KR102470509B1 - 스페로이드 포획 삽입체 - Google Patents

스페로이드 포획 삽입체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제1 개방단부와, 제2 개방단부, 및 이들 사이로 연장되는 적어도 하나의 지지부를 한정하는 프레임을 구비할 수 있는 세포 배양 웰 삽입체를 포함한다. 세포 배양 웰 삽입체는 또한 프레임에 결합되고 제2 개방단부를 가로질러 배치되는 유체 투과 메쉬를 구비할 수 있다. 메쉬는 10 마이크로미터에서 100 마이크로미터까지의 범위에 평균 세공 크기를 갖는 세공을 한정할 수 있다.

Description

스페로이드 포획 삽입체 {SPHEROID TRAP INSERT}
본 출원은 2014년 10월 29일자로 출원된 미국 가출원 제US 62/072,094호에 의거하여 우선권을 주장하였으며, 이의 내용은 본 명세서에 참고로 병합된다.
본 발명은 세포 배양을 위한 장치, 시스템, 및 방법에 관한 것이다.
스페로이드(spheroid)와 같이 3차원적으로 배양된 세포는 단층 배양처럼 2차원적으로 배양된 대조군보다 더 생체(生體) 내에서의 기능을 나타낼 수 있다. 2차원 세포 배양 시스템에서, 세포는 배양될 기질(substrate)에 부착할 수 있다. 하지만, 세포가 스페로이드와 같이 3차원적으로 성장하는 경우에, 세포들은 기질에 부착되지 않고 서로 상호작용을 한다. 따라서, 세포가 현탁액에서 이동가능한 스페로이드로 배양되는 배양 시스템을 위한 세포 배양 배지 교환은 문제점을 나타낼 수 있다.
본 발명의 다양한 실시예에 따르면, 스페로이드의 흡입 또는 손상없이 스페로이드를 저장하는 웰(well) 내부에 배양 배지의 교환을 허용하도록 구성된 세포 배양 삽입체가 기술된다. 세포 배양 삽입체는 제1 개방단부와, 제2 개방단부, 및 제1 개방단부와 제2 개방단부 사이에 연장되는 적어도 하나의 지지부를 갖춘 프레임을 구비할 수 있다. 또한, 삽입체는 프레임과 결합되고 제2 단부의 개방부를 가로질러 배치되는 유체 투과 메쉬를 구비한다. 메쉬는 10 마이크로미터에서 200 마이크로미터의 범위, 예컨대 10, 20, 50, 100, 또는 200 마이크로미터의 평균 세공 크기를 갖는 세공을 한정하고 있으며, 전술된 값 중 임의의 값 사이의 범위를 포함한다. 실시예에서, 세공은 개별적으로 세포가 메쉬를 가로지르거나 통과할 수 있는 크기를 갖는 한편, 스페로이드 세포 클러스터가 통과하지 못하는 크기를 갖는다.
몇몇 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 세포 배양 웰 삽입체는 제1 개방단부와, 개방부를 한정하는 제2 단부, 및 제1 개방단부와 제2 단부 사이에 연장되는 적어도 하나의 지지부를 갖춘 프레임을 구비하는데, 제2 단부의 개방부는 9 mm와 0.25 mm 사이(예컨대, 9 … 5 … 3 … 2 … 0.75 … 0.25 mm)의 직경을 가지며, 유체 투과 메쉬는 프레임에 결합되고 제2 단부의 개방부를 가로질러 배치되고, 메쉬는 10 마이크로미터에서 200 마이크로미터 사이의 범위(예컨대, 10 … 35 … 75 … 200 마이크로미터)의 평균 세공 크기를 가진 세공으로 한정한다. 몇몇 실시예에서, ⅰ) 메쉬가 웰의 천저(nadir)에서 소정의 거리만큼 이격되게 웰 내에 위치선정되고 ⅱ) 상기 웰 내에 존재할 때에 스페로이드가 웰에 포획되도록, 프레임은 세포 배양 물품의 웰에 적어도 부분적으로 삽입되도록 구성된다.
몇몇 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 장치는 제1 개방단부와 개방부를 갖춘 제2 단부를 구비한 웰 삽입체로 이루어지는데, 제1 개방단부와 제2 단부 사이에 공동부(cavity)를 형성하며, 제2 단부의 개방부는 9 mm와 0.25 mm 사이의 직경을 갖고, 유체 투과 메쉬는 제2 단부의 개방부를 가로질러 배치되며, 메쉬는 10 마이크로미터에서 200 마이크로미터 사이의 범위에 평균 세공 크기를 갖는데,
ⅰ) 메쉬가 웰의 천저에 거리만큼 웰에 위치선정되고,
ⅱ) 상기 웰 내에 존재할 때 스페로이드가 웰에 포획되도록, 웰 삽입체는 세포 배양 물품의 웰에 적어도 부분적으로 삽입되도록 구성된다. 어떤 실시예에서, 웰 삽입체는 일체형 몰딩장치이다.
특정 실시예에서, 프레임은 제1 단부에서 제2 단부까지 연장되는 다수의 지지부를 구비한다. 다른 실시예에서, 메쉬는 프레임의 제1 개방단부에서 제2 단부까지 연장되고 프레임 내에 공동부를 한정한다. 다른 실시예에서, 프레임의 적어도 하나의 지지부는 제1 개방단부에서 제2 단부까지 연장되고 프레임의 내부를 한정하는 두름(enclosing) 측벽으로 이루어진다. 몇몇 실시예에서, 프레임의 적어도 하나의 지지부는 제1 개방단부에서 제2 단부까지 연장되고 프레임의 내부를 한정하는 측벽으로 이루어진다. 다른 실시예에서, 프레임은 제1 개방단부에서 방사상으로 연장된 하나 이상의 플랜지를 추가로 구비한다. 추가적인 실시예에서, 프레임은 메쉬가 웰의 천저에서 천저(nadir)에서 거리를 두고 웰 내에 위치되도록 세포 배양 물품의 웰에 적어도 부분적으로 삽입되도록 구성된다.
특정 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 웰에 세포를 배양하는 단계를 포함하는데, 웰은 본 명세서에 기술된 세포 배양 삽입체로 이루어진다. 특정 실시예에서, 세포는 스페로이드에 있거나 세포들이 스페로이드를 형성한다. 다른 실시예에서, 배지는 삽입체 위에 놓이고, 방법은 삽입체 위의 웰로부터 배지를 제거하는 단계를 추가로 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 세포 배양 조립체는 내부면을 한정하는 웰과; 본 명세서에 기술된 바와 같은 삽입체;로 이루어지고, 내부면은 천저를 한정하는데, 삽입체는 유체 투과 메쉬가 천저에서 거리를 두고 웰 내에 위치선정되도록 웰 내에 적어도 부분적으로 삽입되도록 구성된다. 몇몇 실시예에서, 웰은 세포에 접착되지 않는다. 다른 실시예에서, 웰은 웰에서 배양된 세포가 스페로이드를 형성하도록 구성된다. 추가 실시예에서, 메쉬의 세공은 개별 세포들이 메쉬를 통과하고 여기에서 형성된 스페로이드가 메쉬를 통과하지 못하는 크기로 되어 있다.
어떤 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 세포 배양 조립체는 a) 내부면을 한정하고, 여기서 내부면은 천저를 한정하며, 내부에서 배양된 세포가 스페로이드를 형성하도록 구성된 웰과; b) 삽입체;로 이루어지는데, 삽입체는 ⅰ) 세공을 한정하고, 세공은 10 마이크로미터에서 200 마이크로미터까지의 범위에 평균 세공 크기를 한정하고 메쉬는 웰의 적어도 일부에 위치선정되고 천저에서 이격되도록 구성되는 유체 투과 메쉬와, ⅱ) 메쉬에 결합되고 천저에서 연장되도록 구성된 프레임을 구비한다.
어떤 실시예에서, 메쉬의 세공은 스페로이드가 메쉬를 통과하지 못하도록 구성된다. 다른 실시예에서, 프레임은 천저에서 거리를 두고 메쉬를 위치시키도록 구성된다. 추가 실시예에서, 웰은 상부 엣지를 추가로 한정하며, 프레임은 천저에서 이격되게 메쉬를 위치시키기 위해 상부 엣지와 접촉한다. 다른 실시예에서, 조립체는 지지부를 추가로 구비하며, 프레임은 천저에서 이격되게 메쉬를 위치시키기 위해 지지부와 접촉한다. 추가 실시예에서, 메쉬는 세공을 한정하는데, 세공은 40 마이크로미터 이하(예컨대, 40 … 35 … 25 … 15 … 또는 10 마이크로미터)의 평균 세공 크기로 한정한다. 어떤 실시예에서, 웰은 천저와 대향되는 구멍을 추가로 한정하는데, 웰의 내부면은 구멍으로부터 천저까지 원뿔 형상으로 한정한다. 몇몇 실시예에서, 메쉬는 원형 또는 사각형으로 한정한다.
다른 실시예에서, 조립체는 다수의 웰을 추가로 구비하고, 삽입체는 다수의 유체 투과 메쉬를 추가로 구비하며, 유체 투과 메쉬와 다수의 유체 투과 메쉬 중 하나는 웰들의 다른 하나의 적어도 일부와 다수의 메쉬의 적어도 일부에 위치되도록 구성된다. 다른 실시예에서, 웰의 내부면은 초저밀착성 재질로 코팅된다. 다른 실시예에서, 메쉬는 메쉬 엣지를 한정하고 프레임은 메쉬 엣지를 따라 메쉬를 감싸고 천저에서 연장된다. 다른 실시예에서, 프레임은 유체 투과 메쉬와 결합되는 적어도 하나의 지지 와이어를 구비한다. 몇몇 실시예에서, 웰은 내부면을 따라 적어도 하나의 보조-웰을 구비한다.
