KR20170061723A

KR20170061723A - 접착성 세포의 배양 방법

Info

Publication number: KR20170061723A
Application number: KR1020177014232A
Authority: KR
Inventors: 요코 에지리; 사토루 아야노; 마사야 호소다; 고 다자키
Original assignee: 주식회사 쿠라레
Priority date: 2011-09-20
Filing date: 2012-09-20
Publication date: 2017-06-05
Also published as: US20200239854A1; US20140227784A1; CN103814125B; JP6313043B2; KR20140069148A; EP2759592A4; EP2759592A1; CN103814125A; WO2013042360A1; JPWO2013042360A1; CA2848875C; US10655107B2; CA2848875A1

Abstract

이차원 배양과 동일한 배양 방법으로 생체 내에 가까운 환경하에서 접착성 세포를 평가할 수 있기 위한 방법, 및 그 용도를 제공한다. 접착성 세포의 배양 방법은, 배양 용기 (10) 로서 상당 직경 (D) 이 원하는 스페로이드 직경의 1 내지 5 배이며, 높이 (H) 가 상기 상당 직경의 0.3 배 내지 5 배인 배양 공간 (11) 을 2 개 이상 배치함과 함께, 표면의 수접촉각이 45 도 이하인 용기를 사용한다. 배양 용기 (10) 에 배치된 복수의 배양 공간 (11) 각각에서 접착성 세포의 스페로이드를 배양한다.

Description

접착성 세포의 배양 방법{ADHERENT CELL CULTURE METHOD}

본 발명은 종래의 이차원 배양 (평면 상의 배양) 과 동일한 조작으로 이차원 배양에서는 불가능하던 균일한 사이즈의 접착성 세포의 스페로이드를 배양하는 방법에 관한 것이다.

최근, 세포 배양 기술에 의해 배양한 세포가 약제의 약효 시험이나 독성 시험에 이용되게 되었다. 그러나, 종래의 배양 기술로 배양한 세포는, 세포가 이차원 방향으로 퍼져 생체 내와 크게 상이한 형상을 하고 있다. 이 때문에, 본래의 세포 기능을 갖고 있지 않아, 약의 생체 내에서의 거동을 반영할 수 없다는 문제가 있었다.

그래서, 최근 생체 내의 조직 형태를 모방한 스페로이드 배양법이 주목받게 되었다. 예를 들어, 96 멀티 웰 플레이트의 저면을 깔때기 형상으로 하여 그 안에 1 개의 스페로이드를 형성시키는 방법이 개시되어 있다 (특허문헌 1). 또 배양 저면에 미세한 허니콤 구조체를 형성시킴으로써, 세포의 기재 (機材) 에 대한 접착성을 약화시킴으로써 스페로이드를 형성시키는 수법 (특허문헌 2) 이나, 외인성의 세포 응집제를 사용하는 방법 (특허문헌 3) 등을 들 수 있다.

일본 특허 제2716646호 일본 공개특허공보 2002-335949호 일본 공개특허공보 2008-22743호

그러나, 특허문헌 1 의 배양 방법에서는, 하나의 용기 내에 1 개의 스페로이드를 부유시킨 상태로 형성시킨다. 이 방법에서는, 배지 교환시에 세포가 탈리되기 쉽기 때문에, 배지 교환시의 조작이 번잡해진다는 문제가 있다. 아울러, 하나의 용기 내에 1 개의 스페로이드를 형성시키기 때문에, 예를 들어 6, 12, 24, 384 웰 플레이트, 혹은 플라스크 형상의 용기에 적용하기는 곤란하였다.

또, 특허문헌 2, 3 의 배양 방법에서는, 상기 서술한 배양 플레이트나 플라스크 형상의 용기에 적용할 수 있는 한편, 스페로이드의 크기를 제어할 수 없다. 이 때문에, 균일한 직경을 갖는 스페로이드를 제조할 수 없다는 문제가 있다.

이와 같이, 종래의 배양 방법에서는, 시판되고 있는 웰 플레이트나 플라스크 형상의 용기에 적용하기에는 한계가 있거나, 혹은 적용할 수 있다고 하더라도 스페로이드의 직경을 제어하기가 곤란하였다. 그 때문에, 각종 배양 용기의 형상에 적용이 가능하고, 또한 스페로이드의 크기를 제어함으로써, 균일한 직경을 갖는 접착성 세포의 스페로이드를 배양할 수 있는 새로운 방법이 요구되었다.

