CN115141752A - 细胞培养与原位检测容器及制备方法、细胞原位检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种细胞培养与原位检测容器及制备方法、细胞原位检测方法，细胞培养与原位检测容器包括：容器基板，所述容器基板的表面开设有一个或多个用于对细胞进行培养和原位检测的曲面凹陷结构，所述曲面凹陷结构的表面偶联有正电荷基团；金纳米粒子，表面包裹有负电荷材料，与所述正电荷基团相互吸附。根据表面增强拉曼散射效应将金纳米粒子偶联在细胞培养容器表面，从而扩大癌细胞与正常细胞在培养过程中的生长形态差异，且实现对细胞的原位拉曼检测。实现了在本领域对细胞原位分析的效率、便携程度、稳定性以及精度的有效提高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生化成分分析技术领域，具体地，涉及一种细胞培养与原位检测容器及其制备方法，以及基于微加工工艺与拉曼光谱技术的细胞原位检测方法。
背景技术
拉曼光谱技术是目前生物医学研究领域中常用的检测技术，可用于目标样品的生化成分分析，尤其广泛应用于癌细胞的筛查与分选。
PDMS(Polydimethylsiloxane，聚二甲基硅氧烷)，用于微流控芯片制造的一种聚合物。
目前应用于细胞分析的传统拉曼光谱检测技术是在培养皿内培养目标细胞，然后取其样本与胶体金溶液混合，从而实现对目标细胞的高灵敏度拉曼检测。其中培养皿是一种用于微生物或细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般由玻璃或塑料制成；胶体金溶液即悬浮在水溶液中的金纳米粒子，其制备原理是利用柠檬酸三钠从煮沸的氯金酸溶液中还原出单质金纳米粒子，后续再通过离心完成富集，制备出胶体金。
然而传统技术路线存在以下三个不足之处：1、胶体金在使用前需在4℃下避光保存，且由于是液体状态，其环境稳定性较为不佳；2、使用胶体金作为细胞拉曼检测的增强基底时，细胞会出现胞吞金纳米粒子的情况，因此细胞拉曼信号的增强效果会受到较大干扰；3、传统技术路线中细胞培养与细胞检测需在两个平台上分别进行，因此其实验流程较为繁琐，平台集成度有待提高。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种细胞培养与原位检测容器及制备方法、细胞原位检测方法。
根据本发明提供的一种细胞培养与原位检测容器，包括：
容器基板，所述容器基板的表面开设有一个或多个用于对细胞进行培养和原位检测的曲面凹陷结构，所述曲面凹陷结构的表面偶联有正电荷基团；
金纳米粒子，表面包裹有负电荷材料，与所述正电荷基团相互吸附。
优选地，所述容器基板的材质包括PDMS。
优选地，所述曲面凹陷结构的形状包括半球形。
优选地，所述曲面凹陷结构的深度为50-150μm，最大截面直径为75-225μm。
优选地，所述曲面凹陷结构的最大截面直径大于深度。
根据本发明提供的一种细胞培养与原位检测容器的制备方法，包括：
步骤S1、制备得到表面开设有一个或多个用于对细胞进行培养和原位检测的曲面凹陷结构的容器基板；
步骤S2、将所述容器基板浸入带有正电荷基团的溶液中，使得所述曲面凹陷结构的表面偶联上正电荷基团；
步骤S3、将所述容器基板置于胶体金中，使得所述正电荷基团与周围包裹负电荷的金纳米粒子相互吸附。
优选地，所述带有正电荷基团的溶液包括3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液。
优选地，所述步骤S2包括：
先对所述容器基板的所述曲面凹陷结构进行氧等离子体表面活化处理，再将所述容器基板浸入带有正电荷基团的溶液中。
优选地，所述胶体金通过柠檬酸钠还原法制备得到。
根据本发明提供的一种细胞原位检测方法，利用所述的细胞培养与原位检测容器，将待测细胞加入所述曲面凹陷结构中孵育，再用光谱仪对所述曲面凹陷结构中的待测细胞进行原位检测。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1、通过静电吸附将金纳米粒子固定在曲面凹陷结构内壁，摆脱了液体环境，具有优异的环境稳定性。
2、静电吸附效应使原先游离在液体环境中的金纳米粒子稳定地固定于曲面凹陷结构内壁，可有效规避细胞对游离颗粒的胞吞效应，保障了拉曼信号的增强效果与稳定性。
3、通过本发明将细胞培养与细胞检测两个实验环节集成在了一个平台上进行，提升了实验流程的集成度与便携性。
4、曲面凹陷结构的曲面内壁会使正常细胞与癌细胞出现生长形态上的显著差异，正常细胞具有完好的细胞骨架结构，不易被曲面内壁改变其生长形态，因此倾向于以原形态在培养基中悬浮生长；而癌细胞的细胞骨架组织普遍受损，弹性降低且易变形，因此倾向于适应曲面内壁的几何形状并稳定黏附在内壁上。这一生长形态的显著差异进一步提升了细胞分选的灵敏度与准确度。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1是制作细胞培养容器的模板的俯视图；
图2是制作细胞培养容器的模板的侧视图；
图3是细胞培养容器的俯视图；
图4是细胞培养容器的侧视剖面图；
图5为半球状凹槽内表面结合金纳米粒子后的细胞培养容器的俯视原理图；
图6为本发明的实物显微图；
图7为本发明实现细胞原位分析的流程图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
