JP2002335949A - ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法 - Google Patents
ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法Info
- Publication number
- JP2002335949A JP2002335949A JP2001152379A JP2001152379A JP2002335949A JP 2002335949 A JP2002335949 A JP 2002335949A JP 2001152379 A JP2001152379 A JP 2001152379A JP 2001152379 A JP2001152379 A JP 2001152379A JP 2002335949 A JP2002335949 A JP 2002335949A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- honeycomb structure
- polymer
- film
- cells
- organic solvent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/14—Scaffolds; Matrices
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Manufacture Of Porous Articles, And Recovery And Treatment Of Waste Products (AREA)
- Laminated Bodies (AREA)
- Compositions Of Macromolecular Compounds (AREA)
- Biological Depolymerization Polymers (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【課題】 生体組織に類似した秩序だった細胞の三次元
集合体の形成を生体外で行うための培養法を開発するこ
と。 【解決手段】 生分解性かつ両親媒性を有する単独のポ
リマー又は生分解性ポリマーと両親媒性ポリマーとから
成るポリマー混合物の疎水性有機溶媒溶液を基板上にキ
ャストし、該有機溶媒を蒸散させると同時に該キャスト
液表面で結露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発
させることにより得られるハニカム構造体フィルム又は
その延伸フィルムを細胞培養用基材として用いて細胞を
培養することを特徴とする、細胞の三次元集合体を形成
する方法。
集合体の形成を生体外で行うための培養法を開発するこ
と。 【解決手段】 生分解性かつ両親媒性を有する単独のポ
リマー又は生分解性ポリマーと両親媒性ポリマーとから
成るポリマー混合物の疎水性有機溶媒溶液を基板上にキ
ャストし、該有機溶媒を蒸散させると同時に該キャスト
液表面で結露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発
させることにより得られるハニカム構造体フィルム又は
その延伸フィルムを細胞培養用基材として用いて細胞を
培養することを特徴とする、細胞の三次元集合体を形成
する方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ハニカム構造体フ
ィルムを用いた細胞の三次元組織培養法に関する。より
詳細には、本発明は、生分解性ポリマーと両親媒性ポリ
マーを用いて調製されるハニカム構造体フィルム又はそ
の延伸フィルムを用いて細胞を培養することを特徴とす
る、細胞の三次元集合体を形成する方法に関する。
ィルムを用いた細胞の三次元組織培養法に関する。より
詳細には、本発明は、生分解性ポリマーと両親媒性ポリ
マーを用いて調製されるハニカム構造体フィルム又はそ
の延伸フィルムを用いて細胞を培養することを特徴とす
る、細胞の三次元集合体を形成する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞と材料との相互作用において、細胞
は材料表面の化学的な性質のみならず微細な形状によっ
ても影響を受けることが知られている。そこで組織工学
などの観点から細胞の機能制御を目指すとき、細胞と接
触する材料表面の化学的性質と微細な構造の双方の加工
が重要となる。表面の微細加工法としては、表面加工技
術として半導体産業等に利用されているマイクロパター
ン技術を利用した細胞接着面のサイズコントロール、培
養基板への微小溝構造の導入、マイクロスフィアによる
微細凹凸の作製などが挙げられ、表面微細構造が細胞の
成長等に大きく影響を及ぼすことが知られている。
は材料表面の化学的な性質のみならず微細な形状によっ
ても影響を受けることが知られている。そこで組織工学
などの観点から細胞の機能制御を目指すとき、細胞と接
触する材料表面の化学的性質と微細な構造の双方の加工
が重要となる。表面の微細加工法としては、表面加工技
術として半導体産業等に利用されているマイクロパター
ン技術を利用した細胞接着面のサイズコントロール、培
養基板への微小溝構造の導入、マイクロスフィアによる
微細凹凸の作製などが挙げられ、表面微細構造が細胞の
成長等に大きく影響を及ぼすことが知られている。
【０００３】これらのマイクロパターン技術を使った表
面設定は、非常に高度な技術が必要であり、大量生産が
出来ない、高コストになる、などの多くの問題を抱えて
いるのが現状である。全く別の表面パターニング技術と
しては特殊な構造を有するポリマーの希薄溶液を高湿度
下でキャストすることでμｍスケールのハニカム構造を
有するフィルムが得られることが知られている。本方法
はパターニングするに当たっての経済性に優れることが
特徴である。
面設定は、非常に高度な技術が必要であり、大量生産が
出来ない、高コストになる、などの多くの問題を抱えて
いるのが現状である。全く別の表面パターニング技術と
しては特殊な構造を有するポリマーの希薄溶液を高湿度
下でキャストすることでμｍスケールのハニカム構造を
有するフィルムが得られることが知られている。本方法
はパターニングするに当たっての経済性に優れることが
特徴である。
【０００４】具体的には、サイエンス、1999年、283
巻、ページ373には親水性ブロックと疎水性のブロック
からなるロッド−コイルジブロックポリマーであるポリ
フェニルキノリン−ブロック−ポリスチレンを使う例
が、また、ネイチャー、1994年、369巻、ページ387には
ポリスチレンと剛直なブロックであるポリパラフェニレ
ンとからなるジブロックポリマーを使った例が開示され
ている。このように、従来の技術では自己凝集力の強い
部分と柔軟性を発現する部分とを併せ持つ特殊なポリマ
ーを利用し、これらのポリマーを疎水性有機溶媒に溶解
し、これをキャストする事でハニカム構造体を調製して
いた。一方、本発明者らはシンソリッド フィルムズ、
1998年、327-329巻、ページ854、スープラモレキュラー
サイエンス、1998年、第５巻、ページ331、及びモレキ
ュラー・クリスタル・リキッド・クリスタル、1998年、
第322巻、ページ305に親水性のアクリルアミドポリマー
を主鎖骨格とし、疎水性側鎖としてドデシル基と親水性
側鎖としてラクトース基或いはカルボキシル基を併せ持
つ両親媒性ポリマー、或いはヘパリンやデキストラン硫
酸などのアニオン性多糖と4級の長鎖アルキルアンモニ
ウム塩とのイオンコンプレックスが同様な方法でハニカ
ム構造を有する薄膜を与えることを報告している。
巻、ページ373には親水性ブロックと疎水性のブロック
からなるロッド−コイルジブロックポリマーであるポリ
フェニルキノリン−ブロック−ポリスチレンを使う例
が、また、ネイチャー、1994年、369巻、ページ387には
ポリスチレンと剛直なブロックであるポリパラフェニレ
ンとからなるジブロックポリマーを使った例が開示され
ている。このように、従来の技術では自己凝集力の強い
部分と柔軟性を発現する部分とを併せ持つ特殊なポリマ
ーを利用し、これらのポリマーを疎水性有機溶媒に溶解
し、これをキャストする事でハニカム構造体を調製して
いた。一方、本発明者らはシンソリッド フィルムズ、
1998年、327-329巻、ページ854、スープラモレキュラー
サイエンス、1998年、第５巻、ページ331、及びモレキ
ュラー・クリスタル・リキッド・クリスタル、1998年、
第322巻、ページ305に親水性のアクリルアミドポリマー
を主鎖骨格とし、疎水性側鎖としてドデシル基と親水性
側鎖としてラクトース基或いはカルボキシル基を併せ持
つ両親媒性ポリマー、或いはヘパリンやデキストラン硫
酸などのアニオン性多糖と4級の長鎖アルキルアンモニ
ウム塩とのイオンコンプレックスが同様な方法でハニカ
ム構造を有する薄膜を与えることを報告している。
【０００５】しかしながらこれらのポリマーでは、得ら
れるハニカム構造体の自己自立性に劣ったり、経時的に
ハニカム構造が崩壊するなどの欠点を有するため、細胞
培養用基材として十分な機能を提供するものでなかっ
た。
れるハニカム構造体の自己自立性に劣ったり、経時的に
ハニカム構造が崩壊するなどの欠点を有するため、細胞
培養用基材として十分な機能を提供するものでなかっ
た。
【０００６】細胞工学、組織工学等において細胞培養を
行う時、細胞の足場となる基材が必要であり、前述の如
く、細胞との相互作用において細胞は最良表面の化学的
な性質のみならず微細な形状によっても影響を受けるこ
とが知られている。細胞の機能制御を目指すとき、細胞
と接触する材料表面の化学的性質と細胞の微細な構造の
双方の設計が重要となる。ハニカム構造を有する多孔性
フィルムではハニカムパターンが細胞接着面を提供し、
多孔質構造が細胞の支持基盤へのアクセス、栄養の供給
ルートとなることが示されている。
行う時、細胞の足場となる基材が必要であり、前述の如
く、細胞との相互作用において細胞は最良表面の化学的
な性質のみならず微細な形状によっても影響を受けるこ
とが知られている。細胞の機能制御を目指すとき、細胞
と接触する材料表面の化学的性質と細胞の微細な構造の
双方の設計が重要となる。ハニカム構造を有する多孔性
フィルムではハニカムパターンが細胞接着面を提供し、
多孔質構造が細胞の支持基盤へのアクセス、栄養の供給
ルートとなることが示されている。
【０００７】このハニカム構造フィルムをベースに細胞
を組織化すれば、その１つの利用方法として人工臓器が
考えられる。しかし人工臓器等にしたときには体内に埋
め込むことが必須となる為、この基材は長期的には生体
内へ吸収されることが望ましい。これまでのハニカム構
造を与える材料で細胞培養に要する時間は安定に構造を
維持し、それ以上では分解するような生分解性材料から
作られたものはない。言い換えれば、ハニカム構造体と
