KR102235430B1

KR102235430B1 - 세포 적층체의 제조 방법

Info

Publication number: KR102235430B1
Application number: KR1020197036033A
Authority: KR
Inventors: 마사후미 니시노; 고주 이토; 신지 미마; 하야토 미요시
Original assignee: 후지필름 가부시키가이샤
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2021-04-01
Also published as: CA3066325C; US20200095531A1; EP3636746B1; CA3066325A1; JPWO2018225835A1; CN110709503B; EP3636746A4; EP3636746A1; KR20200003902A; JP6877540B2; CN110709503A; WO2018225835A1

Abstract

저부 및 저부의 외연으로부터 기립하는 측벽부를 갖는 용기와, 다공막과, 다공막을 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향시켜 지지하는 지지 부재를 이용하여, 다공막의 양면에 세포층을 구비하는 세포 적층체를 제조하는 방법으로서, 다공막이 지지 부재에 의하여 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향한 상태로 지지되고, 또한 중력 방향에 있어서 용기의 저부가 상방이며 다공막이 하방인 상태로, 용기의 내저면과 다공막의 표면에 접하는 액체 배지 중에서 제1 세포를 배양하는 것; 및, 다공막이 지지 부재에 의하여 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향한 상태로 지지되며, 또한 중력 방향에 있어서 용기의 저부가 하방이며 다공막이 상방인 상태로, 다공막의 하측의 면에서 제1 세포를 배양하고, 다공막의 상측의 면에서 제2 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포 적층체의 제조 방법.

Description

세포 적층체의 제조 방법

본 개시는, 세포 적층체의 제조 방법에 관한 것이다.

생체 내의 조직에 유사한 구조를 갖는 인공 세포 조직을 제조하는 방법이, 예를 들면 일본 공개특허공보 2002-335949호 및 일본 특허공보 제5113332호에 개시되어 있다.

일본 공개특허공보 2002-335949호에는, 허니콤(honeycomb) 구조체 필름의 양면에 있어서 세포를 배양하여, 세포의 삼차원 집합체를 얻은 것이 개시되어 있다. 즉, 일본 공개특허공보 2002-335949호에는, 허니콤 구조체 필름의 한쪽의 면에 세포를 파종하여 필름에 접착시키고, 이어서, 다른 한쪽의 면에 세포를 파종하여, 필름의 양면에 있어서 동종의 세포(간 세포 또는 심근 세포)를 배양한 것이 개시되어 있다.

일본 특허공보 제5113332호에는, 셀 컬처 인서트(cell culture insert)라고 불리는 필터 디바이스의 필터 상면에 뇌 모세 혈관 내피 세포층이 배치되고, 필터 하면에 뇌 주피 세포(pericyte)층이 배치되며, 배양 플레이트의 저면에 성상 세포(astrocyte)층이 배치된 혈액 뇌 관문 모델이 개시되어 있다. 본 개시에 있어서는, 셀 컬처 인서트를 상하 반전시켜 둔 상태로, 필터 상에 뇌 주피 세포를 파종하여 배양한 후, 셀 컬처 인서트를 배양 플레이트 내에 설치하고, 셀 컬처 인서트 내측에 혈관 내피 세포를 파종함으로써, 필터의 양면에 세포층을 형성하고 있다.

동물 실험을 대체하는 약물 평가용 또는 병태(病態) 평가용 인공 세포 조직을 얻으려면, 생체 내의 조직에 근사한 구조 및 기능을 갖는 세포 조직을 구축할 필요가 있다. 생체 내의 조직에 근사한 구조 및 기능을 갖는 세포 조직을 구축하는 관점에서는, 일본 공개특허공보 2002-335949호에 있어서의 허니콤 구조체 필름과 같이 개구율이 높은 다공막을 세포 배양의 기반으로 하여, 다공막의 양면에서 세포를 배양하는 것이 바람직하다. 또, 인공 세포 조직이 모방하는 생체 조직에 맞추어, 다공막의 양면 각각에 있어서 별종의 세포를 배양하고, 세포의 종류가 양 세포층에서 상이한 세포 적층체를 구축하는 것도 요구된다.

그러나, 일본 공개특허공보 2002-335949호에는, 허니콤 구조체 필름의 양면 각각에 있어서 별종의 세포를 배양하는 방법이 구체적으로 개시되어 있지 않다.

한편, 일본 특허공보 제5113332호에는, 셀 컬처 인서트의 필터의 상면 및 하면 각각에 있어서 별종의 세포를 배양하는 방법이 개시되어 있다. 단, 본 배양 방법에 있어서 이용한 셀 컬처 인서트는, Transwell(등록 상표) 인서트이며, 그 필터는 트랙 에칭 멤브레인(track etched membrane, TE막)이다. TE막은 일반적으로 개구율이 낮기 때문에(2%~20% 정도), TE막 상에 세포 현탁액을 두어도 액체 배지가 TE막을 통과하여 낙하하기 어렵다. 따라서, 필터로서 TE막을 구비하는 셀 컬처 인서트이면, 상하 반전시켜 둔 상태로 필터 상에 세포 현탁액을 파종하여 세포 배양이 가능하다. 그러나, 셀 컬처 인서트의 필터에, 일본 공개특허공보 2002-335949호에 있어서의 허니콤 구조체 필름과 같이 개구율이 높은 다공막을 적용한 경우, 상하 반전시켜 둔 상태로 필터 상에 세포 현탁액을 파종하면 액체 배지가 다공막의 구멍을 통과하여 낙하하게 되므로, 세포 배양은 할 수 없다.

본 개시의 실시형태는, 상기 상황하에서 이루어졌다.

본 개시는, 신규 세포 적층체의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 하며, 이것을 해결하는 것을 과제로 한다.

상기의 과제를 해결하기 위한 구체적 수단에는, 이하의 양태가 포함된다.

[1] 저부 및 저부의 외연(外緣)으로부터 기립하는 측벽부를 갖는 용기와, 다공막과, 다공막을 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향시켜 지지하는 지지 부재를 이용하여, 다공막의 양면에 세포층을 구비하는 세포 적층체를 제조하는 방법으로서, 다공막이 지지 부재에 의하여 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향한 상태로 지지되고, 또한 중력 방향에 있어서 용기의 저부가 상방이며 다공막이 하방인 상태로, 용기의 내저면과 다공막의 표면에 접하는 액체 배지 중에서 제1 세포를 배양하는 것; 및, 다공막이 지지 부재에 의하여 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향한 상태로 지지되고, 또한 중력 방향에 있어서 용기의 저부가 하방이며 다공막이 상방인 상태로, 다공막의 하측의 면에서 제1 세포를 배양하고, 다공막의 상측의 면에서 제2 세포를 배양하는 것을 포함하는, 세포 적층체의 제조 방법.

[2] 용기의 내저면은, 제1 세포가 접착하지 않는 성질을 갖는, [1]에 기재된 세포 적층체의 제조 방법.

[3] 지지 부재는, 축 방향의 일단에 다공막을 지지하는 통상부(筒狀部)이며, 용기의 내경보다 작은 외경을 갖고, 축 방향의 길이가 용기의 측벽부의 높이보다 짧은 통상부와, 통상부의 축 방향의 타단으로부터 직경 방향 외측으로 돌출되어, 용기의 측벽부의 가장자리에 걸치는 돌출부를 구비하는, [1] 또는 [2]에 기재된 세포 적층체의 제조 방법.

[4] 다공막이, 허니콤 구조를 갖는 다공막인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 세포 적층체의 제조 방법.

[5] 다공막의 재질이, 폴리뷰타다이엔, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리락트산 및 폴리락트산-폴리글라이콜산 공중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 세포 적층체의 제조 방법.

[6] 다공막은, 적어도 세포를 배양하는 표면이, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 퍼레칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스 및 폴리라이신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종에 의하여 피복되어 있는, [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 세포 적층체의 제조 방법.

[7] 제1 세포와 제2 세포가 별종의 세포이며, 제1 세포와 제2 세포의 2종의 세포가, 실질 세포, 간질 세포, 근 세포, 섬유아 세포, 신경 세포, 내피 세포, 상피 세포 및 이들 중 어느 하나로 분화하는 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종의 세포인, [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 세포 적층체의 제조 방법.

[8] 제1 세포가, 평활근 세포 또는 평활근 세포로 분화하는 세포이며, 제2 세포가, 혈관 내피 세포 또는 혈관 내피 세포로 분화하는 세포인, [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 세포 적층체의 제조 방법.

