JPWO2013042360A1 - 接着性細胞の培養方法 - Google Patents
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Abstract
二次元培養と同様の培養方法で生体内に近い環境下で接着性細胞を評価できるための方法、およびその用途を提供する。接着性細胞の培養方法は、培養容器（１０）として、相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１から５倍であり、高さＨが前記相当直径の０．３倍から５倍である培養空間（１１）を２つ以上配置するととともに、表面の水接触角が４５度以下である容器を使用する。培養容器（１０）に配置された複数の培養空間（１１）それぞれで接着性細胞のスフェロイドを培養する。
Description
本発明は、従来の二次元培養（平面上の培養）と同様の操作で、二次元培養では不可能であった均一なサイズの接着性細胞のスフェロイドを培養する方法に関する。
近年、細胞培養技術によって培養した細胞が薬剤の薬効試験や毒性試験に利用されるようになってきた。しかしながら、従来の培養技術で培養した細胞は、細胞が二次元方向に広がり、生体内と大きく異なった形状をしている。このため、本来の細胞機能を有しておらず、薬の生体内での挙動を反映できないといった問題があった。
そこで、近年、生体内の組織の形態を模倣したスフェロイド培養法が注目されるようになってきた。例えば、９６マルチウェルプレートの底面をロート状にしてその中に１個のスフェロイドを形成させる方法が開示されている（特許文献１）。また培養底面に、微細なハニカム構造体を形成させることで、細胞の機材に対する接着性を弱めることで、スフェロイドを形成させる手法（特許文献２）や、外因性の細胞凝集剤を用いる方法（特許文献３）などが挙げられる。
しかしながら、特許文献１の培養方法では、一つの容器内に１個のスフェロイドを浮遊した状態で形成させる。この方法では、培地交換時に細胞が脱離しやすいため、培地交換時の操作が煩雑になるといった問題がある。加えて、一つの容器内に１個のスフェロイドを形成させるため、たとえば、６、１２、２４、３８４ウェルプレート、あるいは、フラスコ形状の容器に適用するのは困難であった。
また、特許文献２，３の培養方法では、上述した培養プレートやフラスコ形状の容器に適用できる一方、スフェロイドの大きさを制御することができない。このため、均一な直径を有するスフェロイドを作成することができないという問題がある。
また、特許文献２，３の培養方法では、上述した培養プレートやフラスコ形状の容器に適用できる一方、スフェロイドの大きさを制御することができない。このため、均一な直径を有するスフェロイドを作成することができないという問題がある。
このように、従来の培養方法では、市販されているウェルプレートやフラスコ形状の容器に適用するには限界がある、もしくは、適用できるとしても、スフェロイドの直径を制御することが困難であった。そのため、各種培養容器の形状に適用可能で、かつ、スフェロイドの大きさを制御することによって、均一な直径を有する接着性細胞のスフェロイドを培養できる新たな方法が求められていた。
本発明に係る接着性細胞の培養方法の一態様は、培養容器として、相当直径が所望するスフェロイドの直径の１から５倍であり、高さが前記相当直径の０．３倍から５倍である培養空間を２つ以上配置するととともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である容器を選択する。選択した培養容器に配置された複数の培養空間それぞれで接着性細胞のスフェロイドを培養する。培養したいスフェロイドのサイズに応じた培養空間が形成された培養容器を用いることによって、培養するスフェロイドのサイズを制御する。これにより、所望のサイズのスフェロイドを得ることができる。
本発明に係る接着性細胞の培養方法の一態様において、培養空間の相当直径が１００μｍから５０００μｍの範囲であることが好ましい。加えて、隣り合う培養空間を隔てる壁の厚さが、５μｍから５０μｍの範囲であることが好ましく、隣り合う前記培養空間を隔てる壁の上面と側面とがなす角度が９０度から１３５度の範囲であることが好ましい。
また、培養したスフェロイドすべてのうち６０％以上が、培養後のスフェロイドの直径の平均値のプラスマイナス５％の範囲内の直径であることが好ましく、スフェロイドが、がん細胞であることが好ましい。
また、培養したスフェロイドすべてのうち６０％以上が、培養後のスフェロイドの直径の平均値のプラスマイナス５％の範囲内の直径であることが好ましく、スフェロイドが、がん細胞であることが好ましい。