특정 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 방법은 세포 배양 장치의 웰로부터 배양 배지를 제거하는 단계를 포함하고, 웰은 천저를 갖춘 내부면을 한정하는데, 방법은 a) 삽입체의 단부를 웰에 배치하는 단계, 삽입체의 단부는 삽입체의 공동부와 유체연통되는 개방부를 한정하며, 삽입체는 개방부를 가로질러 배치된 유체 투과 메쉬를 갖추고, 삽입체의 단부는 메쉬가 천저에서 이격되게 위치되도록 웰 내에 배치되고; b) 팁부가 적어도 메쉬에서 천저까지의 거리만큼 천저에서 이격되도록 유체 제거 장치의 팁부를 삽입체의 공동부에 삽입하는 단계; 및 c) 유체 제거 장치를 통해 유체를 회수하여 웰로부터 유체를 제거하는 단계;를 포함한다.
어떤 실시예에서, 본 명세서에서 제공된 세포 배양 조립체는 내부면을 한정하는 제1 웰, 여기서 내부면은 천저를 한정하고; 세공을 한정하는 유체 투과 메쉬, 여기서 세공은 10 마이크로미터에서 200 마이크로미터까지의 범위에 평균 세공 크기를 한정하며; 메쉬에 결합되고 제1 웰의 적어도 일부 상으로 위치선정된 메쉬를 지지보유하도록 구성된 프레임;으로 이루어진다.
몇몇 실시예에서, 메쉬는 세공을 한정하고 세공은 20 마이크로미터에서 200 마이크로미터까지의 범위에 평균 세공 크기를 한정한다. 다른 실시예에서, 유체 투과 메쉬는 9 mm와 0.25 mm (예컨대, 9 … 7 … 4 … 2 … 1 … 0.25 mm) 사이의 직경을 갖는다. 다른 실시예에서, 메쉬는 세공을 한정하고 세공은 40 마이크로미터 이하의 평균 세공 크기로 한정한다. 추가 실시예에서, 메쉬는 웰의 적어도 일부 내에 천저로부터 이격되게 위치되도록 구성된다. 다른 실시예에서, 프레임은 천저로부터 연장되도록 구성된다. 추가 실시예에서, 제1 웰은 상부 엣지를 한정하고 메쉬는 웰의 상부 엣지 상에 배치되도록 구성된다. 다른 실시예에서, 조립체는 제2 웰을 구비하고 메쉬는 제2 웰 상에 위치되도록 구성된다. 특정 실시예에서, 메쉬는 메쉬 둘레를 한정하고 프레임은 메쉬 둘레를 따라 메쉬를 둘러싼다.
몇몇 실시예에서, 웰(예컨대, 마이크로 웰(microwell))은 사인파(sine)와 유사한 단면형상을 갖는다. 이러한 실시예에서, 웰의 저면부는 라운딩(예컨대, 반구형상으로 라운딩)되고, 측벽은 저면부에서 상부까지 직경을 증가시키고 웰들 사이의 경계는 라운딩되어 있다. 이와 같이 웰의 상부는 직각으로 마감처리되지 않았다. 몇몇 실시예에서, 웰은 저면부와 상부 사이에 중간 지점(Dhalf -way)에서 직경(D)과, 웰의 상부에 직경(Dtop), 및 웰의 저면부에서 상부까지의 높이(H)를 갖는다. 이러한 실시예들에서, Dtop은 D 보다 크다. 추가 실시예는 도 7에 도시되되, 웰의 폭은 연속적인 웰 사이의 경계의 폭보다 크다. 이러한 실시예는 배양면의 주어진 영역 내에서 더욱 많은 갯수의 웰을 허용하게 된다.
본 발명의 요지의 추가적인 특징과 장점은 아래의 상세한 설명에 기술될 것이며, 부분적으로 당해분야의 숙련자들에게 아래의 상세한 설명을 통해 명백해질 것이며 아래의 상세한 설명, 청구항 뿐만 아니라 첨부된 도면을 포함하는 여기에 기재된 본 발명의 요지를 실시하여 인지될 것이다.
전술된 배경기술과 다음의 상세한 설명 모두는 본 발명의 요지의 실시예들을 설명하고, 청구된 주제의 본질 및 특징을 이해하기 위해 개요 또는 체계를 제공하도록 의도된 것으로 이해될 것이다. 첨부된 도면은 본 발명의 요지의 또 다른 이해를 제공하기 위해 포함되고, 본 명세서의 일부를 구성하고 병합된다. 첨부도면은 추가적인 이해를 제공하기 위해 구비되고, 본 명세서에 병합되고 일부를 구성한다. 도면은 하나 이상의 실시예를 도해하며 다양한 실시예의 원리와 동작을 설명하는 역할을 한다. 추가로, 도면과 설명은 단지 예시적인 것을 의미하며 어떠한 방식으로도 청구범위의 범주를 제한하지는 않는다.
도 1a는 일 실시예에 따른 웰을 갖춘 세포 배양 장치의 사시도이다.
도 1b는 도 1a에 도시된 일 실시예에 따른 장치의 단면도이다.
도 1c는 구조화된 표면의 실시예의 웰에서 스페로이드로 성장된 세포를 개략적으로 도시한 평면도이다.
도 2a는 구형 트랩 혹은 웰 삽입체의 사시도이다.
도 2b 및 도 2c는 2개의 다른 형상 메쉬를 도해한 도 2a의 웰 삽입체의 평면도이다.
도 3은 다수의 웰과 다수의 웰 삽입체의 실시예를 개략적으로 도시한 단면도이다.
도 4는 다수의 보조-웰을 구비한 웰과 웰 삽입체의 실시예를 개략적으로 도시한 단면도이다.
도 5는 다수의 웰과 웰 삽입체를 갖춘 세포 배양 장치의 실시예의 사시도이다.
도 6은 사인곡선 혹은 포물선 형상을 가진 웰 어레이(array)를 도해한 도면이다.
도 7은 일 실시에서 스페로이드를 저장하는 웰 어레이의 측면도이다.
도 8은 기술된 장치의 실시예를 사용하는 예시적인 방법을 도해한 개략도이다.
이제, 본 발명의 실시예들이 상세하게 기술될 것이며, 이들의 실례들은 첨부도면들에 예시된다. 가능할 때마다, 동일한 도면 부호는 동일하거나 유사한 부분들을 나타내기 위해 도면 전체에 걸쳐 사용될 것이다.
본 발명의 요지의 다양한 실시예에 대한 참조가 더욱 상세하게 이루어질 것이며, 몇몇 실시예는 첨부도면에 도시된다. 도면에 사용되는 유사 참조번호는 유사한 구성요소, 단계 등을 지칭한다. 그러나, 도면에서 구성요소를 지칭하기 위해 사용되는 참조번호가 동일한 번호로 표기된 다른 도면에 구성요소를 한정하려는 것이 아니라는 것으로 이해될 것이다. 덧붙여서, 구성요소를 지칭하기 위해 다른 참조번호를 사용하는 것은 상이한 번호의 구성요소가 다른 번호의 구성요소와 동일하거나 유사할 수 없음을 나타내는 것은 아니다.
무엇보다도, 본 발명은 하나 이상의 웰을 한정하는 기질 뿐만 아니라 하나 이상의 웰 중에서 적어도 하나에 위치될 수 있는 세포 배양 웰 삽입체를 갖춘 세포 배양 장치를 기술한다.
몇몇 실시예에서, 웰은 웰에서 배양된 세포가 스페로이드를 형성하도록 구성될 수 있다. 예컨대, 웰은 웰에서 세포를 상호 병합하고 스페로이드 클러스터(cluster)를 형성하기 위해 세포와 비점착성일 수 있다. 스페로이드는 웰의 기하학적 구조에 의해 부과되는 제한 크기까지 팽창할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 웰은 웰을 세포와 비점착성을 갖도록 하기 위해 초저밀착성 재질로 코팅된다. 세포는 웰의 표면에 점착되지 않기 때문에, 스페로이드의 흡입 또는 손상없이 세포 배양 배지의 교환이 어려울 수 있다.
스페로이드와 같이 3차원적으로 배양된 세포는 단층 배양처럼 2차원적으로 배양된 대조군보다 더 생체 내에서의 기능을 나타낼 수 있다. 2차원 세포 배양 시스템에서, 세포는 배양될 기질에 부착할 수 있다. 하지만, 세포가 스페로이드와 같이 3차원적으로 성장하는 경우에, 세포들은 기질에 부착되지 않고 서로 상호작용을 한다. 3차원적으로 배양된 세포는 세포 간 통신과 세포외 기질(extracellular matrix)의 발달과 관련하여 생체 내 조직과 더욱 유사하다. 따라서, 스페로이드는 세포 이동, 분화, 생존, 및 성장을 위한 우수한 모델을 제공하고, 연구, 진단, 및 약물 효능을 위한 우수한 시스템과 약리학 및 독성 테스트를 제공한다.