본 개시에 의하면, 신규 세포 적층체의 제조 방법이 제공된다.

도 1a는 허니콤 구조를 갖는 다공막의 일례를 나타내는 사시도이다.
도 1b는 도 1a에 있어서의 다공막을 상면 측에서 본 평면도이다.
도 1c는 도 1b에 있어서의 다공막의 c-c선을 따른 단면도이다.
도 2a는 지지 부재의 일례를 나타내는 사시도이다.
도 2b는 도 2a에 나타낸 지지 부재를 배양 용기에 설치한 상태를 나타내는 사시도이다.
도 3은 본 개시의 제조 방법의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 4는 본 개시의 제조 방법의 일례를 나타내는 모식도이다.
도 5는 실시예 1에 있어서 사용한 다공막의 현미경 상(像)이다.
도 6은 실시예 1에 있어서의, 다공막의 양면에 형성된 세포층 각각의 형광 면역 염색 상이다.
도 7은 FITC-덱스트란 70의 상대 형광 강도를 나타내는 그래프이다.
도 8은 실시예 2에 있어서의, 다공막의 양면에 형성된 세포층 각각의 형광 면역 염색 상이다.
도 9는 실시예 2에 있어서의, 세포 적층체의 형광 면역 염색 상이다.

이하에, 발명의 실시형태를 설명한다. 이들의 설명 및 실시예는 실시형태를 예시하는 것이며, 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다. 본 개시에 있어서 설명하는 작용 기전(機轉)은 추정을 포함하고 있으며, 그 옳고 그름은 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

본 개시에 있어서 "~"를 이용하여 나타난 수치 범위는, "~"의 전후에 기재되는 수치를 각각 하한값 및 상한값으로서 포함하는 범위를 나타낸다.

본 개시에 있어서 조성물 중의 각 성분의 양에 대하여 언급하는 경우, 조성물 중에 각 성분에 해당하는 물질이 복수 종 존재하는 경우에는, 특별히 설명하지 않는 한, 조성물 중에 존재하는 당해 복수 종의 물질의 합계량을 의미한다.

<세포 적층체의 제조 방법>

본 개시의 세포 적층체의 제조 방법은, 다공막의 양면에서 세포를 배양하고, 다공막의 양면에 세포층을 형성함으로써, 다공막의 양면에 세포층을 구비하는 세포 적층체를 제조하는 방법이다.

본 개시의 세포 적층체의 제조 방법은, 저부 및 저부의 외연으로부터 기립하는 측벽부를 갖는 용기와, 다공막과, 다공막을 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향시켜 지지하는 지지 부재를 이용한다. 이하, 상기 용기를 "배양 용기"라고 한다.

본 개시의 세포 적층체의 제조 방법은, 배양 용기와, 다공막과, 지지 부재를 이용하여, 다공막의 양면에 있어서 세포를 배양하고, 다공막의 양면에 세포층을 구비하는 세포 적층체를 제조한다.

먼저, 본 개시의 제조 방법에 있어서 이용하는 배양 용기, 다공막 및 지지 부재를 설명한다.

[배양 용기]

배양 용기로서는, 예를 들면 디시(dish), 멀티 디시, 또는 멀티 웰 플레이트를 들 수 있다. 배양 용기의 저부의 형상은, 예를 들면 원형, 직사각형, 또는 정사각형이다. 배양 용기의 재질은, 예를 들면 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리에스터, 또는 유리이다. 배양 용기는, 투명성이 높은 것이 바람직하다.

배양 용기의 내저면은, 평탄한 것이 바람직하다. 배양 용기의 내저면은, 세포가 접착하지 않는 성질을 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 배양 용기의 내저면에는, 코로나 방전 처리 또는 단백질 코팅 처리가 실시되어 있지 않은 것이 바람직하다. 배양 용기의 내저면은, 세포의 접착을 억제하기 위하여, 포스포릴콜린기를 갖는 폴리머, 폴리에틸렌글라이콜, 하이드로 겔 등에 의하여 피복되어 있어도 된다. 배양 용기의 내측면도, 내저면과 동일하게, 세포가 접착하지 않는 성질을 갖는 것이 바람직하다.

[다공막]

본 개시의 제조 방법에 있어서 다공막은, 세포가 접착하여 증식하는 기반이다. 본 개시의 제조 방법에 이용하는 다공막은, 제조 방법, 재질, 형상에 있어서 제한되지 않는다.

다공막의 제조 방법으로서는, 수지제의 막에, 에칭 가공, 블라스트 가공 또는 펀칭 가공을 실시하여 관통 구멍을 형성하여 다공막으로 하는 제조 방법; 일본 특허공보 제4734157호, 일본 특허공보 제4945281호, 일본 특허공보 제5405374호, 일본 특허공보 제5422230호, 및 일본 공개특허공보 2011-074140호에 기재되어 있는, 폴리머 및 용제를 함유하는 도막 중에서 물방울을 성장시켜 관통 구멍을 형성하는 제조 방법을 들 수 있다.

다공막의 재질로서는, 폴리뷰타다이엔, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리에스터(예를 들면, 폴리락트산, 폴리카프로락톤, 폴리글라이콜산, 폴리락트산-폴리글라이콜산 공중합체, 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리에틸렌나프탈레이트, 폴리에틸렌석시네이트, 폴리뷰틸렌석시네이트, 폴리-3-하이드록시뷰틸레이트 등), 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아마이드, 폴리메타크릴아마이드, 폴리 염화 바이닐, 폴리 염화 바이닐리덴, 폴리 불화 바이닐리덴, 폴리헥사플루오로프로펜, 폴리바이닐에터, 폴리바이닐카바졸, 폴리아세트산 바이닐, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리락톤, 폴리아마이드, 폴리이미드, 폴리유레테인, 폴리유레아, 폴리아로마틱스, 폴리설폰, 폴리에터설폰, 폴리실록세인 유도체, 셀룰로스아실레이트(예를 들면, 트라이아세틸셀룰로스, 셀룰로스아세테이트프로피오네이트, 셀룰로스아세테이트뷰틸레이트) 등의 폴리머를 들 수 있다. 일본 특허공보 제4734157호 등에 기재된 제조 방법에 의하여 다공막을 제조하는 관점에서는, 소수성의 유기 용제에 용해되는 폴리머가 바람직하다. 이들 폴리머는, 용제에 대한 용해성, 광학적 물성, 전기적 물성, 막 강도, 탄성 등의 관점에서, 필요에 따라 호모 폴리머, 코폴리머, 폴리머 블렌드 또는 폴리머 알로이로 해도 된다. 이들 폴리머는, 1종 단독으로 사용해도 되고 또는 2종 이상을 혼합하여 사용해도 된다.

다공막의 재질로서는, 자기 지지성의 관점에서, 폴리뷰타다이엔, 폴리유레테인, 폴리스타이렌, 또는 폴리카보네이트가 바람직하고, 세포층의 생착(生着)이 유지되기 쉬운 관점에서, 폴리락트산, 폴리락트산-폴리글라이콜산 공중합체, 또는 폴리락트산-폴리카프로락톤 공중합체가 바람직하다.

다공막은, 세포의 접착성의 관점에서, 적어도 세포가 파종되는 영역의 표면이, 피브로넥틴, 콜라겐(예를 들면, I형 콜라겐, IV형 콜라겐, 또는 V형 콜라겐), 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 퍼레칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스 및 폴리라이신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종에 의하여 피복되어 있는 것이 바람직하다. 기저막 매트릭스는, 시판품(예를 들면, MATRIGEL(등록 상표), Geltrex(등록 상표))이 입수 가능하다. 다공막은, 구멍 내도, 이들 중 적어도 1종에 의하여 피복되어 있는 것이 바람직하다.

다공막은, 허니콤 구조를 갖는 것이 바람직하다. 본 개시에 있어서 허니콤 구조란, 격벽에 의하여 다수의 관통 구멍으로 구획되어 있는 구조를 말한다.

본 개시의 다공막이 허니콤 구조를 갖는 경우, 허니콤 구조의 관통 구멍은, 다공막의 주면(主面)을 향하여 개구되어 있다. 본 개시의 다공막이 허니콤 구조를 갖는 경우, 허니콤 구조가 복수 적층되어 있어도 된다.

