JP6877540B2

JP6877540B2 - 細胞積層体の製造方法

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Publication number: JP6877540B2
Application number: JP2019523979A
Authority: JP
Inventors: 雅史西野; 晃寿伊藤; 伸治美馬; 隼人三好
Original assignee: Fujifilm Corp
Current assignee: Fujifilm Corp
Priority date: 2017-06-09
Filing date: 2018-06-07
Publication date: 2021-05-26
Anticipated expiration: 2038-06-07
Also published as: EP3636746A1; CA3066325A1; EP3636746A4; US20200095531A1; JPWO2018225835A1; EP3636746B1; CA3066325C; CN110709503B; KR102235430B1; WO2018225835A1; CN110709503A; KR20200003902A

Description

本開示は、細胞積層体の製造方法に関する。

生体内の組織に類似した構造を有する人工細胞組織を製造する方法が、例えば、特開２００２−３３５９４９号公報および特許第５１１３３３２号公報に開示されている。

特開２００２−３３５９４９号公報には、ハニカム構造体フィルムの両面において細胞を培養し、細胞の三次元集合体を得たことが開示されている。即ち、特許文献１には、ハニカム構造体フィルムの一方の面に細胞を播種しフィルムへ接着させ、次いで、もう一方の面に細胞を播種し、フィルムの両面において同種の細胞（肝細胞又は心筋細胞）を培養したことが開示されている。

特許第５１１３３３２号公報には、セルカルチャーインサート（cell culture insert）と呼ばれるフィルターデバイスのフィルター上面に脳毛細血管内皮細胞層が配置され、フィルター下面に脳ペリサイト層が配置され、培養プレートの底面にアストロサイト層が配置された血液脳関門モデルが開示されている。本開示においては、セルカルチャーインサートを上下反転させて置いた状態で、フィルター上に脳ペリサイトを播種して培養した後、セルカルチャーインサートを培養プレート内に設置し、セルカルチャーインサート内側に血管内皮細胞を播種することにより、フィルターの両面に細胞層を形成している。

動物実験に替わる薬物評価用又は病態評価用の人工細胞組織を得るには、生体内の組織に近似した構造及び機能を有する細胞組織を構築する必要がある。生体内の組織に近似した構造及び機能を有する細胞組織を構築する観点からは、特許文献１におけるハニカム構造体フィルムのように開口率の高い多孔膜を細胞培養の足場にし、多孔膜の両面で細胞を培養することが望まれる。また、人工細胞組織が模倣する生体組織に合せて、多孔膜の両面それぞれにおいて別種の細胞を培養し、細胞の種類が両細胞層で相違する細胞積層体を構築することも要求される。

しかし、特許文献１には、ハニカム構造体フィルムの両面それぞれにおいて別種の細胞を培養する方法が具体的に開示されていない。

一方、特許文献２には、セルカルチャーインサートのフィルターの上面及び下面それぞれにおいて別種の細胞を培養する方法が開示されている。但し、本培養方法において用いたセルカルチャーインサートは、Transwell（登録商標）インサートであり、そのフィルターはトラックエッチドメンブレン（track etched membrane、ＴＥ膜）である。ＴＥ膜は一般的に開口率が低い故（２％〜２０％程度）、ＴＥ膜上に細胞懸濁液を置いても液体培地がＴＥ膜を通過して落下しにくい。したがって、フィルターとしてＴＥ膜を備えるセルカルチャーインサートであれば、上下反転させて置いた状態でフィルター上に細胞懸濁液を播種して細胞培養が可能である。しかし、セルカルチャーインサートのフィルターに、特許文献１におけるハニカム構造体フィルムのように開口率の高い多孔膜を適用した場合、上下反転させて置いた状態でフィルター上に細胞懸濁液を播種すれば液体培地が多孔膜の孔を通過して落下してしまうので、細胞培養はできない。

本開示の実施形態は、上記状況のもとになされた。

本開示は、新規な細胞積層体の製造方法を提供することを目的とし、これを解決することを課題とする。

上記の課題を解決するための具体的手段には、以下の態様が含まれる。

［１］底部及び底部の外縁から起立する側壁部を有する容器と、多孔膜と、多孔膜を容器の内底面に接触しない位置に内底面に対向させて保持する保持部材と、を用いて、多孔膜の両面に細胞層を備える細胞積層体を製造する方法であって、多孔膜が保持部材により容器の内底面に接触しない位置に内底面に対向した状態に保持され、且つ、重力方向において容器の底部が上方で多孔膜が下方である状態で、容器の内底面と多孔膜の表面とに接する液体培地中で第一の細胞を培養すること；及び、多孔膜が保持部材により容器の内底面に接触しない位置に内底面に対向した状態に保持され、且つ、重力方向において容器の底部が下方で多孔膜が上方である状態で、多孔膜の下側の面で第一の細胞を培養し、多孔膜の上側の面で第二の細胞を培養すること；を含む、細胞積層体の製造方法。
［２］容器の内底面は、第一の細胞が接着しない性質を有する、［１］に記載の細胞積層体の製造方法。
［３］保持部材は、軸方向の一端に多孔膜を保持する筒状部であって、容器の内径よりも小さい外径を有し、軸方向の長さが容器の側壁部の高さよりも短い筒状部と、筒状部の軸方向の他端から径方向外側に突出し、容器の側壁部の縁に掛かる突出部と、を備える、［１］又は［２］に記載の細胞積層体の製造方法。
［４］多孔膜が、ハニカム構造を有する多孔膜である、［１］〜［３］のいずれか１つに記載の細胞積層体の製造方法。
［５］多孔膜の材質が、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ乳酸及びポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体からなる群から選択される少なくとも１種である、［１］〜［４］のいずれか１つに記載の細胞積層体の製造方法。
［６］多孔膜は、少なくとも細胞を培養する表面が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テネイシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス及びポリリジンからなる群から選択される少なくとも１種によって被覆されている、［１］〜［５］のいずれか１つに記載の細胞積層体の製造方法。
［７］第一の細胞と第二の細胞とが別種の細胞であり、第一の細胞と第二の細胞との２種の細胞が、実質細胞、間質細胞、筋細胞、線維芽細胞、神経細胞、内皮細胞、上皮細胞及びこれらのいずれかに分化する細胞からなる群から選択される２種の細胞である、［１］〜［６］のいずれか１つに記載の細胞積層体の製造方法。
［８］第一の細胞が、平滑筋細胞又は平滑筋細胞に分化する細胞であり、第二の細胞が、血管内皮細胞又は血管内皮細胞に分化する細胞である、［１］〜［７］のいずれか１つに記載の細胞積層体の製造方法。