본 발명에 관련된 접착성 세포의 배양 방법의 일 양태는, 배양 용기로서 상당 직경이 원하는 스페로이드 직경의 1 내지 5 배이며, 높이가 상기 상당 직경의 0.3 배 내지 5 배인 배양 공간을 2 개 이상 배치함과 함께, 그 배양 공간 표면의 수접촉각이 45 도 이하인 용기를 선택한다. 선택한 배양 용기에 배치된 복수의 배양 공간 각각에서 접착성 세포의 스페로이드를 배양한다. 배양하고자 하는 스페로이드의 사이즈에 따른 배양 공간이 형성된 배양 용기를 사용함으로써, 배양하는 스페로이드의 사이즈를 제어한다. 이로써, 원하는 사이즈의 스페로이드를 얻을 수 있다.

본 발명에 관련된 접착성 세포의 배양 방법의 일 양태에 있어서, 배양 공간의 상당 직경이 100 ㎛ 내지 5000 ㎛ 의 범위인 것이 바람직하다. 아울러, 이웃하는 배양 공간을 사이에 둔 벽의 두께가 5 ㎛ 내지 50 ㎛ 의 범위인 것이 바람직하고, 이웃하는 상기 배양 공간을 사이에 둔 벽의 상면과 측면이 이루는 각도가 90 도 내지 135 도의 범위인 것이 바람직하다.

또, 배양한 스페로이드 전체 중 60 ％ 이상이, 배양 후의 스페로이드 직경의 평균치의 플러스마이너스 5 ％ 의 범위 내의 직경인 것이 바람직하고, 스페로이드가 암 세포인 것이 바람직하다.

또한, 배양 용기가 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지, 및 실리콘 수지 중 하나 또는 이들의 조합으로 이루어지는 수지 성형품인 것이 바람직하다.

아울러, 배양 공간의 표면이, 유리 처리에 의해 또는 플라즈마 처리에 의해 관능기를 형성시킴으로써, 수접촉각을 45 도 이하가 되도록 처리된 것이 바람직하다.

더 나아가, 배양 공간의 표면에, 온도, 광 중 어느 것에 의해 친수성과 소수성이 변화되는 폴리머가 코트되어 있는 것, 세포 접착을 저해하는 친수성 폴리머 사슬이 고정화되어 있는 것, 및 인 지질 또는 인 지질·고분자 복합체가 고정화되어 있는 것 중 어느 것이 실시되고 있는 것이 바람직하다.

본 발명에 의해, 종래의 이차원 배양과 동일한 조작으로 균일한 사이즈의 접착성 세포의 스페로이드를 고밀도로 배양할 수 있다.

도 1 은 본 발명의 실시형태에 관련된 배양 용기의 구성예를 나타내는 도면이다.
도 2 는 도 1 에 나타내는 배양 용기의 II-II 선을 따른 단면도이다.
도 3 은 배양 플레이트의 웰 내에 본 실시형태의 배양 용기를 형성한 구성예를 설명하는 개략도이다.
도 4 는 배양 공간에서 스페로이드를 배양하는 상태를 나타내는 개략도이다.
도 5a 는 배양 공간의 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 5b 는 배양 공간의 또 다른 형상예를 나타내는 도면이다.
도 6a 는 배양 공간의 다른 측면의 형상예를 나타내는 단면도이다.
도 6b 는 배양 공간의 또 다른 측면의 형상예를 나타내는 단면도이다.
도 6c 는 배양 공간의 또 다른 측면의 형상예를 나타내는 단면도이다.
도 7 은 실시예 1 의 결과를 나타내는 사진이다.
도 8 은 실시예 2 의 결과를 나타내는 사진이다.
도 9 는 비교예 1 의 결과를 나타내는 사진이다.
도 10 은 비교예 2 의 결과를 나타내는 사진이다.
도 11 은 실시예 3 의 결과를 나타내는 사진이다.

이하, 도면을 참조하여 본 발명의 실시형태에 대하여 설명한다. 단, 본 발명이 이하의 실시형태로 한정되는 것은 아니다. 설명을 명확하게 하기 위해, 이하의 기재 및 도면은 적절히 생략 및 간략화가 이루어져 있다. 각 도면에 있어서 동일한 구성 또는 기능을 갖는 구성 요소 및 상당 부분에는 동일한 부호를 부여하고, 그 설명은 생략한다.

도 1 에 본 발명의 실시형태에 관련된 배양 용기의 구성예를 나타낸다. 도 2 에 도 1 의 II-II 선을 따른 단면도를 나타낸다.

배양 용기 (10) 는, 배양 공간 (11) 과 벽 (12) 과 저부 (13) 를 갖는다.