細胞工学、細胞培養技術を組み合わせ人工臓器等の医療
用途へ展開するに当たっては生分解性材料を使うことが
必須である。
を組織化すれば、その１つの利用方法として人工臓器が
考えられる。しかし人工臓器等にしたときには体内に埋
め込むことが必須となる為、この基材は長期的には生体
内へ吸収されることが望ましい。これまでのハニカム構
造を与える材料で細胞培養に要する時間は安定に構造を
維持し、それ以上では分解するような生分解性材料から
作られたものはない。言い換えれば、ハニカム構造体と
細胞工学、細胞培養技術を組み合わせ人工臓器等の医療
用途へ展開するに当たっては生分解性材料を使うことが
必須である。
【０００８】このような事情に鑑み、本発明者らは、生
分解性ポリマーが５０〜９９ｗ／ｗ％および両親媒性ポ
リマーが５０〜１ｗ／ｗ％からなるポリマーの疎水性有
機溶媒溶液を、相対湿度５０〜９５％の大気下で基板上
にキャストし、該有機溶媒を徐々に蒸散させると同時に
該キャスト液表面で結露させ、該結露により生じた微小
水滴を蒸発させることで得られるハニカム構造体、並び
に該ハニカム構造体からなるフィルムを提案している
（特願平１１−３４０５６８号明細書（本出願時点にお
いて未公開）。しかしながら、この方法で作製したハニ
カム構造を有するフィルムを用いて、生体組織に類似し
た秩序だった細胞の三次元集合体の形成することができ
るかどうかは不明であった。
分解性ポリマーが５０〜９９ｗ／ｗ％および両親媒性ポ
リマーが５０〜１ｗ／ｗ％からなるポリマーの疎水性有
機溶媒溶液を、相対湿度５０〜９５％の大気下で基板上
にキャストし、該有機溶媒を徐々に蒸散させると同時に
該キャスト液表面で結露させ、該結露により生じた微小
水滴を蒸発させることで得られるハニカム構造体、並び
に該ハニカム構造体からなるフィルムを提案している
（特願平１１−３４０５６８号明細書（本出願時点にお
いて未公開）。しかしながら、この方法で作製したハニ
カム構造を有するフィルムを用いて、生体組織に類似し
た秩序だった細胞の三次元集合体の形成することができ
るかどうかは不明であった。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、生体組織に
類似した秩序だった細胞の三次元集合体の形成を生体外
で行うための培養法を開発することを解決すべき課題と
した。
類似した秩序だった細胞の三次元集合体の形成を生体外
で行うための培養法を開発することを解決すべき課題と
した。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは上記課題を
解決するために鋭意検討を行った結果、ポリ乳酸の自己
支持性ハニカム構造体上で肝実質細胞を培養することに
より、肝臓組織類似の三次元的細胞集合体構造を形成さ
せることができることを見出した。また、ポリ乳酸の自
己支持性ハニカム構造体上で心筋細胞の培養を行ったと
ころ、フィルムの各面に接着した心筋細胞が多孔質構造
を介して接着した三次元心筋細胞集合体が形成されるこ
とを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成し
たものである。
解決するために鋭意検討を行った結果、ポリ乳酸の自己
支持性ハニカム構造体上で肝実質細胞を培養することに
より、肝臓組織類似の三次元的細胞集合体構造を形成さ
せることができることを見出した。また、ポリ乳酸の自
己支持性ハニカム構造体上で心筋細胞の培養を行ったと
ころ、フィルムの各面に接着した心筋細胞が多孔質構造
を介して接着した三次元心筋細胞集合体が形成されるこ
とを見出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成し
たものである。
【００１１】即ち、本発明によれば、生分解性かつ両親
媒性を有する単独のポリマー又は生分解性ポリマーと両
親媒性ポリマーとから成るポリマー混合物の疎水性有機
溶媒溶液を基板上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させ
ると同時に該キャスト液表面で結露させ、該結露により
生じた微小水滴を蒸発させることにより得られるハニカ
ム構造体フィルム又はその延伸フィルムを細胞培養用基
材として用いて細胞を培養することを特徴とする、細胞
の三次元集合体を形成する方法が提供される。
媒性を有する単独のポリマー又は生分解性ポリマーと両
親媒性ポリマーとから成るポリマー混合物の疎水性有機
溶媒溶液を基板上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させ
ると同時に該キャスト液表面で結露させ、該結露により
生じた微小水滴を蒸発させることにより得られるハニカ
ム構造体フィルム又はその延伸フィルムを細胞培養用基
材として用いて細胞を培養することを特徴とする、細胞
の三次元集合体を形成する方法が提供される。
【００１２】本発明において好ましくは、生分解性ポリ
マーと両親媒性ポリマーとから成るポリマー混合物の疎
水性有機溶媒溶液を使用する。本発明において好ましく
は、生分解性ポリマーとして脂肪族ポリエステルを使用
する。本発明において好ましくは、生分解性ポリマーと
両親媒性ポリマーとから成るポリマー混合物として、５
０〜９９ｗ／ｗ％の生分解性ポリマーおよび５０〜１ｗ
／ｗ％の両親媒性ポリマーからなるポリマー混合物を使
用する。
マーと両親媒性ポリマーとから成るポリマー混合物の疎
水性有機溶媒溶液を使用する。本発明において好ましく
は、生分解性ポリマーとして脂肪族ポリエステルを使用
する。本発明において好ましくは、生分解性ポリマーと
両親媒性ポリマーとから成るポリマー混合物として、５
０〜９９ｗ／ｗ％の生分解性ポリマーおよび５０〜１ｗ
／ｗ％の両親媒性ポリマーからなるポリマー混合物を使
用する。
【００１３】本発明では、例えば、疎水性有機溶媒溶液
を基板上にキャストし、高湿度空気を吹き付けることで
該有機溶媒を蒸散させると同時に該キャスト液表面で結
露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発させること
により得られるハニカム構造体フィルム又はその延伸フ
ィルムを用いることができ、あるいは、疎水性有機溶媒
溶液を、相対湿度５０〜９５％の大気下で基板上にキャ
ストし、該有機溶媒を蒸散させると同時に該キャスト液
表面で結露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発さ
せることにより得られるハニカム構造体フィルム又はそ
の延伸フィルムを用いることができる。
を基板上にキャストし、高湿度空気を吹き付けることで
該有機溶媒を蒸散させると同時に該キャスト液表面で結
露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発させること
により得られるハニカム構造体フィルム又はその延伸フ
ィルムを用いることができ、あるいは、疎水性有機溶媒
溶液を、相対湿度５０〜９５％の大気下で基板上にキャ
ストし、該有機溶媒を蒸散させると同時に該キャスト液
表面で結露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発さ
せることにより得られるハニカム構造体フィルム又はそ
の延伸フィルムを用いることができる。
【００１４】本発明では、ハニカム構造体フィルムの延
伸フィルムを用いてもよく、その場合、延伸は一軸延
伸、二軸延伸又は三軸延伸によって行うことができ、延
伸方向の伸長率は好ましくは１．１から１０倍の範囲内
である。本発明において好ましくは、ハニカム構造体の
直径が０．１〜１００μｍである。本発明において好ま
しくは、ハニカム構造体フィルム又はその延伸フィルム
の両面上において細胞が培養される。この場合、ハニカ
ム構造体フィルム又はその延伸フィルムの両面上で培養
される細胞が互いに異なっていてもよい。本発明の別の
側面によれば、上記した本発明による方法により調製さ
れる細胞の三次元集合体が提供される。
伸フィルムを用いてもよく、その場合、延伸は一軸延
伸、二軸延伸又は三軸延伸によって行うことができ、延
伸方向の伸長率は好ましくは１．１から１０倍の範囲内
である。本発明において好ましくは、ハニカム構造体の
直径が０．１〜１００μｍである。本発明において好ま
しくは、ハニカム構造体フィルム又はその延伸フィルム
の両面上において細胞が培養される。この場合、ハニカ
ム構造体フィルム又はその延伸フィルムの両面上で培養
される細胞が互いに異なっていてもよい。本発明の別の
側面によれば、上記した本発明による方法により調製さ
れる細胞の三次元集合体が提供される。
【００１５】
【発明の実施の形態】以下、本発明の実施態様及び実施
方法について詳細に説明する。本発明による細胞の三次
元集合体を形成する方法は、生分解性かつ両親媒性を有
する単独のポリマー又は生分解性ポリマーと両親媒性ポ
リマーとから成るポリマー混合物の疎水性有機溶媒溶液
を基板上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させると同時
に該キャスト液表面で結露させ、該結露により生じた微
小水滴を蒸発させることにより得られるハニカム構造体
フィルム又はその延伸フィルムを細胞培養用基材として
用いて細胞を培養することを特徴とする。
方法について詳細に説明する。本発明による細胞の三次
元集合体を形成する方法は、生分解性かつ両親媒性を有
する単独のポリマー又は生分解性ポリマーと両親媒性ポ
リマーとから成るポリマー混合物の疎水性有機溶媒溶液
を基板上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させると同時
に該キャスト液表面で結露させ、該結露により生じた微
小水滴を蒸発させることにより得られるハニカム構造体
フィルム又はその延伸フィルムを細胞培養用基材として
用いて細胞を培養することを特徴とする。
【００１６】本発明では、生分解性かつ両親媒性を有す
る単独のポリマーを使用してもよいし、あるいは、生分
解性を有するポリマーと両親媒性を有するポリマーから
成る複数のポリマーの混合物を使用してもよい。
る単独のポリマーを使用してもよいし、あるいは、生分
解性を有するポリマーと両親媒性を有するポリマーから
成る複数のポリマーの混合物を使用してもよい。
【００１７】本発明で用いることができる生分解性ポリ
マーとしては、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカ
プロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリブチレン
アジペートなどの生分解性脂肪族ポリエステル、並びに
ポリブチレンカーボネート、ポリエチレンカーボネート
等の脂肪族ポリカーボネート等が、有機溶媒への溶解性
の観点から好ましい。中でも、ポリ乳酸、ポリカプロラ
クトンが入手の容易さ、価格等の観点から望ましい。