본 개시에 있어서, 허니콤 구조의 관통 구멍의 형상은 한정되지 않는다. 관통 구멍의 형상으로서는, 예를 들면 구체의 일부가 결여된 구결(球缺) 형상, 배럴 형상, 원기둥 형상, 또는 각기둥 형상을 들 수 있으며, 복수 종류의 형상이 혼재되어 있어도 된다. 관통 구멍의 개구의 형상으로서는, 예를 들면 원형, 타원형, 또는 다각형을 들 수 있으며, 복수 종류의 형상이 혼재되어 있어도 된다. 허니콤 구조에 있어서, 서로 이웃하는 관통 구멍끼리는 일부에서 연통되어 있어도 된다.

허니콤 구조를 갖는 다공막에 있어서 관통 구멍은, 다공막 상에 형성되는 세포층의 균질성을 높이는 관점에서, 규칙적으로 배치되어 있는 것이 바람직하다. 규칙적인 배치는, 끊기거나 어긋남이 있거나 해도 되지만, 모든 방향으로 간극없이 연속해서 반복하고 있는 것이 바람직하다.

이하에, 허니콤 구조를 갖는 다공막의 일 실시형태를, 도면을 참조하면서 설명한다. 각 도면에 있어서 동일하거나 또는 등가인 구성 요소 및 부분에는 동일한 참조 부호를 붙이고 있다. 이하의 설명에 있어서, "긴 직경"이란, 윤곽 상의 임의의 2점 간 거리 중 최대 길이를 의미하며, 단 방향이 특정되어 있는 경우는, 그 방향의 임의의 2점 간 거리 중 최대 길이를 의미한다.

도 1a~도 1c에, 허니콤 구조를 갖는 다공막의 일례인 다공막(20)을 나타낸다. 도 1a는, 다공막(20)의 사시도이고, 도 1b는, 도 1a에 있어서의 다공막(20)을 상면 측에서 본 평면도이며, 도 1c는, 도 1b에 있어서의 c-c선을 따른 다공막(20)의 단면도이다.

다공막(20)에는, 주면 전체 영역에 걸쳐 관통 구멍(22)이 배치되어 있다. 단, 다공막(20)에 세포가 접촉할 수 없는 영역이 있는 경우, 그 영역에는 관통 구멍(22)이 배치되어 있지 않아도 된다. 다공막(20)에 있어서, 서로 이웃하는 관통 구멍(22)끼리는, 격벽(24)에 의하여 격리되어 있다.

관통 구멍(22)의 배치는, 평행육변형(바람직하게는 정육각형) 또는 이것에 가까운 형상을 단위로 하며, 이들 도형의 정점 및 대각선의 교점에 개구의 중심이 위치하는 배치이다. "개구의 중심"이란, 주면 상에 있어서의 개구의 2차원 도형의 무게 중심을 의미한다.

관통 구멍(22)의 형상으로서는, 예를 들면 구체의 일부가 결여된 구결 형상, 배럴 형상, 원기둥 형상, 또는 각기둥 형상을 들 수 있다. 관통 구멍(22)의 개구의 형상으로서는, 예를 들면 원형, 타원형, 또는 다각형을 들 수 있다. 서로 이웃하는 관통 구멍(22)끼리는, 다공막(20)의 내부에 있어서, 연통 구멍에 의하여 연통되어 있어도 된다.

이하, 다공막(20)의 치수에 대하여 설명한다.

관통 구멍(22)의 피치(P1)는, 서로 이웃하는 개구의 중심 간의 거리이다. 피치(P1)는, 다공막(20) 상에서 배양하는 세포의 크기에 따라 설정하는 것이 바람직하다. 피치(P1)는, 예를 들면 1μm~50μm이다.

개구 직경(Da)은, 관통 구멍(22)의 개구의 긴 직경이다. 개구 직경(Da)은, 파종되는 세포가 다공막(20) 상에 고정되는 크기인 것이 바람직하다. 개구 직경(Da)은, 파종되는 세포의 긴 직경(예를 들면, 10μm~50μm)에 대하여, 예를 들면 10%~150%이다. 개구 직경(Da)은, 적혈구의 누출 시험을 행할 목적으로 혈관벽 모델을 구축하는 경우는, 적혈구를 통과시키는 크기인 것이 바람직하다. 개구 직경(Da)은, 한쪽의 면의 세포와 다른 한쪽의 면의 세포가 접촉(cell-cell contact)하는 관점에서는, 지나치게 작지 않은 것이 바람직하다. 개구 직경(Da)은, 다공막(20)의 강도의 관점에서는, 지나치게 크지 않은 것이 바람직하다. 이들 관점에서, 개구 직경(Da)은, 1μm~20μm가 바람직하고, 2μm~10μm가 보다 바람직하며, 3μm~5μm가 더 바람직하다.

개구 직경(Da)의 변동 계수는, 20% 이하인 것이 바람직하고, 작을수록 바람직하다. 개구 직경(Da)의 변동 계수가 작을수록, 다공막(20) 상에 형성되는 세포층의 균질성이 높아진다. 변동 계수는, 소정 집단에 대하여 표준 편차를 산술 평균값으로 나눈 값이며, 그 집단의 불균일의 정도를 나타내는 지표이다. 본 개시에 있어서는, 변동 계수를 백분율로 나타낸다.

격벽(24)의 폭(W)은, 서로 이웃하는 개구의 중심 간에 있어서 측정되는, 격벽(24)의 폭의 길이이다. 폭(W)은, 파종되는 세포가 다공막(20) 상에 고정되는 폭인 것이 바람직하다.

다공막(20)의 개구율은, 물질 투과성과 다공막의 강도의 관점에서, 30%~70%가 바람직하고, 35%~65%가 보다 바람직하며, 40%~60%가 더 바람직하다. 다공막(20)의 개구율이란, 평면시한 주면의 면적(개구를 포함하는 면적)에서 차지하는 개구의 합계 면적의 비율이며, 한쪽의 면 및 다른 한쪽의 면에 대하여 각각 산출한다.

다공막(20)의 막두께는, 한쪽의 면의 세포와 다른 한쪽의 면의 세포가 접촉(cell-cell contact)하는 관점에서는, 지나치게 두껍지 않은 것이 바람직하다. 다공막(20)의 막두께는, 다공막(20)의 강도의 관점에서는, 지나치게 얇지 않은 것이 바람직하다. 이들 관점에서, 다공막(20)의 막두께는, 0.5μm~40μm가 바람직하고, 1μm~20μm가 보다 바람직하며, 2μm~8μm가 더 바람직하다.

다공막(20)의 제조 방법의 상세는, 예를 들면 일본 특허공보 제4734157호, 일본 특허공보 제4945281호, 일본 특허공보 제5405374호, 일본 특허공보 제5422230호, 및 일본 공개특허공보 2011-074140호에 기재되어 있다.

본 개시의 세포 적층체의 제조 방법에 있어서 다공막은, 세포가 접착하여 증식하는 기반인바, 다공막의 개구율이 높을수록, 또 다공막의 막두께가 얇을수록, 한쪽의 면의 세포와 다른 한쪽의 면의 세포의 사이의 세포 간 상호 작용(cell-cell interaction), 즉 액성 인자에 의한 정보 전달 및 세포끼리의 접촉(cell-cell contact) 중 적어도 한쪽이 활발해진다. 세포 배양 시에 있어서의 세포 간 상호 작용이 활발해질수록, 생체 내의 조직에 근사한 기능을 갖는 세포 적층체를 제조하는 것이 가능해진다. 본 관점에서, 본 개시의 제조 방법에 이용하는 다공막으로서는, 허니콤 구조를 갖는 다공막이 바람직하고, 다공막(20)이 바람직한 형태의 하나이다.

[지지 부재]

지지 부재는, 다공막을, 배양 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향시켜 지지하는 부재이다.

지지 부재의 재질로서는, 투명성이 높은 것, 액체 배지에 대하여 화학적으로 안정적인 것, 경량인 것 등의 관점에서, 폴리카보네이트, 폴리스타이렌, 폴리에스터 등의 수지가 바람직하다.

지지 부재의 형상은, 제한되지 않는다. 지지 부재는, 예를 들면 다공막을 지지하는 부위와, 배양 용기에 접촉하는 부위를 갖는다. 지지 부재로서는, 예를 들면 배양 용기의 측벽부의 가장자리에 걸치는 돌출부를 구비하는, 와이어상 부재, 봉상 부재, 통상 부재 등을 들 수 있다.

지지 부재의 형태예로서는, 축 방향의 일단에 다공막을 지지하는 통상부와, 통상부의 축 방향의 타단으로부터 직경 방향 외측으로 돌출되는 돌출부를 구비하는 부재를 들 수 있다. 이하에, 본 형태를, 도면을 참조하면서 설명한다.