本開示によれば、新規な細胞積層体の製造方法が提供される。

ハニカム構造を有する多孔膜の一例を示す斜視図である。図１Ａにおける多孔膜を上面側から見た平面図である。図１Ｂにおける多孔膜のｃ−ｃ線に沿った断面図である。保持部材の一例を示す斜視図である。図２Ａに示した保持部材を培養容器に設置した状態を示す斜視図である。本開示の製造方法の一例を示す模式図である。本開示の製造方法の一例を示す模式図である。実施例１において使用した多孔膜の顕微鏡像である。実施例１における、多孔膜の両面に形成した細胞層それぞれの蛍光免疫染色像である。ＦＩＴＣ−デキストラン７０の相対蛍光強度を示すグラフである。実施例２における、多孔膜の両面に形成した細胞層それぞれの蛍光免疫染色像である。実施例２における、細胞積層体の蛍光免疫染色像である。

以下に、発明の実施形態を説明する。これらの説明及び実施例は実施形態を例示するものであり、発明の範囲を制限するものではない。本開示において述べる作用機序は推定を含んでおり、その正否は発明の範囲を制限するものではない。

本開示において「〜」を用いて示された数値範囲は、「〜」の前後に記載される数値をそれぞれ下限値及び上限値として含む範囲を示す。

本開示において組成物中の各成分の量について言及する場合、組成物中に各成分に該当する物質が複数種存在する場合には、特に断らない限り、組成物中に存在する当該複数種の物質の合計量を意味する。

＜細胞積層体の製造方法＞
本開示の細胞積層体の製造方法は、多孔膜の両面で細胞を培養して、多孔膜の両面に細胞層を形成することによって、多孔膜の両面に細胞層を備える細胞積層体を製造する方法である。

本開示の細胞積層体の製造方法は、底部及び底部の外縁から起立する側壁部を有する容器と、多孔膜と、多孔膜を容器の内底面に接触しない位置に内底面に対向させて保持する保持部材と、を用いる。以下、上記容器を「培養容器」という。

本開示の細胞積層体の製造方法は、培養容器と、多孔膜と、保持部材とを用いて、多孔膜の両面において細胞を培養し、多孔膜の両面に細胞層を備える細胞積層体を製造する。

まず、本開示の製造方法において用いる培養容器、多孔膜及び保持部材を説明する。

［培養容器］
培養容器としては、例えば、ディッシュ、マルチディッシュ、又はマルチウェルプレートが挙げられる。培養容器の底部の形状は、例えば、円形、長方形、又は正方形である。培養容器の材質は、例えば、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル、又はガラスである。培養容器は、透明性が高いことが好ましい。

培養容器の内底面は、平坦であることが好ましい。培養容器の内底面は、細胞が接着しない性質を有することが好ましい。したがって、培養容器の内底面には、コロナ放電処理又はタンパク質コート処理が施されていないことが好ましい。培養容器の内底面は、細胞の接着を抑制するために、ホスホリルコリン基を有するポリマー、ポリエチレングリコール、ハイドロゲル等によって被覆されていてもよい。培養容器の内側面も、内底面と同様に、細胞が接着しない性質を有することが好ましい。

［多孔膜］
本開示の製造方法において多孔膜は、細胞が接着して増殖する足場である。本開示の製造方法に用いる多孔膜は、製造方法、材質、形状において制限されない。

多孔膜の製造方法としては、樹脂製の膜に、エッチング加工、ブラスト加工又はパンチング加工を施して貫通孔を形成し多孔膜とする製造方法；特許第４７３４１５７号公報、特許第４９４５２８１号公報、特許第５４０５３７４号公報、特許第５４２２２３０号公報、及び特開２０１１−７４１４０号公報に記載されている、ポリマー及び溶剤を含有する塗膜中で水滴を成長させて貫通孔を形成する製造方法；が挙げられる。

多孔膜の材質としては、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリエステル（例えば、ポリ乳酸、ポリカプロラクトン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、ポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体、ポリエチレンテレフタレート、ポリエチレンナフタレート、ポリエチレンサクシネート、ポリブチレンサクシネート、ポリ−３−ヒドロキシブチレート等）、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリフッ化ビニリデン、ポリヘキサフルオロプロペン、ポリビニルエーテル、ポリビニルカルバゾール、ポリ酢酸ビニル、ポリテトラフルオロエチレン、ポリラクトン、ポリアミド、ポリイミド、ポリウレタン、ポリウレア、ポリアロマティックス、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、ポリシロキサン誘導体、セルロースアシレート（例えば、トリアセチルセルロース、セルロースアセテートプロピオネート、セルロースアセテートブチレート）などのポリマーが挙げられる。特許第４７３４１５７号公報などに記載の製造方法により多孔膜を製造する観点からは、疎水性の有機溶剤に溶解するポリマーが好ましい。これらのポリマーは、溶剤への溶解性、光学的物性、電気的物性、膜強度、弾性等の観点から、必要に応じてホモポリマー、コポリマー、ポリマーブレンド又はポリマーアロイとしてよい。これらのポリマーは、１種単独で又は２種以上を混合して使用してよい。

多孔膜の材質としては、自己支持性の観点から、ポリブタジエン、ポリウレタン、ポリスチレン、又はポリカーボネートが好ましく、細胞層の生着が維持されやすい観点から、ポリ乳酸、ポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体、又はポリ乳酸−ポリカプロラクトン共重合体が好ましい。

多孔膜は、細胞の接着性の観点から、少なくとも細胞が播種される領域の表面が、フィブロネクチン、コラーゲン（例えば、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、又はＶ型コラーゲン）、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テネイシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス及びポリリジンからなる群から選択される少なくとも１種によって被覆されていることが好ましい。基底膜マトリックスは、市販品（例えば、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）、Ｇｅｌｔｒｅｘ（登録商標））が入手可能である。多孔膜は、孔内も、これらの少なくとも１種によって被覆されていることが好ましい。

多孔膜は、ハニカム構造を有することが好ましい。本開示においてハニカム構造とは、隔壁によって多数の貫通孔に区画されている構造をいう。

本開示の多孔膜がハニカム構造を有する場合、ハニカム構造の貫通孔は、多孔膜の主面に向かって開口している。本開示の多孔膜がハニカム構造を有する場合、ハニカム構造が複数積層されていてもよい。

本開示において、ハニカム構造の貫通孔の形状は限定されない。貫通孔の形状としては、例えば、球体の一部を欠いた球欠形状、バレル形状、円柱形状、又は角柱形状が挙げられ、複数種類の形状が混在していてもよい。貫通孔の開口の形状としては、例えば、円形、楕円形、又は多角形が挙げられ、複数種類の形状が混在していてもよい。ハニカム構造において、隣り合う貫通孔どうしは一部で連通していてもよい。

ハニカム構造を有する多孔膜において貫通孔は、多孔膜上に形成される細胞層の均質性を高める観点から、規則的に配置されていることが好ましい。規則的な配置は、途切れたりズレがあったりしてもよいが、あらゆる方向に隙間無く連続して繰り返していることが好ましい。

以下に、ハニカム構造を有する多孔膜の一実施形態を、図面を参照しながら説明する。各図面において同一又は等価な構成要素及び部分には同一の参照符号を付与している。以下の説明において、「長径」とは、輪郭上の任意の２点間距離のうちの最大長を意味し、但し方向が特定されている場合は、その方向の任意の２点間距離のうちの最大長を意味する。

