JP2017063645A - バインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】細胞に酸素と栄養分とを供給することができるバインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法を提供する。【解決手段】第1細胞シート11と第2細胞シート12との間には膜状に形成されているバインダ材15が設けられている。バインダ材15には、孔が複数形成されており、孔は、第1細胞シート11の一方のシート面に接する第1膜面に開口している。孔は、厚み方向と第1膜面に沿った面方向とに貫通している。バインダ材15の空隙率は少なくとも50%とされている。【選択図】図1
Description
本発明は、バインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法に関する。
心臓や肝臓などの立体臓器の再生医療の実現においては、十分な厚みを有するいわゆる三次元に形成された細胞群で形成された組織体(以下、三次元細胞組織体と称する)の形成が不可欠である。三次元細胞組織体を形成する方法としては、スフェロイドと呼ばれる球状の細胞凝集体を面状に並べる方法や、シート状の細胞凝集体である複数の細胞シートを厚み方向に複数重ねる方法や、細胞シートを折りたたむことで三次元化する方法がある。細胞シートを折りたたむ方法は、大面積に細胞シートを作ることができれば、比較的簡単に三次元化ができるという利点がある。
細胞シートは、通常、シャーレなどの培養容器内でつくられるが、積層化に際して取り扱うためには、培養容器から破損させずに取り出すことが要求される。そこで、例えば特許文献1では、一定の温度範囲内で水和力が変化するいわゆる温度応答性ポリマーを表面に被覆した培養支持体上で細胞を培養して細胞シートをつくり、得られた細胞シートを剥離して複数重ねる手法を用いている。具体的には、温度応答性ポリマーの水和力が弱い温度域で細胞を培養し、温度応答性ポリマーの水和力が強い状態になる温度に変化させることで培養した細胞をシート状に剥離する。
上記のように破損することなく細胞シートを得ても、これを積層化して厚くするほど、酸素や培地中の培養液からの栄養分などの細胞への供給が不足するために、細胞が死滅してしまうという問題がある。そこで、特許文献1は、重ねられる複数の細胞シート間及び細胞シート内に血管網を形成する手法を提案している。
スフェロイドを面状に並べる方法は、得られる細胞凝集体の厚みに限界があり、三次元細胞組織体として利用可能なレベルではない。そしてスフェロイドを面状に並べたものを用いてさらに細胞を培養し、厚くしようとしても、酸素や培地中の培養液からの栄養分などの細胞への供給が不足するために、細胞が死滅してしまう。また、特許文献1のように細胞シートの利用で血管網を形成する手法は、複雑で時間がかかるという問題があり、簡易な別手法が望まれる。
そこで本発明は、細胞に酸素と栄養分とを供給することができるバインダ材、細胞集積体、細胞集積方法、細胞保存方法を提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明のバインダ材は、第1細胞群と第2細胞群との間に配されて用いられ、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも50%である。
第1細胞群及び第2細胞群は、細胞凝集体と、散在した複数の細胞とのいずれか一方であることが好ましい。細胞凝集体は、複数の細胞がシート状に凝集した細胞シートまたは球状に凝集したスフェロイドであることが好ましい。
複数の孔が厚み方向に貫通しており、厚みが1μm以上50μm以下の範囲内であることが好ましい。
一方の膜面の第1領域と第2領域とが対向する状態に折り曲げられており、第1細胞群がバインダに挟まれた状態に配されて用いられてもよい。
本発明の細胞集積体は、第1細胞群と、第2細胞群と、第1細胞群と第2細胞群との間に設けられている上記バインダ材とを備える。
細胞集積体は、バインダ材が一方の膜面の第1領域と第2領域とが対向する状態に折り曲げられており、第1細胞群がバインダ材に挟まれていてもよい。
本発明の細胞集積方法は、以下の第1ステップと第2ステップとを有する。第1ステップは、第1細胞群と、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも50%であるバインダ材とを、第1細胞群と一方の膜面とが接触する状態に重ねる。第2ステップは、第2細胞群とバインダ材とを、第2細胞群とバインダ材の他方の膜面とが接触する状態に重ねる。
第1細胞群は上記の細胞凝集体であり、第1細胞群の厚みは大きくとも200μmであることが好ましい。第2細胞群は上記の細胞凝集体であり、第2細胞群の厚みは大きくとも200μmであり、バインダ材の複数の孔は厚み方向に貫通していることが好ましい。バインダ材を一方の膜面の第1領域と第2領域とが対向する状態に折り曲げ、第1細胞群をバインダに挟まれた状態に配することが好ましい。
