、攪拌部５１および５２を通過することで、攪拌され、混合される。

ステップＳ２４において、貯留容器３０内に貯留された細胞および新たな培地は、分割処理部４０内に移送され、分割処理部４０内において細胞塊に対する分割処理が施される。ステップＳ２５において、分割処理が施された細胞が、培地とともに貯留容器３０内に移送される。

ステップＳ２６において、貯留容器３０内に貯留された細胞および培地が、攪拌部５０を経由して培養容器２０内に流入する。細胞および培地は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。これにより、細胞は、培地内に浮遊する細胞間の距離が均一化された状態で培養容器２０内に収容される。

なお、上記の例では、フィルタ部６０における濃縮処理を１回のみとしているが、必要に応じて、細胞および使用済みの培地を含む混合物を貯留容器３０とフィルタ部６０との間で繰り返し循環させることにより、濃縮処理の実施回数を２回以上としてもよい。また、上記の例では、フィルタ部における濃縮処理および新たな培地の供給を、分割処理前に実施しているが、フィルタ部における濃縮処理および新たな培地の供給を、分割処理後に実施してもよい。

＜凍結処理＞
以下において、第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂによる凍結処理について説明する。なお、以下の説明において、第１の実施形態に係る凍結処理と重複する事項については、適宜省略する。図１８は、細胞培養装置１０Ｂが凍結処理を実施する場合における細胞および培地等の流れを示す図であり、第１の実施形態に係る図６に対応する。なお、図１８において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ４１において、培養容器２０から細胞および使用済みの培地が貯留容器３０内に移送される。ステップＳ４２において、開閉バルブ５１および５２が開状態とされ、ポンプＰ１０が駆動される。これにより、貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物が、フィルタ部６０内に流入する。フィルタ部６０は、細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去する濃縮処理を行う。使用済みの培地は、廃液回収容器１６内に回収され、濃縮処理が施された細胞は、貯留容器３０内に回収される。

ステップＳ４３において、凍結液収容部１３１に収容された凍結液が、流路Ｆ３および循環流路Ｆ１を経由して貯留容器３０内に流入し、貯留容器３０内に貯留された細胞と合流する。凍結液は、攪拌部５１および５２を通過することで、攪拌される。

ステップＳ４４において、貯留容器３０に貯留された細胞および凍結液が、攪拌部５０および流路Ｆ５を経由して凍結部１７の保存容器１７ａ内に収容される。細胞および凍結液は、攪拌部５０を通過することで、攪拌され、混合される。凍結部１７は、保存容器１７ａ内に収容された細胞を凍結液とともに凍結させる。

なお、上記の例では、フィルタ部６０における濃縮処理を１回のみとしているが、必要に応じて、細胞および使用済みの培地を含む混合物を貯留容器３０とフィルタ部６０との間で繰り返し循環させることにより、濃縮処理の実施回数を２回以上としてもよい。

以上のように、第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂにおいては、細胞および培地等を含む混合物を、フィルタ部６０に通過させることにより濃縮処理が行われる。従って、細胞を貯留容器３０内で沈降させる沈降処理が不要となる。従って、第１および第２の実施形態に係る細胞培養装置１０および１０Ａと比較して、濃縮処理の効率化を図ることが可能となる。

［第４の実施形態］
図１９は、本発明の第４の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｃの構成を示す図である。細胞培養装置１０Ｃは、第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂに第２の貯留容器３５および第２のフィルタ部６１を加えた構成を有する。また、第２のフィルタ部６１には、廃液回収容器１９が接続されている。なお、細胞培養装置１０Ｃにおける第１の貯留容器および第１のフィルタ部６０は、第３の実施形態に係る貯留容器３０およびフィルタ部６０に相当する。

第２の貯留容器３５は、第１の貯留容器３０と同じ構成を有し、流入口３６および流出口３７を有する。第２の貯留容器３５の流入口３６は、接続部位Ｘ７において循環流路Ｆ１に接続された配管ｇ１を介して第１の貯留容器３０の流入口３１に接続されている。流路Ｆ７は、第２の貯留容器３５の流入口３６と流出口３７とを接続する流路であり、配管ｈ１およびｈ２を含んで構成されている。