몇몇 실시예에서, 장치는 장치 내에서 배양될 세포가 스페로이드를 형성하기 위해 구성된다. 예컨대, 세포가 성장되는 웰은 웰에서 세포를 상호 병합하고 스페로이드를 형성하기 위해 세포와 비점착성일 수 있다. 스페로이드는 웰의 기하학적 구조에 의해 부과되는 제한 크기까지 팽창할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 웰은 웰을 세포와 비점착성을 갖도록 하기 위해 초저밀착성 재질로 코팅된다.
비점착성 재질의 일례는 퍼플루오르화 중합체, 올레핀, 또는 유사한 중합체, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 일례는 아가로스, 폴리아크릴아미드와 같은 비이온성의 히드로겔, 폴리에틸렌옥사이드와 같은 폴리에테르, 또는 폴리비닐알코올과 같은 폴리올, 또는 이와 유사한 재질 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 예컨대, 비점착성 웰, 웰의 기하학 구조(예컨대, 크기와 형상) 및/또는 중력의 조합은 웰에서 배양될 세포가 스페로이드로 자가 조립되도록 유도할 수 있다. 몇몇 스페로이드는 단층에서 성장된 세포에 비해서 반응과 같은 생체 내에서의 분화된 세포 기능을 유지할 수 있다. 중간엽줄기세포(mesenchymal stromal cell)와 같은 다른 세포 유형은 스페로이드로 배양될 때 다능성(pluripotency)을 유지한다.
몇몇 실시예에서, 여기에 시스템, 장치 및 방법은 하나 이상의 세포를 구비한다. 몇몇 실시예에서, 세포는 저온보존된다. 몇몇 실시예에서, 세포는 3차원적으로 배양된다. 이러한 몇몇 실시예에서, 시스템, 장치 및 방법은 하나 이상의 스페로이드를 구비한다. 몇몇 실시예에서, 하나 이상의 세포는 활발하게 분할한다. 몇몇 실시예에서, 시스템, 장치 및 방법은 (예컨대, 영양소(예컨대, 단백질, 펩티드(peptides), 아미노산), 에너지(예컨대, 탄수화물), 필수 금속 및 무기질(예컨대대, 칼슘, 마그네슘, 철, 인산염, 황산염), 완충화제(예컨대, 인산염, 아세트산염), pH 변화 지시약(예컨대, 페놀 레드(phenol red), 브로모크레솔퍼플(bromo-cresol purple), 선택 제제(예컨대, 화학 약품, 항균제) 등을 포함하는) 배양 배지를 구비한다. 몇몇 실시예에서, 하나 이상의 테스트 화합물(예컨대, 약물)이 시스템, 장치 및 방법에 포함된다.
다양한 유형의 세포가 배양될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 스페로이드는 단일 세포 유형을 함유한다. 몇몇 실시예에서, 스페로이드는 하나 이상의 세포 유형을 함유한다. 하나 이상의 스페로이드가 성장하는 몇몇 실시예에서, 각각의 스페로이드는 동일 유형이지만 다른 실시예에서는 2개 이상의 다른 유형의 스페로이드가 성장된다. 스페로이드로 성장될 세포는 자연세포 또는 변형세포(예컨대, 하나 이상의 비자연 유전자 변형을 포함하는 세포)일 수 있다. 몇몇 실시예에서, 세포는 체세포이다. 몇몇 실시예에서, 세포는 임의의 원하는 분화상태(예컨대, 다능성, 다기능성, 운명 결정, 불멸성 등)에 줄기세포 또는 전구세포(예컨대, 배아줄기세포, 유도만능줄기세포)이다. 몇몇 실시예에서, 세포는 질병세포 또는 질병모델세포이다. 예컨대, 몇몇 실시예에서, 스페로이드는 하나 이상 유형의 암세포 또는 과증식상태로 유도될 수 있는 세포(예컨대, 형질전환세포)를 포함한다. 세포는 임의의 바람직한 조직 또는 신체 유형의 부신, 방광, 혈관, 뼈, 골수, 뇌, 연골, 경신경, 각막, 자궁 내막, 식도, 위장, 면역체계(예컨대, T 림프구, B 림프구, 백혈구, 대식세포(macrophages), 및 수지상세포(dendritic cell)), 간, 폐, 임파선, 근육(예컨대, 심근), 신경, 난소, 췌장(예컨대, 섬세포), 뇌하수체, 전립선, 신장, 타액, 피부, 힘줄, 고환, 및 갑상선일 수 있거나 이로부터 유래될 수 있으며, 이에 한정되지는 않는다. 몇몇 실시예에서, 세포는 포유류 세포(예컨대, 인간, 생쥐, 쥐, 토끼, 개, 소, 돼지, 닭, 염소, 말 등)이다.
배양된 세포는 다양한 연구, 진단, 약물검사 및 테스트, 치료, 및 산업 분야에 사용된다.
몇몇 실시예에서, 세포는 단백질 또는 바이러스의 생산을 위해 사용된다. 다수의 스페로이드를 병행하여 배양하는 시스템, 장치, 및 방법은 단백질 생산에 특히 효과적이다. 3차원적 배양은 세포 밀도의 증가와, 세포 배양 표면의 제곱 센티미터당 높은 단백질 수율을 허용한다. 백신 생산을 위한 임의의 바람직한 단백질 또는 바이러스는 세포에서 성장될 수 있고, 바람직하게 사용되도록 단절되거나 정제될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 단백질은 세포에 생단백질(native protein)이다. 몇몇 실시예에서, 단백질은 생단백질이 아니다. 몇몇 실시예에서, 단백질은 재조합되어 발현된다. 바람직하기로, ?첫溶珦? 비-고유 프로모터(non-native promoter)를 사용하여 과발현된다. 단백질은 융합단백질로 발현될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 정제 또는 검출 태그는 정제 및/또는 검출을 용이하게 하기 위해 목적 단백질에 대한 융합단백질로서 발현된다. 몇몇 실시예에서, 융합은 정제 후에 융합 파트너를 분리할 수 있게 절단가능한 링커(linker)와 발현된다.
몇몇 실시예에서, 단백질은 치료 단백질이다. 이러한 단백질은 단백질과, 결핍되거나 비정상적인 단백질을 대체하는 펩티드(예컨대, 인슐린)를 포함하는데, 이에 국한되지 않으며, 현 통로를 증대시키거나(예컨대, 억제제, 작용제), 새로운 기능 또는 활성을 제공하거나, 분자 또는 유기물을 간섭하거나, 다른 화합물 또는 단백질을 전달한다(예컨대, 방사성 핵종, 세포독성 약물(cytotoxic drugs), 작용 단백질(effector proteins) 등). 몇몇 실시예에서, 단백질은 임의의 유형(예컨대, 인간화, 2중특이성향체, 다가 특이성 등)의 항체(예컨대, 단일클론항체)와 같은 면역글로불린(immunoglobulin)이다. 치료 단백질 카테고리는 항체 기반 약물, Fc 융합 단백질, 혈액응고억제제, 항원, 혈액 인자, 뼈 형성 단백질, 공학적 단백질 비계(engineered protein scaffolds), 효소, 성장 인자, 호르몬, 인터페론, 인터류킨, 및 혈전용해제를 포함하며, 이에 국한되지는 않는다. 치료 단백질은 암, 면역장애, 대사장애, 유전적 유전장애, 감염, 및 기타 질병 및 상태를 예방하거나 치료하는데 사용될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 단백질은 진단 단백질이다. 진단 단백질은 항체, 친화성 결합 파트너(예컨대, 수용체-결합 리간드(receptor- binding ligands)), 억제제, 길항제(antagonists) 등)을 포함하며, 이에 국한되지는 않는다. 몇몇 실시예에서, 진단 단백질은 검출 성분(detectable moiety, 예컨대 형광성 성분, 발광성 성분(예컨대, 루시페라아제), 비색계 성분 등)이거나 이와 발현된다.
몇몇 실시예에서, 단백질은 산업 단백질(industrial protein)이다. 산업 단백질은 식품 성분, 산업 효소, 농업 단백질, 분석 효소 등을 포함하며, 이에 국한되지는 않는다.
몇몇 실시예에서, 세포는 약물 발견, 특성감별, 효능 시험, 및 독성 시험에 사용된다. 이러한 시험은 약리학적 효과 평가, 발암성 평가, 의학적 이미징제 특성 평가, 반감기 평가, 방사선 안전 평가, 유전독성 시험, 면역독성 시험, 생식 및 계발 시험, 약물 상호작용 평가, 선량 평가, 흡착 평가, 성향 평가, 신진대사 평가, 제거 연구 등을 포함하며, 이에 국한되지는 않는다. 특정 세포 유형은 특정 검사(예컨대, 간독성을 위한 간세포, 신장독성을 위한 신장 근위세관 상피세포, 혈관 독성을 위한 혈관내피세포, 신경독성을 위한 신경 세포 및 신경아교세포, 심장독성을 위한 심근세포, 횡문근융해증을 위한 골격근 세포 등)에 사용될 수 있다. 치료된 세포는 멤브레인 보전, 세포 물질대사 내용물, 미토콘드리아 기능, 리소좀 기능, 세포자멸, 유전적 변형, 유전자 발현 차이 등을 포함하는 매개변수에 대해 평가할 수 있으며, 이에 국한되지 않는다.