本発明の細胞保存方法は、第1細胞群と第2細胞群とを重ねて細胞を保存する細胞保存方法であり、第1細胞群と、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも50%であるバインダ材とを、第1細胞群と一方の膜面とが接触する状態に重ね、第2細胞群とバインダ材とを、第2細胞群とバインダ材の他方の膜面とが接触する状態に重ね、バインダ材を介して第1細胞群と第2細胞群とが重なっている細胞集積体を、細胞の培養液に接した状態で保持する。
本発明によれば、細胞に酸素と栄養分とを供給することができる。
図1において、細胞集積体10は、第1細胞シート11と、第2細胞シート12と、第1細胞シート11と第2細胞シート12との間に配されているバインダ材15とを備える。第1細胞シート11と第2細胞シート12とは、複数の細胞がシート状に凝集した細胞凝集体であり、細胞外マトリックスを含む。複数の細胞はこの細胞外マトリックスの介在によりシート形状を成している。バインダ材15は、第1細胞シート11の細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものであり、この例では、第1細胞シート11と第2細胞シート12との両方の細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものとなっている。バインダ材15ついての詳細は、別の図面を用いて後述する。
第1細胞シート11と第2細胞シート12とバインダ材15とは、図1における上方から見た場合、すなわち細胞集積体10を第1細胞シート11側の表面に対して垂直な方向から見た場合において、この例では径が20μmの円形としているが、径はこれに限られず、また、円形以外の形状、たとえば楕円形、矩形、多角形、不定形などでもよい。
第1細胞シート11の厚みT11と第2細胞シート12の厚みT12とは、この例では100μmとしているが、これに限定されない。ただし、厚みT11と厚みT12とは、第1細胞シート11及び第2細胞シート12の取り扱いの容易性などの観点では少なくとも50μm、第1細胞シート11と第2細胞シート12との細胞に酸素や栄養分とをより確実に供給する観点では大きくても200μm以下、すなわち50μm以上200μm以下の範囲内であることが好ましい。厚みT11と厚みT12とは、60μm以上180μm以下の範囲内であることがより好ましく、70μm以上160μm以下の範囲内であることがさらに好ましい。なお、図1においては、厚みT11と厚みT12と詳細を後述するバインダ材15の厚みT15とについて、大きく誇張して描いてある。
第1細胞シート11と第2細胞シート12との細胞の種類は、互いに同じであってもよいし、異なるものであってもよく、本実施形態では同じにしている。本実施形態における細胞は肝細胞であるが、これに限られず、細胞は、例えば、心臓組織、肝組織、腎組織、副腎組織、皮膚組織、粘膜組織をそれぞれ構成する細胞であって、それぞれの組織において複数種類の細胞が混在している場合にはそれらのうちのいずれか1種であってもよいし、もしくは2種以上の混合であってもよい。
第1細胞シート11及び第2細胞シート12の細胞は、例えば培地において播種された細胞の培養による培養細胞であり、この例では、第1細胞シート11及び第2細胞シート12は、培養する際に用いられていた培養液を含んでいる。しかし、培養の際の培養液に代えて、新たな培養液であってもよく、またはこれらの混合液でもよい。
バインダ材15は、前述の通り、第1細胞シート11と第2細胞シート12との細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものである。バインダ材15は、膜状に形成されており、一方の膜面(以下、第1膜面と称する)が第1細胞シート11の一方のシート面に接触した状態に、他方の膜面(以下、第2膜面と称する)が第2細胞シート12の一方のシート面に接触した状態に、第1細胞シート11及び第2細胞シート12と重なっている。
バインダ材15について、図2〜図4を参照しながら説明する。なお、図2は第1膜面を示す。なお、図3,図4においては、第1膜面に符号15aを付し、第2膜面には符号15bを付してある。
バインダ材15は、第1膜面15aに開口した孔21を複数備える。孔21は、第1膜面15a上に配された第1細胞シート11(図1参照)に酸素と栄養分とを案内するためのものである。この例では、孔21は、第1膜面15aに加えて第2膜面15bにも開口しており、第1細胞シート11のみならず、第2膜面15b上に配された第2細胞シート12にも酸素と栄養分とを案内するためのものでもある。孔21は、第1膜面15aと第2膜面15bとに対して垂直な方向、すなわち厚み方向にバインダ材15を貫通しており、第1膜面15a,第2膜面15bにそれぞれ開口して開口部(以下、表面開口部と称する)21aを形成している。