도 2a에, 지지 부재의 일례인 지지 부재(40)를, 다공막(20)(다공막의 일례)을 구비한 상태로 나타낸다. 도 2a는, 지지 부재(40)의 사시도이다. 도 2b는, 다공막(20)을 구비한 지지 부재(40)를, 배양 용기(60)(배양 용기의 일례)에 설치한 상태를 나타내는 사시도이다.

지지 부재(40)는, 통상부(42)와, 돌출부(44)를 구비한다. 통상부(42)의 축 방향의 일단에는, 다공막(20)이 배치되어 있다. 다공막(20)은, 적어도, 통상부(42)의 일단의 개구를 막는 크기이면 된다. 다공막(20)은, 열압착, 초음파 용착, 레이저 용착, 접착제 또는 양면 테이프에 의하여, 통상부(42)의 일단에 접착된다. 또는, 다공막(20)은, 통상부(42)의 외면에 끼워 넣는 링상의 고정 부재에 의하여, 통상부(42)의 일단에 고정된다.

통상부(42)는, 배양 용기(60)의 내경보다 작은 외경을 갖고, 배양 용기(60)의 내부(즉, 저부(62)와 측벽부(64)로 규정된 공간)에 삽입 가능하다. 통상부(42)의 축 방향의 길이는, 배양 용기(60)의 측벽부(64)의 높이보다 짧으며, 따라서 다공막(20)은 배양 용기(60)의 저부(62)에 접촉하지 않는다.

통상부(42)는, 벽이 원주 방향 및 축 방향으로 연속되어 있다. 이로써, 다공막(20)과 통상부(42)로 규정된 공간에 액체의 수용이 가능해진다. 단, 돌출부(44)의 근방에 있어서는, 통상부(42)의 벽에 슬릿이 마련되어 있어도 된다. 통상부(42)의 내면 형상은, 예를 들면 원기둥 형상, 각기둥 형상, 원뿔대 형상, 각뿔대 형상이다.

돌출부(44)는, 통상부(42)의 축 방향의 일단이며, 다공막(20)이 배치되어 있는 일단과는 반대 측의 일단에 있어서, 통상부(42)의 직경 방향 외측으로 돌출되어 있다. 돌출부(44)는, 예를 들면 통상부(42)의 원주 방향에 약 120°간격으로 3개 마련되어 있다. 단, 돌출부(44)의 개수 및 형상은 이에 한정되지 않는다. 돌출부(44)는, 통상부(42)의 원주 방향으로 연속된 링상이어도 된다.

돌출부(44)는, 지지 부재(40)가 배양 용기(60)의 내부에 삽입되었을 때에, 배양 용기(60)의 측벽부(64)의 가장자리에 걸치는 길이로 돌출되어 있다. 돌출부(44)에 의하여, 지지 부재(40)는, 배양 용기(60)의 측벽부(64)의 가장자리에 계지된다.

도 2a에 나타내는 바와 같은 형상의 배양 디바이스는, 일반적으로, 셀 컬처 인서트(cell culture insert)라고 불리고 있다.

다음으로, 본 개시의 제조 방법의 공정을 설명한다. 본 개시에 있어서 "공정"이라는 말은, 독립된 공정뿐만 아니라, 다른 공정과 명확하게 구별할 수 없는 경우여도 그 공정의 소기의 목적이 달성되면, 본 용어에 포함된다.

본 개시의 세포 적층체의 제조 방법은, 하기의 공정 (A)와 공정 (B)를 포함한다. 도 3은, 본 개시의 제조 방법의 일례를 나타내는 모식도이며, 공정 (A) 및 공정 (B)를 설명하기 위한 모식도이다. 도 3에 있어서, 화살표 G는 중력 방향을 나타낸다.

공정 (A): 다공막(2)이 지지 부재(4)에 의하여 배양 용기(6)의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향한 상태로 지지되고, 또한 중력 방향(G)에 있어서 배양 용기(6)의 저부가 상방이며 다공막(2)이 하방인 상태로, 배양 용기(6)의 내저면과 다공막(2)의 표면에 접하는 액체 배지 중에서 제1 세포(11)를 배양한다.

공정 (B): 다공막(2)이 지지 부재(4)에 의하여 배양 용기(6)의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 내저면에 대향한 상태로 지지되고, 또한 중력 방향(G)에 있어서 배양 용기(6)의 저부가 하방이며 다공막(2)이 상방인 상태로, 다공막(2)의 하측의 면에서 제1 세포(11)를 배양하고, 다공막(2)의 상측의 면에서 제2 세포(12)를 배양한다.

본 개시에 있어서 "배양"은, 반드시 세포의 증식을 수반할 필요는 없으며, 증식의 유무에 관계없이, 세포의 생존이 유지되면 본 용어에 포함된다.

공정 (A)에 있어서는, 중력 방향(G)에 있어서 배양 용기(6)의 저부가 상방이고 다공막(2)이 하방인 상태를 취한다. 공정 (A)에 있어서는, 제1 세포(11)를 함유하는 세포 현탁액이, 배양 용기(6)의 내저면과 다공막(2)의 표면에 접하도록, 배양 용기(6)와 다공막(2)의 사이에 놓이고, 이 상태로 제1 세포(11)가 배양된다. 배양 용기(6)의 내저면과, 세포 현탁액에 포함되는 액체 배지의 사이에 작용하는 표면 장력에 의하여, 액체 배지는 다공막(2) 상에 유지되어, 액체 배지가 다공막(2)의 구멍을 통과하여 낙하하는 것이 억제된다. 따라서, 다공막(2)으로서, 개구율이 높은 다공막을 세포 적층체의 제조에 이용할 수 있다. 다공막(2)은, 지지 부재(4)에 의하여, 배양 용기(6)의 내저면의 근방에, 배양 용기(6)의 내저면에 대하여 평행하게 또는 대략 평행하게 대향한 상태로 유지되는 것이 바람직하다. 다공막(2)과 배양 용기(6)의 내저면과의 거리는, 예를 들면 0.5mm~10mm이다.

공정 (A)에 있어서, 액체 배지 중의 제1 세포(11)는, 자체 중량에 의하여 중력 방향(G)으로 이동하여, 다공막(2)에 접착한다. 공정 (A)는, 제1 세포(11)를 다공막(2) 상에서 접착 배양하는 공정이다.

공정 (A)에 있어서의 세포 배양의 조건으로서는, 일반적인 세포 배양 조건을 적용해도 된다. 예를 들면, 온도 37℃이고 또한 5%(v/v) CO₂ 농도의 인큐베이터 내에서의 배양이 적용된다. 배양 기간은, 제1 세포(11)의 다공막(2) 상에 대한 접착이 안정될 때까지의 기간이 바람직하다.

공정 (B)에 있어서는, 중력 방향(G)에 있어서 배양 용기(6)의 저부가 하방이고 다공막(2)이 상방인 상태를 취한다. 공정 (B)에 있어서는, 다공막(2)의 하측의 면에서 제1 세포(11)가 배양되고, 다공막(2)의 상측의 면에서 제2 세포(12)가 배양된다. 다공막(2)의 하측의 면에서 배양되는 제1 세포(11)는, 공정 (A)에 있어서, 다공막(2)의, 배양 용기(6)의 내저면을 향한 측의 면에서 배양된 제1 세포(11)이며, 그 세포가 공정 (B)에 있어서 계속 배양된다.

공정 (B)에 있어서의 세포 배양의 조건으로서는, 일반적인 세포 배양 조건을 적용해도 된다. 예를 들면, 온도 37℃이고 또한 5%(v/v) CO₂ 농도의 인큐베이터 내에서의 배양이 적용된다. 배양 기간은, 다공막(2)의 양면 모두 세포가 콘플루언트가 될 때까지의 기간이 바람직하다. 세포가 콘플루언트가 된 것은, 예를 들면 광학 현미경에 의한 관찰로 판단할 수 있다. 배양 기간 중, 배지 교환을 행해도 된다.

본 개시의 제조 방법의 일 실시형태를, 도 4를 참조하면서 설명한다. 도 4에 나타내는 실시형태는, 도 2b에 나타내는 바와 같은 형상의 배양 디바이스를 이용하는 제조 방법이며, 도 4의 (1)~(5)는, 하기의 공정 (1)~공정 (5)에 각각 대응한다. 도 4에 있어서, 화살표 G는 중력 방향을 나타낸다. 공정 (1)~공정 (5)를 포함하는 실시형태에 의하면, 본 개시의 제조 방법을 간편하게 실현할 수 있다.