몇몇 실시예에서, 세포 배양 장치는 대형 시스템의 일부 구성요소이다. 몇몇 실시예에서, 시스템은 다수(예컨대, 2, 3, 4, 5, …, 10, …, 20, …, 50, …, 100, …, 1000, 등)의 이러한 세포 배양 장치를 구비한다. 몇몇 실시예에서, 시스템은 최적의 배양 조건(예컨대, 온도, 대기, 습도 등)에서 배양 장치를 유지하기 위한 인큐베이터를 구비한다. 몇몇 실시예에서, 시스템은 세포를 이미징(imaging)하거나 그렇지 않다면 분석을 위한 검출기를 구비한다. 이러한 검출기는 형광측정기, 루미노미터, 카메라, 현미경, 플레이트 판독기(예컨대, PERKIN ELMER ENVISION plate reader; PERKIN ELMER VIEWLUX plate reader), 세포분석기(예컨대, GE IN Cell Analyzer 2000 and 2200; THERMO/CELLOMICS CELLNSIGHT High Content Screening Platform), 및 공초점 이미지 시스템(confocal imaging systems, 예컨대, PERKIN ELMER OPERAPHENIX high throughput content screening system; GE INCELL 6000 Cell Imaging System)을 포함하며, 이에 국한되지는 않는다. 몇몇 실시예에서, 시스템은 관류 시스템(perfusion systems), 또는 배양될 세포에 다른 구성성분 또는 배지를 공급, 재공급 및 순환하는 다른 구성부재를 포함한다. 몇몇 실시예에서, 시스템은 배양 장치의 취급, 사용 및/또는 분석을 자동화하는 로봇 컴포넌트를 포함한다.
몇몇 실시예에서, 여기에 기술된 바와 같이 삽입체가 사용될 수 있는 세포 배양 장치는 96 웰 라운딩 저면부 플레이트와 같은 다수 웰 라운딩 저면부 플레이트이다.
세포 배양 컨테이너(100)의 실시예는 도 1a 및 도 1b에 도시된다. 도 1a는 다수의 웰(115)을 갖춘 96 웰 플레이트로 되어 있는 실시예를 도시한다. 일반적으로, 웰(well)은 도 1a에 도시된 바와 같이 매크로 웰을 의미한다. 하지만, 임의의 유형의 세포 배양 컨테이너가 제공될 수 있다. 예컨대, 접시(dish), 6 웰 플레이트, 12 웰 플레이트, 24 웰 플레이트, 96 웰 플레이트, 384 웰 플레이트 또는 1536 웰 플레이트가 제공될 수 있다. "마이크로 웰"은 일반적으로 단일 스페로이드를 저장할 수 있는 구조를 갖춘 소형 웰을 의미한다. 다수의 웰(115)은 다양한 다른 배열로 제공될 수 있다. 예컨대, 다수의 웰(115)은 스택(stack), 육방 밀집(hexagonal close-packed) 등의 패턴으로 한정할 수 있다. 실시예에서, 웰(115)은 주 표면(112)에 형성된다. 웰(115)은 도 1a에 도시된 바와 같이 정렬된 웰 구조의 어레이(array)를 구비할 수 있다. 다수 웰 세포 배양 컨테이너의 실시예의 측단면도는 기질(110)에 형성된 라운딩 저면부 웰을 도시한 도 1b에 도해된다. 이 실시예에서, 다수의 웰(115)은 세포 배양 장치(100)의 주 표면(112) 아래로 떨어지고, 전술된 바와 같이 스페로이드를 형성하는 위치에 제공하는 라운딩 저면부를 갖는다.
실시예에서, 세포 배양 컨테이너(100)는 전술된 바와 같이 삽입체(insert)를 적합하게 수용할 수 있는 도 1a와 도 1b에 도시된 매크로 웰을 구비할 수 있다. 이러한 매크로 웰은 예컨대 1536 웰 플레이트(일반적으로 5.01 mm 깊이와 1.69 mm 상부 직경)에 비교적 소형의 웰일 수 있지만, (500 ㎛ 깊이와 500 ㎛ 폭일 수 있는) 마이크로 웰 보다 더욱 클 수 있다. 또한, 실시예에서, 매크로 웰은 마이크로 웰(도 4에 도시된 125)를 수용하는 세포 배양 표면(도 4에 126)을 구비할 수 있다. 이러한 마이크로 웰은 각각의 마이크로 웰에 단일 스페로이드를 수용할 수 있는 구조로 이루어져 있다. 마이크로 웰의 크기와 형상은 전술된 바와 같이 스페로이드의 형성을 유도할 수 있다. 도 1c는 육방 밀집된 마이크로 웰의 어레이를 구비한 구조화된 표면(113)의 실시예의 마이크로 웰(125, 도 4에 125)에서 성장하는 세포(200)를 개략적으로 도해한다. 몇몇 실시예에서, 각 웰(125) 내에 세포(200)는 도 1c에 도시된 바와 같이 단일 스페로이드로 형성한다. 마이크로 웰은 임의의 형상 혹은 형태 또는 도 1c에 도시된 형상을 포함하는 기하학적 구조를 가질 수 있다.
실시예에서, 도 2a 내지 도 2c에 도해된 세포 배양 삽입체는 세포 배양 컨테이너(100)의 웰(115)에 삽입될 수 있다. 이들은 매크로 웰 삽입체이다.
다수의 웰(115) 각각은 도 2a에 도시된 바와 같이 스페로이드 포획 삽입체, 또는 웰 삽입체 또는 삽입체(150)를 구비할 수 있다. 웰 삽입체(150)는 웰(115)의 적어도 일부에 위치선정되도록 구성될 수 있다. 웰 삽입체(150) 또는 이의 일부는 임의의 적당한 재질로 제작될 수 있다. 바람직하기로, 세포와 배양 배지에 접촉되는 재질은 세포와 배지와 양립할 수 있다. 통상적으로, 세포 배양 성분은 고분자 재질로 형성된다. 적당한 고분자 재질의 실례는 폴리스티렌(polystyrene,), 폴리메타크릴산메칠(polymethylmethacrylate), 폴리염화비닐(polyvinyl chloride), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리술폰(polysulfone), 폴리스티렌 공중합체(polystyrene copolymers), 폴루오로폴리머(fluoropolymers), 폴리에스테르(polyesters), 폴리아미드(polyamides), 폴리스티렌 부타디엔 공중합체(polystyrene butadiene copolymers), 수소첨가된 스티렌계 폴리머(fully hydrogenated styrenic polymers), 폴리카보네이트 PDMS 공중합체(polycarbonate PDMS copolymers), 및 폴리에틸렌(polyethylene)과 같은 폴리올레핀(polyolefins), 폴리프로필렌(polypropylene,), 폴리메틸펜텐(polymethyl pentene), 폴리프로필렌 공중합체(polypropylene copolymers), 환형 올레핀 공중합체(cyclic olefin copolymers) 등을 포함한다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 웰 삽입체(150)는 프레임(160)을 구비할 수 있다. 프레임(160)은 제1 단부(161)와, 제2 단부(162), 및 제1 단부(161)와 제2 단부(162) 사이에 연장되는 적어도 하나의 지지부(163)를 구비할 수 있다. 도시된 바와 같이, 제1 단부(161)는 구멍 또는 개방부(164)를 한정할 수 있다. 제1 단부(161)의 구멍(164)은 웰의 상부 구멍과 정렬되고 웰의 내부의 적어도 일부에 접근을 허용할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 제1 단부(161)은 웰의 외부에 놓이고 웰의 상부 구멍에서 떨어져 있다(도 4에 도시됨). 프레임(160)의 제1 단부(161)는 다양한 형상, 예컨대 원형, 정사각형, 직사각형, 다이아몬드형, 육각형 등으로 한정될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 제1 단부(161)의 형상은 웰의 상부 구멍의 형상과 일치할 수 있다.
도 2a에 도시된 바와 같이, 프레임(160)의 제1 단부(161)는 프레임(160)이 웰의 적어도 일부에 위치선정될 수 있도록 구성될 수 있다. 예컨대, 프레임(160)은 웰의 상부 구멍에서 웰 내부 아래로 연장될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 제1 단부(161)의 형상은 웰의 상부 구멍에 근접한 위치에 프레임(160)의 고정을 도울 수 있다. 도 2a에 도시된 바와 같이, 프레임(160)은 프레임(160)의 제1 단부(161)에서 연장된 하나 이상의 플랜지(168)를 구비할 수 있다. 하나 이상의 플랜지(168)는 웰의 적어도 일부 내에 프레임(160)의 위치선정을 도울 수 있다. 예컨대, 하나 이상의 플랜지(168)은 프레임(160)을 웰의 적어도 일부 내에 위치시키기 위해 웰에 인접한 일부와 접촉할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 하나 이상의 플랜지(168)는 웰의 적어도 일부 내에 프레임(160)을 위치시키기 위해 세포 배양 장치의 일부 다른 부분과 접촉할 수 있다.