배양 공간 (11) 은, 벽 (12) 과 저부 (13) 로 칸막이된 영역으로, 세포를 배양하는 삼차원의 공간 영역 (배양 영역) 이 된다. 배양 공간 (11) 은 간단히 「공간」또는 「마이크로 공간」이라고도 칭한다.

벽 (12) 은, 배양 공간 (11) 을 칸막이하는 격벽으로, 배양 용기 (10) 에 요철 패턴을 형성하는 볼록부라고도 할 수 있다.

저부 (13) 는, 배양 용기 (10) 의 기판으로서 기능함과 함께, 배양 공간 (11) 이 배치되는 측의 표면은 배양 영역 (배양 표면) 의 일부가 된다.

도 1, 2 에서는, 배양 용기 (10) 에 있어서의 배양 공간 (11) 에 관해서, 상당 직경 (D), 높이 (H), 벽 (12) 의 폭 (W) (두께), 및 저부 (13) 의 두께 (T) 를 나타낸다. 도 1, 2 에서는, 저부 (13) 는 벽 (12) 과 일체적으로 제작된 경우를 나타내고 있다.

상당 직경 (D) 은, 배양 공간 (11) 에 내접하는 내접원의 직경을 가리킨다. 보다 상세하게는, 상당 직경 (D) 은 배양 공간 (11) 의 저부 (13) 와 평행한 면의 형상 (정면의 형상), 바꾸어 말하면, 배양 공간 (11) 의 높이 (H) 의 방향과 수직이 되는 면의 형상의 내접원의 직경을 가리킨다. 배양 공간 (11) 의 정면의 형상이 높이 (H) 에 따라 상이한 경우, 접착성 세포를 배양하는 공간 영역의 최대치의 상당 직경을 상당 직경으로 한다.

높이 (H) 는, 배양 공간 (11) 의 바닥에서 벽 (12) 의 상면까지의 길이로, 배양 공간 (11) 의 깊이라고도 할 수 있다. 또, 배양 저면이 평면인 경우에는 높이 (H) 는 벽 (12) 의 높이와 동일하다. 벽 (12) 의 폭 (W) 은, 인접하는 배양 공간 (11) 사이의 거리라고도 할 수 있다.

발명자들은, 상당 직경 (D) 이 원하는 스페로이드 직경의 1 ∼ 5 배이며, 높이 (H) (깊이) 가 상당 직경 (D) 의 0.3 배 ∼ 5 배인 배양 공간 (11) 을 복수 가짐과 함께, 그 배양 공간 표면의 수접촉각이 45 도 이하인 배양 용기 (10) 를 사용하여, 각 배양 공간 (11) 에서 접착성 세포를 배양함으로써, 균일한 직경의 접착성 세포의 스페로이드를 배양할 수 있음을 알아내었다. 따라서, 원하는 스페로이드의 크기에 따라, 배양 용기 (10) 에 배치되는 배양 공간 (11) 의 크기를 선택함으로써, 배양하는 스페로이드의 크기를 제어하는 것이 가능해진다.

도 3 은, 배양 플레이트의 웰 내에 본 실시형태의 배양 용기를 형성한 구성예를 설명하는 개략도이다. 배양 플레이트 (1) 는, 복수의 웰 (21) 이 형성되고, 이웃하는 웰 (21) 끼리는 칸막이부 (22) 에 의해 격리된다. 각 웰 (21) 은, 배양 용기 (10) 에 대응하고, 복수의 배양 공간 (11) 과 벽 (12) 을 포함한다.

각 웰 (21) 내, 바꾸어 말하면, 배양 용기 (10) 내에 있어서 복수의 배양 공간 (11) 은 도 1 에 나타내는 바와 같이 어레이상으로 배치된다. 각 웰 (21) 에 포함되는 배양 공간 (11) 의 수는, 배양 플레이트에 제작되는 웰 (21) 의 수 (웰 (21) 의 크기) 와 배양 공간 (11) 및 벽 (12) 의 크기에 의존하는 것이다. 도 3 에서는, 구성을 설명하기 위한, 배양 공간 (11) 의 수를 줄여서 나타낸 개략도로, 각 웰 (21) 에 포함되는 배양 공간 (11) 의 수는 실제와는 상이하다. 아울러, 도 1, 2 에서는 9 개의 배양 공간 (11) 을 나타내고 있다. 이는 설명을 위해서 나타낸 것으로, 실제의 배양 용기 (10) (웰 (21)) 에 포함되는 배양 공간 (11) 의 수에 대응하는 것은 아니다.