図１Ａ〜図１Ｃに、ハニカム構造を有する多孔膜の一例である多孔膜２０を示す。図１Ａは、多孔膜２０の斜視図であり、図１Ｂは、図１Ａにおける多孔膜２０を上面側から見た平面図であり、図１Ｃは、図１Ｂにおけるｃ−ｃ線に沿った多孔膜２０の断面図である。

多孔膜２０には、主面全域に亘って貫通孔２２が配置されている。但し、多孔膜２０に細胞が接触し得ない領域が有る場合、該領域には貫通孔２２が配置されていなくてもよい。多孔膜２０において、隣り合う貫通孔２２どうしは、隔壁２４により隔てられている。

貫通孔２２の配置は、平行六辺形（好ましくは正六角形）又はこれに近い形状を単位とし、これら図形の頂点及び対角線の交点に開口の中心が位置する配置である。「開口の中心」とは、主面上における開口の２次元図形の重心を意味する。

貫通孔２２の形状としては、例えば、球体の一部を欠いた球欠形状、バレル形状、円柱形状、又は角柱形状が挙げられる。貫通孔２２の開口の形状としては、例えば、円形、楕円形、又は多角形が挙げられる。隣り合う貫通孔２２どうしは、多孔膜２０の内部において、連通孔により連通していてもよい。

以下、多孔膜２０の寸法について説明する。

貫通孔２２のピッチＰ１は、隣り合う開口の中心間の距離である。ピッチＰ１は、多孔膜２０上で培養する細胞の大きさに応じて設定することが好ましい。ピッチＰ１は、例えば、１μｍ〜５０μｍである。

開口径Ｄａは、貫通孔２２の開口の長径である。開口径Ｄａは、播種される細胞が多孔膜２０上に留まる大きさであることが好ましい。開口径Ｄａは、播種される細胞の長径（例えば、１０μｍ〜５０μｍ）に対して、例えば、１０％〜１５０％である。開口径Ｄａは、赤血球の漏出試験を行う目的で血管壁モデルを構築する場合は、赤血球を通過させる大きさであることが好ましい。開口径Ｄａは、一方の面の細胞と他方の面の細胞とが接触（cell-cell contact）する観点からは、小さ過ぎないことが好ましい。開口径Ｄａは、多孔膜２０の強度の観点からは、大き過ぎないことが好ましい。これらの観点から、開口径Ｄａは、１μｍ〜２０μｍが好ましく、２μｍ〜１０μｍがより好ましく、３μｍ〜５μｍが更に好ましい。

開口径Ｄａの変動係数は、２０％以下であることが好ましく、小さいほど好ましい。開口径Ｄａの変動係数が小さいほど、多孔膜２０上に形成される細胞層の均質性が高まる。変動係数は、ある集団について標準偏差を算術平均値で除した値であり、その集団のばらつきの度合いを示す指標である。本開示においては、変動係数を百分率で示す。

隔壁２４の幅Ｗは、隣り合う開口の中心間において測定される、隔壁２４の幅の長さである。幅Ｗは、播種される細胞が多孔膜２０上に留まる幅であることが好ましい。

多孔膜２０の開口率は、物質透過性と多孔膜の強度の観点から、３０％〜７０％が好ましく、３５％〜６５％がより好ましく、４０％〜６０％が更に好ましい。多孔膜２０の開口率とは、平面視した主面の面積（開口を含む面積）に占める開口の合計面積の割合であり、一方の面および他方の面についてそれぞれ算出する。

多孔膜２０の膜厚は、一方の面の細胞と他方の面の細胞とが接触（cell-cell contact）する観点からは、厚過ぎないことが好ましい。多孔膜２０の膜厚は、多孔膜２０の強度の観点からは、薄過ぎないことが好ましい。これらの観点から、多孔膜２０の膜厚は、０．５μｍ〜４０μｍが好ましく、１μｍ〜２０μｍがより好ましく、２μｍ〜８μｍが更に好ましい。

多孔膜２０の製造方法の詳細は、例えば、特許第４７３４１５７号公報、特許第４９４５２８１号公報、特許第５４０５３７４号公報、特許第５４２２２３０号公報、及び特開２０１１−７４１４０号公報に記載されている。

本開示の細胞積層体の製造方法において多孔膜は、細胞が接着して増殖する足場であるところ、多孔膜の開口率が高いほど、また、多孔膜の膜厚が薄いほど、一方の面の細胞と他方の面の細胞との間の細胞間相互作用（cell-cell interaction）、即ち、液性因子による情報伝達及び細胞どうしの接触（cell-cell contact）の少なくとも一方が活発になる。細胞培養時における細胞間相互作用が活発になるほど、生体内の組織に近似した機能を有する細胞積層体を製造することが可能となる。本観点から、本開示の製造方法に用いる多孔膜としては、ハニカム構造を有する多孔膜が好ましく、多孔膜２０が好ましい形態の一つである。

［保持部材］
保持部材は、多孔膜を、培養容器の内底面に接触しない位置に内底面に対向させて保持する部材である。

保持部材の材質としては、透明性が高いこと、液体培地に対して化学的に安定であること、軽量であること等の観点から、ポリカーボネート、ポリスチレン、ポリエステル等の樹脂が好ましい。

保持部材の形状は、制限されない。保持部材は、例えば、多孔膜を保持する部位と、培養容器に接触する部位とを有する。保持部材としては、例えば、培養容器の側壁部の縁に掛かる突出部を備える、ワイヤ状部材、棒状部材、筒状部材などが挙げられる。

保持部材の形態例としては、軸方向の一端に多孔膜を保持する筒状部と、筒状部の軸方向の他端から径方向外側に突出する突出部と、を備える部材が挙げられる。以下に、本形態を、図面を参照しながら説明する。

図２Ａに、保持部材の一例である保持部材４０を、多孔膜２０（多孔膜の一例）を備えた状態で示す。図２Ａは、保持部材４０の斜視図である。図２Ｂは、多孔膜２０を備えた保持部材４０を、培養容器６０（培養容器の一例）に設置した状態を示す斜視図である。

保持部材４０は、筒状部４２と、突出部４４とを備える。筒状部４２の軸方向の一端には、多孔膜２０が配置されている。多孔膜２０は、少なくとも、筒状部４２の一端の開口を塞ぐ大きさであればよい。多孔膜２０は、熱圧着、超音波溶着、レーザー溶着、接着剤又は両面テープによって、筒状部４２の一端に接着される。または、多孔膜２０は、筒状部４２の外面にはめ込むリング状の固定部材によって、筒状部４２の一端に固定される。

筒状部４２は、培養容器６０の内径よりも小さい外径を有し、培養容器６０の内部（即ち、底部６２と側壁部６４とで規定された空間）に挿入可能である。筒状部４２の軸方向の長さは、培養容器６０の側壁部６４の高さよりも短く、したがって、多孔膜２０は培養容器６０の底部６２に接触しない。