マーとしては、ポリ乳酸、ポリヒドロキシ酪酸、ポリカ
プロラクトン、ポリエチレンアジペート、ポリブチレン
アジペートなどの生分解性脂肪族ポリエステル、並びに
ポリブチレンカーボネート、ポリエチレンカーボネート
等の脂肪族ポリカーボネート等が、有機溶媒への溶解性
の観点から好ましい。中でも、ポリ乳酸、ポリカプロラ
クトンが入手の容易さ、価格等の観点から望ましい。
【００１８】本発明で用いることができる両親媒性ポリ
マーとしては、細胞培養基材として利用することを考慮
すると毒性のないことが好ましく、ポリエチレングリコ
ール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体、ア
クリルアミドポリマーを主鎖骨格とし、疎水性側鎖とし
てドデシル基と親水性側鎖としてラクトース基或いはカ
ルボキシル基を併せ持つ両親媒性ポリマー、或いはヘパ
リンやデキストラン硫酸、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）など
のアニオン性高分子と長鎖アルキルアンモニウム塩との
イオンコンプレックス、ゼラチン、コラーゲン、アルブ
ミン等の水溶性タンパク質を親水性基とした両親媒性ポ
リマー等を利用することが望ましい。
マーとしては、細胞培養基材として利用することを考慮
すると毒性のないことが好ましく、ポリエチレングリコ
ール／ポリプロピレングリコールブロック共重合体、ア
クリルアミドポリマーを主鎖骨格とし、疎水性側鎖とし
てドデシル基と親水性側鎖としてラクトース基或いはカ
ルボキシル基を併せ持つ両親媒性ポリマー、或いはヘパ
リンやデキストラン硫酸、核酸（ＤＮＡやＲＮＡ）など
のアニオン性高分子と長鎖アルキルアンモニウム塩との
イオンコンプレックス、ゼラチン、コラーゲン、アルブ
ミン等の水溶性タンパク質を親水性基とした両親媒性ポ
リマー等を利用することが望ましい。
【００１９】また、生分解性かつ両親媒性を有する単独
のポリマーとしては、例えば、ポリ乳酸−ポリエチレン
グリコールブロック共重合体、ポリε−カプロラクトン
−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリリン
ゴ酸−ポリリンゴ酸アルキルエステルブロック共重合体
などが挙げられる。
のポリマーとしては、例えば、ポリ乳酸−ポリエチレン
グリコールブロック共重合体、ポリε−カプロラクトン
−ポリエチレングリコールブロック共重合体、ポリリン
ゴ酸−ポリリンゴ酸アルキルエステルブロック共重合体
などが挙げられる。
【００２０】本発明で用いるハニカム構造体を作成する
に当たってはポリマー溶液上に微小な水滴粒子を形成さ
せることが必要であることから、使用する有機溶媒とし
ては非水溶性（疎水性）であることが必要である。疎水
性有機溶媒の例としてはクロロホルム、塩化メチレン等
のハロゲン系有機溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン
等の芳香族炭化水素、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエス
テル類、メチルイソブチルケトンなどの非水溶性ケトン
類、二硫化炭素などが挙げられる。これらの有機溶媒は
単独で使用しても、又、これらの溶媒を組み合わせた混
合溶媒として使用してもよい。疎水性有機溶媒に溶解す
る生分解性ポリマーと両親媒性ポリマーの両者の合計の
ポリマー濃度は、好ましくは０．０１から１０重量％で
あり、より好ましくは０．０５から５重量％である。ポ
リマー濃度が０．０１重量％より低いと得られるフィル
ムの力学強度が不足し望ましくない。また、ポリマー濃
度が１０重量％以上ではポリマー濃度が高くなりすぎ、
十分なハニカム構造が得られない。
に当たってはポリマー溶液上に微小な水滴粒子を形成さ
せることが必要であることから、使用する有機溶媒とし
ては非水溶性（疎水性）であることが必要である。疎水
性有機溶媒の例としてはクロロホルム、塩化メチレン等
のハロゲン系有機溶媒、ベンゼン、トルエン、キシレン
等の芳香族炭化水素、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエス
テル類、メチルイソブチルケトンなどの非水溶性ケトン
類、二硫化炭素などが挙げられる。これらの有機溶媒は
単独で使用しても、又、これらの溶媒を組み合わせた混
合溶媒として使用してもよい。疎水性有機溶媒に溶解す
る生分解性ポリマーと両親媒性ポリマーの両者の合計の
ポリマー濃度は、好ましくは０．０１から１０重量％で
あり、より好ましくは０．０５から５重量％である。ポ
リマー濃度が０．０１重量％より低いと得られるフィル
ムの力学強度が不足し望ましくない。また、ポリマー濃
度が１０重量％以上ではポリマー濃度が高くなりすぎ、
十分なハニカム構造が得られない。
【００２１】また、生分解性ポリマーと両親媒性ポリマ
ーを使用する場合、その組成比は特に限定されないが、
好ましくは９９：１〜５０：５０（wt／wt）の範囲内で
ある。両親媒性ポリマー比が１以下の場合には、均一な
ハニカム構造が得るのが困難となる場合があり、又、両
親媒性ポリマー比が５０以上では得られるハニカム構造
体の安定性、特に力学的な安定性が低下する場合があ
る。
ーを使用する場合、その組成比は特に限定されないが、
好ましくは９９：１〜５０：５０（wt／wt）の範囲内で
ある。両親媒性ポリマー比が１以下の場合には、均一な
ハニカム構造が得るのが困難となる場合があり、又、両
親媒性ポリマー比が５０以上では得られるハニカム構造
体の安定性、特に力学的な安定性が低下する場合があ
る。
【００２２】本発明においては該ポリマー有機溶媒溶液
を基板上にキャストしハニカム構造体を調製する。基板
としてはガラス、金属、シリコンウェハー等の無機材
料、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテルケト
ン等の耐有機溶剤性に優れた高分子、水、流動パラフィ
ン、液状ポリエーテル等の液体が使用できる。中でも、
基材に水を使用した場合、該ハニカム構造体の特徴であ
る自立性を生かすことで、該構造体を単独で容易に基板
から取り出すことができ、好適である。
を基板上にキャストしハニカム構造体を調製する。基板
としてはガラス、金属、シリコンウェハー等の無機材
料、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリエーテルケト
ン等の耐有機溶剤性に優れた高分子、水、流動パラフィ
ン、液状ポリエーテル等の液体が使用できる。中でも、
基材に水を使用した場合、該ハニカム構造体の特徴であ
る自立性を生かすことで、該構造体を単独で容易に基板
から取り出すことができ、好適である。
【００２３】本発明で、ハニカム構造が形成される機構
は次のように考えられる。疎水性有機溶媒が蒸発すると
き、潜熱を奪う為に、キャストフィル表面の温度が下が
り、微小な水の液滴がポリマー溶液表面に凝集、付着す
る。ポリマー溶液中の親水性部分の働きによって水と疎
水性有機溶媒の間の表面張力が減少し、このため、水微
粒子が凝集して１つの塊になろうとするに際し、安定化
される。溶媒が蒸発していくに伴い、ヘキサゴナルの形
をした液滴が最密充填した形で並んでいき、最後に、水
が飛び、ポリマーが規則正しくハニカム状に並んだ形と
して残る。
は次のように考えられる。疎水性有機溶媒が蒸発すると
き、潜熱を奪う為に、キャストフィル表面の温度が下が
り、微小な水の液滴がポリマー溶液表面に凝集、付着す
る。ポリマー溶液中の親水性部分の働きによって水と疎
水性有機溶媒の間の表面張力が減少し、このため、水微
粒子が凝集して１つの塊になろうとするに際し、安定化
される。溶媒が蒸発していくに伴い、ヘキサゴナルの形
をした液滴が最密充填した形で並んでいき、最後に、水
が飛び、ポリマーが規則正しくハニカム状に並んだ形と
して残る。
【００２４】従って、該フィルムを調製する環境として
は、（１）疎水性有機溶媒溶液を基板上にキャストし、
高湿度空気を吹き付けることで該有機溶媒を徐々に蒸散
させると同時に該キャスト液表面で結露させ、該結露に
より生じた微小水滴を蒸発させる方法；並びに（２）疎
水性有機溶媒溶液を、相対湿度50〜95％の大気下で基板
上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させると同時に該キ
ャスト液表面で結露させ、該結露により生じた微小水滴
を蒸発させる方法；などが好ましい。このようにしてで
きるハニカム構造体のひとつひとつ（個々）の大きさ
は、特には限定されないが、好ましくは０．１から１０
０μmであり、より好ましくは０．１から１０μmであ
り、この範囲の大きさであれば、細胞培養用の基材とし
て好適に用いることができる。
は、（１）疎水性有機溶媒溶液を基板上にキャストし、
高湿度空気を吹き付けることで該有機溶媒を徐々に蒸散
させると同時に該キャスト液表面で結露させ、該結露に
より生じた微小水滴を蒸発させる方法；並びに（２）疎
水性有機溶媒溶液を、相対湿度50〜95％の大気下で基板
上にキャストし、該有機溶媒を蒸散させると同時に該キ
ャスト液表面で結露させ、該結露により生じた微小水滴
を蒸発させる方法；などが好ましい。このようにしてで
きるハニカム構造体のひとつひとつ（個々）の大きさ
は、特には限定されないが、好ましくは０．１から１０
０μmであり、より好ましくは０．１から１０μmであ
り、この範囲の大きさであれば、細胞培養用の基材とし
て好適に用いることができる。
【００２５】さらに、本発明においては、上記のように
して作製したハニカム構造体フィルムをそのまま用いる
ことに加えて、該ハニカム構造体フィルムを延伸するこ
とにより伸長した細孔の配列構造を有するフィルムを用
いることもできる。このような延伸フィルム上で細胞を
培養した場合、細胞が細孔の直線的な配列に沿って配向
する。
して作製したハニカム構造体フィルムをそのまま用いる
ことに加えて、該ハニカム構造体フィルムを延伸するこ
とにより伸長した細孔の配列構造を有するフィルムを用
いることもできる。このような延伸フィルム上で細胞を
培養した場合、細胞が細孔の直線的な配列に沿って配向
する。
【００２６】フィルムの延伸の方法は、特に限定され
ず、例えば、ハニカム構造体フィルムの２以上の端をピ
ンセット又は手でつまみ、伸長方向に引っ張ることによ
り行うことができる。あるいは、マイクロマニュピレー
ターを用いて延伸を行うこともできる。
ず、例えば、ハニカム構造体フィルムの２以上の端をピ
ンセット又は手でつまみ、伸長方向に引っ張ることによ
り行うことができる。あるいは、マイクロマニュピレー
ターを用いて延伸を行うこともできる。
【００２７】本発明において、延伸は、一軸延伸、二軸
延伸又は三軸延伸の何れでもよい。本発明における延伸
の具体例の模式図を図１に示す。図１において、（ａ）
は一軸延伸、（ｂ）は二軸延伸、（ｃ）は三軸延伸を示