複数の孔21は、第1膜面15aに沿って規則的に、この例では、より具体的にはマトリクス状に配列されている。各孔21は、その大きさ、形状が一定であり、表面開口部21aの大きさ、形状も一定である。このようなバインダ材15は、第1膜面15aに垂直な方向から見たときに、任意の1つの孔21を中心にした6角形の各頂点に周囲の6個の孔21が配された状態に、各孔21が密に配列されている。これによりバインダ材15は、蜂の巣状となるハニカム構造となっている。
ハニカム構造は、表面開口部21aの形状や、孔21の第1膜面15aに平行な断面の形状が6角形である必要はない。この例では、表面開口部21aの形状は円形となっている。第1膜面15aの単位面積当たりの孔21の密度や隣り合う孔21同士の距離等に応じて、表面開口部21aと、第1膜面15aに平行な断面での孔21との各形状は、例えば丸みを帯びた略6角形や略8角形等になる場合もあり、ハニカム構造とはこのような態様も含む。また、ハニカム構造は、各孔21が互いに独立している構造の他、この例のように隣接した孔21同士がバインダ材15の内部で繋がっている構造をも含む。さらに、孔21の配列は、上記のものに限定されない。任意の1つの孔21の周囲に3〜5個、あるいは7個以上の孔21が配されてもよく、孔21が正方配列されてもよい。
図3,図4では、バインダ材15の厚みT15に対して、隣り合う孔21と孔21との間の隔壁22の厚みを誇張して描いてある。隣り合う孔21と孔21とを隔てる隔壁22は、この例では、第1膜面15aと第2膜面15bとのそれぞれから厚み方向での中央に向かうに従い厚みが漸減している。
この例では、隔壁22は、厚み方向での概ね中央に隔壁開口部22aが形成されており、これにより、隣接した孔21同士はバインダ材15の内部で第1膜面15aに沿った方向(以下、面方向と称する)に繋がっている。ただし、隔壁22は、隔壁開口部22aが形成されていない場合もあり、その場合には孔21は個々に独立している。隔壁開口部22aは、各孔21に酸素と栄養分とを案内するためのものである。
孔21は、第1細胞シート11へ酸素と栄養分とを案内する観点では、厚み方向と面方向とのいずれか一方に貫通していればよい。ただし、酸素と栄養分との第1細胞シート11へのより確実な案内や、第1細胞シート11に加えて第2細胞シート12へ対しても案内する観点では、本実施形態のように、厚み方向と面方向との両方に貫通している方が好ましい。
表面開口部21aの径、すなわち、孔21の第1膜面15aにおける開口径φaは、2μm以上100μm以下の範囲内とされ、本実施形態では20μmである。開口径φaは、5μm以上70μm以下の範囲内であることがより好ましく、10μm以上50μm以下の範囲内であることがさらに好ましい。なお、孔21のように厚み方向に貫通した孔が形成されている場合には、その孔の第2膜面15bにおける開口径φbについても同様に2μm以上100μm以下の範囲内とされることが好ましく、本実施形態では20μmである。
また、隔壁開口部22aの開口径φcは、2μm以上80μm以下の範囲内とされることが好ましい。
バインダ材15の空隙率は少なくとも50%、すなわち50%以上とされている。この空隙率は、バインダ材15に孔21が形成されていない場合の体積をV1、複数の孔21の体積の和をV2とするときに、(V2/V1)×100で算出して求める。体積V2は、SEM(Scanning Electron Microscope、走査型電子顕微鏡)での画像により、バインダ材15の内部における孔21の最大径、開口径φa,開口径φbから算出して求めることができる。バインダ材15の空隙率は、50%以上90%以下の範囲内であることが好ましい。
第1膜面15aにおいて隣り合う表面開口部21aと表面開口部21aとの距離(以下、開口部ピッチと称する)Pは、特に限定されないが、3μm以上120μm以下の範囲内であることが好ましく、本実施形態では24μmである。開口部ピッチPは、5μm以上100μm以下の範囲内であることがより好ましく、10μm以上60μm以下の範囲内であることがさらに好ましい。開口径φaと開口部ピッチPとは、例えばSEMの画像から求めている。
バインダ材15の厚みT15は、孔21が厚み方向に貫通している場合には、1μm以上50μm以下の範囲内であることが好ましく、本実施形態では10μmとしている。孔21が厚み方向に貫通している場合の厚みT15は、1μm以上50μm以下の範囲内であることがより好ましく、2μm以上40μm以下の範囲内であることがさらに好ましい。なお、孔21が面方向にのみ貫通している場合には、厚みT15は特に限定されない。
