JP2019097392A - 細胞培養容器及び細胞培養装置 - Google Patents
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Description
(1)線径が100μm〜2000μm、目開きが50μm〜2000μmであるメッシュシートが収納された細胞培養容器。
(2)前記メッシュシートの開口率が20〜65%である(1)に記載の細胞培養容器。
(3)前記メッシュシートは合成樹脂および/またはガラス繊維である(1)または(2)に記載の細胞培養容器。
(4)前記メッシュシートは編物、織物、交点溶着シート、回転押出成形シートからなる群から選ばれる1種以上である(1)〜(3)のいずれかに記載の細胞培養容器。
(5)前記メッシュシートは螺旋および/または多層に巻回された状態で容器内に収納されている(1)〜(4)のいずれかに記載の細胞培養容器。
(6)前記メッシュシートの充填率が20〜55%である(1)〜(5)のいずれかに記載の細胞培養容器。
(7)(1)〜(6)のいずれかに記載の細胞培養容器を含む細胞培養装置。
本発明において、メッシュシートの素材については、細胞をメッシュシート表面に保持できる構造をとることができるものであればよく、合成樹脂でも天然繊維でもよい。合成樹脂としては、例えば、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、フッ素系樹脂、ポリアミド等の水不溶性の樹脂が好適に利用できる。また、綿、麻、竹、紙などの植物性繊維、羊毛、絹などの動物性繊維など、天然繊維を用いることもできる。また、合成樹脂製繊維と天然繊維とを混紡してもよい。さらに、ガラス繊維やカーボンでもよく、アルミナ(Al2O3)などのセラミックス系、さらにステンレス、鋼、アルミニウム、金、プラチナなどの金属も使用できる。また、これらの素材に化学的に修飾を加えたものであっても良く、例えば、親水化処理されていてもよい。親水化処理することにより、メッシュシート表面への細胞の接着が容易になる。また、使用する細胞に応じて、メッシュシートへの接着性向上のため、コラーゲンやフィブロネクチン等をコーティングしたものでも良い。
開口率(%)=(目開き/(目開き+線径))2×100
本発明において、細胞培養容器は、例えば、筒状容器に1枚または複数枚のメッシュシートを螺旋または円筒形に巻いたものを格納することにより簡単に作製することができる。このような細胞培養容器は、容積あたりの培養面積を中空糸膜タイプほどではないが大きくすることができるため好ましい。また、培養操作も簡便化することが出来、効率よく細胞培養を実施することが出来る。図1は、本発明の第1の実施態様を示す模式図であって、複数枚のメッシュシートを円筒状に巻いたものを内挿した細胞培養容器を表している。また、図2は、本発明の第2の実施態様を示す模式図であって、1枚のメッシュシートを螺旋状に巻いたものを内挿した細胞培養容器を表している。
充填率(%)=メッシュシートの線径×幅/ケース断面積(内径基準)×100
図5は、本発明の細胞培養装置の一例である。図5において、6は、培養液貯留容器(培養バッグなど)である。培養液貯留容器6からは、流路管を経由して、細胞培養容器2の入口ポート5に、流路が接続され、培養液貯留容器6に入っている培養液が細胞培養容器2の内腔側に移送できるようになっている。細胞培養容器2の内腔側からは、送液ポンプ7を経由して、廃液回収容器8まで流路管が接続され、細胞培養容器2を通過した培養液が廃棄できるようになっている。なお、前記流路に設けられた送液ポンプ7により、培養液貯留容器6から細胞培養容器2への液体(培養液など)の供給および/または前記細胞培養容器2からの前記液体の排出、さらには前記液体の廃棄などにおける流速等を制御することができる。
本発明において、培養の対象となる細胞は、特に限定されるものではないが、接着性の動物細胞が好適である。細胞の由来も特に限定されず、ヒト、ブタ、イヌ、マウス等のいずれの動物由来のものも使用できる。また、接着性の動物細胞は、初代培養細胞及び株化細胞の双方を対象とすることができる。また、表皮角化細胞、血管内皮細胞、繊維芽細胞、肝細胞などのプライマリー細胞や、さらに胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪前駆細胞、肝幹細胞などの幹細胞、前駆細胞でもよい。また、これらの細胞は、培養前に外来遺伝子を導入した細胞であってもよいし、抗体やリガンドなどの刺激因子などで予め刺激、加工されている細胞であっても良い。
本発明において、メッシュシートを用いて細胞を培養する場合には、前述の細胞培養容器を用い、出入口の一方から細胞を懸濁した液を容器内に流入させることにより、細胞を播種することが出来る。一定時間静置し、細胞を容器表面に接着させた後に、インキュベーター内に設置した細胞培養容器に、連続的あるいは断続的に培養液を送液することにより細胞を培養、増殖させることが出来る。培養液は、細胞に必要な養分や酸素・二酸化炭素などのガスを供給する役割を有する。培養に用いられる培地は、培養細胞の種類に応じて決定され、当該細胞の培地として通常用いられるものであればよい。
本発明において、細胞培養における培養液、特に細胞培養容器内を流れる培養液の流速については、厳密に制御することが好ましい。培養液は連続的に流しても良いし、断続的に流しても構わないが、流速が遅すぎると、細胞への栄養供給が十分になされず、細胞が増殖しにくくなる。逆に、流速が速すぎても、細胞周囲の環境変化が激しく、細胞が周りの環境に馴染めず、細胞が増殖しにくくなる。このように、細胞培養容器内を流れる培養液の流速は、細胞増殖度合いや環境に応じて、調整することが好ましい。細胞増殖度合いを調べる方法は、特に限定されないが、培養液中のグルコースや乳酸塩の濃度等の測定結果をもとに行うことが出来る。
メッシュシートを用いて培養した細胞を回収するための手段を例を挙げて説明する。例えば、細胞培養容器を用い、メッシュシート表面において細胞を培養した場合には、培養液の灌流を停止した後、モジュール内の培養液を除去するため、二価陽イオンフリーのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を一定時間灌流させ、培養液を充分PBSに置換する。次に、PBSを除去し、トリプシン等のプロテアーゼを容器内へ充填し、一定時間インキュベートして培養細胞をメッシュシート表面から剥離させた後、培養液などを容器内へ流入させることにより、細胞を回収することが出来る。