し、αは対称軸と延伸方向のなす角を示し、β及びγは
延伸方向のなす角を示す。本発明において、延伸方向の
伸長率は特に限定されないが、好ましくは１．１から１
０倍の範囲内である。伸長率が１．１倍以下では延伸に
よる本発明の効果が小さく、また伸長率が１０倍以上で
はフィルムが破壊され易くなる。
延伸又は三軸延伸の何れでもよい。本発明における延伸
の具体例の模式図を図１に示す。図１において、（ａ）
は一軸延伸、（ｂ）は二軸延伸、（ｃ）は三軸延伸を示
し、αは対称軸と延伸方向のなす角を示し、β及びγは
延伸方向のなす角を示す。本発明において、延伸方向の
伸長率は特に限定されないが、好ましくは１．１から１
０倍の範囲内である。伸長率が１．１倍以下では延伸に
よる本発明の効果が小さく、また伸長率が１０倍以上で
はフィルムが破壊され易くなる。
【００２８】本発明においては、上記のようにして作製
したハニカム構造体フィルム又はその延伸フィルムを細
胞培養用基材として用いて細胞を培養することにより、
細胞の三次元集合体を形成することができる。本発明の
方法で培養できる細胞の種類は特に限定されず、任意の
培養細胞、並びに組織から採取した細胞などを培養する
ことができる。以下の実施例で示される通り、本発明の
方法で形成したラット肝臓由来肝実質細胞の集合体は高
いアルブミン合成能を発現することができ、また本発明
の方法で形成したラット胎児心臓由来心筋細胞の集合体
はその拍動リズムをフィルム全体で同期させて拍動させ
ることができる。従って、本発明の方法によれば、培養
細胞から、生体内における機能を発現する３次元組織体
を形成することが可能である。
したハニカム構造体フィルム又はその延伸フィルムを細
胞培養用基材として用いて細胞を培養することにより、
細胞の三次元集合体を形成することができる。本発明の
方法で培養できる細胞の種類は特に限定されず、任意の
培養細胞、並びに組織から採取した細胞などを培養する
ことができる。以下の実施例で示される通り、本発明の
方法で形成したラット肝臓由来肝実質細胞の集合体は高
いアルブミン合成能を発現することができ、また本発明
の方法で形成したラット胎児心臓由来心筋細胞の集合体
はその拍動リズムをフィルム全体で同期させて拍動させ
ることができる。従って、本発明の方法によれば、培養
細胞から、生体内における機能を発現する３次元組織体
を形成することが可能である。
【００２９】本発明の好ましい態様においては、まず、
ハニカム構造体フィルムの片側に細胞を播種し、フィル
ムへの細胞の接着を確認した後に、その反対側の面に細
胞を播種し、培養を行う。培養は通常の細胞培養の条件
に準じて行うことができる。即ち、本発明では、ハニカ
ム構造体フィルム又はその延伸フィルムの両面上におい
て細胞を培養することが好ましい。この場合、ハニカム
構造体フィルム又はその延伸フィルムの両面上で培養さ
れる細胞は互いに同一でも異なっていてもよい。細胞培
養に用いる培地の種類は特に限定されず、細胞の種類に
応じて適当な培地（例えば、Williams’E培地、Ｆ−１
０培地、RPM11640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、ま
たはこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等）を
選択することができる。培養条件は細胞の種類に応じて
適宜選択することができ、一般的にはｐＨ６〜８、温度
３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で培養を行
うことができる。
ハニカム構造体フィルムの片側に細胞を播種し、フィル
ムへの細胞の接着を確認した後に、その反対側の面に細
胞を播種し、培養を行う。培養は通常の細胞培養の条件
に準じて行うことができる。即ち、本発明では、ハニカ
ム構造体フィルム又はその延伸フィルムの両面上におい
て細胞を培養することが好ましい。この場合、ハニカム
構造体フィルム又はその延伸フィルムの両面上で培養さ
れる細胞は互いに同一でも異なっていてもよい。細胞培
養に用いる培地の種類は特に限定されず、細胞の種類に
応じて適当な培地（例えば、Williams’E培地、Ｆ−１
０培地、RPM11640培地、EagleのMEM培地、DMEM培地、ま
たはこれらの培地に牛胎児血清等を添加した培地等）を
選択することができる。培養条件は細胞の種類に応じて
適宜選択することができ、一般的にはｐＨ６〜８、温度
３０〜４０℃、５％ＣＯ2存在下等の条件下で培養を行
うことができる。
【００３０】また、延伸フィルムを細胞培養用基材とし
て用いる場合には、細胞の配列を制御することも可能で
あり、特に、心筋組織や血管組織などのように細胞の配
列構造を有する組織の再生の場合には有利である。上記
したような本発明による方法により調製される細胞の三
次元集合体も本発明の範囲内である。以下、本発明を実
施例を使って詳細に説明するが、本発明は実施例によっ
て何ら限定されるものではない。
て用いる場合には、細胞の配列を制御することも可能で
あり、特に、心筋組織や血管組織などのように細胞の配
列構造を有する組織の再生の場合には有利である。上記
したような本発明による方法により調製される細胞の三
次元集合体も本発明の範囲内である。以下、本発明を実
施例を使って詳細に説明するが、本発明は実施例によっ
て何ら限定されるものではない。
【００３１】
【実施例】実施例１：自己支持性ハニカムフィルムの作
製 ポリ乳酸（分子量：85,000〜160,000）のクロロホルム
溶液（１０ｇ／Ｌ）、両親媒性高分子Ｃａｐ（化学構造
は以下に示す）のベンゼン溶液（０．４ｇ／Ｌ）、ベン
ゼンを１：２．５：６．５の割合（体積比）で混合し、
キャスト溶液を調製した。直径９ｃｍのガラスシャーレ
にMilli−Q水を張り、この水面上にポリ乳酸−Ｃａｐ溶
液４０μLを一様に展開し液滴が拡がらない状態にし
た。溶媒が蒸発したのを確認した後、同じ溶液５０μＬ
を水面上にキャストし、エアポンプで高湿度空気を吹き
付けることでハニカムフィルムを得た。水面上に浮いて
いるハニカムフィルムをフレーム（直径５ｍｍ）に移
し、自己支持性ハニカムフィルムとした。
製 ポリ乳酸（分子量：85,000〜160,000）のクロロホルム
溶液（１０ｇ／Ｌ）、両親媒性高分子Ｃａｐ（化学構造
は以下に示す）のベンゼン溶液（０．４ｇ／Ｌ）、ベン
ゼンを１：２．５：６．５の割合（体積比）で混合し、
キャスト溶液を調製した。直径９ｃｍのガラスシャーレ
にMilli−Q水を張り、この水面上にポリ乳酸−Ｃａｐ溶
液４０μLを一様に展開し液滴が拡がらない状態にし
た。溶媒が蒸発したのを確認した後、同じ溶液５０μＬ
を水面上にキャストし、エアポンプで高湿度空気を吹き
付けることでハニカムフィルムを得た。水面上に浮いて
いるハニカムフィルムをフレーム（直径５ｍｍ）に移
し、自己支持性ハニカムフィルムとした。
【００３２】
【化１】
【００３３】実施例２：自己支持性ハニカムフィルム上
でのラット肝臓由来肝実質細胞の培養 自己支持性ハニカムフィルム上でラット肝臓由来肝実質
細胞（肝細胞）の培養を行った。まず、実施例１で作製
した自己支持性ハニカムフィルムの片側に肝細胞を播種
し、フィルムへの接着を確認した。次に、その反対側の
面にも肝細胞を播種し、培養を行った。培養はWilliam
s’E培地を用い、CO2インキュベーター内（ＣＯ2濃度＝
５％、温度＝３７℃、相対湿度＝８０％）で行った。比
較例として細孔のないPLLA−両親媒性高分子キャスト膜
をフレーム上に設置した自己支持性フィルムの両面に肝
実質細胞を播種し、同様の条件で培養を行った。
でのラット肝臓由来肝実質細胞の培養 自己支持性ハニカムフィルム上でラット肝臓由来肝実質
細胞（肝細胞）の培養を行った。まず、実施例１で作製
した自己支持性ハニカムフィルムの片側に肝細胞を播種
し、フィルムへの接着を確認した。次に、その反対側の
面にも肝細胞を播種し、培養を行った。培養はWilliam
s’E培地を用い、CO2インキュベーター内（ＣＯ2濃度＝
５％、温度＝３７℃、相対湿度＝８０％）で行った。比
較例として細孔のないPLLA−両親媒性高分子キャスト膜
をフレーム上に設置した自己支持性フィルムの両面に肝
実質細胞を播種し、同様の条件で培養を行った。
【００３４】実施例１で作製した自己支持性ハニカムフ
ィルムを使用した場合には、フィルムの各面において肝
実質細胞が２０μｍ程度の厚みを有する立体化した形態
を採り、肝臓組織に類似した層状の三次元細胞集合体が
形成された。結果を図２に示す。この細胞集合体は高い
アルブミン合成能を発現した。一方、細孔のないPLLA−
両親媒性高分子キャスト膜をフレーム上に設置した自己
支持性フィルムを使用した場合には、肝細胞は厚さ５μ
ｍ程度の著しく扁平化した形態を採り、そのアルブミン
分泌能は前者に比較して３０％程度であった。
ィルムを使用した場合には、フィルムの各面において肝
実質細胞が２０μｍ程度の厚みを有する立体化した形態
を採り、肝臓組織に類似した層状の三次元細胞集合体が
形成された。結果を図２に示す。この細胞集合体は高い
アルブミン合成能を発現した。一方、細孔のないPLLA−
両親媒性高分子キャスト膜をフレーム上に設置した自己
支持性フィルムを使用した場合には、肝細胞は厚さ５μ
ｍ程度の著しく扁平化した形態を採り、そのアルブミン
分泌能は前者に比較して３０％程度であった。
【００３５】実施例３：自己支持性ハニカムフィルム上
でのラット胎児心臓由来心筋細胞の培養 自己支持性ハニカムフィルム上でラット胎児心臓由来心
筋細胞（心筋細胞）の培養を行った。まず、実施例１で
作製した自己支持性ハニカムフィルムの片側に心筋細胞
を播種し、フィルムへの接着を確認した。次に、その反
対側の面にも心筋細胞を播種し、培養を行った。培養は
Ｆ−１０培地を用い、ＣＯ2インキュベーター内（ＣＯ2
濃度＝５％、温度＝３７℃、相対湿度＝８０％）で行っ
た。比較例として細孔のないＰＬＬＡ−両親媒性高分子
キャスト膜をフレーム上に設置した自己支持性フィルム
の両面に心筋細胞を播種し、同様の条件で培養を行っ
た。
でのラット胎児心臓由来心筋細胞の培養 自己支持性ハニカムフィルム上でラット胎児心臓由来心
筋細胞（心筋細胞）の培養を行った。まず、実施例１で
作製した自己支持性ハニカムフィルムの片側に心筋細胞
を播種し、フィルムへの接着を確認した。次に、その反
対側の面にも心筋細胞を播種し、培養を行った。培養は
Ｆ−１０培地を用い、ＣＯ2インキュベーター内（ＣＯ2
濃度＝５％、温度＝３７℃、相対湿度＝８０％）で行っ
た。比較例として細孔のないＰＬＬＡ−両親媒性高分子
キャスト膜をフレーム上に設置した自己支持性フィルム
の両面に心筋細胞を播種し、同様の条件で培養を行っ
た。
【００３６】実施例１で作製した自己支持性ハニカムフ
ィルムを使用した場合には、フィルムの各面において形
成した心筋細胞集合体がその拍動リズムをフィルム全体
で同期させて拍動していた。即ち、フィルムの各面に接
着した心筋細胞が多孔質構造を介しても接着している三