筒状部４２は、壁が周方向及び軸方向に連続している。これにより、多孔膜２０と筒状部４２とで規定された空間に液体の収容が可能となる。但し、突出部４４の近傍においては、筒状部４２の壁にスリットが設けられていてもよい。筒状部４２の内面形状は、例えば、円柱形状、角柱形状、円錐台形状、角錐台形状である。

突出部４４は、筒状部４２の軸方向の一端であって、多孔膜２０が配置されている一端とは反対側の一端において、筒状部４２の径方向外側に突出している。突出部４４は、例えば、筒状部４２の周方向に約１２０°間隔で３個設けられている。但し、突出部４４の個数及び形状はこれに限定されない。突出部４４は、筒状部４２の周方向に連続したリング状でもよい。

突出部４４は、保持部材４０が培養容器６０の内部に挿入された際に、培養容器６０の側壁部６４の縁に掛かる長さに突出している。突出部４４によって、保持部材４０は、培養容器６０の側壁部６４の縁に係止される。

図２Ａに示すような形状の培養デバイスは、一般的に、セルカルチャーインサート（cell culture insert）と呼ばれている。

次に、本開示の製造方法の工程を説明する。本開示において「工程」との語は、独立した工程だけでなく、他の工程と明確に区別できない場合であってもその工程の所期の目的が達成されれば、本用語に含まれる。

本開示の細胞積層体の製造方法は、下記の工程（Ａ）と工程（Ｂ）とを含む。図３は、本開示の製造方法の一例を示す模式図であり、工程（Ａ）及び工程（Ｂ）を説明するための模式図である。図３において、矢印Ｇは重力方向を示す。

工程（Ａ）：多孔膜２が保持部材４により培養容器６の内底面に接触しない位置に内底面に対向した状態に保持され、且つ、重力方向Ｇにおいて培養容器６の底部が上方で多孔膜２が下方である状態で、培養容器６の内底面と多孔膜２の表面とに接する液体培地中で第一の細胞１１を培養する。

工程（Ｂ）：多孔膜２が保持部材４により培養容器６の内底面に接触しない位置に内底面に対向した状態に保持され、且つ、重力方向Ｇにおいて培養容器６の底部が下方で多孔膜２が上方である状態で、多孔膜２の下側の面で第一の細胞１１を培養し、多孔膜２の上側の面で第二の細胞１２を培養する。

本開示において「培養」は、必ずしも細胞の増殖を伴う必要はなく、増殖の有無にかかわらず、細胞の生存が維持されれば本用語に含まれる。

工程（Ａ）においては、重力方向Ｇにおいて培養容器６の底部が上方で多孔膜２が下方である状態をとる。工程（Ａ）においては、第一の細胞１１を含有する細胞懸濁液が、培養容器６の内底面と多孔膜２の表面とに接するように、培養容器６と多孔膜２との間に置かれ、この状態で第一の細胞１１が培養される。培養容器６の内底面と、細胞懸濁液に含まれる液体培地との間にはたらく表面張力により、液体培地は多孔膜２上に保持され、液体培地が多孔膜２の孔を通過して落下することが抑制される。したがって、多孔膜２として、開口率の高い多孔膜を細胞積層体の製造に用いることができる。多孔膜２は、保持部材４により、培養容器６の内底面の近傍に、培養容器６の内底面に対して平行又は略平行に対向した状態に保持されることが好ましい。多孔膜２と培養容器６の内底面との距離は、例えば０．５ｍｍ〜１０ｍｍである。

工程（Ａ）において、液体培地中の第一の細胞１１は、自重によって重力方向Ｇに移動し、多孔膜２に接着する。工程（Ａ）は、第一の細胞１１を多孔膜２上で接着培養する工程である。

工程（Ａ）における細胞培養の条件としては、一般的な細胞培養条件を適用してよい。例えば、温度３７℃且つ５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。培養期間は、第一の細胞１１の多孔膜２上への接着が安定するまでの期間が好ましい。

工程（Ｂ）においては、重力方向Ｇにおいて培養容器６の底部が下方で多孔膜２が上方である状態をとる。工程（Ｂ）においては、多孔膜２の下側の面で第一の細胞１１が培養され、多孔膜２の上側の面で第二の細胞１２が培養される。多孔膜２の下側の面で培養される第一の細胞１１は、工程（Ａ）において、多孔膜２の、培養容器６の内底面に向いた側の面で培養された第一の細胞１１であり、該細胞が工程（Ｂ）において引き続き培養される。

工程（Ｂ）における細胞培養の条件としては、一般的な細胞培養条件を適用してよい。例えば、温度３７℃且つ５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２濃度のインキュベーター内での培養が適用される。培養期間は、多孔膜２の両面とも細胞がコンフルエントになるまでの期間が好ましい。細胞がコンフルエントになったことは、例えば光学顕微鏡による観察で判断できる。培養期間中、培地交換を行ってもよい。

本開示の製造方法の一実施形態を、図４を参照しながら説明する。図４に示す実施形態は、図２Ｂに示すような形状の培養デバイスを用いる製造方法であり、図４の（１）〜（５）は、下記の工程（１）〜工程（５）にそれぞれ対応する。図４において、矢印Ｇは重力方向を示す。工程（１）〜工程（５）を含む実施形態によれば、本開示の製造方法を簡便に実現できる。

工程（１）：第一の細胞１１を含む細胞懸濁液を、培養容器６の内底面に置く。

工程（１）においては、培養容器６の内側面に接触しないように、細胞懸濁液を内底面に置くことが好ましい。工程（３）において、細胞懸濁液が培養容器６の内側面を伝って落下することを防ぐためである。細胞懸濁液が培養容器６の内側面を伝って落下することを防ぐ手段としては、ほかに、多孔膜２の主面の大きさを、培養容器６の内側面に周全体にわたって接触する大きさとすることも挙げられる。

工程（１）において培養容器６の内底面に置く細胞懸濁液の量は、培養容器６の内底面と多孔膜２とで挟まれる空間の容積に相当する量が好ましい。第一の細胞１１の播種密度は、多孔膜２の面積に対して例えば１．０×１０^３〜１．０×１０^６細胞／ｃｍ^２である。

工程（２）：多孔膜２を備える保持部材４を培養容器６に設置し、多孔膜２を培養容器６の内底面に置いた細胞懸濁液に接触させる。

工程（２）の実施によって、第一の細胞１１を含有する細胞懸濁液が培養容器６の内底面と多孔膜２の表面とに接する状態（換言すれば、培養容器６の内底面と多孔膜２の表面とで細胞懸濁液が挟まれた状態）となる。以下、製造方法の説明において、多孔膜２を備える保持部材４と、培養容器６とが一体になったデバイスを「培養デバイス」という。

工程（３）：重力方向Ｇにおいて培養容器６の底部が上方で多孔膜２が下方である状態で、培養容器６の内底面と多孔膜２の表面とに接する液体培地中で第一の細胞１１を培養する。