メッシュシートをNikon製顕微鏡(ECLIPSE LV100)のステージに設置した後、CCDカメラ(DS−Ri1)および画像処理装置(DIGITAL SIGHT DS−U2)を用いてメッシュシートの撮影および画像の取り込みを行った。得られた画像について、画像解析ソフト(NIS Element D3.00 SP6)を用い、前記解析ソフトの計測機能を用いて測定することでメッシュシートの線径および網目(空隙部)の面積を算出した。各5点測定し、それらの平均値を線径および網目の面積とした。また、得られた網目の面積を正方形と仮定して一辺の長さを算出し、目開きとした。また、前記線径および目開きより、下記式にて開口率を算出した。
開口率(%)=(目開き/(目開き+線径))2×100
充填率は、メッシュシートの線径と幅より求めたメッシュシートの断面積とケース内径基準の断面積との関係より以下の式により求める。
充填率(%)=メッシュシートの線径×幅/ケース断面積(内径基準)×100
細胞培養容器からの細胞を含む回収液は、遠心分離操作により最終的に1mlの培養液に懸濁した。この懸濁液とトリパンブルー染色液を1:1で混和した液を血球計算盤に添加し、顕微鏡下で細胞数の計測を行った。
1.血球計算盤およびカバーガラスの表面を70%イソプロパノールで洗浄し、余分なイソプロパノールをふき取り風乾する。
2.注射用蒸留水でカバーガラスの側面を濡らし、血球計算盤に貼りつける。
3.細胞懸濁液をパスツールピペット等でよく撹拌後、すぐに血球計算盤に流し込み、溝の上まで満たす。
4.1〜3の操作を別の血球計算盤を使用して行う(2回測定し平均をとる)。
5.顕微鏡に血球計算盤を置き、グリッドラインに焦点を合わせる(10×対物レンズ)。
6.カウンターを用いて1mm2エリアの細胞数を速やかに計測する。
※誤差が生じやすいので正確に数えるためには少なくとも100〜500細胞を計測する。
計算法:
C=N×104
C:1ml当たりの細胞数
N:計測した細胞数の平均
104:1mm2に対する容量の変換値
全体の数=C×V
V=細胞を懸濁した液体の容量
(メッシュシートの準備)
ポリプロピレン製の交点融着タイプのメッシュシート(ハギテック社、型番:PP−#16)を、幅29mm、長さ80mmに切ったものを5枚用意した。これを超純水で洗浄した後、0.05%ウシコラーゲン溶液に20分間浸した後、クリーンベンチ内で自然乾燥させた。その後、超純水ですすぎ、再びクリーンベンチ内で自然乾燥させた。
細胞培養容器を以下のように作製した。
前述のメッシュシート5枚を重ねた状態で巻き、内径14mm、長さ10cmの円筒状のポリカーボネート製ケース内に入れた。このようにして、図1に示すような形状の細胞培養容器を作製し、滅菌処理を行った。
前記培養液貯留容器6内の培養液に、プライマリーのヒト間葉系幹細胞(Cell Applications,Inc.製)を懸濁し、ポンプ7を起動して細胞培養容器内に播種して2時間静置し、メッシュシート表面に細胞を接着させた。細胞播種密度は2000cells/cm2となるように調整した。培養液貯留容器6を培養液のみの容器に交換した後、流量を150μl/minとして灌流を開始した。本細胞培養実験は、CO2インキュベーター内で37℃、7日間行った。
7日間培養後、培養液灌流を停止し、細胞培養容器内にて増殖した細胞を回収した。即ち、培養液の灌流を停止した後、容器内に存在する培養液を除去するため、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を一定時間灌流させ、培養液を充分PBSに置換した。次に、PBSを除去し、0.25%トリプシン溶液(ライフテクノロジーズ社製)を細胞培養容器内へ静かに充填し、室温で15分間インキュベートした。この後、ウシ胎児血清を10%(v/v)添加したダルベッコ改変イーグル培地を細胞培養容器内へ流し入れ、反対側より培養液と共に流し出した細胞を回収した。回収した細胞について、生細胞数を計測した。結果を表1に示す。
ポリプロピレン製のメッシュシート(ハギテック社、型番:PP670)1枚(幅145mm、長さ80mm)をらせん状に巻き、内径11mm、長さ10cmのケースに収納して図2に示されるような細胞培養容器を作製した。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
外径13mmの多孔管の周りにポリエチレン製のメッシュシート(ハギテック社、型式2553−3068−13)1枚(幅145mm、長さ80mm)をらせん状に巻きつけ、内径18mm、長さ10cmのケースに収納して図3に示されるような細胞培養容器を作製した。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。なお、本実施態様において、入口ポートから導入された培養液は、多孔管の穴から容器内に分配されるようになっている。また、容器断面積は多孔管を除いた部分の断面積に基づいてメッシュシートの充填率を算出した。
ポリアミド性のメッシュシート(ハギテック社、型番PA−149μ)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径9mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
フッ素樹脂製のメッシュシート(ハギテック社、型番PFA−144μm)を用いて実施例4と同様にして細胞培養容器を作製した。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
ポリエチレンテレフタレート製のメッシュシート(セミテック社、型番PET158−HD)を用いて実施例4と同様にして細胞培養容器を作製した。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