공정 (1): 제1 세포(11)를 포함하는 세포 현탁액을, 배양 용기(6)의 내저면에 둔다.

공정 (1)에 있어서는, 배양 용기(6)의 내측면에 접촉하지 않도록, 세포 현탁액을 내저면에 두는 것이 바람직하다. 공정 (3)에 있어서, 세포 현탁액이 배양 용기(6)의 내측면을 타고 낙하하는 것을 방지하기 위함이다. 세포 현탁액이 배양 용기(6)의 내측면을 타고 낙하하는 것을 방지하는 수단으로서는, 그 외에, 다공막(2)의 주면의 크기를, 배양 용기(6)의 내측면에 원주 전체에 걸쳐 접촉하는 크기로 하는 것도 들 수 있다.

공정 (1)에 있어서 배양 용기(6)의 내저면에 두는 세포 현탁액의 양은, 배양 용기(6)의 내저면과 다공막(2)으로 협지되는 공간의 용적에 상당하는 양이 바람직하다. 제1 세포(11)의 파종 밀도는, 다공막(2)의 면적에 대하여 예를 들면 1.0×10³~1.0×10⁶세포/cm²이다.

공정 (2): 다공막(2)을 구비하는 지지 부재(4)를 배양 용기(6)에 설치하고, 다공막(2)을 배양 용기(6)의 내저면에 둔 세포 현탁액에 접촉시킨다.

공정 (2)의 실시에 의하여, 제1 세포(11)를 함유하는 세포 현탁액이 배양 용기(6)의 내저면과 다공막(2)의 표면에 접하는 상태(환언하면, 배양 용기(6)의 내저면과 다공막(2)의 표면으로 세포 현탁액이 협지된 상태)가 된다. 이하, 제조 방법의 설명에 있어서, 다공막(2)을 구비하는 지지 부재(4)와, 배양 용기(6)가 일체가 된 디바이스를 "배양 디바이스"라고 한다.

공정 (3): 중력 방향(G)에 있어서 배양 용기(6)의 저부가 상방이고 다공막(2)이 하방인 상태로, 배양 용기(6)의 내저면과 다공막(2)의 표면에 접하는 액체 배지 중에서 제1 세포(11)를 배양한다.

공정 (3)은, 다공막(2)을 구비하는 지지 부재(4)를 배양 용기(6)에 설치한 채로 배양 디바이스의 상하를 반전시키고, 이어서, 배양 디바이스를 인큐베이터 내에 정치함으로써 실현된다. 세포 현탁액에 포함되어 있는 제1 세포(11)는, 자체 중량에 의하여 중력 방향(G)으로 이동하여, 다공막(2)에 접착한다.

공정 (4): 중력 방향(G)에 있어서 배양 용기(6)의 저부가 하방이고 다공막(2)이 상방인 상태로, 다공막(2)의 상측의 면에 제2 세포(12)를 파종한다.

공정 (4)은, 배양 디바이스를 인큐베이터로부터 취출하여 다시 반전시키고, 이어서, 다공막(2) 상에 제2 세포(12)를 포함하는 세포 현탁액을 파종함으로써 실현된다. 제2 세포(12)의 파종 밀도는, 예를 들면 1.0×10³~1.0×10⁶세포/cm²이다. 제2 세포(12)의 파종의 전 또는 후에, 제1 세포(11) 측에, 액체 배지를 추가하는 것이 바람직하다.

공정 (5): 중력 방향(G)에 있어서 배양 용기(6)의 저부가 하방이고 다공막(2)이 상방인 상태로, 다공막(2)의 하측의 면에서 제1 세포(11)를 배양하며, 다공막(2)의 상측의 면에서 제2 세포(12)를 배양한다.

공정 (5)는, 공정 (4)에 이어서, 배양 디바이스를 인큐베이터 내에 정치함으로써 실현된다. 공정 (5)의 기간 중, 배지 교환을 행해도 된다. 제1 세포(11) 및 제2 세포(12) 중 적어도 한쪽이 줄기 세포인 경우, 목적의 체세포로 분화 유도하는 분화 유도 인자를 배지에 첨가한다.

공정 (1) 내지 공정 (5)를 거쳐, 다공막(2)과, 다공막(2)의 한쪽의 면에 배치된, 제1 세포(11)를 포함하는 세포층과, 다공막(2)의 다른 한쪽의 면에 배치된, 제2 세포(12)를 포함하는 세포층을 구비하는 세포 적층체가 얻어진다.

이하, 본 개시의 세포 적층체의 제조 방법에 이용하는 세포를 설명한다.

제1 세포와 제2 세포는, 동종의 세포여도 되고, 별종의 세포여도 된다. 본 개시의 세포 적층체가 모방하는 생체 조직에 맞추어, 세포종의 조합을 선택한다.

본 개시의 제조 방법의 일 실시형태에 있어서는, 제1 세포와 제2 세포가 별종의 세포이다. 제1 세포와 제2 세포의 2종의 세포는, 예를 들면 실질 세포(예를 들면, 간실질 세포, 또는 췌실질 세포), 간질 세포(예를 들면, 주피 세포), 근 세포(예를 들면, 평활근 세포, 심근 세포, 또는 골격근 세포), 섬유아 세포, 신경 세포, 내피 세포(예를 들면, 혈관 내피 세포, 또는 임파관 내피 세포), 상피 세포(예를 들면, 폐포 상피 세포, 구강 상피 세포, 담관 상피 세포, 장관 상피 세포, 췌관 상피 세포, 신장 상피 세포, 요세관 상피 세포, 또는 태반 상피 세포), 및 이들 중 어느 하나로 분화하는 세포(예를 들면, 전구 세포, 간엽계 줄기 세포, 또는 다능성 줄기 세포)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종의 세포이다.

제1 세포 또는 제2 세포로서 이용하는 다능성 줄기 세포로서는, 예를 들면 배성 줄기 세포(embryonic stem cell; ES 세포), 인공 다능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell; iPS 세포), 배성 생식 세포(embryonic germ cell; EG 세포), 배성 암 세포(embryonal carcinoma cell; EC 세포), 다능성 성체 전구 세포(multipotent adult progenitor cell; MAP 세포), 성체 다능성 줄기 세포(adult pluripotent stem cell; APS 세포), Muse 세포(multi-lineage differentiating stress enduring cell) 등을 들 수 있다. 본 개시의 제조 방법의 공정 (B)에 있어서, 목적의 체세포로 분화 유도하는 분화 유도 인자를 배지에 첨가하여, 다능성 줄기 세포를 체세포로 분화시킨다.

본 개시의 제조 방법에 있어서는, 제1 세포 및 제2 세포와는 다른 별종의 세포("제3 세포"라고 함. 1종이어도 되고 복수 종이어도 됨)를, 제1 세포 및 제2 세포 중 적어도 한쪽과 함께 배양해도 된다. 이로써, 다공막의 편면 또는 양면에, 제1 세포 또는 제2 세포와 함께 제3 세포가 포함되는 세포층이 형성된다. 예를 들면, 제1 세포가 실질 세포이고, 제2 세포가 간질 세포이며, 제3 세포가 신경 세포이다.

본 개시의 제조 방법에 있어서, 모방하는 생체 내의 조직에 맞추어, 제1 세포와 제2 세포와의 조합을 선택하고, 나아가서는 필요에 따라 제3 세포를 선택함으로써, 생체 내의 조직을 모방한 조직 모델이 얻어진다. 동물 조직에 있어서는, 하나의 세포층과 다른 세포층의 사이에 기저막(basement membrane)이 존재하는 것이 일반적이다. 본 개시의 제조 방법에 의하여 얻어지는 조직 모델에 있어서는, 다공막이 기저막에 상당한다.

제1 세포 및 제2 세포 중 적어도 한쪽으로서, 병태를 재현할 목적으로, 유전자 변이를 갖는 세포, 또는 환자 유래의 세포를 이용해도 된다.

본 개시의 제조 방법의 일 실시형태에 있어서는, 제1 세포가, 평활근 세포 또는 평활근 세포로 분화하는 세포이며, 제2 세포가, 혈관 내피 세포 또는 혈관 내피 세포로 분화하는 세포이다. 본 실시형태의 제조 방법은, 다공막의 한쪽의 면에 혈관 내피 세포층이 배치되고, 다공막의 다른 한쪽의 면에 평활근 세포층이 배치된 세포 적층체, 즉 혈관벽 모델을 제공한다.