さらに、培養容器がアクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることが好ましい。
加えて、培養空間の表面が、ガラス処理により、または、プラズマ処理で官能基を形成させることにより、水接触角を４５度以下になるように処理されたことが好ましい。
さらに加えて、培養空間の表面に、温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマーがコートされていること、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖が固定化されていること、及び、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体が固定化されていること、のうちのいずれかが実施されていることが好ましい。
加えて、培養空間の表面が、ガラス処理により、または、プラズマ処理で官能基を形成させることにより、水接触角を４５度以下になるように処理されたことが好ましい。
さらに加えて、培養空間の表面に、温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマーがコートされていること、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖が固定化されていること、及び、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体が固定化されていること、のうちのいずれかが実施されていることが好ましい。
本発明により、従来の二次元培養と同様の操作で均一なサイズの接着性細胞のスフェロイドを高密度に培養することができる。
以下、図面を参照して本発明の実施の形態について説明する。ただし、本発明が以下の実施の形態に限定される訳ではない。説明の明確化のため、以下の記載及び図面は、適宜省略及び簡略化がなされている。各図面において同一の構成または機能を有する構成要素及び相当部分には、同一の符号を付し、その説明は省略する。
図１に、本発明の実施形態に係る培養容器の構成例を示す。図２に図１のＩＩ−ＩＩ線に沿った断面図を示す。
培養容器１０は、培養空間１１と、壁１２と、底部１３とを有する。
培養空間１１は、壁１２と底部１３とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間１１は、単に「空間」または「マイクロ空間」とも称する。
壁１２は、培養空間１１を仕切る隔壁であり、培養容器１０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。
底部１３は、培養容器１０の基板として機能するとともに、培養空間１１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。
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培養空間１１は、壁１２と底部１３とで仕切られた領域であり、細胞を培養する三次元の空間領域（培養領域）となる。培養空間１１は、単に「空間」または「マイクロ空間」とも称する。
壁１２は、培養空間１１を仕切る隔壁であり、培養容器１０に凹凸パターンを形成する凸部ともいえる。
底部１３は、培養容器１０の基板として機能するとともに、培養空間１１が配置される側の表面は、培養領域（培養表面）の一部となる。
図１，２では、培養容器１０における培養空間１１に関して、相当直径Ｄ、高さＨ、壁１２の幅Ｗ（厚さ）、及び、底部１３の厚さＴを示す。図１，２では、底部１３は、壁１２と一体として作製された場合を示している。
相当直径Ｄは、培養空間１１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間１１の底部１３と平行する面の形状（正面の形状）、言い換えると、培養空間１１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間１１の正面の形状が、高さＨに応じて異なる場合、接着性細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径を相当直径とする。
高さＨは、培養空間１１の底から壁１２の上面までの長さであり、培養空間１１の深さでもあるともいえる。また、培養底面が平面の場合は高さＨは、壁１２の高さと同じである。壁１２の幅Ｗは、隣接する培養空間１１間の距離であるともいえる。