ポリアミド性のネトロンシート(ハギテック社、型番D6−910)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径16mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
セラミック製のメッシュシート(ハギテック社、型式2553−2506−04)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径20mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
ガラス繊維製のメッシュシート(ハギテック社、型式2552−9822−03)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径20mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
ポリ塩化ビニリデン製のメッシュシート(ハギテック社、型番B−24)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径27mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
セラミック製のネトロンシート(ハギテック社、型番#9)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径16mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
ポリアミド製のネトロンシート(ハギテック社、型番BS1−300)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径27mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
ポリプロピレン製のメッシュシート(ハギテック社、型番PP2145)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径14mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
ポリアミド製のメッシュシート(ハギテック社、型番PA−91μ)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径9mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
ポリアミド製のメッシュシート(ハギテック社、型番PA−25μ)を用いて実施例2と同様にして細胞培養容器を作製した。なお、ケースは内径9mmのものを用いた。得られた細胞培養容器を用いて実施例1と同様の実験を行った。結果を表1に示す。
2 培養容器
3 多孔管
4 ケース
5a、5b ポート
6 培養液貯留容器
7 送液ポンプ
8 廃液回収容器
Claims (7)
- 線径が100μm〜2000μm、目開きが50μm〜2000μmであるメッシュシートが収納された細胞培養容器。
- 前記メッシュシートの開口率が20〜65%である請求項1に記載の細胞培養容器。
- 前記メッシュシートは合成樹脂および/またはガラス繊維である請求項1または2に記載の細胞培養容器。
- 前記メッシュシートは編物、織物、交点溶着シート、回転押出成形シートからなる群から選ばれる1種以上である請求項1〜3のいずれかに記載の細胞培養容器。
- 前記メッシュシートは螺旋および/または多層に巻回された状態で容器内に収納されている請求項1〜4のいずれかに記載の細胞培養容器。
- 前記メッシュシートの充填率が20〜55%である請求項1〜5のいずれかに記載の細胞培養容器。
- 請求項1〜6のいずれかに記載の細胞培養容器を含む細胞培養装置。
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JP2017227868A JP7009957B2 (ja) | 2017-11-28 | 2017-11-28 | 細胞培養容器及び細胞培養装置 |
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Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2023504607A (ja) * | 2019-12-25 | 2023-02-06 | セスコ バイオエンジニアリング カンパニー リミテッド | 細胞バイオマス産生のための担体およびそれを含む細胞培養デバイス |
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JPS62122586A (ja) * | 1985-06-18 | 1987-06-03 | イエダ リサ−チ アンド デベロツプメント コンパニ− リミテツド | 細胞培養に使用するマトリツクス |
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JP2011239756A (ja) * | 2010-05-21 | 2011-12-01 | Mitsubishi Rayon Co Ltd | 細胞培養用モジュール |
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- 2017-11-28 JP JP2017227868A patent/JP7009957B2/ja active Active
Patent Citations (3)
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Title |
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BIOMATERIALS, vol. 35, JPN6021036777, 2 October 2013 (2013-10-02), pages 259 - 268, ISSN: 0004597789 * |
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