도 1 ∼ 3 을 참조하여, 원하는 스페로이드를 형성시키기 위한 마이크로 오더의 배양 공간 (11) 의 형상, 크기의 일례와, 배양 표면의 친수화 처리 방법, 배양 방법을 상세하게 설명한다.

배양 공간 (11) 의 상당 직경에 대하여, 스페로이드의 크기가 세포가 증식함에 따라 그 직경이 커지는 것을 고려할 필요가 있다. 여기서 중요한 것은, 스페로이드가 이웃하는 배양 공간 (11) 의 세포와 접촉하지 않는 배양 공간 (11) 을 확보하는 것이다. 따라서, 배양 공간 (11) 의 상당 직경 (D) 은, 원하는 스페로이드 직경의 1 ∼ 5 배의 범위가 바람직하고, 1.5 ∼ 3 배의 범위가 보다 바람직하다.

본 발명의 배양 방법의 일 양태에서는, 직경 100 ㎛ 의 접착성 세포의 스페로이드를 형성시키기 위해서, 원하는 스페로이드 직경의 1 ∼ 5 배의 범위, 즉 상당 직경 (D) 이 100 ∼ 500 ㎛ 의 범위이고, 높이 (H) 가 상당 직경의 0.3 ∼ 5 배의 범위의 배양 공간 (11) 이 규칙적으로 배치되어 있는 저부 (13) 를 갖는 배양 용기 (10) 를 사용한다.

예를 들어, 접착성 세포인 암 세포를 배양하는 경우를 검토한다. 비특허문헌 1 (Juergen Friedrich 등 저, "Spheroid-based drug screed : considerations and pracitical approach", Nature Protocols vol.4 No.3 2009, pp309-324) 에 의하면, 접착성 세포를 약물의 스크리닝에 사용하는 경우, 증식한 암 세포는, 작은 것으로는 200 ㎛, 최대의 스페로이드 사이즈로는, 유래하는 장기에 따라 다양하여 1000 ㎛ 이상으로 증식하는 것도 있다. 아울러, 생체 내에 있어서의 종양에 특징적인 종양 중심에서 일어나는 이차적인 세포사 (細胞死) 와 유사한 현상은, 500 ㎛ ∼ 600 ㎛ 의 스페로이드에서 볼 수 있다. 이들로부터 배양 공간 (11) 의 상당 직경은 200 ㎛ ∼ 4000 ㎛ 의 범위가 바람직하고, 500 ㎛ ∼ 3000 ㎛ 의 범위가 보다 바람직하다.

배양 공간 (11) 의 높이 (H) 에 대하여, 본 발명의 배양 공간 (11) 은 일반적인 배양 방법에서 사용하는 공간에 비하여 깊은 공간을 사용한다. 구체적으로는, 일반적인 배양 방법에서는, 접착성 세포는 배양 공간 (11) 의 표면과의 세포 접착성을 강화시킴으로써 증식·유지시키고 있다. 이 배양 방법에서는, 아미노산이나 산소 공급성을 높이기 위해서, 본 실시형태와 같은 배양 공간 (11) 의 상당 직경 (D) 이 원하는 스페로이드 직경의 1 ∼ 5 배의 범위, 높이 (H) 가 상당 직경 (D) 의 0.3 ∼ 5 배의 범위와 같은 깊은 공간에서는 배양되지 않는다.

한편, 본 발명에서는 후술하는 바와 같이 세포 접착성을 억제하고 있기 때문에, 아미노산이나 산소 등의 공급이 가능하고, 또한 스페로이드가 탈리되지 않는 최적인 높이 (H) 를 설계할 필요가 있다. 배양 공간 (11) 에 관해서, 다양한 높이 (H), 상당 직경 (D) 을 검토한 결과, 배양 공간 (11) 의 높이 (H) 의 최적인 범위는, 배양 공간 (11) 의 상당 직경 (D) 의 0.3 배 ∼ 5 배의 범위이며, 0.5 ∼ 2 배의 범위가 보다 바람직한 것을 알아내었다. 그 이유의 하나는, 배양 공간 (11) 의 높이 (H) 는 배지 교환시에 스페로이드가 배양 공간 (11) 으로부터 탈리되지 않으면 되고, 또한 배지 중에 포함되는 아미노산이나 산소 공급 영양분을 충분히 실시하기 위해서 공간의 깊이는 얕을수록 바람직하기 때문이다.