지지부(163)는 측벽일 수 있다. 웰 삽입체(150)의 프레임(160)의 지지부(163)는 도 2a 내지 도 2c에 도시된 바와 같이 웰 삽입체(150)의 제1 단부(161)와 제2 단부(162) 사이로 연장되어 결합될 수 있다. 도 2b 및 도 2c에 도시된 바와 같이, 프레임(160)은 4개의 지지부(166)를 구비한다. 프레임(160)은 4개 미만의 지지부(예컨대, 1개, 2개, 3개의 지지부 등), 4개의 지지부, 또는 4개 이상의 지지부(예컨대, 5개, 6개, 8개, 10개의 지지부 등)를 구비할 수 있다. 하나 이상의 지지부(163)는 예컨대 와이어, 바아(bar), 로드(rod) 등을 구비할 수 있다. 제1 단부(161)와 제2 단부(162) 사이에 연장되는 하나 이상의 지지부(163)는 실제로 개방 프레임을 한정할 수 있다. 다시 말하자면, 제1 단부(161)와 제2 단부(162) 사이의 공간이 일반적으로 개방되어 있다. 몇몇 실시예에서, 하나 이상의 지지부(163)는 제1 단부(161)와 제2 단부(162)에 연장되어 결합되는 측벽을 구비할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 측벽은 제2 단부(162)의 엣지 또는 둘레를 완전히 둘러쌀 수 있다. 다시 말하자면, 측벽은 제1 단부(161)와 제2 단부(162) 사이에 영역을 둘러싸고, 따라서 프레임(160)의 폐쇄 관형 구조를 한정할 수 있다. 측벽 지지부는 다양한 다른 특징, 예컨대 견고성(solid), 다공성, 유체 투과성으로 한정될 수 있다.
프레임(160)의 제2 단부(162)는 개방부(165)를 한정할 수 있다. 제2 단부(162)의 개방부(165)는 프레임(160)이 웰의 적어도 일부에 위치선정되어 있는 경우에 제1 단부(161)가 웰의 저면부 간의 거리보다 웰의 저면부에 더 근접하게 된다.
또한, 웰 삽입체(150)는 프레임(160)에 결합되고 제2 단부(162)의 개방부(165)를 가로질러 배치되는 유체 투과 메쉬(170)를 구비할 수 있다. 메쉬(170)는 세공(171)을 한정할 수 있다. 세공(171)은 예컨대 대략 5 마이크로미터 이상, 10 마이크로미터 이상, 20 마이크로미터 이상, 35 마이크로미터 이상, 50 마이크로미터 이상 등, 또는 200 마이크로미터 이하, 90 마이크로미터 이하, 75 마이크로미터 이하, 60 마이크로미터 이하, 45 마이크로미터 이하 등의 평균 세공 크기를 한정할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 세공은 대략 40 마이크로미터 평균 세공 크기를 한정할 수 있다. 세공(171)은 스페로이드가 메쉬(170)를 통과할 수 없는 크기로 한정될 수 있다. 또한, 세공(171)은 개별 세포들이 메쉬(170)를 통과할 수 있는 크기로 한정될 수 있다. 메쉬는 트랙 에칭된 멤브레인 또는 직물 또는 부직포 다공성 재질을 포함하지만 이에 한장되지 않는 다양한 다른 재질로 제작될 수 있다. 다공성 멤브레인의 재질은 세포와 점착성, 습윤성 또는 비점착성될 수 있도록 처리되거나 코팅될 수 있다. 처리는 플라즈마 방전, 코로나 방전, 가스 플라즈마 방전, 이온 충격(ion bombardment), 이온화 방사선, 및 고강도 UV 광을 포함하는 종래기술로 알려진 여러 방법으로 달성될 수 있다. 코팅은 인쇄, 분무, 응축, 방사에너지, 이온화 기술 또는 침지를 포함하는 종래기술로 알려진 임의의 적당한 방법으로 주입될 수 있다. 어떤 실시예에서, 코팅은 공유결합 또는 비공유결합 부위를 제공할 수 있다. 이러한 부위는 세포 배양 성분(예컨대 성장 또는 부착을 촉진하는 단백질)과 같은 잔기(moiety)를 부착하기 위해 사용될 수 있다. 추가로, 코팅은 세포(예컨대, 폴리라이신(polylysine))의 부착을 향상시키기 위해 사용될 수 있다. 선택가능하기로, 전술된 바와 같이 세포 비점착성 코팅은 세포 결합을 방지 혹은 억제하기 위해 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 메쉬는 나일론 또는 폴리에스테르 메쉬로 이루어질 수 있다.
몇몇 실시예에서, 메쉬는 또한 제1 단부와 제2 단부 사이에 배치될 수도 있다. 메쉬 또는 측벽이 제1 단부와 제2 단부 사이로 연장되는 이러한 실시예에서, 프레임은 프레임의 내부 공간 또는 공동부를 한정할 수 있다. 다시 말하자면, 프레임의 내부 공간 또는 공동부는 제2 개방부를 가로질러 배치된 메쉬와, 제1 단부와 제2 단부 사이에 연장되는 측벽(예컨대, 메쉬, 고형물 등)으로 한정될 수 있다.
제2 단부(162)의 개방부(165)와 메쉬(170)는 다양한 형상, 예컨대 정사각형, 직사각형, 원형, 육각형 등으로 한정될 수 있다. 도 2b에 도시된 바와 같이 제2 단부(162)의 개방부(165)는 원형으로 한정될 수 있다. 도 2c에 도시된 바와 같이, 제2 단부(162)의 개방부(165)는 정사각형으로 한정될 수 있다. 제2 단부(162)의 형상은 웰 삽입체(150)가 내부에 위치선정될 때에 스페로이드가 웰에서 빠져나오지 못하도록 기술될 수 있다. 다시 말하자면, 프레임(160)의 제2 단부(162)의 형상은 웰의 형상과 대응할 수 있어서, 프레임(160)의 제2 단부(162)와 웰의 측벽 사이의 임의의 간격은 스페로이드가 통과할만큼 충분히 크지 않는다. 예컨대, 제2 단부(162)는 웰의 측벽으로 한정된 동일 크기의 형상으로 한정되어 2개의 구성부재 사이에 임의의 간극을 제거할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 세포 배양 컨테이너(100)는 도 3에 도시된 바와 같이 하나 이상의 웰(115)과 하나 이상의 웰 삽입체(150))를 구비할 수 있다. 도시되었듯이, 각각의 웰(115)은 대응하는 웰 삽입체(150)를 구비한다. 웰 삽입체(150)는 웰(115)의 적어도 일부 내에 위치선정되도록 구성된다. 다시 말하자면, 웰 삽입체(150)는 웰(115)의 적어도 일부에 삽입될 수 있으며 웰 삽입체(150)는 웰(115)의 적어도 일부에서 제거될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 하나 이상의 웰 삽입체(150)는 서로 결합될 수 있어서, 하나 이상의 웰 삽입체(150)가 동시에 하나 이상의 웰(115) 내부와 외부에 위치선정될 수 있다. 하나 이상의 웰(115)은 프레임(160)을 사용하여 결합될 수 있다. 다른 실시예에서, 하나 이상의 웰 삽입체(150) 각각은 대응하는 웰(115) 내부와 외부에 개별적으로 위치선정되도록 구성될 수 있다. 다시 말하자면, 실시예에서, 하나 이상의 웰 삽입체(150) 중 어느 것도 서로 부착되지 않는다. 또 다른 실시예에서, 하나 이상의 웰 삽입체는 어플리케이션을 기초로 하여 다양한 조합으로 서로 결합될 수 있다. 예컨대, 하나 이상의 웰 삽입체는 대략 384, 96, 48, 24, 12, 6 등의 그룹으로 결합될 수 있다.
추가적인 실시예에서, 도 4에 도시된 바와 같이, 웰(115)은 웰의 저면부에 세포 배양 표면(126)을 구비할 수 있다. 실시예에서, 세포 배양 표면은 마이크로 웰(125)의 어레이를 가진 구조화된 표면(113)에 적어도 일부에서 구비된다.
전술된 바와 같이, 세포 배양 장치(100)의 구조화된 표면(113)은 임의의 적당한 크기와 형상을 가질 수 있는 마이크로 웰(125)의 임의의 적당한 갯수를 한정할 수 있다. 마이크로 웰(125)은 그 크기와 형상을 기초로 하여 부피를 한정한다. 여러 실시예에서, 하나 이상 또는 모든 웰(125)은 길이방향 축 둘레를 대칭적으로 회전할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 하나 이상 또는 모든 웰(125)의 길이방향 축은 서로 평행하다. 마이크로 웰(125)은 균일 혹은 불균일하게 이격될 수 있다. 바람직하기로, 마이크로 웰(125)은 균일하게 이격되어 있다. 하나 이상 또는 모든 마이크로 웰(125)은 동일한 크기와 형상을 가질 수 있거나 상이한 크기와 형상을 가질 수 있다.
어떤 실시예에서, 웰(115)은 주 표면(112) 아래로 연장된 웰의 저면부를 한정하는 기질(110)로 한정될 수 있다. 하나 이상의 웰(115) 중 각각의 웰은 내부면(112)과 외부면(114) 및 상부 구멍(118)을 한정한다. 몇몇 실시예에서, 웰(115)은 기질(110)을 통해 가스 투과성일 수 있다. 기질(110)을 지나 외부면(114)까지 웰(115)의 가스 투과성은 부분적으로 기질의 재료와 웰(115)에 따른 기질의 두께에 종속될 것이다. 예컨대, 웰의 가스 투과성은 미국 가출원 제US 62/072,088호에 기술되었듯이 본 발명과 상충되지 않는 범위 내에서 본 명세서에 참고로 병합된다.