バインダ材15は、この例では疎水性ポリマーから形成されている。疎水性ポリマーとしては、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリジオキサノン、ポリヒドロキシブチレート、ポリブタジエン、ポリウレタン、ポリスチレン(PS、polystyrene)、ポリメタクリル酸メチル、ポリカーボネート、およびこれらの繰り返し単位を含む共重合体等が好ましく、本実施形態ではポリ乳酸を用いている。生体内での使用により経時での分解や吸収性の機能を付与する観点では、上記の中でもポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、これらの共重合体が特に好ましい。また、屈曲部、伸縮部に適用、例えば屈曲部や伸縮部に貼り付けて使用する観点では、伸縮性を有するポリカプロラクトン、ポリブタジエンが特に好ましい。
バインダ材15は、疎水性ポリマーに加えて、例えば両親媒性化合物を含んでいてもよく、両親媒性化合物はポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれでもよい。両親媒性化合物が含まれる場合の両親媒性化合物の質量は、バインダ材15の質量100に対して10以下であることが好ましい。
上記構成の作用を説明する。第1細胞シート11は一方のシート面がバインダ材15の第1膜面15aに接触した状態に、第2細胞シート12は一方のシート面がバインダ材15の第2膜面15bに接触した状態にそれぞれ配されており、バインダ材15の孔21は第1膜面15aに開口するとともに、厚み方向に貫通しているから、第2細胞シート12が培養液に接した状態にされている場合に、第2細胞シート12からバインダ材15の孔21へ案内され、孔21を通じて第1細胞シート11へ案内される。培養液は、栄養分と溶存酸素が含まれているから、第1細胞シート11の細胞へ栄養分と酸素とが供給される。また、第1細胞シート11の他方のシート面11bが外部に露呈した状態にされている場合には、外部の雰囲気中の酸素も第1細胞シート11へ案内される。またこの場合には、外部の雰囲気中の酸素は、第1細胞シート11からバインダ材15へと案内され、バインダ材15の孔21を通じて第2細胞シート12へ案内される。これにより、第2細胞シート12の細胞へ酸素が供給される。
以上のようにバインダ材15の孔21は厚み方向に貫通しているから、第1細胞シート11と第2細胞シート12とのいずれか一方が酸素に接触することにより他方へ酸素が案内されて第1細胞シート11と第2細胞シート12との細胞に供給される。栄養分についても同様に、第1細胞シート11と第2細胞シート12とのいずれか一方が培養液に接触することにより他方へ培養液の栄養分が案内されて、他方の細胞に供給される。この供給により、細胞が生存した状態に保存される。また、老廃物についても同様に案内されるから、代謝の観点で細胞はより確実に生存が維持された状態に保存される。
孔21は面方向に貫通しているから、バインダ材15の例えば側縁部などから内部に取り込まれた酸素や栄養分が、隔壁開口部22aを介して個々の孔21を案内される。個々の孔21は第1膜面15aに開口しているから、孔21内に案内されてきた酸素や栄養分は第1細胞シート11へ向かう。これにより、第1細胞シート11の細胞へ酸素や栄養分が供給される。また、この例では個々の孔21が第2膜面15bにも開口しているから、第2細胞シート12へも同様に酸素や栄養分が案内されて、第2細胞シート12の細胞にも酸素や栄養分が供給される。
この例の孔21は厚み方向と面方向との両方に貫通しているから、バインダ材15の内部に取り込まれた酸素や栄養分は、バインダ材15の内部全体へより拡散しやすくなり、第1細胞シート11と第2細胞シート12との両方に対してより確実に案内されて、両方の細胞に、より確実に供給される。以上のように、バインダ材15は細胞を生存した状態に保存するための細胞保存材料として機能する。
開口径φaが2μm以上とされているから、酸素と栄養分、特に、酸素よりも大きい分子を含む栄養分が、確実に第1細胞シート11へ案内される。第1膜面15aにおける開口径φaが100μm以下とされているから、バインダ材15が第1細胞シート11を支える際の強度が十分となる。開口径φbも同様に2μm以上100μm以下の範囲内とされているから、酸素と栄養分、特に栄養分が、確実に第2細胞シート12へ案内され、細胞の保存効果が高まる。
開口径φcが2μm以上であることから、2μm未満であるよりも酸素と栄養分、特に栄養分が、第1細胞シート11へより十分に案内される。開口径φcが80μm以下であるから、80μmよりも大きい場合に比べてバインダ材15の圧縮に対する耐久性の点で有利である。
バインダ材15の空隙率が50%以上であるから、第1細胞シート11と第2細胞シート12とのシート面全域の細胞に対して酸素と栄養分とが確実に案内される。
開口部ピッチPが3μm以上であるから、3μmよりも小さい場合に比べて、バインダ材15の強度が高い。開口部ピッチPが120μm以下であるから、120μmよりも大きい場合に比べて、第1細胞シート11、第2細胞シート12のシート面全体の細胞に対して酸素と栄養分がより確実に案内される。