相当直径Ｄは、培養空間１１に内接する内接円の直径をいう。より詳しくは、相当直径Ｄは、培養空間１１の底部１３と平行する面の形状（正面の形状）、言い換えると、培養空間１１の高さＨの方向と垂直になる面の形状の内接円の直径をいう。培養空間１１の正面の形状が、高さＨに応じて異なる場合、接着性細胞を培養する空間領域の最大値を相当直径を相当直径とする。
高さＨは、培養空間１１の底から壁１２の上面までの長さであり、培養空間１１の深さでもあるともいえる。また、培養底面が平面の場合は高さＨは、壁１２の高さと同じである。壁１２の幅Ｗは、隣接する培養空間１１間の距離であるともいえる。
発明者らは、相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍であり、高さＨ（深さ）が相当直径Ｄの０．３倍〜５倍である培養空間１１を複数有するとともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である培養容器１０を使用し、各培養空間１１で接着性細胞を培養することによって、均一な直径の接着性細胞のスフェロイドを培養することができることを見出した。従って、所望するスフェロイドの大きさに応じて、培養容器１０に配置される培養空間１１の大きさを選択することにより、培養するスフェロイドの大きさを制御することが可能になる。
図３は、培養プレートのウェル内に本実施形態の培養容器を形成した構成例を説明する概略図である。培養プレート１は、複数のウェル２１が形成され、隣り合うウェル２１同士は仕切り部２２によって隔てられる。各ウェル２１は、培養容器１０に対応し、複数の培養空間１１と壁１２とを含む。
各ウェル２１内、言い換えると、培養容器１０内において、複数の培養空間１１は、図１に示すようにアレイ状に配置される。各ウェル２１に含まれる培養空間１１の数は、培養プレートに作製されるウェル２１の数（ウェル２１の大きさ）と培養空間１１及び壁１２の大きさに依存するものである。図３では、構成を説明するための、培養空間１１の数を少なくして表した概略図であり、各ウェル２１に含まれる培養空間１１の数は実際とは異なる。加えて、図１、２では、９個の培養空間１１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器１０（ウェル２１）に含まれる培養空間１１の数に対応するものではない。
各ウェル２１内、言い換えると、培養容器１０内において、複数の培養空間１１は、図１に示すようにアレイ状に配置される。各ウェル２１に含まれる培養空間１１の数は、培養プレートに作製されるウェル２１の数（ウェル２１の大きさ）と培養空間１１及び壁１２の大きさに依存するものである。図３では、構成を説明するための、培養空間１１の数を少なくして表した概略図であり、各ウェル２１に含まれる培養空間１１の数は実際とは異なる。加えて、図１、２では、９個の培養空間１１を示している。これは説明のために示したものであり、実際の培養容器１０（ウェル２１）に含まれる培養空間１１の数に対応するものではない。
図１〜３を参照して、所望のスフェロイドを形成させるためのマイクロオーダの培養空間１１の形状、大きさの一例と、培養表面の親水化処理方法、培養方法を詳細に説明する。
培養空間１１の相当直径について、スフェロイドの大きさが、細胞が増殖するに従いその直径が大きくなることを考慮する必要がある。そこで重要なことは、スフェロイドが隣り合う培養空間１１の細胞と接触しないような培養空間１１を確保することである。従って、培養空間１１の相当直径Ｄは、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲が好ましく、１．５〜３倍の範囲がより好ましい。
本発明の培養方法の一態様では、直径１００μｍの接着性細胞のスフェロイドを形成させるために、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、即ち、相当直径Ｄが１００〜５００μｍの範囲で、高さＨが相当直径の０．３〜５倍の範囲の培養空間１１が規則的に配置されている底部１３を有する培養容器１０を用いる。
培養空間１１の相当直径について、スフェロイドの大きさが、細胞が増殖するに従いその直径が大きくなることを考慮する必要がある。そこで重要なことは、スフェロイドが隣り合う培養空間１１の細胞と接触しないような培養空間１１を確保することである。従って、培養空間１１の相当直径Ｄは、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲が好ましく、１．５〜３倍の範囲がより好ましい。