웰의 내부면은 상부 구멍(118)과 대향되는 천저(116;nadir) 또는 저점을 한정한다. 도 3을 참조로 하여, 웰(115)은 천저(116)에서 상부 구멍(118)까지의 높이로 한정된 깊이(d)를 갖는다. 웰(115)은 또한 상부 구멍(118)으로 한정된 웰을 가로지르는 직경, 폭 등과 같은 직경 크기(W)를 갖는다. 웰은 임의의 적당한 깊이(d)와 직경 크기(W)를 가질 수 있다. 몇몇 실시예에서, 웰을 형성하는 재질과 함께, 웰의 깊이(d), 직경 크기(W), 및 형상은 세포가 성장할 수 있는 부피를 한정하는 역할을 한다.
몇몇 실시예에서, 기술된 웰(115)은 대략 200 마이크로미터에서 대략 500 마이크로미터까지의 범위에 직경 크기(W)를 갖는다. 이러한 직경 크기는 내부에서 성장된 스페로이드(130)의 크기를 조절하여 스페로이드(130) 내부에 세포가 건강한 상태로 유지된다. 몇몇 실시예에서, 웰(115)은 대략 100 마이크로미터에서 대략 500 마이크로미터까지의 범위에 깊이(d)를 갖는다. 물론, 최대 3000 마이크로미터 또는 그 이상과 같은 다른 적당한 크기도 사용될 수 있다.
몇몇 실시예에서, 웰(115)의 내부면은 세포에 비점착성이다. 웰(115)은 비점착성 웰을 형성하기 위해 비점착성 재질로 형성되거나 비점착성 재질로 코팅될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 비점착성 재질은 초저밀착성 재질로 기술될 수 있다. 비점착성 재질의 일례는 퍼플루오르화 중합체(perfluorinated polymer), 올레핀(olefins), 또는 유사한 중합체, 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 다른 일례는 아가로스(agarose), 폴리아크릴아미드(polyacrylamide)와 같은 비이온성의 히드로겔, 폴리에틸렌옥사이드(polyethyleneoxid)와 같은 폴리에테르(polyether), 또는 폴리비닐알코올(polyvinylalcohol)과 같은 폴리올(polyol), 또는 이와 유사한 재질 또는 이들의 혼합물을 포함한다. 예컨대, 비점착성 웰, 웰의 기하학적 구조, 중력의 조합은 웰에서 배양될 세포가 스페로이드(130)로 자가 조립되도록 유도할 수 있다. 몇몇 스페로이드(130)는 단층에서 성장된 세포에 비해서 반응과 같은 생체 내에서의 분화된 세포 기능을 유지할 수 있다.
도 4에 도시되었듯이, 내부면(120)은 상부 구멍(118)에서 천저(116)까지 다양한 다른 형상으로 한정할 수 있다. 예컨대, 몇몇 실시예에서, 하나 이상의 웰(115)은 반구 또는 오목면과 같은 아치형 표면, 라운딩 저부면을 가진 원추형 표면, 이와 유사한 표면 기하학 구조, 또는 이들의 조합으로 한정될 수 있다. 웰(115)의 천저(116)는 딤플(dimple), 피트(pit) 및 이와 유사한 오목한 절두형 원뿔 릴리프 표면, 또는 이들의 조합과 같은 스페로이드 유도 라운딩 또는 곡선 표면에서 결과적으로 마감처리, 종결 혹은 바닥을 칠 수 있다. 가스 투과성 스페로이드에 적합한 웰의 다른 형상과 구조는 미국 특허출원 제US 14/087,906호에 기술되는데, 본 발명과 상충되지 않는 범위 내에서 본 명세서에 참고로 병합된다
몇몇 실시예에서, 내부면(120)은 편평하거나 포인트(point)로 될 수 있다. 내부면(120)은 다른 적합한 형상 또는 크기를 가질 수 있다.
몇몇 실시예에서, 메쉬(170)는 세포가 웰(115) 내로 시딩될 때 개별 세포들이 메쉬(170)를 통과할 수 있게 구성될 수 있다. 예컨대, 세공(171)은 개별 세포보다 큰 평균 세공 크기로 한정될 수 있다. 하지만, 세포가 스페로이드(130)로 형성된 이후에, 스페로이드(130)는 너무 커져서 메쉬(170)를 통과할 수 없게 된다. 일단 스페로이드(130)가 메쉬(170)와 내부면(120)의 천저(116) 사이에 위치선정되면, 메쉬(170)는 또한 실수 가능성을 감소시켜 사용자 효율을 증가시키는 데에 도움을 줄 것이다. 예컨대, 메쉬(170)의 존재는 피펫(pipette)을 스페로이드(130)와 접촉되는 것을 방지한다. 더욱이, 메쉬(170)는 웰(115)에서 회수되거나 주입되는 배지의 유동을 확산시키기 위해 도울 수 있다. 이러한 확산은 와류가 스페로이드(130)를 방해하지 않도록 도움을 줄 수 있다.
몇몇 실시예에서, 웰 둘레에 기질의 두께와 형상은 내부면 내부와 외부면의 외부로 통과하는 빛의 굴절을 보정할 수 있게 구성되어 있다. 예컨대, 형상과 두께는 미국 가출원 제 US 62/072,019호에 기술되는데, 본 발명과 상충되지 않는 범위 내에서 본 명세서에 참고로 병합된다.
몇몇 실시예에서, 웰 삽입체(150)는 유체 투과 메쉬(170)와 프레임(160)을 구비할 수 있다. 도 3에 도시된 바와 같이, 메쉬(170)가 천저(116)에서 거리(119) 만큼 웰(170) 내에 위치되도록 웰 삽입체(150)는 웰(115) 내부로 적어도 부분적으로 삽입되도록 구성된다. 웰 삽입체(150)가 웰(115) 내에 위치선정될 때에, 프레임(160)은 메쉬(170)와 결합되고 천저(116)와 떨어져 연장될 수 있다. 프레임(160)은 웰(115)의 내외부에 웰 삽입체(150)를 위치선정을 돕는 데에 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 프레임(160)은 천저(116)에서 거리(119)만큼 메쉬(170)를 위치선정되도록 구성될 수 있다. 예컨대, 프레임(160)은 웰의 상부 엣지(121)와 접촉하여 천저(116)에서 거리(119)만큼 메쉬(170)를 위치선정하도록 한다. 다른 실례에서, 세포 배양 조립체(100)는 메쉬(170)가 천저(116)에서 원하는 거리(119)에 위치선정되도록 프레임(160)과 접촉하는 지지부를 구비할 수 있다. 다른 실시예에서, 메쉬(170)는 웰(115)의 내부면(120)과 접촉될 수 있어서, 메쉬(170)가 천저(116)로부터의 거리(119)를 조절할 수 있다.
도 4에 도시된 바와 같이, 웰(115)은 웰(115)의 내부면을 따라 세포 배양 표면(126) 상에 적어도 하나의 마이크로 웰(125)을 구비할 수 있다. 몇몇 실시예에서, 다수의 마이크로 웰(125)은 웰(115)의 내부면(120)을 따라 위치선정된다. 마이크로 웰(125)은 앞서 기술된 웰(115)과 같은 유사한 특징을 가질 수 있다. 선택가능하기로, 세포 배양 장치는 저장조를 구비할 수 있으며 저장조는 본 명세서에 기술된 바와 같이 다수의 웰을 구비할 수 있다. 도 4에 도시된 바와 같이, 웰(115)은 도 3과 유사하게 웰(115)의 상부 구멍과 웰(115)의 내부면(120) 사이에 위치된 웰 삽입체(150)를 수용할 수 있다.
몇몇 실시예에서, 세포 배양 조립체(500)는 도 5에 도시된 바와 같이 웰(515,525)의 어레이를 갖춘 저장조(521)와, 유체 투과 메쉬(570) 및 메쉬(570)와 결합되는 프레임(560)을 구비할 수 있다. 프레임(560)은 제1 웰(515)의 적어도 일부 위의 위치에 메쉬(570)를 지지보유하도록 구성될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 메쉬(570)는 제1 웰(515)의 상부 엣지(520) 상에 배치되도록 구성된다. 몇몇 실시예에서, 세포 배양 조립체(500)는 제2 웰(525)를 구비할 수 있으며 메쉬(570)는 제2 웰(525) 상에 위치선정되도록 구성된다.
기술되었듯이, 웰 삽입체는 세포 배양 컨테이너 웰(115) 내에 스페로이드를저장하는 것을 돕기 위해 사용될 수 있는데, 즉 웰(115) 내에 세포 배양 배지를 교환하는 공정 중에 웰(115)에서 스페로이드의 유출을 방지한다. 몇몇 실시예에서, 세포 배양 장치(100)는 웰 삽입체(150, 예컨대 도 2a)가 웰(115)의 적어도 일부에 위치선정되는 경우에 세포 배양 배지를 제거하기 위해 기울일 수 있다. 다른 실시예에서, 피펫은 웰 삽입체(150)가 웰(115)의 적어도 일부에 위치선정되는 경우에 세포 배양 배지를 제거하기 위해 사용될 수 있다. 피펫과 조합된 웰 삽입체(150)의 사용은 스페로이드에 영향을 미치는 피펫의 위험성을 줄일 수 있는바, 예컨대 피펫은 스페로이드를 흡입할 수 없다.