ところで、細胞群は、安定状態を図るように姿勢を変化させる傾向があり、培養されて増殖する間も同様に、細胞群としてより安定状態となるように姿勢を変化させる傾向がある。したがって、第1細胞シート11と第2細胞シート12との細胞は、孔21が厚み方向に貫通している場合においては、この孔21の空隙を利用して、互いに増殖、遊走、自己組織化を図るようになる。これにより、一定時間経過後に、第1細胞シート11と第2細胞シート12との各細胞から培養細胞が新生されてバインダ材15の内部で一体化することがある。孔21が厚み方向に貫通している本実施形態では、バインダ材15の厚みT15を50μm以下としているから、50μmよりも大きい場合に比べて、第1細胞シート11と第2細胞シート12との細胞同士が互いの存在を認識しやすくなり、上記の一体化が起こりやすい。また。厚みT15を1μm以上としているから、1μm未満である場合に比べて細胞集積体10としての強度の点でより優れる。
バインダ材15による第1細胞シート11の細胞への酸素や栄養分の供給の効果は、第1細胞シート11の厚みが大きい場合ほど大きく、第1細胞シート11が50μm以上の厚みであるときに、特に顕著である。同様に、バインダ材15による第2細胞シート12の細胞への酸素や栄養分の供給の効果は、第2細胞シート12の厚みが大きい場合ほど大きく、第2細胞シート12が50μm以上の厚みであるときに、特に顕著である。
細胞集積体10の製造方法について、図5を参照しながら説明する。細胞集積体10は、第1細胞シート11とバインダ材15とを重ねる第1ステップと、第2細胞シート12とバインダ材15とを重ねる第2ステップとを有する。例えば、以下である。
前述のように第1細胞シート11,第2細胞シート12は、それぞれ、培養細胞から形成されている。第2細胞シート12がつくられた培養容器30中には、第2細胞シート12が底部に収容された状態とされており、培養の際に用いられた培養液31もこの培養容器30内に収容されている。第1細胞シート11も、培養容器30と同様の培養容器(図示無し)でつくられており、その培養容器から取り出される。培養容器30内の第2細胞シート12の上に、バインダ材15は、第2膜面15bが図5における下方を向けた姿勢で配される。これにより、第2細胞シート12の一方のシート面12aにバインダ材15の第2膜面15bが接した状態に、バインダ材15と第2細胞シート12とが重ねられる。第1細胞シート11は、バインダ材15の上に配される。これにより、第1細胞シート11の一方のシート面11aがバインダ材15の第1膜面15aに接した状態に、バインダ材15と第1細胞シート11とが重ねられる。
上記の製造方法の例は、第2ステップ、第1ステップの順に細胞集積体10を製造しているが、第1細胞シート11とバインダ材15とを重ねてから、第1細胞シート11が重なった状態のバインダ材15を第2細胞シート12に重ねるというように、第1ステップ、第2ステップの順で細胞集積体10を製造してもよい。
また、上記の製造方法の例では、第2細胞シート12の上に、バインダ材15、第1細胞シート11を順に積み上げているが、これに代えて、第1細胞シート11の上に、バインダ材15、第2細胞シート12を順に積み上げてもよい。
第1細胞シート11と第2細胞シート12の細胞を保存する方法は、上記の製造方法で製造した細胞集積体10を、培養液31に接した状態に接した状態で保持する。上記の製造方法の例によると、第1細胞シート11と第2細胞シート12とバインダ材15とのうち少なくとも第2細胞シート12は、培養液31に接した状態になり、孔21はバインダ材15を厚み方向に貫通しているから、第2細胞シート12の培養液31はバインダ材15を通過して第1細胞シート11へ案内される。これにより培養液31中の栄養分と溶存酸素とは、第1細胞シート11の細胞へ供給される。また、第1細胞シート11の他方のシート面11b、この例では図5における上面が培養液31の液面よりも高く位置している場合には、第1細胞シート11の細胞には外部の雰囲気からも酸素が供給される。この場合には、厚み方向に貫通した孔21を通じて、第2細胞シート12にも酸素が案内される。
培養液31の液面がバインダ材15の第2膜面15bよりも高い場合には、バインダ材15の側縁からも培養液31がバインダ材15内へ取り込まれる。バインダ材15は面方向に貫通した孔21を備え、孔21は第1膜面15aに開口するから、この孔21を通じて、培養液31は第1細胞シート11へ案内される。また、バインダ材15の孔21は厚み方向にも貫通しているから、第2細胞シート12の厚みが大きくても、孔21を通じてバインダ材15と接している一方のシート面12aから培養液31が案内される。
なお、培養容器中の第1細胞シート11の上に、バインダ材15,第2細胞シート12の順に重ねて細胞集積体10を製造した場合であって、バインダ材15の孔21が、厚み方向に貫通せず、面方向にのみ貫通している場合には、製造した細胞集積体10を、第2細胞シート12が最下層になるような姿勢で、培養液を収容した容器内に保持する。