本発明の培養方法の一態様では、直径１００μｍの接着性細胞のスフェロイドを形成させるために、所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、即ち、相当直径Ｄが１００〜５００μｍの範囲で、高さＨが相当直径の０．３〜５倍の範囲の培養空間１１が規則的に配置されている底部１３を有する培養容器１０を用いる。
例えば、接着性細胞であるがん細胞を培養する場合を検討する。非特許文献１（Juergen Friedrichら著、"Spheroid-based drug screed: considerations and pracitical approach"、Nature Protocols vol.4 No.3 2009、 pp309-324）によれば、接着性細胞を薬物のスクリーニングに用いる場合、増殖したがん細胞は、小さいものでは２００μｍ、最大のスフェロイドサイズでは、由来する臓器によってさまざまで、１０００μｍ以上に増殖するものもある。加えて、生体内における腫瘍に特徴的な腫瘍中心で起こる二次的な細胞死と類似した現象は、５００μｍ〜６００μｍのスフェロイドで見られる。これらから、培養空間１１の相当直径は、２００μｍ〜４０００μｍの範囲が好ましく、５００μｍ〜３０００μｍの範囲がより好ましい。
培養空間１１の高さＨについて、本発明の培養空間１１は、一般的な培養方法で用いる空間に比べて深い空間を用いる。具体的には、一般的な培養方法では、接着性細胞は、培養空間１１の表面との細胞接着性を強めることで、増殖・維持させている。この培養方法では、アミノ酸や酸素供給性を高めるため、本実施形態のような、培養空間１１の相当直径Ｄが所望するスフェロイドの直径の１〜５倍の範囲、高さＨが相当直径Ｄの０．３〜５倍の範囲という、深い空間では培養しない。
一方、本発明では、後述するように細胞接着性を抑制しているため、アミノ酸や酸素などの供給が可能、かつ、スフェロイドが脱離しない最適な高さＨを設計する必要がある。培養空間１１に関して、さまざまな高さＨ、相当直径Ｄを検討した結果、培養空間１１の高さＨの最適な範囲は、培養空間１１の相当直径Ｄの０．３倍〜５倍の範囲であり、０．５〜２倍の範囲がより好ましいことを見いだした。その理由の一つは、培養空間１１の高さＨは、培地交換時にスフェロイドが培養空間１１から脱離しなければよく、かつ、培地中に含まれるアミノ酸や酸素供給栄養分を十分に行うために空間の深さは浅いほどよいからである。
一方、本発明では、後述するように細胞接着性を抑制しているため、アミノ酸や酸素などの供給が可能、かつ、スフェロイドが脱離しない最適な高さＨを設計する必要がある。培養空間１１に関して、さまざまな高さＨ、相当直径Ｄを検討した結果、培養空間１１の高さＨの最適な範囲は、培養空間１１の相当直径Ｄの０．３倍〜５倍の範囲であり、０．５〜２倍の範囲がより好ましいことを見いだした。その理由の一つは、培養空間１１の高さＨは、培地交換時にスフェロイドが培養空間１１から脱離しなければよく、かつ、培地中に含まれるアミノ酸や酸素供給栄養分を十分に行うために空間の深さは浅いほどよいからである。
壁１２の幅Ｗは、培養空間１１と隣接する培養空間１１を隔てる壁１２の厚みである。従って、壁１２の幅Ｗは、壁１２の上面での細胞増殖を防ぐため、かつ、細胞が培養空間１１内に入りやすくするため、５〜５０μｍの範囲がよく、好ましくは、細胞体１個以下の大きさ、即ち５〜３０μｍの範囲が好ましく、５〜１０μｍの範囲がより好ましい。さらに、同様の観点から、壁１２の上面と培養空間１１の側面とのなす角θは、９０〜１３５度の範囲が好ましく、９０度〜１２０度の範囲がより好ましい。
図４に、培養空間１１でスフェロイドを培養する状態を表す概略図を示す。図４では、図２に示す断面図を用い、スフェロイド９を、○印で示す。スフェロイド９は、複数の培養空間１１それぞれにおいて培養される。
図３に示す培養プレート１で培養する場合、ウェル２１毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル２１に複数の培養空間１１を形成することが可能であるため、同条件で複数のスフェロイドを培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いてスフェロイドを培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