工程（３）は、多孔膜２を備える保持部材４を培養容器６に設置したままで培養デバイスの上下を反転させること、次いで、培養デバイスをインキュベーター内に静置することで実現される。細胞懸濁液に含まれている第一の細胞１１は、自重によって重力方向Ｇに移動し、多孔膜２に接着する。

工程（４）：重力方向Ｇにおいて培養容器６の底部が下方で多孔膜２が上方である状態で、多孔膜２の上側の面に第二の細胞１２を播種する。

工程（４）は、培養デバイスをインキュベーターから取り出し再度反転させること、次いで、多孔膜２上に第二の細胞１２を含む細胞懸濁液を播種することで実現される。第二の細胞１２の播種密度は、例えば１．０×１０^３〜１．０×１０^６細胞／ｃｍ^２である。第二の細胞１２の播種の前又は後に、第一の細胞１１側に、液体培地を追加することが好ましい。

工程（５）：重力方向Ｇにおいて培養容器６の底部が下方で多孔膜２が上方である状態で、多孔膜２の下側の面で第一の細胞１１を培養し、多孔膜２の上側の面で第二の細胞１２を培養する。

工程（５）は、工程（４）に次いで、培養デバイスをインキュベーター内に静置することで実現される。工程（５）の期間中、培地交換を行ってもよい。第一の細胞１１及び第二の細胞１２の少なくとも一方が幹細胞である場合、目的の体細胞へと分化誘導する分化誘導因子を培地に添加する。

工程（１）乃至工程（５）を経て、多孔膜２と、多孔膜２の一方の面に配置された、第一の細胞１１を含む細胞層と、多孔膜２の他方の面に配置された、第二の細胞１２を含む細胞層と、を備える細胞積層体が得られる。

以下、本開示の細胞積層体の製造方法に用いる細胞を説明する。

第一の細胞と第二の細胞とは、同種の細胞でもよく、別種の細胞でもよい。本開示の細胞積層体が模倣する生体組織に合せて、細胞種の組み合わせを選択する。

本開示の製造方法の一実施形態においては、第一の細胞と第二の細胞とが別種の細胞である。第一の細胞と第二の細胞との２種の細胞は、例えば、実質細胞（例えば、肝実質細胞、又は膵実質細胞）、間質細胞（例えば、周皮細胞）、筋細胞（例えば、平滑筋細胞、心筋細胞、又は骨格筋細胞）、線維芽細胞、神経細胞、内皮細胞（例えば、血管内皮細胞、又はリンパ管内皮細胞）、上皮細胞（例えば、肺胞上皮細胞、口腔上皮細胞、胆管上皮細胞、腸管上皮細胞、膵管上皮細胞、腎上皮細胞、尿細管上皮細胞、又は胎盤上皮細胞）、及びこれらのいずれかに分化する細胞（例えば、前駆細胞、間葉系幹細胞、又は多能性幹細胞）からなる群から選択される２種の細胞である。

第一の細胞又は第二の細胞として用いる多能性幹細胞としては、例えば、胚性幹細胞（embryonic stem cell；ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cell；ｉＰＳ細胞）、胚性生殖細胞（embryonic germ cell；ＥＧ細胞）、胚性癌細胞（embryonal carcinoma cell；ＥＣ細胞）、多能性成体前駆細胞（multipotent adult progenitor cell；ＭＡＰ細胞）、成体多能性幹細胞（adult pluripotent stem cell；ＡＰＳ細胞）、Ｍｕｓｅ細胞（multi-lineage differentiating stress enduring cell）；などが挙げられる。本開示の製造方法の工程（Ｂ）において、目的の体細胞へと分化誘導する分化誘導因子を培地に添加し、多能性幹細胞を体細胞に分化させる。

本開示の製造方法においては、第一の細胞及び第二の細胞とは異なる別種の細胞（「第三の細胞」という。１種でも複数種でもよい。）を、第一の細胞及び第二の細胞の少なくとも一方と共に培養してもよい。これにより、多孔膜の片面又は両面に、第一の細胞又は第二の細胞と共に第三の細胞が含まれる細胞層が形成される。例えば、第一の細胞が実質細胞であり、第二の細胞が間質細胞であり、第三の細胞が神経細胞である。

本開示の製造方法において、模倣する生体内の組織に合せて、第一の細胞と第二の細胞との組み合わせを選択し、さらには必要に応じて第三の細胞を選択することにより、生体内の組織を模倣した組織モデルが得られる。動物組織においては、一つの細胞層と別の細胞層との間に基底膜（basement membrane）が存在するのが一般的である。本開示の製造方法により得られる組織モデルにおいては、多孔膜が基底膜に相当する。

第一の細胞及び第二の細胞の少なくとも一方として、病態を再現する目的で、遺伝子変異を有する細胞、又は、患者由来の細胞を用いてもよい。

本開示の製造方法の一実施形態においては、第一の細胞が、平滑筋細胞又は平滑筋細胞に分化する細胞であり、第二の細胞が、血管内皮細胞又は血管内皮細胞に分化する細胞である。本実施形態の製造方法は、多孔膜の一方の面に血管内皮細胞層が配置され、多孔膜の他方の面に平滑筋細胞層が配置された細胞積層体、即ち血管壁モデルを提供する。

細胞懸濁液の調製又は細胞培養に用いる液体培地は、対象となる細胞種に合せて選択される。具体的な培地としては、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）、ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）、ＥＭＥＭ（Eagle's minimal essential medium）、ＭＥＭα（Minimum Essential Medium Alpha）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）等の哺乳動物細胞用の基本培地に細胞増殖因子を添加し、細胞種に合せて最適化した培地が挙げられる。このような培地は市販品が入手可能である。液体培地は、共培養する細胞種に応じて、複数種の培地を混合した培地でもよい。液体培地のｐＨは、例えばｐＨ７．０〜８．０である。液体培地は、細胞が自重によって重力方向に移動し得る比重及び粘度であることが好ましい。

本開示の細胞積層体の製造方法により、
多孔膜と、
多孔膜の一方の面に配置された第一の細胞層と、
多孔膜の他方の面に配置された第二の細胞層と、を備える細胞積層体が得られる。

本開示の細胞積層体の製造方法において、多孔膜としてハニカム構造を有する多孔膜を用いることにより、
ハニカム構造を有する多孔膜と、
ハニカム構造を有する多孔膜の一方の面に配置された第一の細胞層と、
ハニカム構造を有する多孔膜の他方の面に配置された第二の細胞層と、を備える細胞積層体が得られる。

本開示の細胞積層体の製造方法において、多孔膜としてハニカム構造を有する多孔膜を用い、第一の細胞を平滑筋細胞又は平滑筋細胞に分化する細胞とし、第二の細胞を血管内皮細胞又は血管内皮細胞に分化する細胞とすることにより、
ハニカム構造を有する多孔膜と、
ハニカム構造を有する多孔膜の一方の面に配置された平滑筋細胞層と、
ハニカム構造を有する多孔膜の他方の面に配置された血管内皮細胞層と、を備える細胞積層体（即ち、血管壁モデル）が得られる。