第２のフィルタ部６１は、流路Ｆ７内（すなわち、流路Ｆ７の途中）に設けられている。第２のフィルタ部６１は、第１のフィルタ部６０と同様、第２の貯留容器３５から供給される細胞と細胞に随伴する培地等の液体とを含む混合物から上記液体を除去する濃縮処理を行う機能を有する。第２のフィルタ部６１は、第１のフィルタ部６０と同様、タンジェンシャルフローフィルタの構成を有するものであってもよい。第２のフィルタ部６１から排出された培地等の廃液は、廃液回収容器１９に回収される。

流路Ｆ７を構成する配管ｈ１には、接続部位Ｘ７の近傍において開閉バルブＶ６１が設けられている。また、流路Ｆ７を構成する配管ｈ２には、第２の貯留容器３５の流出口３７の近傍において開閉バルブＶ６２が設けられている。

また、本実施形態に係る細胞培養装置１０Ｃは、第１の貯留容器３０および第１のフィルタ部６０から細胞および培地等を含む混合物を移送する手段としてポンプは使用されず、第１の貯留容器３０が備える圧力調整機構３３が使用される。同様に、第２の貯留容器３５および第２のフィルタ部６１から細胞および培地等を含む混合物を移送する手段としてポンプは使用されず、第２の貯留容器３５が備える圧力調整機構３８が使用される。

なお、第１の貯留容器３０は、本発明における第１の貯留容器の一例である。第２の貯留容器３５は、本発明における第２の貯留容器の一例である。第２の貯留容器３５の流入口３６は、本発明における第３の流入口の一例である。第２の貯留容器３５の流出口３７は、本発明における第３の流出口の一例である。第２のフィルタ部６１は、本発明における第２のフィルタ部の一例である。流路Ｆ７は、本発明における第４の流路の一例である。圧力調整機構３３は、本発明における第１の貯留容器が有する第１の圧力調整機構の一例である。圧力調整機構３８は、本発明における第２の貯留容器が有する第２の圧力調整機構の一例である。

本実施形態に係る細胞培養装置１０Ｃは、第１の貯留容器３０と第１のフィルタ部６０とを含んで構成される第１の濃縮処理ユニットと、第２の貯留容器３５と第２のフィルタ部６１とを含んで構成される第２の濃縮処理ユニットとを交互に使用することによって濃縮処理を連続的に行うことが可能である。

以下に、第４の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｃによる濃縮処理について説明する。以下の説明では、一例として、培地交換処理の中で行われる濃縮処理を例示する。図２０は、本実施形態に係る細胞培養装置１０Ｃが濃縮処理を実施する場合における細胞および培地の流れを示す図である。なお、図２０において、細胞および培地等の流れと、以下に示す各処理ステップとの対応が示されている。

ステップＳ５１において、培養容器２０から細胞および使用済みの培地が第１の貯留容器３０内に移送される。ステップＳ５２において、開閉バルブ５１および５２が開状態とされる。また、圧力調整機構３３によって第１の貯留容器３０内の雰囲気が加圧される。一方、圧力調整機構３８によって第２の貯留容器３５内の雰囲気は大気に解放される。これにより、第１の貯留容器３０内の気圧が上昇し、第１の貯留容器３０内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物は、第１のフィルタ部６０内に流入する。第１のフィルタ部６０による濃縮処理によって細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地の一部が除去され、廃液回収容器１６内に回収される。その後、細胞および残存する使用済みの培地を含む混合物は、配管ｇ１を経由して第２の貯留容器３５内に流入する。