도 6은 사인곡선 혹은 포물선 형상을 가질 수 있는 마이크로 웰(601)의 어레이를 도해한다. 이러한 사인곡선 또는 포물선의 웰 형상은 라운딩 상부와 라운딩 웰 저면부를 가진다. 도 6에 도시된 바와 같이, 웰(615)은 상부 직경(Dtop)을 가진 상부 개방부와, 웰(616)의 저면부에서 웰의 상부까지의 높이(H), 및 웰의 상부와 웰의 저면부(616) 사이에 높이 중간(613)에서의 웰의 직경(Dhalf-way)을 갖는다. 실시예에서, 세포 배양 컨테이너의 웰 어레이는 일단 세포가 삽입체와 세포 배양 웰의 저면부 또는 천저 사이에서 포획되면 스페로이드의 형성을 유도하기 위해 웰 어레이 내부에 도 6 및 도 7에 도시된 바와 같은 구조를 가진 마이크로 웰 어레이를 추가로 구비할 수 있다.
도 7은 마이크로 웰 어레이의 개략도이다. 도 7은 구조화된 표면(113)에 어레이로 배열된 다수의 마이크로 웰(615)을 도해한다. 또한, 도 7은 다수의 마이크로 웰(615)에 거주하는 다수의 스페로이드(500)를 도시한다. 실시예에서, 세포 배양 컨테이너의 천저 또는 세포 배양 표면, 예컨대 96 웰 플레이트의 웰의 바닥은 스페로이드의 형성을 유도하는 마이크로 웰 어레이를 갖춘 기질일 수 있다. 이는 또한 구조화된 저면부로 불려진다.
세포 배양 장치의 웰로부터 배양 배지를 제거하는 방법(800)이 도 8에 도해된다. 웰은 천저를 포함한 내부면을 한정한다. 삽입체의 단부는 삽입체의 공동부와 유체연통하는 개방부를 한정하는 삽입체의 단부를 웰 내부에 배치된다(810). 삽입체는 개방부를 가로질러 배치된 유체 투과 메쉬를 구비하고, 삽입체의 단부는 메쉬가 천저에서 거리만큼 위치선정되도록 웰 내부에 배치된다. 유체 제거 장치의 팁부는 삽입체의 공동부 내로 삽입되되(820), 팁부는 메쉬로부터 천저까지의 적어도 거리만큼 천저에서 거리를 갖는다. 유체는 유체 제거 장치를 지나 유체를 회수하여 웰로부터 제거된다(630). 도 8은 본 명세서에 기술된 바와 같은 장치의 실시예를 사용하는 예시적인 방법(800)을 개략적으로 도해한다. 첫번째로, 단계(810)에서, 방법은 메쉬가 천저에서 거리만큼 위치선정되도록 삽입체의 단부를 웰 내에 배치한다. 두번째로, 단계(820)에서, 방법은 팁부가 천저에서 적어도 거리만큼 놓이도록 유체 제거 장치의 팁부를 삽입체의 공동부 내로 삽입한다. 세번째로, 단계(830)에서, 방법은 유체 제거 장치를 통해 유체를 회수하여 웰에서 유체를 제거한다.
본 명세서에 기술된 바와 같이 구조화된 저면부 표면은 임의의 적당한 물질로 형성될 수 있다. 예컨대, 기질은 구조화된 표면을 형성하도록 성형될 수 있거나, 기질 필름이 구조화된 표면을 형성하기 위해 엠보싱처리될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 바와 같이 구조화된 저면부 표면은 임의의 적당한 방식으로 세포 배양 장치 내에 조립될 수 있다. 예컨대, 구조화된 저면부 표면과 세포 배양 장치의 하나 이상의 구성부재는 단일 부품으로 몰딩될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 구조화된 저면부 표면 또는 이의 일부는 세포 배양 장치의 하나 이상의 다른 구성부재에 용접(예컨대, 열용접, 초음파 용점 등), 접착 또는 열성형된다.
본 명세서에 기술된 세포 배양 웰 삽입체는 예컨대 배지가 웰 삽입체를 스페로이드 상부 위에 수용하는 다수의 웰/챔버 상으로 유동하는 세포 배양 장치에 사용될 수 있다. 몇몇 실시예에서, 세포 배양 삽입체는 세포 배양 장치와 (예컨대, 부착 또는 일부에 형성되어) 일체로 이루어진다. 어떤 실시예에서, 웰 삽입체는 웰 내의 스페로이드가 웰로부터 빠져나와 세포 배양 관류 장치를 통해 이동하는 배지 흐름으로 유입되는 것을 방지한다. 특정한 실시예에서, 도 5에 도시된 바와 같이, 단일 삽입체가 다수의 웰을 덮기 위해 사용된다. 이러한 삽입체는 세포 배양 장치 내에 삽입되거나 단일 부품일 수 있다. 세포 배양 장치는 산소공급기를 갖추거나 없이도 사용될 수 있다. 산소공급기를 필요로 하지 않는 예시적인 세포 배양 장치(예컨대, 웰은 가스 투과성이고 공기 통로는 장치에 구비됨)는 도 8 및 도 9를 참조로 하여 아래에 기술된다.
여기에 사용된 모든 과학적 그리고 기술적 용어는 달리 명시되지 않는 한 당해분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는다. 본 명세서에 제공된 정의는 여기에서 빈번하게 사용되는 특정 용어의 이해를 용이하기 위한 것으로 본 발명의 범주를 제한하는 것은 아니다.
여기에 사용된 "하나의", "상기"라는 단수형은 내용상 명백하게 명시하지 않는다면 복수의 지시대상물을 포함한다. 예컨대, "구조화된 저면부 표면"은 내용상 명백하게 명시하지 않는다면 2개 이상의 구조화된 저면부 표면을 갖는 예를 포함한다.
본 명세서와 첨부된 청구범위에 사용된 바와 같이, "또는"이라는 용어는 일반적으로 내용상 명백하게 명시하지 않는다면 "및/또는"을 포함한 의미로 사용된다. "및/또는"이라는 용어는 나열된 요소 중 하나 또는 모두를 의미하거나 나열된 요소 중 2개 이상의 조합을 의미한다.
여기에 사용된 바와 같이, "갖추다", "갖는", "구비하다", "구비한", "이루이지다", "이루는" 또는 이와 유사한 단어는 개방적이면서 포괄적인 의미로 사용되고, 일반적으로 "구비한다. 하지만, 이에 국한되지 않는다", 또는 "구비하며, 이에 국한되지 않는" 등을 의미한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 추후 기술된 사건, 상황, 또는 구성요소가 발생할 수 있거나 발생하지 않는 것을 의미하며, 설명에는 사건, 상황, 또는 구성요소가 발생하는 실례와 발생하지 않는 실례를 포함한다.
단어 "바람직한"과 "바람직하게"는 특정 상황 하에서 어떠한 장점을 제공할 수 있는 본 발명의 실시예를 나타낸다. 하지만, 다른 실시예는 동일하거나 다른 상황 하에서 바람직할 수 있다. 덧붙여서, 하나 이상의 바람직한 실시예는 다른 실시예가 유용하지 않다는 것을 내포하지 않으며, 본 발명의 기술적 범주로부터 다른 실시예를 배제하려는 의도는 아니다.
본 명세서에서, "대략" 하나의 특정값으로부터 및/또는 "대략" 다른 특정값까지 범위가 표현될 수 있다. 이러한 범위가 표현되면, 실례는 하나의 특정값에서 및/또는 다른 특정값까지를 포함한다. 유사하게, 수치가 전에 "대략"을 사용하여 근사치로 표시되면, 특정값은 다른 양상으로 형성될 수 있는 것을 이해될 것이다. 추가로, 각 범위의 종말점은 다른 종말점과 관련하여 중요하고 다른 종말점과는 독립적인 것으로 이해될 것이다.
또한, 종말점에 의한 수치 범위의 인용은 범위 내에 포함되는 모든 숫자를 포함한다(예컨대, 1 내지 5는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.80, 4, 5 등을 포함한다). 수치 범위가 "초과", "미만" 등의 경우에, 특정값은 범위 내에 포함된다.
여기에 기술된 임의의 방향, "상단", "바닥", "좌측", "우측", "상부", "하부", "위에", "아래에" 및 다른 방향과 방위는 도면을 참조하여 명확하게 기술되며 실제 장치 또는 시스템, 혹은 장치 또는 시스템의 사용을 제한하지는 않는다. 여기에 기술된 많은 장치, 물품 또는 시스템은 다양한 방향과 방위에서 사용될 수 있다. 세포 배양 장치와 관련하여 여기에 사용된 방향 설명은 종종 장치가 장치 내에 세포 배양을 목적으로 배향된 경우에 방향을 의미한다.
달리 명시적으로 언급하지 않는 한, 본 명세서에 기재된 임의의 방법은 단계가 특정 순서에서 실행되어야 하는 것으로 해석해서는 안 된다. 따라서, 방법 청구항은 실제로 단계들에 의해 따라야 할 순서를 실제로 내포하지 않거나, 청구항 또는 상세한 설명에서 단계들이 특정 순서로 한정되어야 한다고 특정되게 기술하지 않는다면, 임의의 특정 순서가 유추되어야 하는 것으로 의미하지는 않는다
여기에서 인용은 특정 방식으로 기능하도록 구성되거나 적용되는 구성요소를 지칭하고 있음에 주목해야 한다. 이와 관련하여, 이러한 구성요소는 특정 용도 또는 특정 방식에서의 기능을 구체화하기 위해 구성되거나 적용되되, 여기서 이러한 인용은 의도된 용도와 반대되는 구조적 인용이다. 더욱 특별하기로, 구성요소가 구성되거나 적용되는 방식에 대한 참조는 구성요소의 현존하는 물리적 조건을 나타내며, 구성요소의 구조적 특정을 명확하게 인용하는 것으로 간주된다.