벽 (12) 의 폭 (W) 은, 배양 공간 (11) 과 인접하는 배양 공간 (11) 을 사이에 둔 벽 (12) 의 두께이다. 따라서, 벽 (12) 의 폭 (W) 은, 벽 (12) 의 상면에서의 세포 증식을 방지하기 위해, 또한 세포가 배양 공간 (11) 내에 들어가기 쉽게 하기 위해 5 ∼ 50 ㎛ 의 범위가 양호하고, 바람직하게는 세포체 1 개 이하의 크기, 즉 5 ∼ 30 ㎛ 의 범위가 바람직하고, 5 ∼ 10 ㎛ 의 범위가 보다 바람직하다. 또한, 동일한 관점에서, 벽 (12) 의 상면과 배양 공간 (11) 의 측면이 이루는 각 (θ) 은 90 ∼ 135 도의 범위가 바람직하고, 90 도 ∼ 120 도의 범위가 보다 바람직하다.

도 4 에, 배양 공간 (11) 에서 스페로이드를 배양하는 상태를 나타내는 개략도를 나타낸다. 도 4 에서는, 도 2 에 나타내는 단면도를 이용하여, 스페로이드 (9) 를 ○ 표시로 나타낸다. 스페로이드 (9) 는, 복수의 배양 공간 (11) 각각에 있어서 배양된다.

도 3 에 나타내는 배양 플레이트 (1) 에서 배양하는 경우, 웰 (21) 마다 배양 조건의 설정, 배지의 교환 등을 실시하게 된다. 그 때문에, 각 웰 (21) 에 복수의 배양 공간 (11) 을 형성하는 것이 가능하기 때문에, 동일 조건으로 복수의 스페로이드를 배양하는 것이 가능해진다. 아울러, 웰 플레이트를 이용하여 스페로이드를 배양할 수 있기 때문에, 종래의 세포 배양에서 사용하는 장치 등을 이용하는 것이 가능해진다.

스페로이드 (9) 의 직경 (DSP) 을 값 dsp (dsp 는 양의 수치) 로 하면, 배양 공간 (11) 의 상당 직경 (D) 은 값 dsp 에서 값 dsp 의 5 배의 범위 (dsp ≤ D ≤ 5 dsp) 가 된다. 또, 배양 공간 (11) 의 높이 (H) 는, 값 dsp 의 0.3 배에서 값 dsp 의 25 배 (5 × 5) 의 범위 (0.3 dsp ≤ H ≤ 25 dsp) 가 된다.

배양 공간 (11) 의 형상 (정면의 형상), 혹은 저부 (13) 와 평행한 면의 형상은, 도 1 에 나타내는 형상으로 한정되는 것은 아니고, 예를 들어 도 5a ∼ 5b 에 나타내는 바와 같은 형상이어도 되고, 그 밖의 형상 (타원이나 능형 등) 이어도 된다. 보다 고밀도로 균일한 직경을 갖는 스페로이드를 형성시키기 위해서는, 좌우 대칭 구조인 것이 바람직하다.

배양 공간 (11) 의 측면의 형상은 도 2 에 나타내는 원주상으로 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 도 6a ∼ 6c 에 나타내는 바와 같은 형상이어도 된다.

배양 용기 (10) 를 구성하는 재료로는, 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지, 및 실리콘 수지 중 하나 또는 이들의 조합에서 선택된다.

배양 용기 (10) 의 저부 (13) 의 두께 (T) 는, 관찰성의 관점에서 1 ㎜ 이하가 바람직하다. 단, 현미경에 의한 관찰에 지장을 초래하지 않는 한 1 ㎜ 이상이어도 되고, 저부 (13) 의 두께 (T) 를 한정하는 것은 아니다. 배양 용기의 저부 (13) 의 관찰성을 확보함으로써, 배양 플레이트를 그대로 이용하여, 배양한 스페로이드를 관찰하는 것이 가능해진다.

다음으로 배양 표면의 특성에 대하여 설명한다. 배양 표면은, 각 배양 공간 (11) 내에 배지를 넣기 위해, 또 코팅 용액을 사용하는 경우에는, 그 용액이 배양 공간 (11) 내로 비집고 들어가야 표면을 덮을 수 있기 때문에, 수접촉각을 45 도 이하로 하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 0 도 ∼ 20 도의 범위이다. 또, 수접촉각의 값은, 배양 공간 (11) 과 벽 (12) 의 요철 패턴이 형성되어 있지 않은 평판을, 배양 용기 (10) 와 동일 조건으로 제작하여 측정한 값을 전제로 한다.