上記の例は、2枚の細胞シートを重ねる態様であるが、重ねる細胞シートの数は2に限られず、3以上であってもよい。ただし、連続して重ね併せられている複数の細胞シート(集積部と称する)の厚みの合計が200μm以下となるように、第1の集積部と第2の集積部との間にバインダ材15を設けた態様にすることが好ましい。例えば、以下である。
図6において、細胞集積体50は、図6における下から順に、第2細胞シート12、第1細胞シート11が連続して重なっている第1集積部51、バインダ材15、第1細胞シート11が連続して重なっている第2集積部52、バインダ材15、第1細胞シート11が重なっている構成を有する。第1集積部51と第2集積部52とにおける第1細胞シート11の数はそれぞれ5とされている。第1集積部51と第2集積部52との各厚みTSは大きくとも200μm、すなわち200μm以下にされることが好ましく、本実施形態では、それぞれ100μmとしている。バインダ材15は、第2細胞シート12と第1集積部51との間と、第1集積部51と第2集積部52との間と、第2集積部52と図6における最も上部の第1細胞シート11との間とに、それぞれ配されている。このように、第1集積部51,第2集積部52の厚みを200μm以下に抑えた態様でバインダ材15を設けておくことで、酸素と栄養分とが各細胞シートに確実に案内されて、各細胞シートの細胞に供給される。
この例では、第1集積部51と第2集積部52とにおける第1細胞シート11の数はそれぞれ5とされているが、この数は5に限られない。また、第1集積部51と第2集積部52とは、それぞれ第1細胞シート11から形成されているが、互いに異なる細胞シートから形成されていてもよい。
バインダ材15は、折り曲げて使用することができる。図7に示す細胞集積体60は、バインダ材15と第1細胞シート11と第2細胞シート12とを備える。なお、図7においても、バインダ材15、第1細胞シート11、第2細胞シート12の厚みを大きく誇張して描いてある。この例のバインダ材15、第1細胞シート11、第2細胞シート12は、矩形に形成されている以外は、図1におけるバインダ材15、第1細胞シート11、第2細胞シート12と同じであるので同じ符号を用いる。なお、この例においても、バインダ材15、第1細胞シート11、第2細胞シート12は円形などの他の形状でもよい。
バインダ材15は、第1膜面15aの第1領域S1と第2領域S2とが対向する状態に、第1細胞シート11側に折り曲げられている。この例では、第1細胞シート11を第1膜面15aに配してからバインダ材15を折り曲げており、これにより第1細胞シート11も折り曲げられて重なった状態とされ、バインダ材15に挟まれている。なお、バインダ材15を折り曲げてから、第1領域S1と第2領域S2との間に第1細胞シート11を配してもよい。第1領域S1と第2領域S2との間で重ねられる細胞シートの枚数は2枚以上であってもよいが、重なった状態での厚みは大きくとも200μm以下にすることが好ましい。この例では、バインダ材15の折り曲げ回数を1回としているが、2回以上の回数にしてもよい。
バインダ材15は、第2膜面15bの第1領域と第2領域とが対向する状態に、折り曲げてもよい。この場合には、孔21は、バインダ材15の厚み方向に貫通していることが好ましい。
なお、バインダ材15はロール状に巻いて使用してもよい。ロール状に巻かれた場合の細胞集積体(図示無し)は、バインダ材15と第1細胞シート11と第2細胞シート12とを備える。バインダ材15は、第1膜面15aの第1領域と第2領域とが互いに同じ向きで重なる状態に、第1細胞シート11側を内側にして巻かれている。第1細胞シート11を第1膜面15aに配してからバインダ材15をロール状に巻くことにより、第1細胞シート11も巻かれてバインダ材15を介して重なった状態とされ、バインダ材15に挟まれている。第1領域と第2領域との間で重ねられる細胞シートの枚数は2枚以上であってもよいが、重なった状態での厚みは大きくとも200μm以下にすることが好ましい。ロール状に巻く場合のバインダ材15は、孔21は、バインダ材15の厚み方向に貫通していることが好ましい。なお、ロール状に巻く巻き数は、2以上でもよい。バインダ材15は、第2膜面15bの第1領域と第2領域とが互いに同じ向きで重なる状態に、第2細胞シート12側を内側にして巻かれてもよい。この場合にも、孔21は、バインダ材15の厚み方向に貫通していることが好ましい。
図1及び図6の細胞集積体10,50は、第1細胞シート11と第2細胞シート12とに代えて、支持体を備える細胞シートを備えてもよい。例えば、図7に示す第3細胞シート70は、細胞層71と、支持体72とを備える。細胞層71は、前述の第1細胞シート11及び第2細胞シート12と同様に、複数の細胞と細胞マトリックスとを含み、細胞群がシート形状を成している。なお、細胞層71は、第1細胞シート11及び第2細胞シート12と同様に、培養液などの他の物質を含んでいてもよい。