次元心筋細胞集合体が形成された。一方、細孔のないＰ
ＬＬＡ−両親媒性高分子キャスト膜をフレーム上に設置
した自己支持性フィルムを使用した場合には、心筋細胞
はその拍動リズムを同期させることは無かった。
ィルムを使用した場合には、フィルムの各面において形
成した心筋細胞集合体がその拍動リズムをフィルム全体
で同期させて拍動していた。即ち、フィルムの各面に接
着した心筋細胞が多孔質構造を介しても接着している三
次元心筋細胞集合体が形成された。一方、細孔のないＰ
ＬＬＡ−両親媒性高分子キャスト膜をフレーム上に設置
した自己支持性フィルムを使用した場合には、心筋細胞
はその拍動リズムを同期させることは無かった。
【００３７】
【発明の効果】本発明の方法によれば、生体外において
生体類似の細胞集合体構造を形成し、さらにその機能の
発現を誘導することが可能である。
生体類似の細胞集合体構造を形成し、さらにその機能の
発現を誘導することが可能である。
【図１】図１は、ハニカム構造体の延伸の様式を示す図
である。
である。
【図２】図２は、ポリ乳酸の自己支持性ハニカム構造体
フィルムを培養基材に用いた細胞の三次元培養の概念図
（ａ）、並びに肝実質細胞をポリ乳酸の自己支持性ハニ
カム構造体フィルムの両面において培養した場合に形成
される三次元組織の蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す。
フィルムを培養基材に用いた細胞の三次元培養の概念図
（ａ）、並びに肝実質細胞をポリ乳酸の自己支持性ハニ
カム構造体フィルムの両面において培養した場合に形成
される三次元組織の蛍光顕微鏡写真（ｂ）を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ０８Ｌ 67/00 Ｃ０８Ｌ 67/00 101:00） 101:00 (72)発明者 新井 景子 埼玉県和光市広沢２番１号 理化学研究所 内 Ｆターム(参考） 4B029 AA08 AA21 BB11 CC10 GB09 GB10 4B065 AA91X BC41 CA44 4F074 AA04 AA50E AA50F AA50G AA68 AA70 AA76B AA98 CA01 CA02 CA03 CA04 CB47 CC02W CC04X CC04Y CC29X CC29Y CC46 DA53 DA59 4F100 AK42A BA01 DC02A EJ37 EJ38 GB66 GB90 JC00A 4J002 AD002 AD012 BG122 CF181 CF191 CG011 CH022 GB00 GE00
Claims (12)
- 【請求項１】 生分解性かつ両親媒性を有する単独のポ
リマー又は生分解性ポリマーと両親媒性ポリマーとから
成るポリマー混合物の疎水性有機溶媒溶液を基板上にキ
ャストし、該有機溶媒を蒸散させると同時に該キャスト
液表面で結露させ、該結露により生じた微小水滴を蒸発
させることにより得られるハニカム構造体フィルム又は
その延伸フィルムを細胞培養用基材として用いて細胞を
培養することを特徴とする、細胞の三次元集合体を形成
する方法。 - 【請求項２】 生分解性ポリマーとして脂肪族ポリエス
テルを使用する、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 生分解性ポリマーと両親媒性ポリマーと
から成るポリマー混合物として、５０〜９９ｗ／ｗ％の
生分解性ポリマーおよび５０〜１ｗ／ｗ％の両親媒性ポ
リマーからなるポリマー混合物を使用する、請求項１又
は２に記載の方法。 - 【請求項４】 疎水性有機溶媒溶液を基板上にキャスト
し、高湿度空気を吹き付けることで該有機溶媒を蒸散さ
せると同時に該キャスト液表面で結露させ、該結露によ
り生じた微小水滴を蒸発させることにより得られるハニ
カム構造体フィルム又はその延伸フィルムを用いる、請
求項１から３の何れかに記載の方法。 - 【請求項５】 疎水性有機溶媒溶液を、相対湿度５０〜
９５％の大気下で基板上にキャストし、該有機溶媒を蒸
散させると同時に該キャスト液表面で結露させ、該結露
により生じた微小水滴を蒸発させることにより得られる
ハニカム構造体フィルム又はその延伸フィルムを用い
る、請求項１から３の何れかに記載の方法。 - 【請求項６】 ハニカム構造体フィルムの延伸フィルム
を用いる、請求項１から５の何れかに記載の方法。 - 【請求項７】 延伸を一軸延伸、二軸延伸又は三軸延伸
によって行う、請求項１から６の何れかに記載の方法。 - 【請求項８】 延伸方向の伸長率が１．１から１０倍の
範囲内である、請求項１から７の何れかに記載の方法。 - 【請求項９】 ハニカム構造体の直径が０．１〜１００
μｍである、請求項１から８の何れかに記載の方法。 - 【請求項１０】 ハニカム構造体フィルム又はその延伸
フィルムの両面上において細胞を培養することを特徴と
する、請求項１から９の何れかに記載の方法。 - 【請求項１１】 ハニカム構造体フィルム又はその延伸
フィルムの両面上で培養される細胞が互いに異なること
を特徴とする、請求項１から１０の何れかに記載の方
法。 - 【請求項１２】 請求項１から１１の何れかに記載の方
法により調製される細胞の三次元集合体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001152379A JP2002335949A (ja) | 2001-05-22 | 2001-05-22 | ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2001152379A JP2002335949A (ja) | 2001-05-22 | 2001-05-22 | ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2002335949A true JP2002335949A (ja) | 2002-11-26 |
Family
ID=18997064
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2001152379A Pending JP2002335949A (ja) | 2001-05-22 | 2001-05-22 | ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2002335949A (ja) |
Cited By (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002347107A (ja) * | 2001-05-22 | 2002-12-04 | Inst Of Physical & Chemical Res | 延伸フィルムおよびそれを用いた細胞培養基材 |
| WO2004048064A1 (ja) * | 2002-11-27 | 2004-06-10 | Japan Science And Technology Agency | 微細突起構造体及びその製造方法 |
| JP2004331793A (ja) * | 2003-05-07 | 2004-11-25 | Institute Of Physical & Chemical Research | 凹凸を有するハニカム構造体フィルム |
| JP2005110676A (ja) * | 2003-09-17 | 2005-04-28 | Think Engineering Kk | 生細胞培養基材、該基材の製造方法、および該製造方法に用いるエッチング処理装置、並びに生細胞の培養方法 |
| WO2005051450A1 (ja) | 2003-11-28 | 2005-06-09 | Zeon Medical, Inc. | 細胞増殖抑制フィルム、医療用具および消化器系ステント |
| JP2005270688A (ja) * | 2004-03-22 | 2005-10-06 | Japan Science & Technology Agency | マイクロリングあるいはマイクロドットを呈した微細パターンの製造方法 |
| JP2006152309A (ja) * | 2003-04-10 | 2006-06-15 | Teijin Ltd | ハニカム構造を有する生分解性フィルムの製造方法 |
| JPWO2004089434A1 (ja) * | 2003-04-10 | 2006-07-06 | 帝人株式会社 | ハニカム構造を有する生分解性フィルム |
| WO2006088029A1 (ja) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | School Juridical Person Kitasato Gakuen | 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 |
| WO2006093207A1 (ja) * | 2005-03-02 | 2006-09-08 | National University Corporation Hokkaido University | 細胞の分化／増殖を制御するための基材 |
| WO2006112358A1 (ja) * | 2005-04-13 | 2006-10-26 | National University Corporation Hokkaido University | ハニカム状多孔質体の製造方法。 |
| JP2007006987A (ja) * | 2005-06-28 | 2007-01-18 | Hokkaido Univ | 皮膚再生用の細胞シートを作製するための構造体およびその利用 |
| JP2007112856A (ja) * | 2005-10-19 | 2007-05-10 | Hokkaido Univ | パターン化ハニカム状多孔質体の製造方法 |
| WO2007077660A1 (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Tohoku University | 組成物およびその製造方法 |
| WO2007086421A1 (ja) * | 2006-01-26 | 2007-08-02 | National University Corporation Hokkaido University | 硬組織再生治療に用い得るハニカム状多孔質体 |
| WO2007097120A1 (ja) | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Scivax Corporation | 細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法 |
| JP2007252680A (ja) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Teijin Ltd | 止血材 |