スフェロイド９の直径ＤＳＰを値ｄｓｐ（ｄｓｐは正の数値）とすると、培養空間１１の相当直径Ｄは、値ｄｓｐから値ｄｓｐの５倍の範囲（ｄｓｐ≦Ｄ≦５ｄｓｐ）となる。また、培養空間１１の高さＨは、値ｄｓｐの０．３倍から値ｄｓｐの２５倍（５×５）の範囲（０．３ｄｓｐ≦Ｈ≦２５ｄｓｐ）となる。
図３に示す培養プレート１で培養する場合、ウェル２１毎に培養条件の設定、培地の交換等を実施することになる。そのため、各ウェル２１に複数の培養空間１１を形成することが可能であるため、同条件で複数のスフェロイドを培養することが可能になる。加えて、ウェルプレートを用いてスフェロイドを培養することができるため、従来の細胞培養で用いる装置等を利用することが可能になる。
スフェロイド９の直径ＤＳＰを値ｄｓｐ（ｄｓｐは正の数値）とすると、培養空間１１の相当直径Ｄは、値ｄｓｐから値ｄｓｐの５倍の範囲（ｄｓｐ≦Ｄ≦５ｄｓｐ）となる。また、培養空間１１の高さＨは、値ｄｓｐの０．３倍から値ｄｓｐの２５倍（５×５）の範囲（０．３ｄｓｐ≦Ｈ≦２５ｄｓｐ）となる。
培養空間１１の形状（正面の形状）、あるいは、底部１３と平行な面の形状は、図１に示す形状に限定されるものではなく、例えば、図５Ａ〜５Ｂに示すような形状であっても、その他の形状（楕円や菱形など）であってもよい。より高密度で均一な直径を有するスフェロイドを形成させるためには、左右対称構造であることが好ましい。
培養空間１１の側面の形状は、図２に示す円柱状に限定されるものではなく、例えば、図６Ａ〜６Ｃに示すような形状であってもよい。
培養空間１１の側面の形状は、図２に示す円柱状に限定されるものではなく、例えば、図６Ａ〜６Ｃに示すような形状であってもよい。
培養容器１０を構成する材料としては、アクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせから選択される。
培養容器１０の底部１３の厚さＴは、観察性の観点から、１ｍｍ以下が好ましい。ただし、顕微鏡での観察に支障をきたさない限り、１ｍｍ以上であってもよく、底部１３の厚さＴを限定するものではない。培養容器の底部１３の観察性を確保することにより、培養プレートをそのまま用いて、培養したスフェロイドを観察することが可能になる。
次に培養表面の特性について説明する。培養表面は、各培養空間１１内に培地を入れるため、また、コーティング溶液を用いる場合には、その溶液が培養空間１１内に入り込まなければ表面を覆うことができないため、水接触角を４５度以下にすることが好ましい。より好ましくは０度〜２０度の範囲である。また、水接触角の値は、培養空間１１と壁１２の凹凸パターンが形成されていない平板を、培養容器１０と同条件で作製して測定した値を前提とする。
培養空間１１をアレイ状に配置した表面に関して、当該表面の疎水性が高く水接触角が４５度を超えると、すなわち濡れ性が低い場合は、培地やコート溶液を添加した際、空間に気泡が入りやすくなり、細胞が培養できない空間が生じることがある。そのため、水接触角が４５度以下になるよう、親水化を行うことが必要である。親水化する方法としては、ＳｉＯ２を蒸着する方法や、プラズマ処理を行う方法が挙げられる。
加えて、スフェロイドの形成率を向上させるために、細胞接着性を抑制した方がよい。細胞接着性を抑制するためには、水接触角が４５度以下、好ましくは４０度以下、より好ましくは２０度以下になるような表面を用いることで可能になる。細胞接着性を抑制することと、水接触角との関係については、例えば、非特許文献１（Y Ikada著、"Surface modification of polymers for medical applications"、 Biomaterials 1994, vol.15 No.10, pp725-736）に記載されている。
水接触角を４５度以下にする方法としては、ガラスを培養底面に蒸着する方法、プラズマ処理法を用いて、表面に官能基を形成させる方法が挙げられる。プラズマ処理などにより、表面に官能基を形成させる、または、光や温度により親水・疎水性が制御可能なポリマーをコートする方法を用いることができる。さらに、リン脂質・高分子複合体をコートしてもよい。上述した表面処理を行った後、ポリエチレングリコールやリン脂質−高分子複合体などの親水性ポリマーを固定化しても良い。
水接触角を４５度以下にする方法としては、ガラスを培養底面に蒸着する方法、プラズマ処理法を用いて、表面に官能基を形成させる方法が挙げられる。プラズマ処理などにより、表面に官能基を形成させる、または、光や温度により親水・疎水性が制御可能なポリマーをコートする方法を用いることができる。さらに、リン脂質・高分子複合体をコートしてもよい。上述した表面処理を行った後、ポリエチレングリコールやリン脂質−高分子複合体などの親水性ポリマーを固定化しても良い。