세포 현탁액의 조제 또는 세포 배양에 이용하는 액체 배지는, 대상이 되는 세포종에 맞추어 선택된다. 구체적인 배지로서는, 예를 들면 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), DMEM:F-12(Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12), EMEM(Eagle's minimal essential medium), MEM α(Minimum Essential Medium Alpha), BME(Basal Medium Eagle) 등의 포유 동물 세포용 기본 배지에 세포 증식 인자를 첨가하여, 세포종에 맞추어 최적화된 배지를 들 수 있다. 이와 같은 배지는 시판품이 입수 가능하다. 액체 배지는, 공배양하는 세포종에 따라, 복수 종의 배지를 혼합한 배지여도 된다. 액체 배지의 pH는, 예를 들면 pH7.0~8.0이다. 액체 배지는, 세포가 자체 중량에 의하여 중력 방향으로 이동할 수 있는 비중 및 점도인 것이 바람직하다.

본 개시의 세포 적층체의 제조 방법에 의하여,

다공막과,

다공막의 한쪽의 면에 배치된 제1 세포층과,

다공막의 다른 한쪽의 면에 배치된 제2 세포층을 구비하는 세포 적층체가 얻어진다.

본 개시의 세포 적층체의 제조 방법에 있어서, 다공막으로서 허니콤 구조를 갖는 다공막을 이용함으로써,

허니콤 구조를 갖는 다공막과,

허니콤 구조를 갖는 다공막의 한쪽의 면에 배치된 제1 세포층과,

허니콤 구조를 갖는 다공막의 다른 한쪽의 면에 배치된 제2 세포층을 구비하는 세포 적층체가 얻어진다.

본 개시의 세포 적층체의 제조 방법에 있어서, 다공막으로서 허니콤 구조를 갖는 다공막을 이용하여, 제1 세포를 평활근 세포 또는 평활근 세포로 분화하는 세포로 하고, 제2 세포를 혈관 내피 세포 또는 혈관 내피 세포로 분화하는 세포로 함으로써,

허니콤 구조를 갖는 다공막과,

허니콤 구조를 갖는 다공막의 한쪽의 면에 배치된 평활근 세포층과,

허니콤 구조를 갖는 다공막의 다른 한쪽의 면에 배치된 혈관 내피 세포층을 구비하는 세포 적층체(즉, 혈관벽 모델)가 얻어진다.

본 개시의 제조 방법에 있어서 허니콤 구조를 갖는 다공막을 이용하면, 세포 배양 시에 있어서의, 한쪽의 면의 세포와 다른 한쪽의 면의 세포의 사이의 세포 간 상호 작용이 활발해져, 생체 내의 조직에 근사한 구조 및 기능을 갖는 세포 적층체를 제조할 수 있다. 따라서, 본 개시의 제조 방법에 의하면, 허니콤 구조를 갖는 다공막을 이용하여, 혈관 내피 세포의 세포 간 접착이 생체 내의 혈관벽에 가까운 상태로 발달한 혈관벽 모델을 제조할 수 있다.

혈관벽 모델로서는, 혈관 내피 세포층의 세포 간을 화학 물질이 자유롭게 통과하지 않는 것, 즉 배리어 기능을 갖는 것이 바람직하다. 본 개시의 제조 방법에 의하여 얻어지는 혈관벽 모델은, 혈관 내피 세포의 세포 간 접착이, 생체 내의 혈관벽에 근사한 상태로 발달되어 있다고 추측된다. 혈관벽 모델을 이용하여 약물 평가를 보다 정확하게 행하기 위해서는, 혈관벽 모델은 생체 내의 혈관벽에 근사한 구조 및 기능을 갖는 것이 바람직한바, 본 개시의 제조 방법에 의하여 얻어지는 혈관벽 모델은, 약물 평가의 우수한 수단이 될 수 있다.

본 개시의 제조 방법에 의하여 얻어지는 세포 적층체의 용도는, 한정되지 않는다. 본 개시의 제조 방법에 의하여 얻어지는 세포 적층체는, 생체 내로의 이식 재료, 약물 평가용 또는 병태 평가용 조직 모델, 또는 동물 실험을 대체하는 시험용 조직으로서 유용하다.

실시예

이하에, 실시예에 의하여 본 개시의 실시형태를 설명하지만, 본 개시의 실시형태는, 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

하기에 있어서, 물질 농도에 관하여 "M"은 몰 농도를 나타내며, 1M=1mol/L이다.

이하의 실시예에서 사용되는 화학 물질 등의 약칭은 이하와 같다.

EGM: endothelial cell growth medium

FITC: fluorescein isothiocyanate

HBSS: Hanks' balanced salt solution

HCM: honeycomb membrane

HUASMC: human umbilical artery smooth muscle cell, 인간 제대 동맥 평활근 세포

HUVEC: human umbilical vein endothelial cell, 인간 제대 정맥 내피 세포

PBS: phosphate buffered saline

TEM: track etched membrane

<실시예 1>

[세포 배양의 기재]

·24웰 플레이트: 부유 배양용(#662-102, Greiner)

·TEM 인서트: TE막을 필터부에 구비하는 24웰·행잉·인서트(#MCMP24H48, Millipore). 본 인서트가 구비하는 TE막의 현미경 상을 도 5에 나타낸다. TE막은, 개구 직경 5.7μm, 막두께 10.6μm, 개구율 12.4%, 폴리에틸렌테레프탈레이트제.

·HCM 인서트: 허니콤 구조를 갖는 다공막을 필터부에 구비하는 24웰·행잉·인서트. 본 인서트가 구비하는 다공막의 현미경 상을 도 5에 나타낸다. 다공막은, 개구 직경 5.0μm, 막두께 2.2μm, 개구율 55%, 폴리뷰타다이엔제.

·HCM의 피복 재료: 피브로넥틴(#33016-015, Invitrogen)

[세포]

·혈관 내피 세포: HUVEC(#C2517AS, Lonza)

·평활근 세포: HUASMC(#C-12500, PromoCell)

[액체 배지, 세포 박리용 시약]

·HUVEC용: EGM-2(#CC-3162, Lonza)

·HUASMC용: Smooth Muscle Cell Growth Medium 2 Kit(#C-22162, PromoCell)

·Accutase(AT104-500, Innovative cell technologies)

[HCM의 멸균 처리]

(1) 24웰 플레이트 1매의 웰에 70%(v/v) 에탄올을 500μL/웰 넣고, 다른 24웰 플레이트 2매의 웰에 PBS를 500μL/웰 넣었다. 별도, 70%(v/v) 에탄올을 넣은 컵을 준비했다.

(2) 에탄올을 넣은 컵에 HCM 인서트를 통과시키고, 이어서, HCM 인서트를 에탄올이 들어간 웰에, HCM이 에탄올에 잠기도록 두며, 5분간 정치했다.

(3) HCM 인서트를 에탄올로부터 취출하고, 아스피레이터를 이용하여 HCM 인서트의 내측으로부터 에탄올을 제거하며, 곧바로 PBS를 넣은 웰에 옮겨, HCM이 PBS에 잠기도록 두고, PBS를 1mL 따랐다.

(4) HCM 인서트를 PBS로부터 취출하고, 아스피레이터를 이용하여 HCM 인서트의 내측으로부터 PBS를 제거하며, 곧바로 PBS를 넣은 웰에 옮겨, HCM이 PBS에 잠기도록 두고, PBS를 1mL 따랐다.

(5) HCM 인서트를 PBS에 담근 채로 감압 데시케이터에 넣고, HCM을 탈기했다.

(6) HCM 인서트에, 파손, 부착물, 및 HCM의 오염이 없는 것을 현미경으로 확인했다.

[HCM의 피브로넥틴 피복]

(1) 피브로넥틴을 PBS에 용해하여, 농도 30μg/mL의 피브로넥틴액을 조제했다.

(2) 24웰 플레이트의 웰의 중심부에 피브로넥틴액을 70μL 스폿했다.

(3) HCM 인서트를 PBS로부터 취출하고, 아스피레이터를 이용하여 HCM 인서트의 내측으로부터 PBS를 제거하며, 곧바로 웰 상의 피브로넥틴액의 스폿에 올려 놓고, HCM을 피브로넥틴액에 담갔다.

(4) HCM 인서트의 내측에 피브로넥틴액을 100μL 따르고, 실온하에 1시간 두었다(또는, 4℃하에 하룻밤 두었다).

[HCM 인서트를 이용한 세포 배양(세포 적층체의 제조)]

(1) 24웰 플레이트의 웰의 중심부에, HUASMC의 세포 현탁액을 돔상으로 80μL 두었다.