| JPWO2005049104A1 (ja) * | 2003-11-21 | 2007-10-04 | 帝人株式会社 | 組織再生用基材および細胞との複合体とその製造方法 |
| WO2007139144A1 (ja) | 2006-05-30 | 2007-12-06 | Fujifilm Corporation | セルチップ |
| JP2008514254A (ja) * | 2004-09-24 | 2008-05-08 | ザ ユニバーシティ オブ ブリストル | 細胞バンデージ |
| JP2008148685A (ja) * | 2006-11-21 | 2008-07-03 | Covalent Materials Corp | 未分化細胞培養担体および継代培養方法 |
| WO2008090634A1 (ja) | 2007-01-26 | 2008-07-31 | Canon Kabushiki Kaisha | 表面に凹形状を有する固形物の製造方法 |
| EP1961809A1 (en) * | 2007-02-20 | 2008-08-27 | FUJIFILM Corporation | Tissue construct-forming substrate, tissue construct-forming kit, method for forming tissue construct using the same and three-dimensional tissue construct formed by the method |
| WO2009038061A1 (ja) | 2007-09-21 | 2009-03-26 | Fujifilm Corporation | 複層フィルム及びその製造方法 |
| WO2009038060A1 (ja) * | 2007-09-21 | 2009-03-26 | Fujifilm Corporation | 複層フィルム及びその製造方法 |
| EP2165818A1 (en) | 2008-09-19 | 2010-03-24 | Canon Kabushiki Kaisha | Method of producing solid body having depressed portions on its surface and method of producing electrophotographic photosensitive member |
| EP2266500A2 (en) | 2003-08-01 | 2010-12-29 | Cellseed Inc. | Three-dimensional tissue structure |
| US7871549B2 (en) | 2004-08-06 | 2011-01-18 | Fujifilm Corporation | Producing method for film |
| CN102671554A (zh) * | 2012-05-11 | 2012-09-19 | 上海师范大学 | 一种pvc微孔薄膜的制备工艺 |
| US8357428B2 (en) | 2008-03-31 | 2013-01-22 | Fujifilm Corporation | Method for producing porous film |
| WO2013042360A1 (ja) | 2011-09-20 | 2013-03-28 | 株式会社クラレ | 接着性細胞の培養方法 |
| JP2013059287A (ja) * | 2011-09-13 | 2013-04-04 | National Institute For Materials Science | パターン化多孔質材料及びその製造方法 |
| US9096826B2 (en) | 2005-11-22 | 2015-08-04 | Covalent Materials Corporation | Culture substrate and culture method for undifferentiated cell and undifferentiated cultured cell |
| US9428728B2 (en) | 2006-11-21 | 2016-08-30 | Coorstek Kk | Carrier for undifferentiated cell culture and subculture method thereof |
| JP2017063645A (ja) * | 2015-09-29 | 2017-04-06 | 富士フイルム株式会社 | バインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法 |
| WO2018225835A1 (ja) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | 富士フイルム株式会社 | 細胞積層体の製造方法 |
| WO2018226901A1 (en) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | Fujifilm Corporation | Living tissue model device, vascular wall model, vascular wall model device and method of evaluating test substance |
| WO2019054500A1 (ja) | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Ａｇｃ株式会社 | マイクロ流路チップ |
| JP2021526386A (ja) * | 2018-05-22 | 2021-10-07 | モルフォセル テクノロジーズ インコーポレイテッドＭｏｒｐｈｏｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． | 灌流バイオリアクタ、灌流装置、人工肝臓システム及びこれらに関連する方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4868668A (ja) * | 1971-12-17 | 1973-09-19 | ||
| JPS62234510A (ja) * | 1986-04-05 | 1987-10-14 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 再生セルロ−ス中空糸の乾燥方法 |
-
2001
- 2001-05-22 JP JP2001152379A patent/JP2002335949A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS4868668A (ja) * | 1971-12-17 | 1973-09-19 | ||
| JPS62234510A (ja) * | 1986-04-05 | 1987-10-14 | Asahi Chem Ind Co Ltd | 再生セルロ−ス中空糸の乾燥方法 |
Cited By (73)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4731044B2 (ja) * | 2001-05-22 | 2011-07-20 | 独立行政法人理化学研究所 | 延伸フィルムおよびそれを用いた細胞培養基材 |
| JP2002347107A (ja) * | 2001-05-22 | 2002-12-04 | Inst Of Physical & Chemical Res | 延伸フィルムおよびそれを用いた細胞培養基材 |
| JPWO2004048064A1 (ja) * | 2002-11-27 | 2006-03-23 | 独立行政法人科学技術振興機構 | 微細突起構造体及びその製造方法 |
| WO2004048064A1 (ja) * | 2002-11-27 | 2004-06-10 | Japan Science And Technology Agency | 微細突起構造体及びその製造方法 |
| US7799378B2 (en) | 2002-11-27 | 2010-09-21 | Japan Science And Technology Agency | Process for producing micropillar structure |
| JP4579824B2 (ja) * | 2003-04-10 | 2010-11-10 | 帝人株式会社 | ハニカム構造を有する生分解性フィルム |
| JP4579840B2 (ja) * | 2003-04-10 | 2010-11-10 | 帝人株式会社 | ハニカム構造を有する生分解性フィルムの製造方法 |
| JP2006152309A (ja) * | 2003-04-10 | 2006-06-15 | Teijin Ltd | ハニカム構造を有する生分解性フィルムの製造方法 |
| JPWO2004089434A1 (ja) * | 2003-04-10 | 2006-07-06 | 帝人株式会社 | ハニカム構造を有する生分解性フィルム |
| JP2010131435A (ja) * | 2003-04-10 | 2010-06-17 | Teijin Ltd | ハニカム構造を有する生分解性フィルム |
| US8097273B2 (en) | 2003-04-10 | 2012-01-17 | Teijin Limited | Biodegradable film having honeycomb structure |
| JP2004331793A (ja) * | 2003-05-07 | 2004-11-25 | Institute Of Physical & Chemical Research | 凹凸を有するハニカム構造体フィルム |
| EP2266500A2 (en) | 2003-08-01 | 2010-12-29 | Cellseed Inc. | Three-dimensional tissue structure |
| EP2266499A2 (en) | 2003-08-01 | 2010-12-29 | Cellseed Inc. | Three-dimensional tissue structure |
| JP2005110676A (ja) * | 2003-09-17 | 2005-04-28 | Think Engineering Kk | 生細胞培養基材、該基材の製造方法、および該製造方法に用いるエッチング処理装置、並びに生細胞の培養方法 |
| US7915028B2 (en) | 2003-11-21 | 2011-03-29 | Teijin Limited | Tissue regeneration substrate, complex thereof with cells, and method for its production |