以下に、本発明に係る細胞培養方法の実施例について説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
［実施例１、２、比較例１］
１．培養容器の作製
実施例１，２及び比較例１について、図１，２に示す培養空間１１が規則的に配列している培養容器１０であって、以下の相当直径Ｄ、幅Ｗ、及び高さＨのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。
・実施例１：Ｄ＝１００μｍ、Ｗ＝２０μｍ、Ｈ＝５０μｍ（Ｈ／Ｄ＝０．５）
・実施例２：Ｄ＝２００μｍ、Ｗ＝２０μｍ、Ｈ＝１００μｍ（Ｈ／Ｄ＝０．５）
・比較例１：Ｄ＝２００μｍ、Ｗ＝２０μｍ、Ｈ＝５０μｍ（Ｈ／Ｄ＝０．２５）
実施例１，２，比較例１は、その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上に凹凸パターン形状の転写を行い、上記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させたフィルムを作製し、ポリスチレン製の底面のない２４穴プレートに、レーザ溶着法でフィルムを貼り付けた後、γ線滅菌を行った。このようにして、各ウェルに複数の培養空間１１を有する培養容器１０を形成した２４ウェルの培養プレートを作製した。
比較例２は、市販（ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン（登録商標））のγ線滅菌済み平面状の２４ウェル培養プレートを用いた。比較例２は、平面状で培養する、従来の二次元培養となる。
１．培養容器の作製
実施例１，２及び比較例１について、図１，２に示す培養空間１１が規則的に配列している培養容器１０であって、以下の相当直径Ｄ、幅Ｗ、及び高さＨのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。
・実施例１：Ｄ＝１００μｍ、Ｗ＝２０μｍ、Ｈ＝５０μｍ（Ｈ／Ｄ＝０．５）
・実施例２：Ｄ＝２００μｍ、Ｗ＝２０μｍ、Ｈ＝１００μｍ（Ｈ／Ｄ＝０．５）
・比較例１：Ｄ＝２００μｍ、Ｗ＝２０μｍ、Ｈ＝５０μｍ（Ｈ／Ｄ＝０．２５）
実施例１，２，比較例１は、その金型を用い、ホットエンボス成形によりポリスチレン上に凹凸パターン形状の転写を行い、上記寸法の樹脂基材を作製した。その樹脂基材表面へ真空蒸着により二酸化ケイ素膜を１００ｎｍ形成させたフィルムを作製し、ポリスチレン製の底面のない２４穴プレートに、レーザ溶着法でフィルムを貼り付けた後、γ線滅菌を行った。このようにして、各ウェルに複数の培養空間１１を有する培養容器１０を形成した２４ウェルの培養プレートを作製した。
比較例２は、市販（ベクトン・ディッキンソン製、ファルコン（登録商標））のγ線滅菌済み平面状の２４ウェル培養プレートを用いた。比較例２は、平面状で培養する、従来の二次元培養となる。
すべての培養プレートは水接触角が４５度以下であった。水接触角は、自動接触角測定装置 ＯＣＡ２０（英弘精機株式会社製）を用いて測定した。実施例１、２、及び比較例１の培養プレートについては、培養空間１１を形成する凹凸パターンのない平板のプレートを同条件で作製して水接触角を測定した。比較例２については、目視にて明らかに水接触角が４５度以下であることが確認できた。
２．細胞培養及び観察
全ての培養プレートのウェルに、１ｖｏｌ％ＭＰＣ溶液を３００μＬ入れ、４℃で２４時間放置した後、アスピレータで溶液を吸い取り、完全に乾燥させた培養プレートを用いた。
細胞はHuman HT29 Colon Cancer（ＤＳファーマバイオメディカル社）を用いた。
全ての培養プレートのウェルに、１ｖｏｌ％ＭＰＣ溶液を３００μＬ入れ、４℃で２４時間放置した後、アスピレータで溶液を吸い取り、完全に乾燥させた培養プレートを用いた。
細胞はHuman HT29 Colon Cancer（ＤＳファーマバイオメディカル社）を用いた。