ステップＳ５３において、開閉バルブＶ６１およびＶ６２が開状態とされる。また、圧力調整機構３８によって第２の貯留容器３５内の雰囲気が加圧される。一方、圧力調整機構３３によって第１の貯留容器３０内の雰囲気は大気圧に開放される。これにより、第２の貯留容器３５内の気圧が上昇し、第２の貯留容器３５内に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物は、第２のフィルタ部６１内に流入する。第２のフィルタ部６１による濃縮処理によって細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地の一部が除去され、廃液回収容器１９内に回収される。その後、細胞および残存する使用済みの培地を含む混合物は、配管ｇ１を経由して第１の貯留容器３０内に流入する。

その後、必要に応じて、ステップＳ５２およびＳ５３の処理が繰り返し実施される。これにより、細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地が除去される。濃縮処理が施された細胞は、ステップＳ５４において第１の貯留容器３０内に貯留される。

以上の説明では、培地交換処理の中で行われる濃縮処理を例示したが、上記の濃縮処理は、継代処理、分割処理および凍結処理の中で行われる濃縮処理に適用することも可能である。

第４の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｃによれば、濃縮処理は、第１のフィルタ部６０および第２のフィルタ部６１において行われるので、細胞を貯留容器内で沈降させる沈降処理が不要となる。また、細胞培養装置１０Ｃによれば、第１の濃縮処理ユニットと第２の濃縮処理ユニットとを交互に使用して濃縮処理を行うので、第１の濃縮処理ユニットと第２の処理ユニットとの間での細胞および培地等の移送を、圧力調整機構３３および３８による圧送により行うことが可能となる。従って、接液ポンプを使用することなく濃縮処理を行うことが可能となり、接液ポンプを使用する場合と比較して細胞に対するダメージを軽減することが可能である。なお、本実施形態では、第１の濃縮処理ユニットと第２の濃縮処理ユニットを交互に使用する場合を例示したが、第１の濃縮処理ユニットと第２の濃縮処理ユニットとを同時に使用してもよい。すなわち、この場合、第１の濃縮処理ユニットと第２の濃縮処理ユニットにおいて濃縮処理が並行して行われる。

［第１の変形例］
上記第１〜第４の実施形態に係る細胞培養装置の構成に対して様々な変形が可能である。

図２１は、第１の変形例に係る細胞培養装置１０Ｄの構成を示す図である。細胞培養装置１０Ｄは、培養容器２０から貯留容器３０に細胞および培地を移送する手段として、ポンプＰ２０を有する。

例えば、培養容器２０がプラスチック製のバッグの形態を有する場合には、容器本体の耐圧性能に起因して、圧力調整機構２６によって培養容器２０の内部雰囲気を加圧することが困難となり得る。ポンプＰ２０は、このように培養容器２０の内部雰囲気の加圧が困難である場合に適用され得る。

ポンプＰ２０は、図２１に示すように、循環流路Ｆ１内における培養容器２０の流出口２２と接続部位Ｘ２との間に配置されることが好ましい。細胞は、分割処理部４０における分割処理によってダメージを受けていると考えられる。また、分割処理の直後に細胞に更なるダメージを与えると、細胞の生存率が低下するおそれがある。すなわち、分割処理後の細胞がポンプを経由することによりダメージが蓄積され、細胞の生存率が低下するおそれがある。本変形例に係る細胞培養装置１０Ｄによれば、ポンプＰ２０が培養容器２０の流出口２２と接続部位Ｘ２との間に配置されているので、分割処理部４０において分割処理が施された細胞は、ポンプを経由することなく培養容器２０内に収容される。

なお、図２１においては、ポンプＰ２０を、第２の実施形態に係る細胞培養装置１０Ａに適用した場合が示されているが、第１、第３および第４の実施形態に係る細胞培養装置１０、１０Ｂおよび１０Ｄに適用することも可能である。

［第２の変形例］
図２２は、第２の変形例に係る細胞培養装置１０Ｅの構成を示す図である。細胞培養装置１０Ｅは、第３の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂにおけるフィルタ部６０を、遠心沈降部７０に置き換えた構成を有する。

遠心沈降部７０は、フィルタ部６０と同様、細胞および使用済みの培地等の液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う機能を有する。遠心沈降部７０は、細胞と培地等の液体との比重差を利用して細胞と培地等の液体とを遠心分離させ、培地等の液体を廃液回収容器１６に排出する。