支持体72は、細胞層71をシート形状に保持した状態で支持するためのものであり、シート形状とされている。支持体72は、バインダ材15と同様に、厚み方向と面方向とに貫通し、細胞層71と接する表面に開口する孔(図示せず)が複数形成されているものとされている。
この第3細胞シート70を前述の細胞集積体10の第1細胞シート11に代えて用いる場合には、支持体72とバインダ材15とが接した状態に、第3細胞シート70とバインダ材15とが重ねられる。なお、支持体72として、厚み方向には貫通せず、面方向のみに貫通し、細胞層71と接する表面に開口する孔が複数形成されているものを用いた場合には、細胞層71とバインダ材15とが接した状態に、第3細胞シート70とバインダ材15とが重ねられる。
この第3細胞シート70を前述の細胞集積体10の第2細胞シート12に代えて用いる場合には、支持体72と細胞層71とのいずれか一方とバインダ材15とが接した状態に、第3細胞シート70とバインダ材15とが重ねられる。なお、支持体72として、厚み方向には貫通せず、面方向のみに貫通し、細胞層71と接する表面に開口する孔が複数形成されているものを用いた場合も同様に、支持体72と細胞層71とのいずれか一方とバインダ材15とが接した状態に、第3細胞シート70とバインダ材15とが重ねられる。第3細胞シート70の厚みは、第1細胞シート11の厚みT11及び第2細胞シート12の厚みT12と同様に、取り扱いの容易性などの観点では少なくとも50μm、第3細胞シート70の細胞層71の細胞に酸素や栄養分とをより確実に供給する観点では大きくても200μm以下、すなわち50μm以上200μm以下の範囲内であることが好ましい。
バインダ材15に代えて、図8に示す複合バインダ材80を用いてもよい。複合バインダ材80は、バインダ材15と、細胞非接着部82とを備える。細胞非接着部82は、第1細胞シート11及び第2細胞シート12の細胞がバインダ材15に接着することを一定期間抑制するためのものである。
細胞非接着部82は、バインダ材15の第1膜面15aと第2膜面15bとにそれぞれ形成されており、複合バインダ材80の表面80a,80bを成しているが、表面開口部21aには形成されていない。この例では、細胞非接着層82は、表面開口部21aを除く第1膜面15aと第2膜面15bとを覆っているが、一部のみ覆った態様でもよい。細胞非接着層82は、第1膜面15aと第2膜面15bとのいずれか一方にのみ設けられていてもよい。また、この例では、細胞非接着層82は、孔21と孔21との間の隔壁の表面には設けられていないが、隔壁の表面にも設けられていてよい。細胞非接着部82は、例えば周知のディップコート法により、形成することができる。例えば、細胞非接着部82を構成する素材を溶媒に溶かして溶液をつくり、この溶液にバインダ材15を浸漬してバインダ材15に溶液を塗布した後、塗膜を乾燥することで、形成することができる。細胞非接着部82が形成されていることにより、第1細胞シート11及び第2細胞シート12の細胞とバインダ材15との一体化が一定期間抑制されるから、酸素と栄養分との流路が確保されて細胞がより確実に保存される。
細胞非接着層82を構成する素材としては、ポリエチレングリコール(PEG)、2‐メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)ポリマーが好ましい。
上記の例は、細胞凝集体が細胞シートである場合であるが、細胞凝集体は細胞シートに限られず、複数の細胞が球状に凝集したスフェロイドであってもよい。例えば、図10に示す細胞集積体90は、複数の第1スフェロイド91と、複数の第2スフェロイド92と、第1スフェロイド91と第2スフェロイド92との間に配されているバインダ材15とを備える。バインダ材15は、細胞集積体10におけるものと同じである。第1スフェロイド91と第2スフェロイド92とは、複数の細胞が球状に凝集した細胞凝集体であり、細胞マトリックスを含む。複数の細胞はこの細胞外マトリックスの介在により球状を成している。第1スフェロイド91は、バインダ材15の第1膜面15aに、散在して配されている。第2第1スフェロイド92は、バインダ材15の第2膜面15bに、散在して配されている。バインダ材15は、第1スフェロイド91の細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものであり、この例では、第1スフェロイド91と第2スフェロイド92との両方の細胞に酸素と栄養分とを供給するためのものとなっている。このように複数のスフェロイドが散在した状態でバインダ材15に配された細胞集積体90も、第1スフェロイド91と第2スフェロイド92との細胞に酸素と栄養分とが供給されるから、細胞が生存した状態に保存される。
また、細胞シートやスフェロイドなどの細胞凝集体に代えて、細胞(シングル)であってもよい。この場合には、第1膜面15aと第2膜面15bとに、複数の細胞が散在した状態で配される。このように複数の細胞が散在した状態でバインダ材15に配された細胞集積体も、細胞に酸素と栄養分とが供給されるから、細胞が生存した状態に保存される。