培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＧＮ社製）を用い、３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２インキュベータ内で、所定の細胞数まで増殖させた。培地は、１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Fetal Bovine Serum）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle Medium）（ＳＩＧＭＡ社製）培地を用いた。培養フラスコ（ＣＯＲＮＩＧＮ社製）で、５ｖｏｌ％ＣＯ２インキュベータ内で、所定の細胞数まで増殖させた。増殖させた細胞を、０．２５ｖｏｌ％トリプシン溶液を用いて培養底面から剥離し、遠心分離法にて細胞を回収した。回収した細胞を、１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液を入れ、細胞濃度が、５００，０００個／ｃｍ２になるように細胞を播種した。その後、細胞を３７℃、５ｖｏｌ％ＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。
細胞培養後、倒立顕微鏡を用いて観察を行った。
観察結果について、スフェロイド形成率（Ａ）、スフェロイド直径平均（ＤＡｖ）、及び、スフェロイド直径の平均値±５％の直径のスフェロイドの割合（Ｂ）を以下の計算式を用いて計算した。計算結果を表１に示す。
・スフェロイド形成率Ａ（％）＝
（スフェロイドの個数）×１００／（倒立顕微鏡で観察した１視野の空間の数）
・スフェロイド直径平均ＤＡｖ（μｍ）＝
（各スフェロイドの直径の合計値）／（スフェロイド全ての数）
・スフェロイド直径の平均値±５％の直径のスフェロイドの割合Ｂ（％）＝
（平均値±５％の直径のスフェロイドの数）×１００／（スフェロイド全ての数）
観察結果について、スフェロイド形成率（Ａ）、スフェロイド直径平均（ＤＡｖ）、及び、スフェロイド直径の平均値±５％の直径のスフェロイドの割合（Ｂ）を以下の計算式を用いて計算した。計算結果を表１に示す。
・スフェロイド形成率Ａ（％）＝
（スフェロイドの個数）×１００／（倒立顕微鏡で観察した１視野の空間の数）
・スフェロイド直径平均ＤＡｖ（μｍ）＝
（各スフェロイドの直径の合計値）／（スフェロイド全ての数）
・スフェロイド直径の平均値±５％の直径のスフェロイドの割合Ｂ（％）＝
（平均値±５％の直径のスフェロイドの数）×１００／（スフェロイド全ての数）
図７〜１０に、実施例、比較例の条件で培養したスフェロイドを、倒立顕微鏡で撮影した写真を示す。
［実施例３］
１．培養容器の作製
図１，２に示す培養空間１１が規則的に配列している培養容器１０であって、以下の相当直径Ｄ、幅Ｗ、及び高さＨのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。
Ｄ＝２００μｍ、Ｗ＝２００μｍ、Ｈ＝１００μｍ（Ｈ／Ｄ＝０．５）
実施例３では、この金型と９６穴プレートとを用いたことを除いて、実施例１，２と同様の方法で培養プレートを作製し、９６ウェルの培養プレートを得た。
１．培養容器の作製
図１，２に示す培養空間１１が規則的に配列している培養容器１０であって、以下の相当直径Ｄ、幅Ｗ、及び高さＨのパターンをフォトリソグラフィにより作製し、Ｎｉ電解メッキを行い、対応する凹凸形状を有する金型を得た。
Ｄ＝２００μｍ、Ｗ＝２００μｍ、Ｈ＝１００μｍ（Ｈ／Ｄ＝０．５）
実施例３では、この金型と９６穴プレートとを用いたことを除いて、実施例１，２と同様の方法で培養プレートを作製し、９６ウェルの培養プレートを得た。
２．細胞培養及び観察
全ての培養プレートのウェルに、培養表面をマイクロ波プラズマ処理の後、燐酸緩衝液で洗浄した後、０．０１ｖｏｌ％ＭＰＣ溶液でコートした。クリーンベンチ内で室温下にて２４時間放置しＭＰＣ溶液を乾燥させた。
細胞は、ＨｅｐＧ２を用いた。
培地は１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液を用いた。培養方法は、実施例１，２と同様である。
全ての培養プレートのウェルに、培養表面をマイクロ波プラズマ処理の後、燐酸緩衝液で洗浄した後、０．０１ｖｏｌ％ＭＰＣ溶液でコートした。クリーンベンチ内で室温下にて２４時間放置しＭＰＣ溶液を乾燥させた。
細胞は、ＨｅｐＧ２を用いた。
培地は１０ｖｏｌ％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培養液を用いた。培養方法は、実施例１，２と同様である。
図１１に実施例３の結果を示す。図１１の写真に示すように、ＨｅｐＧ２を培養した場合にも培養容器１０内にスフェロイドが形成されていることが観察される。
なお、本発明は上記実施の形態に限られたものではなく、趣旨を逸脱しない範囲で適宜変更することが可能である。