| JPWO2005049104A1 (ja) * | 2003-11-21 | 2007-10-04 | 帝人株式会社 | 組織再生用基材および細胞との複合体とその製造方法 |
| JP4647497B2 (ja) * | 2003-11-21 | 2011-03-09 | 帝人株式会社 | 組織再生用基材および細胞との複合体とその製造方法 |
| WO2005051450A1 (ja) | 2003-11-28 | 2005-06-09 | Zeon Medical, Inc. | 細胞増殖抑制フィルム、医療用具および消化器系ステント |
| JP4512918B2 (ja) * | 2004-03-22 | 2010-07-28 | 独立行政法人科学技術振興機構 | マイクロリングあるいはマイクロドットを呈した微細パターンの製造方法 |
| JP2005270688A (ja) * | 2004-03-22 | 2005-10-06 | Japan Science & Technology Agency | マイクロリングあるいはマイクロドットを呈した微細パターンの製造方法 |
| US7871549B2 (en) | 2004-08-06 | 2011-01-18 | Fujifilm Corporation | Producing method for film |
| JP2008514254A (ja) * | 2004-09-24 | 2008-05-08 | ザ ユニバーシティ オブ ブリストル | 細胞バンデージ |
| JP4671365B2 (ja) * | 2005-02-15 | 2011-04-13 | 学校法人北里研究所 | 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 |
| JPWO2006088029A1 (ja) * | 2005-02-15 | 2008-07-03 | 学校法人北里学園 | 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 |
| WO2006088029A1 (ja) * | 2005-02-15 | 2006-08-24 | School Juridical Person Kitasato Gakuen | 高密度培養組織の製造方法及び高密度培養組織 |
| WO2006093207A1 (ja) * | 2005-03-02 | 2006-09-08 | National University Corporation Hokkaido University | 細胞の分化／増殖を制御するための基材 |
| WO2006112358A1 (ja) * | 2005-04-13 | 2006-10-26 | National University Corporation Hokkaido University | ハニカム状多孔質体の製造方法。 |
| JP2007006987A (ja) * | 2005-06-28 | 2007-01-18 | Hokkaido Univ | 皮膚再生用の細胞シートを作製するための構造体およびその利用 |
| JP2007112856A (ja) * | 2005-10-19 | 2007-05-10 | Hokkaido Univ | パターン化ハニカム状多孔質体の製造方法 |
| US9096826B2 (en) | 2005-11-22 | 2015-08-04 | Covalent Materials Corporation | Culture substrate and culture method for undifferentiated cell and undifferentiated cultured cell |
| WO2007077660A1 (ja) * | 2005-12-28 | 2007-07-12 | Tohoku University | 組成物およびその製造方法 |
| WO2007086421A1 (ja) * | 2006-01-26 | 2007-08-02 | National University Corporation Hokkaido University | 硬組織再生治療に用い得るハニカム状多孔質体 |
| WO2007097121A1 (ja) * | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Scivax Corporation | スフェロイドおよびスフェロイド群並びにこれらの製造方法 |
| JP5397934B2 (ja) * | 2006-02-21 | 2014-01-22 | Ｓｃｉｖａｘ株式会社 | スフェロイド群およびその製造方法 |
| WO2007097120A1 (ja) | 2006-02-21 | 2007-08-30 | Scivax Corporation | 細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法 |
| JPWO2007097121A1 (ja) * | 2006-02-21 | 2009-07-09 | Ｓｃｉｖａｘ株式会社 | スフェロイドおよびスフェロイド群並びにこれらの製造方法 |
| JPWO2007097120A1 (ja) * | 2006-02-21 | 2009-07-09 | Ｓｃｉｖａｘ株式会社 | 細胞培養構造体、細胞培養容器、スフェロイド付き構造体、スフェロイド付き容器およびこれらの製造方法 |
| US7727759B2 (en) | 2006-02-21 | 2010-06-01 | Scivax Corporation | Structure for cell culture, cell culture vessel, structure with spheroid, vessel with spheroid, and manufacturing methods thereof |
| KR101362293B1 (ko) | 2006-02-21 | 2014-02-12 | 에스씨아이브이에이엑스 가부시키가이샤 | 세포배양구조체, 세포배양용기, 스페로이드를 갖는 구조체,스페로이드를 갖는 용기 및 이들의 제조방법 |
| JP2007252680A (ja) * | 2006-03-24 | 2007-10-04 | Teijin Ltd | 止血材 |
| EP2048223B1 (en) * | 2006-05-30 | 2015-03-25 | FUJIFILM Corporation | Cell chip |
| EP2048223A1 (en) * | 2006-05-30 | 2009-04-15 | FUJIFILM Corporation | Cell chip |
| WO2007139144A1 (ja) | 2006-05-30 | 2007-12-06 | Fujifilm Corporation | セルチップ |
| JP2008148685A (ja) * | 2006-11-21 | 2008-07-03 | Covalent Materials Corp | 未分化細胞培養担体および継代培養方法 |
| US9428728B2 (en) | 2006-11-21 | 2016-08-30 | Coorstek Kk | Carrier for undifferentiated cell culture and subculture method thereof |
| JP2008179749A (ja) * | 2007-01-26 | 2008-08-07 | Canon Inc | 表面に凹形状を有する固形物の製造方法 |
| WO2008090634A1 (ja) | 2007-01-26 | 2008-07-31 | Canon Kabushiki Kaisha | 表面に凹形状を有する固形物の製造方法 |
| US7931848B2 (en) | 2007-01-26 | 2011-04-26 | Canon Kabushiki Kaisha | Method of producing solid body having depressed portion on surface |
| EP1961809B1 (en) * | 2007-02-20 | 2017-05-10 | FUJIFILM Corporation | Tissue construct-forming substrate, tissue construct-forming kit, method for forming tissue construct using the same and three-dimensional tissue construct formed by the method |
| EP1961809A1 (en) * | 2007-02-20 | 2008-08-27 | FUJIFILM Corporation | Tissue construct-forming substrate, tissue construct-forming kit, method for forming tissue construct using the same and three-dimensional tissue construct formed by the method |
| US8815595B2 (en) | 2007-02-20 | 2014-08-26 | Fujifilm Corporation | Substrate for forming a three-dimensional tissue construct and method of use |
| WO2009038061A1 (ja) | 2007-09-21 | 2009-03-26 | Fujifilm Corporation | 複層フィルム及びその製造方法 |
| WO2009038060A1 (ja) * | 2007-09-21 | 2009-03-26 | Fujifilm Corporation | 複層フィルム及びその製造方法 |
| US8357428B2 (en) | 2008-03-31 | 2013-01-22 | Fujifilm Corporation | Method for producing porous film |
| US7972551B2 (en) | 2008-09-19 | 2011-07-05 | Canon Kabushiki Kaisha | Method of producing solid body having depressed portions on its surface and method of producing electrophotographic photosensitive member |