本開示の製造方法においてハニカム構造を有する多孔膜を用いると、細胞培養時における、一方の面の細胞と他方の面の細胞との間の細胞間相互作用が活発になり、生体内の組織に近似した構造及び機能を有する細胞積層体を製造することができる。したがって、本開示の製造方法によれば、ハニカム構造を有する多孔膜を用いて、血管内皮細胞の細胞間接着が生体内の血管壁に近い状態に発達した血管壁モデルを製造することができる。

血管壁モデルとしては、血管内皮細胞層の細胞間を化学物質が自由に通過しないこと、つまり、バリア機能を有することが好ましい。本開示の製造方法によって得られる血管壁モデルは、血管内皮細胞の細胞間接着が、生体内の血管壁に近い状態に発達していると推測される。血管壁モデルを用いて薬物評価をより正確に行うためには、血管壁モデルは生体内の血管壁に近似した構造及び機能を有することが望ましいところ、本開示の製造方法によって得られる血管壁モデルは、薬物評価の優れた手段となり得る。

本開示の製造方法によって得られる細胞積層体の用途は、限定されない。本開示の製造方法によって得られる細胞積層体は、生体内への移植材料、薬物評価用又は病態評価用の組織モデル、又は、動物実験に替わる試験用組織として有用である。

以下に、実施例により本開示の実施形態を説明するが、本開示の実施形態は、これら実施例により限定されるものではない。

下記において、物質濃度に関し「Ｍ」はモル濃度を表し、１Ｍ＝１ｍｏｌ／Ｌである。

以下の実施例で使用される化学物質等の略称は以下のとおりである。
ＥＧＭ：endothelial cell growth medium
ＦＩＴＣ：fluorescein isothiocyanate
ＨＢＳＳ：Hanks' balanced salt solution
ＨＣＭ：honeycomb membrane
ＨＵＡＳＭＣ：human umbilical artery smooth muscle cell、ヒト臍帯動脈平滑筋細胞
ＨＵＶＥＣ：human umbilical vein endothelial cell、ヒト臍帯静脈内皮細胞
ＰＢＳ：phosphate buffered saline
ＴＥＭ：track etched membrane

＜実施例１＞
［細胞培養の器材］
・２４ウェルプレート：浮遊培養用（#662-102、Greiner）
・ＴＥＭインサート：ＴＥ膜をフィルター部に備える２４ウェル・ハンギング・インサート（#MCMP24H48、Millipore）。本インサートが備えるＴＥ膜の顕微鏡像を図５に示す。ＴＥ膜は、開口径５．７μｍ、膜厚１０．６μｍ、開口率１２．４％、ポリエチレンテレフタレート製。
・ＨＣＭインサート：ハニカム構造を有する多孔膜をフィルター部に備える２４ウェル・ハンギング・インサート。本インサートが備える多孔膜の顕微鏡像を図５に示す。多孔膜は、開口径５．０μｍ、膜厚２．２μｍ、開口率５５％、ポリブタジエン製。
・ＨＣＭの被覆材料：フィブロネクチン（#33016-015、Invitrogen）

［細胞］
・血管内皮細胞：ＨＵＶＥＣ（#C2517AS、Lonza）
・平滑筋細胞：ＨＵＡＳＭＣ（#C-12500、PromoCell）

［液体培地、細胞剥離用試薬］
・ＨＵＶＥＣ用：ＥＧＭ−２（#CC-3162、Lonza）
・ＨＵＡＳＭＣ用：Smooth Muscle Cell Growth Medium 2 Kit（#C-22162、PromoCell）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（AT104-500、Innovative cell technologies）

［ＨＣＭの滅菌処理］
（１）２４ウェルプレート１枚のウェルに７０％（ｖ／ｖ）エタノールを５００μＬ／ウェル入れ、別の２４ウェルプレート２枚のウェルにＰＢＳを５００μＬ／ウェル入れた。別途、７０％（ｖ／ｖ）エタノールを入れたカップを準備した。
（２）エタノールを入れたカップにＨＣＭインサートをくぐらせ、次いで、ＨＣＭインサートをエタノールが入ったウェルに、ＨＣＭがエタノールに浸るように置き、５分間静置した。
（３）ＨＣＭインサートをエタノールから取り出し、アスピレータを用いてＨＣＭインサートの内側からエタノールを除去し、すぐにＰＢＳを入れたウェルに移し、ＨＣＭがＰＢＳに浸るように置き、ＰＢＳを１ｍＬ注いだ。
（４）ＨＣＭインサートをＰＢＳから取り出し、アスピレータを用いてＨＣＭインサートの内側からＰＢＳを除去し、すぐにＰＢＳを入れたウェルに移し、ＨＣＭがＰＢＳに浸るように置き、ＰＢＳを１ｍＬ注いだ。
（５）ＨＣＭインサートをＰＢＳに浸したまま減圧デシケータに入れて、ＨＣＭを脱気した。
（６）ＨＣＭインサートに、破損、付着物、及び、ＨＣＭのよれがないことを顕微鏡で確認した。

［ＨＣＭのフィブロネクチン被覆］
（１）フィブロネクチンをＰＢＳに溶解し、濃度３０μｇ／ｍＬのフィブロネクチン液を調製した。
（２）２４ウェルプレートのウェルの中心部にフィブロネクチン液を７０μＬスポットした。
（３）ＨＣＭインサートをＰＢＳから取り出し、アスピレータを用いてＨＣＭインサートの内側からＰＢＳを除去し、すぐにウェル上のフィブロネクチン液のスポットに載せ、ＨＣＭをフィブロネクチン液に浸した。
（４）ＨＣＭインサートの内側にフィブロネクチン液を１００μＬ注ぎ、室温下に１時間置いた（又は、４℃下に一晩置いた。)。

［ＨＣＭインサートを用いた細胞培養（細胞積層体の製造）］
（１）２４ウェルプレートのウェルの中心部に、ＨＵＡＳＭＣの細胞懸濁液をドーム状に８０μＬ置いた。
（２）ＨＵＡＳＭＣの細胞懸濁液の上にコーティング済みのＨＣＭインサートを載せ、ウェルの底面とＨＣＭとにより細胞懸濁液を挟んだ。
（３）ウェルの底面とＨＣＭとにより細胞懸濁液を挟んだ状態のまま、プレート及びＨＣＭインサートを反転させた。反転させた状態でインキュベーター（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２）へ入れ、１６時間培養した。
（４）ＨＣＭインサートの外側にSmooth Muscle Cell Growth Medium 2 Kitを１２００μＬ添加した。インキュベーターから取り出し、プレート及びＨＣＭインサートの上下をもとに戻し、培地の入ったウェルへ移した後、ＨＣＭインサートの内側にＨＵＶＥＣの細胞懸濁液を３００μＬ播種した。
（５）インキュベーター（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２）へ入れ、８０時間培養した。