なお、遠心沈降部７０とフィルタ部６０とを併設し、これらを選択的に使用できる構成としてもよい。また、第４の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｃにおける第１のフィルタ部６０および第２のフィルタ部６１をそれぞれ遠心沈降部７０に置き換えてもよい。

［第３の変形例］
図２３は、第３の変形例に係る細胞培養装置１０Ｆの構成を示す図である。細胞培養装置１０Ｆは、循環流路Ｆ１および流路Ｆ２を構成する各配管の構成が上記した第１〜第４の実施形態に係る細胞培養装置１０、１０Ａ〜１０Ｃと異なる。

細胞培養装置１０Ｆにおいて、培養容器２０の流入口２１と流出口２２とを接続する循環流路Ｆ１は、配管ａ１〜ａ７および配管ｂ５を含んで構成されている。培養容器２０、貯留容器３０および攪拌部５０は、循環流路Ｆ１内に設けられている。

流路Ｆ２は、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流出口３２と培養容器２０の流入口２１との間に位置する接続部位Ｘ１１と、循環流路Ｆ１内における、貯留容器３０の流入口３１と培養容器２０の流出口２２との間に位置する接続部位Ｘ１２と、を接続する配管ｂ３〜ｂ６を含んで構成されている。循環流路Ｆ１内を流れる細胞および培地等は、接続部位Ｘ１１を経由して流路Ｆ２内に流入することが可能である。また、流路Ｆ２内を流れる細胞および培地等は、接続部位Ｘ１２を経由して循環流路Ｆ１内に流入することが可能である。分割処理部４０は、流路Ｆ２内に設けられている。

なお、循環流路Ｆ１は、本発明における第１の流路の一例である。流路Ｆ２は、本発明における第２の流路の一例である。接続部位Ｘ１１は、本発明における第１の部位の一例である。接続部位Ｘ１２は、本発明における第２の部位の一例である。

細胞培養装置１０Ｆによれば、上記した第１および第２の実施形態に係る細胞培養装置１０および１０Ａと同様の継代処理、培地交換処理、分割処理および凍結処理を行うことが可能である。細胞培養装置１０Ｆにおける配管構成を、第３および第４の実施形態に係る細胞培養装置１０Ｂおよび１０Ｃに適用することも可能である。

１０、１０Ａ〜１０Ｆ 細胞培養装置
１７ 凍結部
２０ 培養容器
２１ 流入口
２２ 流出口
３０ 貯留容器、第１の貯留容器
３１ 流入口
３２ 流出口
３３、３８、４３ 圧力調整機構
３５ 第２の貯留容器
３６ 流入口
３７ 流出口
４０ 分割処理部
４２ 処理容器
５０〜５２ 攪拌部
６０ フィルタ部、第１のフィルタ部
６１ 第２のフィルタ部
１００ 細胞供給部
１１０ 培地供給部
Ｆ１ 循環流路Ｆ１
Ｆ２〜Ｆ７ 流路
Ｘ１〜Ｘ６、Ｘ１１、Ｘ１２ 接続部位

Claims (16)