배양 공간 (11) 을 어레이상으로 배치한 표면에 관해서, 당해 표면의 소수성이 높아 수접촉각이 45 도를 초과하면, 즉 젖음성이 낮은 경우에는, 배지나 코트 용액을 첨가했을 때, 공간에 기포가 들어가기 쉬워져 세포를 배양할 수 없는 공간이 생기는 경우가 있다. 그 때문에, 수접촉각이 45 도 이하가 되도록 친수화를 실시하는 것이 필요하다. 친수화하는 방법으로는, SiO₂ 를 증착하는 방법이나, 플라즈마 처리를 실시하는 방법을 들 수 있다.

또한, 스페로이드의 형성률을 향상시키기 위해서, 세포 접착성을 억제하는 것이 바람직하다. 세포 접착성을 억제하기 위해서는, 수접촉각이 45 도 이하, 바람직하게는 40 도 이하, 보다 바람직하게는 20 도 이하가 되는 바와 같은 표면을 사용함으로써 가능해진다. 세포 접착성을 억제하는 것과 수접촉각의 관계에 대해서는, 예를 들어 비특허문헌 1 (Y Ikada 저, "Surface modification of polymers for medical applications", Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp725-736) 에 기재되어 있다.

수접촉각을 45 도 이하로 하는 방법으로는, 유리를 배양 저면에 증착하는 방법, 플라즈마 처리법을 이용하여 표면에 관능기를 형성시키는 방법을 들 수 있다. 플라즈마 처리 등에 의해 표면에 관능기를 형성시키거나, 또는 광이나 온도에 의해 친수·소수성을 제어할 수 있는 폴리머를 코트하는 방법을 사용할 수 있다. 또한, 인 지질·고분자 복합체를 코트해도 된다. 상기 서술한 표면 처리를 실시한 후, 폴리에틸렌글리콜이나 인 지질-고분자 복합체 등의 친수성 폴리머를 고정화시켜도 된다.

실시예

이하에, 본 발명에 관련된 세포 배양 방법의 실시예에 대하여 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1, 2, 비교예 1]

1. 배양 용기의 제작

실시예 1, 2 및 비교예 1 에 대하여, 도 1, 2 에 나타내는 배양 공간 (11) 이 규칙적으로 배열되어 있는 배양 용기 (10) 로서, 이하의 상당 직경 (D), 폭 (W), 및 높이 (H) 의 패턴을 포토리소그래피에 의해 제작하고, Ni 전해 도금을 실시하여 대응하는 요철 형상을 갖는 금형을 얻었다.

·실시예 1 : D = 100 ㎛, W = 20 ㎛, H = 50 ㎛ (H/D = 0.5)

·실시예 2 : D = 200 ㎛, W = 20 ㎛, H = 100 ㎛ (H/D = 0.5)

·비교예 1 : D = 200 ㎛, W = 20 ㎛, H = 50 ㎛ (H/D = 0.25)

실시예 1, 2, 비교예 1 은, 그 금형을 이용하여 핫 엠보스 성형에 의해 폴리스티렌 상에 요철 패턴 형상의 전사를 실시하여, 상기 치수의 수지 기재를 제작하였다. 그 수지 기재 표면에 진공 증착에 의해 이산화규소막을 100 ㎚ 형성시킨 필름을 제작하고, 폴리스티렌제의 저면이 없는 24 웰 플레이트에 레이저 용착법으로 필름을 첩부 (貼付) 한 후, γ 선 멸균을 실시하였다. 이와 같이 하여, 각 웰에 복수의 배양 공간 (11) 을 갖는 배양 용기 (10) 를 형성한 24 웰의 배양 플레이트를 제작하였다.

비교예 2 는, 시판되는 (벡톤·디킨슨 제조, 팔콘 (등록상표)) γ 선 멸균이 완료된 평면상의 24 웰 배양 플레이트를 사용하였다. 비교예 2 는, 평면상으로 배양하는 종래의 이차원 배양이 된다.

모든 배양 플레이트는 수접촉각이 45 도 이하였다. 수접촉각은, 자동 접촉각 측정 장치 OCA20 (에이코 정기 주식회사 제조) 을 이용하여 측정하였다. 실시예 1, 2, 및 비교예 1 의 배양 플레이트에 대해서는, 배양 공간 (11) 을 형성하는 요철 패턴이 없는 평판의 플레이트를 동일 조건으로 제작하여 수접촉각을 측정하였다. 비교예 2 에 대해서는, 육안으로 분명하게 수접촉각이 45 도 이하인 것을 확인할 수 있었다.

2. 세포 배양 및 관찰

모든 배양 플레이트의 웰에 1 vol％ MPC 용액을 300 ㎕ 넣고, 4 ℃ 에서 24 시간 방치한 후, 아스피레이터로 용액을 빨아들여 완전히 건조시킨 배양 플레이트를 사용하였다.