(2) HUASMC의 세포 현탁액 상에 코팅된 HCM 인서트를 올려 놓고, 웰의 저면과 HCM에 의하여 세포 현탁액을 협지했다.

(3) 웰의 저면과 HCM에 의하여 세포 현탁액을 협지한 상태인 채로, 플레이트 및 HCM 인서트를 반전시켰다. 반전시킨 상태로 인큐베이터(37℃, 5%(v/v) CO₂)에 넣고, 16시간 배양했다.

(4) HCM 인서트의 외측에 Smooth Muscle Cell Growth Medium 2 Kit를 1200μL 첨가했다. 인큐베이터로부터 취출하고, 플레이트 및 HCM 인서트의 상하를 원래대로 되돌려, 배지가 들어간 웰에 옮긴 후, HCM 인서트의 내측에 HUVEC의 세포 현탁액을 300μL 파종했다.

(5) 인큐베이터(37℃, 5%(v/v) CO₂)에 넣고, 80시간 배양했다.

각 세포의 파종 조건은 하기와 같다.

·HUASMC: 배양 면적 0.785cm², 파종 밀도 1.0×10⁴세포/cm², 세포 현탁액 80μL

·HUVEC: 배양 면적 0.32cm², 파종 밀도 5.0×10⁴세포/cm², 세포 현탁액 300μL

상기 배양에 의하여, 필터의 상면에 혈관 내피 세포층이 배치되고, 필터의 하면에 평활근 세포층이 배치된 HCM 인서트("VEC/SMC-HCM 인서트"라고 함)를 얻었다. 도 6에, CD31를 형광 면역 염색한 상면의 세포층과, α-평활근 액틴을 형광 면역 염색한 하면의 세포층을 나타낸다.

상기의 조작에 준하여, 필터의 상면에 혈관 내피 세포층이 배치되고 필터의 하면에 세포층이 배치되어 있지 않은 HCM 인서트("VEC-HCM 인서트"라고 함)와, 필터의 하면에 평활근 세포층이 배치되며 필터의 상면에 세포층이 배치되어 있지 않은 HCM 인서트("SMC-HCM 인서트"라고 함)를 각각 제작했다.

[TEM 인서트를 이용한 세포 배양(종래의 방법에 의한 세포 적층체의 제조)]

TEM 인서트를 상하 반전시켜 둔 상태로, 필터 상에 HUASMC를 파종하여, 인큐베이터(37℃, 5%(v/v) CO₂)에 넣고 16시간 배양했다. 이어서, TEM 인서트를 24웰 플레이트의 웰에 설치하고, TEM 인서트의 내측에 HUVEC를 파종하며, TEM 인서트의 외측에 Smooth Muscle Cell Growth Medium 2 Kit를 1200μL 첨가했다. 이어서, 인큐베이터(37℃, 5%(v/v) CO₂)에 넣고, 80시간 배양했다.

TEM 인서트에 대한 각 세포의 파종 조건은, HCM 인서트에 대한 각 세포의 파종 조건과 동일하다.

상기 배양에 의하여, 필터의 상면에 혈관 내피 세포층이 배치되고, 필터의 하면에 평활근 세포층이 배치된 TEM 인서트("VEC/SMC-TEM 인서트"라고 함)를 얻었다.

상기의 조작에 준하여, 필터의 상면에 혈관 내피 세포층이 배치되고 필터의 하면에 세포층이 배치되어 있지 않은 TEM 인서트("VEC-TEM 인서트"라고 함)와, 필터의 하면에 평활근 세포층이 배치되며 필터의 상면에 세포층이 배치되어 있지 않은 TEM 인서트("SMC-TEM 인서트"라고 함)를 각각 제작했다.

[물질 투과성의 평가]

(1) FITC-덱스트란 70(70kDa, Sigma)을 2mg, 8mL의 HBSS(+)(084-08965, 와코 준야쿠 고교)에 녹여, 농도 250μg/mL의 FITC-덱스트란 70 용액을 조제하고, 차광하여 보관했다.

(2) 24웰 플레이트의 1열째~3열째의 각 웰에 HBSS(+)를 900μL씩 넣었다.

(3) 세포 적층체를 구비하는 인서트를 배지로부터 취출하고, 아스피레이터를 이용하여 인서트의 내측으로부터 배지를 제거하여, 1열째의 웰에 두었다.

(4) 1열째의 웰에 둔 인서트의 내측에, FITC-덱스트란 70 용액을 200μL 첨가하고, 37℃하에서 10분간 인큐베이트했다.

(5) 인서트를 2열째의 웰에 옮기고, 37℃하에서 10분간 인큐베이트했다.

(6) 인서트를 3열째의 웰에 옮기고, 곧바로 플레이트에 알루미늄 시트를 씌워 차광했다.

(7) 1열째 및 2열째의 웰 내의 시료액을 각각 피펫으로 믹싱하고, 각 웰로부터 100μL씩 취하여, 96웰·블랙·플레이트에 옮기며, 알루미늄 시트를 씌워 차광했다.

(8) 시료액 중의 FITC의 형광 강도를, 플레이트 리더(EnSpire, PerkinElmer)를 이용하여 Ex/Em=485nm/530nm, 광조사 횟수 60회로 측정했다.

1열째의 웰의 시료액에 있어서의 FITC의 상대 형광 강도(즉, FITC-덱스트란 70 용액의 첨가로부터 10분간의 FITC-덱스트란 70의 상대 누출량)를 도 7에 나타낸다. 도 7에 나타내는 그래프는, 필터의 양면에 세포층을 형성하고 있지 않은 인서트에 있어서의 형광 강도를 기준으로 한 상대 형광 강도(relative fluorescence intensity)를 나타낸다.

TEM 인서트는, VEC-TEM 인서트에 있어서 상대 형광 강도가 3.0±0.5%(n=5), SMC-TEM 인서트에 있어서 상대 형광 강도가 8.2±2.9%(n=5), VEC/SMC-TEM 인서트에 있어서 상대 형광 강도가 0.4±0.2%(n=5)였다. 평활근 세포층은 일반적으로 세포 간의 결합이 그다지 타이트하지 않음에도 불구하고, SMC-TEM 인서트에 있어서 상대 형광 강도가 상기 값이었던 점에서, TEM 인서트에 있어서는, TEM 자체가 FITC-덱스트란 70에 대한 배리어 기능을 하고 있다고 추측되었다.

HCM 인서트는, VEC-HCM 인서트에 있어서 상대 형광 강도가 19.3±10.2%(n=5), SMC-HCM 인서트에 있어서 상대 형광 강도가 67.4±6.1%(n=5), VEC/SMC-HCM 인서트에 있어서 상대 형광 강도가 0.4±0.3%(n=5)였다. HCM의 한쪽의 면에 혈관 내피 세포층을 형성하고 다른 한쪽의 면에 평활근 세포층을 형성함으로써, FITC-덱스트란 70에 대한 배리어 기능이 획득되어 있었다.

<실시예 2>

[세포 배양의 기재]

·24웰 플레이트: 부유 배양용(#662-102, Greiner)

·HCM 인서트: 허니콤 구조를 갖는 다공막을 필터부에 구비하는 24웰·행잉·인서트. 다공막은, 개구 직경 3.0μm, 막두께 1.2μm, 개구율 55%, 폴리카보네이트제.

·HCM의 피복 재료: 콜라겐 I rat tail(#354236, Corning)

[세포]

·혈관 내피 세포: 래트 혈관 내피 세포(#cAP-r0001, Angioproteomie)

·평활근 세포: 래트 평활근 세포(#R-ASM-580, Lonza)

[액체 배지, 세포 박리용 시약]

·래트 혈관 내피 세포용: Rat endothelial cell growth medium(#cAP-03, cAP-04, Angioproteomie)

·래트 평활근 세포용: DMEM:F-12(1:1) 배지(#BE04-687Q, Lonza)

·Accutase(AT104-500, Innovative cell technologies)

[HCM의 멸균 처리]

실시예 1과 동일하게, HCM의 멸균 처리를 행했다.

[HCM의 콜라겐 피복]

(1) 콜라겐 I를 0.2N의 아세트산 용액에 용해하여, 농도 50μg/mL의 콜라겐 I액을 조제했다.

(2) 24웰 플레이트의 웰의 중심부에 콜라겐 I액을 70μL 스폿했다.