1. 第１の流入口および第１の流出口を有する、細胞を培養するための培養容器と、
   前記第１の流出口と前記第１の流入口とを接続する第１の流路と、
   前記第１の流路内に設けられ、前記培養容器で培養される細胞を貯留するための貯留容器であって、前記第１の流出口に接続された第２の流入口および前記第１の流入口に接続された第２の流出口を有する第１の貯留容器と、
   前記第２の流出口と前記第１の流入口との間に位置する前記第１の流路内の第１の部位と、前記第２の流入口と前記第１の流出口との間に位置する前記第１の流路内の第２の部位と、を接続する第２の流路と、
   前記第２の流路内に設けられ、前記第１の部位を経由して前記第１の流路から流入する、前記培養容器で培養された細胞の塊である細胞塊を分割する分割処理を行い、前記分割処理が施された細胞を前記第２の部位を経由して前記第１の流路内に流出させる分割処理部と、
   前記第１の流路内に培地を供給する培地供給部と、
   を含む細胞培養装置。
2. 前記第１の流路内において、前記第２の流出口と前記第１の流入口との間に設けられ、流入する流体を攪拌する第１の攪拌部を更に含む
   請求項１に記載の細胞培養装置。
3. 前記第１の攪拌部は、スタティックミキサを含む
   請求項２に記載の細胞培養装置。
4. 前記第２の流入口と前記第２の流出口とを接続する第３の流路内に設けられ、前記第２の流出口から流出する細胞および細胞に随伴する液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う第１のフィルタ部を更に含む
   請求項１から請求項３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
5. 前記第１のフィルタ部はタンジェンシャルフローフィルタを含む
   請求項４に記載の細胞培養装置。
6. 第３の流出口と、前記第２の流入口に接続された第３の流入口と、を含む第２の貯留容器と、
   前記第３の流入口と前記第３の流出口とを接続する第４の流路内に設けられ、前記第３の流出口から流出する細胞および細胞に随伴する液体を含む混合物から液体を除去する濃縮処理を行う第２のフィルタ部と、
   を更に含む請求項４または請求項５に記載の細胞培養装置。
7. 前記第２のフィルタ部はタンジェンシャルフローフィルタを含む
   請求項６に記載の細胞培養装置。
8. 前記第１のフィルタ部による濃縮処理と、前記第２のフィルタ部による濃縮処理を交互に行う請求項６または請求項７に記載の細胞培養装置。
9. 前記第１の貯留容器の内部の圧力を調整する第１の圧力調整機構と、
   前記第２の貯留容器の内部の圧力を調整する第２の圧力調整機構と、
   を更に含む請求項６から請求項８のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
10. 前記分割処理部は、前記分割処理を行うための処理容器と、前記処理容器の内部の圧力を調整する圧力調整機構と、を有する
    請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
11. 前記培地供給部と前記第１の流路とを接続する第５の流路内に設けられ、流入する流体を攪拌する第２の攪拌部を更に含む
    請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
12. 前記第１の流路に前記培養容器で培養される細胞を供給する細胞供給部を更に含む
    請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
13. 前記第５の流路における前記第２の攪拌部の下流側に接続され、前記培養容器で培養される細胞を前記第５の流路を経由して前記第１の流路に供給する細胞供給部と、
    前記第５の流路における前記細胞供給部が接続される部位の下流側に設けられ、流入する流体を攪拌する第３の攪拌部と、
    を更に含む請求項１１に記載の細胞培養装置。
14. 前記第２の流出口と前記第１の流入口との間に位置する前記第１の流路内の第３の部位に接続された、細胞を凍結させる凍結部を更に含む、
    請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
15. 前記培養容器の内部の圧力を調整する圧力調整機構を更に含む
    請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載の細胞培養装置。
16. 請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の細胞培養装置を用いた細胞培養方法であって、
    前記培養容器内で細胞の培養に使用された使用済みの培地を新たな培地に交換する培地交換処理と、
    前記培養容器で細胞を培養することによって形成された細胞塊を分割する分割処理と、を含み、
    前記培地交換処理は、
    前記培養容器で培養された細胞を使用済みの培地とともに前記第１の貯留容器に貯留するステップと、
    前記第１の貯留容器に貯留された細胞および使用済みの培地を含む混合物から使用済みの培地を除去するステップと、
    前記第１の貯留容器に貯留された細胞に新たな培地を前記培地供給部から供給するステップと、
    細胞および新たな培地を含む混合物を前記培養容器に収容するステップと、を含み、
    前記分割処理は、
    前記培養容器内において形成された細胞塊を前記分割処理部において分割するステップと、
    前記分割処理部において細胞塊を分割する前若しくは後に前記培養容器内で細胞の培養に使用された使用済みの培地を新たな培地に交換するステップと、
    分割された細胞および新たな培地を含む混合物を前記培養容器に収容するステップと、を含む
    細胞培養方法。