| EP2165818A1 (en) | 2008-09-19 | 2010-03-24 | Canon Kabushiki Kaisha | Method of producing solid body having depressed portions on its surface and method of producing electrophotographic photosensitive member |
| JP2013059287A (ja) * | 2011-09-13 | 2013-04-04 | National Institute For Materials Science | パターン化多孔質材料及びその製造方法 |
| WO2013042360A1 (ja) | 2011-09-20 | 2013-03-28 | 株式会社クラレ | 接着性細胞の培養方法 |
| US10655107B2 (en) | 2011-09-20 | 2020-05-19 | Corning Incorporated | Adherent cell culture method |
| CN102671554B (zh) * | 2012-05-11 | 2015-02-18 | 上海师范大学 | 一种pvc微孔薄膜的制备工艺 |
| CN102671554A (zh) * | 2012-05-11 | 2012-09-19 | 上海师范大学 | 一种pvc微孔薄膜的制备工艺 |
| JP2017063645A (ja) * | 2015-09-29 | 2017-04-06 | 富士フイルム株式会社 | バインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法 |
| WO2017057346A1 (ja) * | 2015-09-29 | 2017-04-06 | 富士フイルム株式会社 | バインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法 |
| WO2018226901A1 (en) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | Fujifilm Corporation | Living tissue model device, vascular wall model, vascular wall model device and method of evaluating test substance |
| JPWO2018225835A1 (ja) * | 2017-06-09 | 2020-01-09 | 富士フイルム株式会社 | 細胞積層体の製造方法 |
| CN110709503A (zh) * | 2017-06-09 | 2020-01-17 | 富士胶片株式会社 | 细胞层叠体的制造方法 |
| US20200095531A1 (en) * | 2017-06-09 | 2020-03-26 | Fujifilm Corporation | Method for producing cell laminate |
| WO2018225835A1 (ja) | 2017-06-09 | 2018-12-13 | 富士フイルム株式会社 | 細胞積層体の製造方法 |
| CN110709503B (zh) * | 2017-06-09 | 2023-09-08 | 富士胶片株式会社 | 细胞层叠体的制造方法 |
| WO2019054500A1 (ja) | 2017-09-15 | 2019-03-21 | Ａｇｃ株式会社 | マイクロ流路チップ |
| JP2021526386A (ja) * | 2018-05-22 | 2021-10-07 | モルフォセル テクノロジーズ インコーポレイテッドＭｏｒｐｈｏｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ． | 灌流バイオリアクタ、灌流装置、人工肝臓システム及びこれらに関連する方法 |
| US11805775B2 (en) | 2018-05-22 | 2023-11-07 | Morphocell Technologies Inc. | Perfusion bioreactor, perfusion device, artificial liver system, and related methods |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2002335949A (ja) | ハニカム構造体フィルムを用いた細胞の三次元組織培養法 | |
| JP4731044B2 (ja) | 延伸フィルムおよびそれを用いた細胞培養基材 | |
| JP4431233B2 (ja) | ハニカム構造体およびその調製方法、ならびにその構造体を用いたフィルムおよび細胞培養基材 | |
| Zhou et al. | Engineering aligned electrospun PLLA microfibers with nano-porous surface nanotopography for modulating the responses of vascular smooth muscle cells | |
| Nishikawa et al. | Honeycomb-patterned thin films of amphiphilic polymers as cell culture substrates | |
| Calejo et al. | Breath figures in tissue engineering and drug delivery: State-of-the-art and future perspectives | |
| JP4610885B2 (ja) | 細胞増殖抑制フィルムおよび医療用具 | |
| Ho et al. | Preparation of porous scaffolds by using freeze-extraction and freeze-gelation methods | |
| Ranucci et al. | Polymer substrate topography actively regulates the multicellular organization and liver-specific functions of cultured hepatocytes | |
| US9938384B2 (en) | Ultra-thin polymer film, and porous ultra-thin polymer film | |
| JP4247432B2 (ja) | 凹凸を有するハニカム構造体フィルム | |
| Tanaka | Design of novel 2D and 3D biointerfaces using self-organization to control cell behavior | |
| US10131874B2 (en) | Cell culture support and associated method for cell growth and release | |
| WO2004048064A1 (ja) | 微細突起構造体及びその製造方法 | |
| JP2008263863A (ja) | 細胞培養支持体とその製造方法 | |
| JPWO2006093207A1 (ja) | 細胞の分化／増殖を制御するための基材 | |
| Wang et al. | Biomimetic topography: bioinspired cell culture substrates and scaffolds | |
| Tanaka et al. | Control of hepatocyte adhesion and function on self-organized honeycomb-patterned polymer film | |
| Kim et al. | Thermoresponsive terpolymeric films applicable for osteoblastic cell growth and noninvasive cell sheet harvesting | |
| Kumashiro et al. | Rate control of cell sheet recovery by incorporating hydrophilic pattern in thermoresponsive cell culture dish | |
| Akiyama et al. | Temperature-responsive polymers for cell culture and tissue engineering applications | |
| JP4342338B2 (ja) | ３次元多孔質構造体とその製造方法 | |
| JP2008278769A (ja) | 膵島細胞からなる３次元凝集体をインビトロで製造する方法 | |
| Gritsch et al. | Nanostructured biocomposites for tissue engineering scaffolds | |
| Liu et al. | Fabrication of micropatterns of nanoarrays on a polymeric gel surface |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A711 | Notification of change in applicant |
Effective date: 20031201 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A712 |
|
| RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20040416 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20080423 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Effective date: 20101130 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 |
|
| A521 | Written amendment |
Effective date: 20110117 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Effective date: 20110201 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 |