세포는 Human HT29 Colon Cancer (DS 파머 바이오메디컬사) 를 사용하였다.

배양 플라스크 (CORNIGN 사 제조) 를 이용하여, 37 ℃, 5 vol％ CO₂ 인큐베이터 내에서 소정의 세포수까지 증식시켰다. 배지는 10 vol％ 소 태아 혈청 (FBS : Fetal Bovine Serum) 을 함유하는 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) (SIGMA 사 제조) 배지를 사용하였다. 배양 플라스크(CORNIGN 사 제조) 로, 5 vol％ CO₂ 인큐베이터 내에서 소정의 세포수까지 증식시켰다. 증식시킨 세포를 0.25 vol％ 트립신 용액을 이용하여 배양 저면으로부터 박리하고, 원심 분리법으로 세포를 회수하였다. 회수한 세포를, 10 vol％ 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배양액을 넣고, 세포 농도가 500,000 개/㎠ 가 되도록 세포를 파종하였다. 그 후, 세포를 37 ℃, 5 vol％ CO₂ 인큐베이터 내에서 24 시간 배양하였다.

세포 배양 후, 도립 현미경을 이용하여 관찰을 실시하였다.

관찰 결과에 대하여, 스페로이드 형성률 (A), 스페로이드 직경 평균 (D_Av), 및 스페로이드 직경의 평균치 ±5 ％ 의 직경의 스페로이드의 비율 (B) 을 이하의 계산식을 이용하여 계산하였다. 계산 결과를 표 1 에 나타낸다.

·스페로이드 형성률 A (％) =

(스페로이드의 개수) × 100/(도립 현미경으로 관찰한 1 시야의 공간의 수)

·스페로이드 직경 평균 D_Av (㎛) =

(각 스페로이드 직경의 합계치)/(스페로이드 전체의 수)

·스페로이드 직경의 평균치 ±5 ％ 의 직경의 스페로이드의 비율 B (％) =

(평균치 ±5 ％ 의 직경의 스페로이드의 수) × 100/(스페로이드 전체의 수)

실시예 1			실시예 2			비교예 1			비교예 2
A	D_AV	B	A	D_AV	B	A	D_AV	B	A	D_AV	B
79 ％	41 ㎛	61 ％	100 ％	65 ㎛	73 ％	33 ％	73 ㎛	8 ％	스페로이드 형성되지 않음

도 7 ∼ 10 에, 실시예, 비교예의 조건으로 배양한 스페로이드를 도립 현미경으로 촬영한 사진을 나타낸다.

[실시예 3]

1. 배양 용기의 제작

도 1, 2 에 나타내는 배양 공간 (11) 이 규칙적으로 배열되어 있는 배양 용기 (10) 로서, 이하의 상당 직경 (D), 폭 (W), 및 높이 (H) 의 패턴을 포토리소그래피에 의해 제작하고, Ni 전해 도금을 실시하여 대응하는 요철 형상을 갖는 금형을 얻었다.

D = 200 ㎛, W = 200 ㎛, H = 100 ㎛ (H/D = 0.5)

실시예 3 에서는, 이 금형과 96 웰 플레이트를 사용한 것을 제외하고 실시예 1, 2 와 동일한 방법으로 배양 플레이트를 제작하여, 96 웰의 배양 플레이트를 얻었다.

2. 세포 배양 및 관찰

모든 배양 플레이트의 웰에, 배양 표면을 마이크로파 플라즈마 처리 후, 인산 완충액으로 세정한 후, 0.01 vol％ MPC 용액으로 코트하였다. 클린 벤치 내에서 실온하에서 24 시간 방치하여 MPC 용액을 건조시켰다.

세포는 HepG2 를 사용하였다.

배지는 10 vol％ 소 태아 혈청을 함유하는 DMEM 배양액을 사용하였다. 배양 방법은 실시예 1, 2 와 동일하다.

도 11 에 실시예 3 의 결과를 나타낸다. 도 11 의 사진에 나타내는 바와 같이, HepG2 를 배양한 경우에도 배양 용기 (10) 내에 스페로이드가 형성되어 있는 것이 관찰된다.

또한, 본 발명은 상기 실시형태에 한정된 것은 아니고, 취지를 일탈하지 않는 범위에서 적절히 변경하는 것이 가능하다.

이 출원은 2011년 9월 20일에 출원된 일본 특허출원 2011-204796 을 기초로 하는 우선권을 주장하고, 그 개시의 전부를 여기에 도입한다.