この出願は、２０１１年９月２０日に出願された日本出願特願２０１１−２０４７９６を基礎とする優先権を主張し、その開示の全てをここに取り込む。
１ 培養プレート
９ スフェロイド
１０ 培養容器
１１ 培養空間
１２ 壁
１３ 底部
２１ ウェル
２２ 仕切り部
９ スフェロイド
１０ 培養容器
１１ 培養空間
１２ 壁
１３ 底部
２１ ウェル
２２ 仕切り部
Claims (14)
- 相当直径が所望するスフェロイドの直径の１から５倍であり、高さが前記相当直径の０．３倍から５倍である培養空間を２つ以上配置するととともに、該培養空間表面の水接触角が４５度以下である培養容器を使用し、複数の培養空間で接着性細胞のスフェロイドを培養する接着性細胞の培養方法。
- 前記培養空間の相当直径が１００μｍから５０００μｍの範囲である請求項１の培養方法。
- 隣り合う前記培養空間を隔てる壁の厚さが、５μｍから５０μｍの範囲であることを特徴とする請求項１または２記載の培養方法。
- 隣り合う前記培養空間を隔てる壁の上面と側面とがなす角度が９０度から１３５度の範囲であることを特徴とする請求項１乃至３のいずれか一項に記載の培養方法。
- 培養したスフェロイドすべてのうち６０％以上が、培養後のスフェロイドの直径の平均値のプラスマイナス５％の範囲内の直径であることを特徴とする１乃至４のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記スフェロイドが、がん細胞であることを特徴とする請求項１乃至５のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養容器がアクリル系樹脂、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、スチレン系樹脂、アクリル・スチレン系共重合樹脂、ポリカーボネート系樹脂、ポリエステル系樹脂、ポリビニルアルコール系樹脂、エチレン・ビニルアルコール系共重合樹脂、熱可塑性エラストマー、塩化ビニル系樹脂、及びシリコン樹脂のうちの１つまたはこれらの組み合わせからなる樹脂成形品であることを特徴とする請求項１乃至６のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養空間の表面が、ガラス処理により、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養空間の表面が、プラズマ処理により官能基を形成させて、水接触角を４５度以下になるように処理されたことを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養空間の表面に、温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマーがコートされていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養空間の表面に、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養空間の表面に、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体が固定化されていることを特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養空間の表面が、ガラス処理により、水接触角を４５度以下になるように処理した後、温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマー、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、及び、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体のうちのいずれか一つのポリマーが、前記培養容器の表面に固定化されていること特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養空間の表面が、プラズマ処理により官能基を形成させて水接触角を４５度以下になるように処理された後、温度、光のいずれかにより親水性と疎水性とが変化するポリマー、細胞接着を阻害する親水性のポリマー鎖、及び、リン脂質、または、リン脂質・高分子複合体のうちのいずれか一つのポリマーが、前記培養容器の表面に固定化されていること特徴とする請求項１乃至７のいずれか一項に記載の培養方法。
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