各細胞の播種条件は下記のとおりである。
・ＨＵＡＳＭＣ：培養面積０．７８５ｃｍ^２、播種密度１．０×１０^４細胞／ｃｍ^２、細胞懸濁液８０μＬ
・ＨＵＶＥＣ：培養面積０．３２ｃｍ^２、播種密度５．０×１０^４細胞／ｃｍ^２、細胞懸濁液３００μＬ

上記培養によって、フィルターの上面に血管内皮細胞層が配置され、フィルターの下面に平滑筋細胞層が配置されたＨＣＭインサート（「ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサート」という。）を得た。図６に、ＣＤ３１を蛍光免疫染色した上面の細胞層と、α−平滑筋アクチンを蛍光免疫染色した下面の細胞層を示す。

上記の操作に準じて、フィルターの上面に血管内皮細胞層が配置されフィルターの下面に細胞層が配置されていないＨＣＭインサート（「ＶＥＣ−ＨＣＭインサート」という。）と、フィルターの下面に平滑筋細胞層が配置されフィルターの上面に細胞層が配置されていないＨＣＭインサート（「ＳＭＣ−ＨＣＭインサート」という。）とをそれぞれ作製した。

［ＴＥＭインサートを用いた細胞培養（従来の方法による細胞積層体の製造）］
ＴＥＭインサートを上下反転させて置いた状態で、フィルター上にＨＵＡＳＭＣを播種し、インキュベーター（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２）へ入れ１６時間培養した。次いで、ＴＥＭインサートを２４ウェルプレートのウェルに設置し、ＴＥＭインサートの内側にＨＵＶＥＣを播種し、ＴＥＭインサートの外側にSmooth Muscle Cell Growth Medium 2 Kitを１２００μＬ添加した。次いで、インキュベーター（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２）へ入れ、８０時間培養した。

ＴＥＭインサートへの各細胞の播種条件は、ＨＣＭインサートへの各細胞の播種条件と同じである。

上記培養によって、フィルターの上面に血管内皮細胞層が配置され、フィルターの下面に平滑筋細胞層が配置されたＴＥＭインサート（「ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＴＥＭインサート」という。）を得た。

上記の操作に準じて、フィルターの上面に血管内皮細胞層が配置されフィルターの下面に細胞層が配置されていないＴＥＭインサート（「ＶＥＣ−ＴＥＭインサート」という。）と、フィルターの下面に平滑筋細胞層が配置されフィルターの上面に細胞層が配置されていないＴＥＭインサート（「ＳＭＣ−ＴＥＭインサート」という。）とをそれぞれ作製した。

［物質透過性の評価］
（１）ＦＩＴＣ−デキストラン７０（７０ｋＤａ、Sigma）を２ｍｇ、８ｍＬのＨＢＳＳ（＋）（084-08965、和光純薬工業）に溶かし、濃度２５０μｇ／ｍＬのＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液を調製し、遮光して保管した。
（２）２４ウェルプレートの１列目〜３列目の各ウェルにＨＢＳＳ（＋）を９００μＬずつ入れた。
（３）細胞積層体を備えるインサートを培地から取り出し、アスピレータを用いてインサートの内側から培地を除去し、１列目のウェルに置いた。
（４）１列目のウェルに置いたインサートの内側に、ＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液を２００μＬ添加し、３７℃下で１０分間インキュベートした。
（５）インサートを２列目のウェルに移し、３７℃下で１０分間インキュベートした。
（６）インサートを３列目のウェルに移し、すぐにプレートにアルミシートを被せ遮光した。
（７）１列目及び２列目のウェル内の試料液をそれぞれピペットでミキシングし、各ウェルから１００μＬずつとり、９６ウェル・ブラック・プレートに移し、アルミシートを被せ遮光した。
（８）試料液中のＦＩＴＣの蛍光強度を、プレートリーダー（EnSpire、PerkinElmer）を用いてＥｘ/Ｅｍ＝４８５ｎｍ/５３０ｎｍ、光照射回数６０回で測定した。

１列目のウェルの試料液におけるＦＩＴＣの相対蛍光強度（即ち、ＦＩＴＣ−デキストラン７０溶液の添加から１０分間のＦＩＴＣ−デキストラン７０の相対漏出量）を図７に示す。図７に示すグラフは、フィルターの両面に細胞層を形成していないインサートにおける蛍光強度を水準にした相対蛍光強度（relative fluorescence intensity）を示す。

ＴＥＭインサートは、ＶＥＣ−ＴＥＭインサートにおいて相対蛍光強度が３．０±０．５％（ｎ＝５）、ＳＭＣ−ＴＥＭインサートにおいて相対蛍光強度が８．２±２．９％（ｎ＝５）、ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＴＥＭインサートにおいて相対蛍光強度が０．４±０．２％（ｎ＝５）であった。平滑筋細胞層は一般的に細胞間の結合がそれほどタイトではないにもかかわらず、ＳＭＣ−ＴＥＭインサートにおいて相対蛍光強度が上記値であったことから、ＴＥＭインサートにおいては、ＴＥＭ自体がＦＩＴＣ−デキストラン７０に対するバリア機能を果たしていると推測された。

ＨＣＭインサートは、ＶＥＣ−ＨＣＭインサートにおいて相対蛍光強度が１９．３±１０．２％（ｎ＝５）、ＳＭＣ−ＨＣＭインサートにおいて相対蛍光強度が６７．４±６．１％（ｎ＝５）、ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサートにおいて相対蛍光強度が０．４±０．３％（ｎ＝５）であった。ＨＣＭの一方の面に血管内皮細胞層を形成し他方の面に平滑筋細胞層を形成することにより、ＦＩＴＣ−デキストラン７０に対するバリア機能が獲得されていた。

＜実施例２＞
［細胞培養の器材］
・２４ウェルプレート：浮遊培養用（#662-102、Greiner）
・ＨＣＭインサート：ハニカム構造を有する多孔膜をフィルター部に備える２４ウェル・ハンギング・インサート。多孔膜は、開口径３．０μｍ、膜厚１．２μｍ、開口率５５％、ポリカーボネート製。
・ＨＣＭの被覆材料：コラーゲンＩ rat tail（#354236、Corning）

［細胞］
・血管内皮細胞：ラット血管内皮細胞（#cAP-r0001、Angioproteomie）
・平滑筋細胞：ラット平滑筋細胞（#R-ASM-580、Lonza）

［液体培地、細胞剥離用試薬］
・ラット血管内皮細胞用：Rat endothelial cell growth medium（#cAP-03,cAP-04、Angioproteomie）
・ラット平滑筋細胞用：ＤＭＥＭ：Ｆ−１２（１：１）培地（#BE04-687Q、Lonza）
・Ａｃｃｕｔａｓｅ（AT104-500、Innovative cell technologies）