如图3、图4所示，本实施例提供一种细胞培养与原位检测容器，包括：容器基板1，容器基板1的材质采用PDMS，容器基板1的表面开设有用于对细胞进行培养和原位检测的曲面凹陷结构2，曲面凹陷结构2的表面偶联有正电荷基团。而金纳米粒子的表面包裹有负电荷材料，通过静电吸附将金纳米粒子稳定地固定于曲面凹陷结构2的内壁。曲面凹陷结构2的数量可以是一个，也可以是多个，其分布方式也根据实际需求确定，本发明对此不做限制。由于正常细胞与癌细胞有不同细胞骨架组织的特性，正常细胞具有完好的细胞骨架结构，不易被曲面内壁改变其生长形态，因此倾向于以原形态在培养基中悬浮生长；而癌细胞的细胞骨架组织普遍受损，弹性降低且易变形，因此倾向于适应曲面内壁的几何形状并稳定黏附在内壁上。这一生长形态的显著差异进一步提升了细胞分选的灵敏度与准确度。在本实施例中，优选半球状凹陷结构，但本发明对此不做限制。
通常来说，单个细胞的尺寸一般在几微米至几十微米，因此为了使半球状凹陷结构内壁对细胞的相对曲率足够大，半球状凹陷结构的尺寸不能过大；同时受限于微加工工艺的分辨率，半球状凹陷结构尺寸不能过小。设计最大截面直径大于深度，从而便于对凹槽内的细胞进行拉曼光谱检测。在本实施例中，半球状凹陷结构深度的范围值应为50μm～150μm，最大截面直径范围保持深度的1.5倍同比变化。
实施例2
本实施例提供了实施例1所述细胞培养与原位检测容器的一种制备方法：
步骤1：制备细胞培养与原位检测容器模板，模板如图1和图2所示，利用双光子3D打印技术制作，其上带有一系列高度为100μm，底部直径为150μm的半球状凸起结构。
步骤2：利用PDMS芯片倒模工艺，通过模板制备出具有多个半球状凹陷结构的PDMS容器基板，如图3和图4所示，容器基板上有对应的一系列深度为100um，最大截面直径为150um的半球状凹陷结构。
步骤3：将容器基板的半球状凹陷结构进行氧等离子体表面活化处理后，浸入APTES(3-氨丙基三乙氧基硅烷)溶液中静置1小时以偶联上APTES基团，此时的半球状凹陷结构内壁将携带正电荷。
步骤4：利用柠檬酸三钠还原法制备胶体金，金纳米粒子周围包裹带负电荷的柠檬酸根。
步骤5：将内壁携带正电荷的半球状凹陷结构浸入胶体金溶液中静置1小时，由于金纳米粒子周围包裹着带负电荷的柠檬酸根，其会与半球状凹陷结构内壁上携带正电荷的APTES基团产生静电吸附，金纳米粒子就被结合到了半球状凹陷结构的内壁上。结合了金纳米粒子的半球状凹槽的俯视图如附图5所示。
实施例3
本实施例提供一种细胞培养与原位检测方法，在实施例1的细胞培养与原位检测容器，或者实施例2方法制备得到的细胞培养与原位检测容器的基础上，将待测细胞通过移液枪滴加到半球状凹槽内，孵育两至三小时以保证细胞在凹槽内的充分生长，最后利用共聚焦拉曼光谱仪对目标细胞进行原位的拉曼检测以表征其生化成分。本发明的实物显微图如附图6所示，其实现细胞原位检测的流程图如附图7所示。
在本申请的描述中，需要理解的是，术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本申请和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本申请的限制。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。
Claims (10)
1.一种细胞培养与原位检测容器，其特征在于，包括：
容器基板，所述容器基板的表面开设有一个或多个用于对细胞进行培养和原位检测的曲面凹陷结构，所述曲面凹陷结构的表面偶联有正电荷基团；
金纳米粒子，表面包裹有负电荷材料，与所述正电荷基团相互吸附。
2.根据权利要求1所述的细胞培养与原位检测容器，其特征在于，所述容器基板的材质包括PDMS。
3.根据权利要求1所述的细胞培养与原位检测容器，其特征在于，所述曲面凹陷结构的形状包括半球形。
4.根据权利要求1所述的细胞培养与原位检测容器，其特征在于，所述曲面凹陷结构的深度为50-150μm，最大截面直径为75-225μm。
5.根据权利要求1所述的细胞培养与原位检测容器，其特征在于，所述曲面凹陷结构的最大截面直径大于深度。
6.一种细胞培养与原位检测容器的制备方法，其特征在于，包括：
步骤S1、制备得到表面开设有一个或多个用于对细胞进行培养和原位检测的曲面凹陷结构的容器基板；
步骤S2、将所述容器基板浸入带有正电荷基团的溶液中，使得所述曲面凹陷结构的表面偶联上正电荷基团；
步骤S3、将所述容器基板置于胶体金中，使得所述正电荷基团与周围包裹负电荷的金纳米粒子相互吸附。
7.根据权利要求6所述的细胞培养与原位检测容器的制备方法，其特征在于，所述带有正电荷基团的溶液包括3-氨丙基三乙氧基硅烷溶液。
8.根据权利要求6所述的细胞培养与原位检测容器的制备方法，其特征在于，所述步骤S2包括：
先对所述容器基板的所述曲面凹陷结构进行氧等离子体表面活化处理，再将所述容器基板浸入带有正电荷基团的溶液中。
9.根据权利要求6所述的细胞培养与原位检测容器的制备方法，其特征在于，所述胶体金通过柠檬酸钠还原法制备得到。
10.一种细胞原位检测方法，其特征在于，利用权利要求1所述的细胞培养与原位检测容器，将待测细胞加入所述曲面凹陷结构中孵育，再用光谱仪对所述曲面凹陷结构中的待测细胞进行原位检测。
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