(3) HCM 인서트를 PBS로부터 취출하고, 아스피레이터를 이용하여 HCM 인서트의 내측으로부터 PBS를 제거하며, 곧바로 웰 상의 콜라겐 I액의 스폿에 올려 놓고, HCM을 콜라겐 I액에 담갔다.

(4) HCM 인서트의 내측에 콜라겐 I액을 100μL 따르고, 실온하에 4시간 두었다(또는, 4℃하에 하룻밤 두었다).

(5) PBS를 500μL 첨가하여, HCM을 중화했다.

[HCM 인서트를 이용한 세포 배양(세포 적층체의 제조)]

(1) 24웰 플레이트의 웰의 중심부에, 래트 평활근 세포의 세포 현탁액을 돔상으로 80μL 두었다.

(2) 래트 평활근 세포의 세포 현탁액 상에 코팅된 HCM 인서트를 올려 놓고, 웰의 저면과 HCM에 의하여 세포 현탁액을 협지했다.

(4) HCM 인서트의 외측에 Rat endothelial cell growth medium을 1200μL 첨가했다. 인큐베이터로부터 취출하고, 플레이트 및 HCM 인서트의 상하를 원래대로 되돌려, 배지가 들어간 웰에 옮긴 후, HCM 인서트의 내측에 래트 혈관 내피 세포의 세포 현탁액을 300μL 파종했다.

(5) 인큐베이터(37℃, 5%(v/v) CO₂)에 넣고, 80시간 배양했다.

각 세포의 파종 조건은 하기와 같다.

·래트 평활근 세포: 배양 면적 0.785cm², 파종 밀도 1.0×10⁴세포/cm², 세포 현탁액 80μL

·래트 혈관 내피 세포: 배양 면적 0.32cm², 파종 밀도 5.0×10⁴세포/cm², 세포 현탁액 300μL

상기 배양에 의하여, 필터의 상면에 혈관 내피 세포층이 배치되고, 필터의 하면에 평활근 세포층이 배치된 HCM 인서트("VEC/SMC-HCM 인서트"라고 함)를 얻었다. 도 8에, VE-Cadherin을 형광 면역 염색한 상면의 세포층과, Calponin을 형광 면역 염색한 하면의 세포층을 나타낸다.

도 8에 나타내는 바와 같이, 콘플루언트한 세포층의 형성과, 혈관 내피 카드헤린의 국재가 명료하게 관찰되었다. 혈관 내피 카드헤린의 국재는, 혈관 내피 세포끼리가 강고하게 접합되어 있는 것(cell-cell 정션(junction)의 형성)을 나타내며, 실제의 혈관벽의 특징 중 하나이다. HCM의 한쪽의 면에 혈관 내피 세포층을 형성하고 다른 한쪽의 면에 평활근 세포층을 형성함으로써, 생체 조직과 동일한 구조를 갖는 세포 적층체를 제작할 수 있었다.

[생리 활성 물질에 대한 반응의 평가]

(1) 트롬빈(#T7009-100UN, Sigma) 0.1mg(100UN)을 100μL의 생리 식염수에 녹여, 농도 1000U/mL의 트롬빈 용액을 조제했다. 이것을 추가로 HBSS(+)로 희석하여, 25U/mL, 100U/mL의 트롬빈 용액을 조제했다.

(2) 24웰 플레이트의 각 웰에 HBSS(+)를 900μL씩 넣었다.

(3) 세포 적층체를 구비하는 인서트를 배지로부터 취출하고, 아스피레이터를 이용하여 인서트의 내측으로부터 배지를 제거하여, 웰에 두었다.

(4) 웰에 둔 인서트의 내측에, HBSS(+)(대조군), 25U/mL의 트롬빈 용액, 100U/mL의 트롬빈 용액 중 어느 하나를 200μL 첨가하고, 37℃하에서 30분간 인큐베이트했다.

(5) 세포 적층체의 모습을 현미경으로 관찰했다. 세포 적층체의 현미경 상을 도 9(적색 형광: VE-Cadherin과 녹색 형광: α-smooth muscle actin과의 중합 화상)에 나타낸다.

도 9에 나타내는 바와 같이, 트롬빈 첨가에 의하여, 액틴 스트레스 파이버의 활성화에 따른 세포 수축의 모습이 관찰되었다. 세포 수축은, 도 9의 상단에 나타내는 화살표 방향으로 관찰되었다. 트롬빈 농도가 높을수록 세포 수축의 정도가 강했다. HCM의 한쪽의 면에 혈관 내피 세포층을 구비하고 다른 한쪽의 면에 평활근 세포층을 구비한 세포 적층체는, 생체 조직과 동일하게, 생리 활성 물질에 반응하는 것이 확인되었다.

2017년 6월 9일에 출원된 일본 출원 번호 제2017-114755호의 개시는, 그 전체가 참조에 의하여 본 명세서에 원용된다.

본 명세서에 기재된 모든 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격은, 개개의 문헌, 특허 출원, 및 기술 규격이 참조에 의하여 원용되는 것이 구체적이고 또한 개개에 기재된 경우와 동일한 정도로, 본 명세서 중에 참조에 의하여 원용된다.

2 다공막
4 지지 부재
6 배양 용기
11 제1 세포
12 제2 세포
20 다공막
22 관통 구멍
24 격벽
40 지지 부재
42 통상부
44 돌출부
60 배양 용기
62 저부
64 측벽부

Claims

저부 및 상기 저부의 외연으로부터 기립하는 측벽부를 갖는 용기와, 다공막과, 상기 다공막을 상기 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 상기 내저면에 대향시켜 지지하는 지지 부재를 이용하여, 상기 다공막의 양면에 세포층을 구비하는 세포 적층체를 제조하는 방법으로서,
상기 다공막이 상기 지지 부재에 의하여 상기 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 상기 내저면에 대향한 상태로 지지되고, 또한 중력 방향에 있어서 상기 용기의 상기 저부가 상방이며 상기 다공막이 하방인 상태로, 상기 용기의 내저면과 상기 다공막의 표면에 접하는 액체 배지 중에서 제1 세포를 배양하는 것; 및,
상기 다공막이 상기 지지 부재에 의하여 상기 용기의 내저면에 접촉하지 않는 위치에 상기 내저면에 대향한 상태로 지지되고, 또한 중력 방향에 있어서 상기 용기의 상기 저부가 하방이며 상기 다공막이 상방인 상태로, 상기 다공막의 하측의 면에서 상기 제1 세포를 배양하고, 상기 다공막의 상측의 면에서 제2 세포를 배양하는 것을 포함하고,
상기 다공막의 개구율은 30%~70% 인, 세포 적층체의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 용기의 내저면은, 상기 제1 세포가 접착하지 않는 성질을 갖는, 세포 적층체의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 지지 부재는,
축 방향의 일단에 상기 다공막을 지지하는 통상부이며, 상기 용기의 내경보다 작은 외경을 갖고, 축 방향의 길이가 상기 용기의 상기 측벽부의 높이보다 짧은 통상부와,
상기 통상부의 축 방향의 타단으로부터 직경 방향 외측으로 돌출되어, 상기 용기의 상기 측벽부의 가장자리에 걸치는 돌출부를 구비하는, 세포 적층체의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 다공막이, 허니콤 구조를 갖는 다공막인, 세포 적층체의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 다공막의 재질이, 폴리뷰타다이엔, 폴리스타이렌, 폴리카보네이트, 폴리락트산 및 폴리락트산-폴리글라이콜산 공중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 세포 적층체의 제조 방법.
청구항 1에 있어서,
상기 다공막은, 적어도 세포를 배양하는 표면이, 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 비트로넥틴, 젤라틴, 퍼레칸, 니도젠, 프로테오글리칸, 오스테오폰틴, 테나신, 네프로넥틴, 기저막 매트릭스 및 폴리라이신으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종에 의하여 피복되어 있는, 세포 적층체의 제조 방법.
청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
상기 제1 세포와 상기 제2 세포가 별종의 세포이며,
상기 제1 세포와 상기 제2 세포의 2종의 세포가, 실질 세포, 간질 세포, 근 세포, 섬유아 세포, 신경 세포, 내피 세포, 상피 세포 및 이들 중 어느 하나로 분화하는 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 2종의 세포인, 세포 적층체의 제조 방법.
청구항 7에 있어서,
상기 제1 세포가, 평활근 세포 또는 평활근 세포로 분화하는 세포이며,
상기 제2 세포가, 혈관 내피 세포 또는 혈관 내피 세포로 분화하는 세포인,
세포 적층체의 제조 방법.