10,50 細胞集積体
11,12 第1細胞シート,第2細胞シート
15 バインダ材
21 孔
21a 表面開口部
22 隔壁
22a 隔壁開口部
31 培養液
82 細胞非接着部
11,12 第1細胞シート,第2細胞シート
15 バインダ材
21 孔
21a 表面開口部
22 隔壁
22a 隔壁開口部
31 培養液
82 細胞非接着部
Claims (15)
- 第1細胞群と第2細胞群との間に配されて用いられ、
膜状に形成されており、
一方の膜面に開口した複数の孔が前記一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、
前記複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、前記複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、
空隙率が少なくとも50%であるバインダ材。 - 前記第1細胞群及び前記第2細胞群は、
細胞凝集体と、散在した複数の細胞とのいずれか一方である請求項1に記載のバインダ材。 - 前記細胞凝集体は、複数の細胞がシート状に凝集した細胞シートまたは球状に凝集したスフェロイドである請求項2に記載のバインダ材。
- 前記複数の孔が厚み方向に貫通しており、
厚みが1μm以上50μm以下の範囲内である請求項1〜3のいずれか1項に記載のバインダ材。 - 前記一方の膜面の第1領域と第2領域とが対向する状態に折り曲げられており、前記第1細胞群が前記バインダ材に挟まれた状態に配されて用いられる請求項1〜4のいずれか1項に記載のバインダ材。
- 第1細胞群と、
第2細胞群と、
前記第1細胞群と前記第2細胞群との間に設けられている請求項1〜4のいずれか1項に記載のバインダ材と、
を備える細胞集積体。 - 前記バインダ材は前記一方の膜面の第1領域と第2領域とが対向する状態に折り曲げられており、前記第1細胞群は前記バインダ材に挟まれている請求項6に記載の細胞集積体。
- 第1細胞群と、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が前記一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、前記複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、前記複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも50%であるバインダ材とを、前記第1細胞群と前記一方の膜面とが接触する状態に重ねる第1ステップと、
第2細胞群と前記バインダ材とを、前記第2細胞群と前記バインダ材の他方の膜面とが接触する状態に重ねる第2ステップと、
を有する細胞集積方法。 - 前記バインダ材は、前記複数の孔が厚み方向に貫通しており、
前記バインダ材の厚みは1μm以上50μm以下の範囲内である請求項8に記載の細胞集積方法。 - 前記第1細胞群及び前記第2細胞群は、
細胞凝集体と、散在した複数の細胞とのいずれか一方である請求項8または9に記載の細胞集積方法。 - 前記細胞凝集体は、複数の細胞がシート状に凝集した細胞シートまたは球状に凝集したスフェロイドである請求項10に記載の細胞集積方法。
- 前記第1細胞群は前記細胞凝集体であり、前記第1細胞群の厚みは大きくとも200μmである請求項10または11に記載の細胞集積方法。
- 前記第2細胞群は前記細胞凝集体であり、前記第2細胞群の厚みは大きくとも200μmであり、
前記バインダ材の前記複数の孔は厚み方向に貫通している請求項10〜12のいずれか1項に記載の細胞集積方法。 - 前記バインダ材を前記一方の膜面の第1領域と第2領域とが対向する状態に折り曲げ、前記第1細胞群を前記バインダ材に挟まれた状態に配する請求項8ないし13のいずれか1項に記載の細胞集積方法。
- 第1細胞群と第2細胞群とを重ねて細胞を保存する細胞保存方法において、
前記第1細胞群と、膜状に形成されており、一方の膜面に開口した複数の孔が前記一方の膜面に沿って規則的に配列されたハニカム構造とされ、前記複数の孔のそれぞれが厚み方向に貫通、または、前記複数の孔が面方向に沿った面方向に貫通しており、空隙率が少なくとも50%であるバインダ材とを、前記第1細胞群と前記一方の膜面とが接触する状態に重ね、
前記第2細胞群と前記バインダ材とを、前記第2細胞群と前記バインダ材の他方の膜面とが接触する状態に重ね、
前記バインダ材を介して前記第1細胞群と前記第2細胞群とが重なっている前記細胞集積体を、前記細胞の培養液に接した状態で保持することを特徴とする細胞保存方法。
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