1 배양 플레이트
9 스페로이드
10 배양 용기
11 배양 공간
12 벽
13 저부
21 웰
22 칸막이부

Claims

상당 직경이 원하는 스페로이드 직경의 1 내지 5 배이며, 높이가 상기 상당 직경의 0.3 배 내지 5 배인 배양 공간을 2 개 이상 배치함과 함께, 그 배양 공간 표면의 수접촉각이 45 도 이하인 배양 용기를 사용하고, 복수의 배양 공간에서 접착성 세포의 스페로이드를 배양하는, 접착성 세포의 배양 방법으로서,
상기 스페로이드는 단면이 원형이고,
상기 배양 공간의 저면은 평면이고,
이웃하는 상기 배양 공간을 사이에 둔 벽의 높이가, 상기 배양 공간의 상기 높이와 동일하고,
상기 배양 공간의 저면과 상기 벽이 이루는 각도는 90 도 이고,
상기 벽의 측면과 상기 저면으로 구획되는 상기 배양 공간의 형상은 주상 (柱狀) 이고,
상기 배양 공간의 상당 직경이 100 ㎛ 내지 5000 ㎛ 의 범위이고,
상기 배양 공간의 표면은, 유리 처리에 의한, 또는 플라즈마 처리에 의한 관능기의 형성에 의해, 수접촉각이 45 도 이하가 되도록 처리되어 있고,
상기 수접촉각이 45 도 이하가 된 표면에는, 친수성 폴리머에 의해 코트되어 있는, 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항에 있어서,
상기 배양 공간의 상당 직경이 원하는 스페로이드의 상기 직경의 1.5 내지 3 배인, 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 벽의 두께가 5 ㎛ 내지 50 ㎛ 의 범위인 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 벽의 상면과 측면이 이루는 각도가 90 도 내지 135 도의 범위인 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
배양한 스페로이드 전체 중 60 ％ 이상이, 배양 후의 스페로이드 직경의 평균치의 플러스마이너스 5 ％ 의 범위 내의 직경인 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 스페로이드가 암 세포인 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양 용기가 아크릴계 수지, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 스티렌계 수지, 아크릴·스티렌계 공중합 수지, 폴리카보네이트계 수지, 폴리에스테르계 수지, 폴리비닐알코올계 수지, 에틸렌·비닐알코올계 공중합 수지, 열가소성 엘라스토머, 염화비닐계 수지, 및 실리콘 수지 중 하나 또는 이들의 조합으로 이루어지는 수지 성형품인 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양 공간의 표면에, 온도, 광 중 어느 것에 의해 친수성과 소수성이 변화되는 폴리머가 추가적으로 코트되어 있는 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양 공간의 표면에, 세포 접착을 저해하는 친수성 폴리머 사슬이 추가적으로 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양 공간의 표면에, 인 지질이 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양 공간의 표면이, 유리 처리에 의해 수접촉각을 45 도 이하가 되도록 처리하고, 상기 수접촉각이 45 도 이하가 된 표면에, MPC (인산2-(메타크릴로일옥시)에틸2-(트리메틸암모니오)에틸 (2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine)) 코트에 의해, 인 지질ㆍ고분자 복합체를 고정화한 후, 온도, 광 중 어느 것에 의해 친수성과 소수성이 변화되는 폴리머, 및 세포 접착을 저해하는 친수성 폴리머 사슬, 및 인 지질 중 어느 것이, 상기 배양 용기의 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양 공간의 표면이, 플라즈마 처리에 의해 관능기를 형성시켜 수접촉각을 45 도 이하가 되도록 처리하고, 상기 수접촉각이 45 도 이하가 된 표면에, MPC (인산2-(메타크릴로일옥시)에틸2-(트리메틸암모니오)에틸 (2-Methacryloyloxyethyl Phosphorylcholine)) 코트에 의해, 인 지질ㆍ고분자 복합체를 고정화한 후, 온도, 광 중 어느 것에 의해 친수성과 소수성이 변화되는 폴리머, 및 세포 접착을 저해하는 친수성 폴리머 사슬, 및 인 지질 중 어느 것이, 상기 배양 용기의 표면에 고정화되어 있는 것을 특징으로 하는 접착성 세포의 배양 방법.
제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
상기 배양 공간의 형상은 정사각주상 (正四角柱狀) 이고.
상기 배양 공간의 상당 직경은 100 ㎛ 내지 200 ㎛ 의 범위이고,
상기 배양 공간의 높이가 상기 상당 직경의 0.5 배 내지 2 배인,
접착성 세포의 배양 방법.