특정 실시예의 다양한 특징, 요소 또는 단계가 전이 문구를 사용하여 기재될 수 있지만, 구성되거나 본질적으로 구성되는 전이 문구를 사용하여 기술될 수 있는 선택적인 실시예가 내포되는 것으로 이해되어야 한다. 그러므로, 예컨대, 프레임과 메쉬로 이루어진 삽입체에 대한 선택적인 실시예는 프레임과 메쉬로 구성되는 삽입체의 실시예와 프레임과 메쉬로 본질적으로 구성되는 삽입체의 실시예를 포함한다.
다양한 변경과 변경이 본 발명의 사상과 범주를 벗어나지 않고 본 명세서에서 이루어질 수 있음은 당해분야의 숙련자들에게 있어 명백해질 것이다. 이로써, 본 발명이 첨부된 청구 범위의 범주 및 그 균등물 내에 속한다면 여기에 기재된 변형과 변경을 보호하는 것으로 의도된다.

Claims (29)

  1. 개방부와 천저를 갖춘 적어도 하나의 웰(well)을 구비한 세포 배양 컨테이너와;
    상기 세포 배양 컨테이너의 상기 적어도 하나의 웰 내부에 끼워지도록 구성되고, 제1 개방단부 및 개방부를 갖춘 제2 단부를 구비하는 삽입체, 여기서 상기 제1 개방단부와 상기 제2 단부는 이들 사이에 공동부를 한정함;로 이루어지고,
    여기서, 상기 제2 단부는 유체 투과 메쉬(mesh)를 구비하고,
    여기서, 상기 세포 배양 컨테이너는 세포 배양 표면을 구비하고, 상기 세포 배양 표면은 마이크로 웰(microwell)의 어레이(array)를 갖춘 기질(substrate)로 이루어져 있고, 상기 마이크로 웰의 어레이는 웰에서 배양된 세포가 마이크로 웰의 어레이의 마이크로 웰에서 스페로이드를 형성하도록 구성되고, 각각의 마이크로 웰은 상단 구멍, 측벽, 및 가스 투과성 저면부를 포함하고, 여기서 상기 저면부의 적어도 일부는 세포에 대해 비점착성인, 세포 배양 조립체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 메쉬는 10 마이크로미터에서 200 마이크로미터까지의 범위에 평균 세공 크기의 세공을 구비하는, 세포 배양 조립체.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 메쉬의 세공은 메쉬를 통한 개별 세포의 통과를 허용하고 메쉬를 통한 마이크로 웰의 어레이에 형성된 스페로이드의 통과를 방지하는 크기인, 세포 배양 조립체.
  4. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 삽입체는 상기 제1 개방단부에서 상기 제2 단부로 연장되는 측벽 또는 다수의 지지부를 추가로 구비하는, 세포 배양 조립체.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 측벽의 적어도 일부는 상기 메쉬로 이루어져 있는, 세포 배양 조립체.
  6. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 삽입체는 상기 제1 개방단부에서 연장되는 하나 이상의 플랜지를 추가로 구비하는, 세포 배양 조립체.
  7. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 웰은 상부 엣지(edge)를 추가로 한정하고,
    상기 삽입체의 상기 제1 개방단부는 상기 천저에서 소정의 거리만큼 이격되게 상기 메쉬를 위치선정하기 위해 상기 웰의 상부 엣지와 접촉하는, 세포 배양 조립체.
  8. 청구항 7에 있어서,
    지지부를 추가로 구비하고,
    상기 삽입체는 상기 천저에서 소정의 거리만큼 이격되게 상기 메쉬를 위치선정하기 위해 상기 지지부와 접촉하는, 세포 배양 조립체.
  9. 청구항 1에 있어서,
    상기 메쉬는 40 마이크로미터 이하의 평균 세공 크기로 이루어진, 세포 배양 조립체.
  10. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 웰은 상기 개방부에서 상기 천저까지 원뿔형상으로 이루어져 있는, 세포 배양 조립체.
  11. 청구항 1 또는 2에 있어서,
    상기 삽입체의 내부면의 적어도 일부는 상기 삽입체의 내부면에 세포의 점착을 방지하기 위해 처리되거나 코팅되는, 세포 배양 조립체.
  12. 청구항 1 또는 2에 따른 세포 배양 조립체 내에서 스페로이드 세포를 배양하는 방법으로서,
    웰 내에 삽입체를 위치선정하는 단계;
    상기 삽입체의 공동부 내에 세포와 배지를 주입하는 단계,
    세포를 상기 삽입체의 메쉬에 통과시키고 상기 웰의 상기 천저와 상기 삽입체의 상기 메쉬 사이의 공간에서 스페로이드(spheroid)의 형성을 허용함;를 포함하는, 세포 배양 조립체 내에서 스페로이드 세포를 배양하는 방법.
  13. 청구항 1 또는 2에 따른 세포 배양 조립체로부터 배지를 제거하는 방법으로서,
    웰 내에 삽입체를 위치선정하는 단계;
    상기 삽입체의 공동부 내에 세포와 배지를 주입하는 단계,
    세포를 상기 삽입체의 메쉬에 통과시키고 상기 웰의 천저와 상기 삽입체의 메쉬 사이의 공간에서 스페로이드(spheroid)의 형성을 허용함;
    상기 삽입체 위의 웰로부터 배지를 제거하는 단계;를 포함하는, 세포 배양 조립체로부터 배지를 제거하는 방법.
  14. 구멍, 측벽 및 천저를 포함하는 웰;
    여기서, 상기 천저는 마이크로 웰의 어레이를 포함하며, 상기 마이크로 웰의 어레이는 웰에서 배양된 세포가 마이크로 웰의 어레이의 마이크로 웰에서 스페로이드를 형성하도록 구성되고, 각각의 마이크로 웰은 상단 구멍, 측벽, 및 가스 투과성 저면부를 포함하고, 여기서 상기 저면부의 적어도 일부는 세포에 대해 비점착성임;
    구멍, 프레임 및 세공을 포함하는 유체 투과 메쉬를 포함하는 삽입체;를 포함하며,
    여기서, 상기 세공은 10 마이크로미터 내지 100 마이크로미터 범위의 평균 세공 크기를 포함하며, 상기 삽입체는 상기 천저로부터 이격되어 웰의 적어도 일부분 내에 위치되도록 구성되는, 세포 배양 조립체.
  15. 청구항 14에 있어서,
    상기 메쉬의 세공은 스페로이드가 메쉬를 통해 통과하는 것을 방지하도록 구성된, 세포 배양 조립체.
  16. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    상기 웰은 상부 엣지를 추가로 한정하며, 상기 프레임은 천저에서 이격되게 메쉬를 위치시키기 위해 상부 엣지와 접촉하는, 세포 배양 조립체.
  17. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    지지부를 추가로 포함하며, 상기 프레임은 상기 천저로부터 이격되게 메쉬를 위치시키기 위해 상기 지지부와 접촉하는, 세포 배양 조립체.
  18. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    세공은 40 마이크로미터 이하의 평균 세공 크기를 포함하는, 세포 배양 조립체.
  19. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    상기 웰의 내부면은 구멍으로부터 천저까지 원뿔 형상을 포함하는, 세포 배양 조립체.
  20. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    상기 메쉬는 원형을 포함하는, 세포 배양 조립체.
  21. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    상기 메쉬는 사각형을 한정하는, 세포 배양 조립체.
  22. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    다수의 웰을 더욱 포함하며, 상기 삽입체는 다수의 삽입체를 포함하고, 상기 삽입체 각각은 다수의 웰의 웰들 중 다른 하나의 적어도 일부에 위치되도록 구성되는, 세포 배양 조립체.
  23. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    상기 웰의 내부면은 세포에 대해 비점착성인, 세포 배양 조립체.
  24. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    상기 프레임 중 적어도 일부는 메쉬를 포함하는, 세포 배양 조립체.
  25. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    상기 프레임은 상기 유체 투과 메쉬와 결합되는 적어도 하나의 지지 와이어를 포함하는, 세포 배양 조립체.
  26. 청구항 14 또는 15에 있어서,
    상기 웰은 내부면을 따라 적어도 하나의 보조-웰을 포함하는, 세포 배양 조립체.
  27. 청구항 14에 따른 세포 배양 조립체 내에서 스페로이드 세포를 배양하는 방법으로서,
    웰에 삽입체를 위치선정하는 단계;
    상기 삽입체의 공동부로 세포 및 배지를 주입하는 단계,
    세포를 상기 삽입체의 메쉬에 통과시키고 상기 웰의 천저와 상기 삽입체의 메쉬 사이의 공간에서 스페로이드의 형성을 허용함;를 포함하는, 세포 배양 조립체 내에서 스페로이드 세포를 배양하는 방법.
  28. 청구항 14에 따른 세포 배양 조립체로부터 배지를 제거하는 방법으로서,
    웰에 삽입체를 위치선정하는 단계;
    상기 삽입체의 공동부로 세포 및 배지를 주입하는 단계,
    세포를 상기 삽입체의 메쉬에 통과시키고 상기 웰의 천저와 상기 삽입체의 메쉬 사이의 공간에서 스페로이드의 형성을 허용함;
    상기 삽입체 위의 웰로부터 배지를 제거하는 단계;를 포함하는, 세포 배양 조립체로부터 배지를 제거하는 방법.
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