［ＨＣＭの滅菌処理］
実施例１と同様に、ＨＣＭの滅菌処理を行った。

［ＨＣＭのコラーゲン被覆］
（１）コラーゲンＩを０．２Ｎの酢酸溶液に溶解し、濃度５０μｇ／ｍＬのコラーゲンＩ液を調製した。
（２）２４ウェルプレートのウェルの中心部にコラーゲンＩ液を７０μＬスポットした。
（３）ＨＣＭインサートをＰＢＳから取り出し、アスピレータを用いてＨＣＭインサートの内側からＰＢＳを除去し、すぐにウェル上のコラーゲンＩ液のスポットに載せ、ＨＣＭをコラーゲンＩ液に浸した。
（４）ＨＣＭインサートの内側にコラーゲンＩ液を１００μＬ注ぎ、室温下に４時間置いた（又は、４℃下に一晩置いた)。
（５）ＰＢＳを５００μＬ添加し、ＨＣＭを中和した。

［ＨＣＭインサートを用いた細胞培養（細胞積層体の製造）］
（１）２４ウェルプレートのウェルの中心部に、ラット平滑筋細胞の細胞懸濁液をドーム状に８０μＬ置いた。
（２）ラット平滑筋細胞の細胞懸濁液の上にコーティング済みのＨＣＭインサートを載せ、ウェルの底面とＨＣＭとにより細胞懸濁液を挟んだ。
（３）ウェルの底面とＨＣＭとにより細胞懸濁液を挟んだ状態のまま、プレート及びＨＣＭインサートを反転させた。反転させた状態でインキュベーター（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２）へ入れ、１６時間培養した。
（４）ＨＣＭインサートの外側にRat endothelial cell growth mediumを１２００μＬ添加した。インキュベーターから取り出し、プレート及びＨＣＭインサートの上下をもとに戻し、培地の入ったウェルへ移した後、ＨＣＭインサートの内側にラット血管内皮細胞の細胞懸濁液を３００μＬ播種した。
（５）インキュベーター（３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ_２）へ入れ、８０時間培養した。

各細胞の播種条件は下記のとおりである。
・ラット平滑筋細胞：培養面積０．７８５ｃｍ^２、播種密度１．０×１０^４細胞／ｃｍ^２、細胞懸濁液８０μＬ
・ラット血管内皮細胞：培養面積０．３２ｃｍ^２、播種密度５．０×１０^４細胞／ｃｍ^２、細胞懸濁液３００μＬ

上記培養によって、フィルターの上面に血管内皮細胞層が配置され、フィルターの下面に平滑筋細胞層が配置されたＨＣＭインサート（「ＶＥＣ／ＳＭＣ−ＨＣＭインサート」という。）を得た。図８に、VE-Cadherinを蛍光免疫染色した上面の細胞層と、Calponinを蛍光免疫染色した下面の細胞層を示す。

図８に示すとおり、コンフルエントな細胞層の形成と、血管内皮カドヘリンの局在が明瞭に観察された。血管内皮カドヘリンの局在は、血管内皮細胞どうしが強固に接合していること（cell-cellジャンクションの形成）を示し、実際の血管壁の特徴の一つである。ＨＣＭの一方の面に血管内皮細胞層を形成し他方の面に平滑筋細胞層を形成することにより、生体組織と同様の構造を有する細胞積層体を作成することができた。

［生理活性物質に対する反応の評価］
（１）トロンビン（#T7009-100UN、Sigma）０．１ｍｇ（１００ＵＮ）を１００μＬの生理食塩水に溶かし、濃度１０００Ｕ／ｍＬのトロンビン溶液を調製した。これをさらにＨＢＳＳ（＋）で希釈し、２５Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬのトロンビン溶液を調製した。
（２）２４ウェルプレートの各ウェルにＨＢＳＳ（＋）を９００μＬずつ入れた。
（３）細胞積層体を備えるインサートを培地から取り出し、アスピレータを用いてインサートの内側から培地を除去し、ウェルに置いた。
（４）ウェルに置いたインサートの内側に、ＨＢＳＳ（＋）（対照）、２５Ｕ／ｍＬのトロンビン溶液、１００Ｕ／ｍＬのトロンビン溶液のいずれかを２００μＬ添加し、３７℃下で３０分間インキュベートした。
（５）細胞積層体の様子を顕微鏡にて観察した。細胞積層体の顕微鏡像を図９（赤色蛍光：VE-Cadherinと緑色蛍光：α-smooth muscle actinとの重ね合せ画像）に示す。

図９に示すとおり、トロンビン添加により、アクチンストレスファイバーの活性化に伴う細胞収縮の様子が観察された。細胞収縮は、図９の上段に示す矢印方向に観察された。トロンビン濃度が高いほど細胞収縮の度合いが強かった。ＨＣＭの一方の面に血管内皮細胞層を備え他方の面に平滑筋細胞層を備えた細胞積層体は、生体組織と同様に、生理活性物質に反応することが確認された。

２０１７年６月９日に出願された日本国出願番号第２０１７−１１４７５５号の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。

本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書中に参照により取り込まれる。

２多孔膜
４保持部材
６培養容器
１１第一の細胞
１２第二の細胞
２０多孔膜
２２貫通孔
２４隔壁
４０保持部材
４２筒状部
４４突出部
６０培養容器
６２底部
６４側壁部

Claims

底部及び前記底部の外縁から起立する側壁部を有する容器と、開口率が一方の面及び他方の面それぞれ３０％〜７０％である多孔膜と、前記多孔膜を前記容器の内底面に接触しない位置に該内底面に対向させて保持する保持部材と、を用いて、前記多孔膜の両面に細胞層を備える細胞積層体を製造する方法であって、
前記多孔膜が前記保持部材により前記容器の内底面に接触しない位置に該内底面に対向した状態に保持され、且つ、重力方向において前記容器の前記底部が上方で前記多孔膜が下方である状態で、前記容器の内底面と前記多孔膜の表面とに接する液体培地中で第一の細胞を培養すること；及び、
前記多孔膜が前記保持部材により前記容器の内底面に接触しない位置に該内底面に対向した状態に保持され、且つ、重力方向において前記容器の前記底部が下方で前記多孔膜が上方である状態で、前記多孔膜の下側の面で前記第一の細胞を培養し、前記多孔膜の上側の面で第二の細胞を培養すること；
を含み、前記第一の細胞と前記第二の細胞とが別種の細胞である、細胞積層体の製造方法。
前記容器の内底面は、前記第一の細胞が接着しない性質を有する、請求項１に記載の細胞積層体の製造方法。
前記保持部材は、
軸方向の一端に前記多孔膜を保持する筒状部であって、前記容器の内径よりも小さい外径を有し、軸方向の長さが前記容器の前記側壁部の高さよりも短い筒状部と、
前記筒状部の軸方向の他端から径方向外側に突出し、前記容器の前記側壁部の縁に掛かる突出部と、
を備える、請求項１又は請求項２に記載の細胞積層体の製造方法。
前記多孔膜が、ハニカム構造を有する多孔膜である、請求項１〜請求項３のいずれか１項に記載の細胞積層体の製造方法。
前記多孔膜の材質が、ポリブタジエン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ乳酸及びポリ乳酸−ポリグリコール酸共重合体からなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜請求項４のいずれか１項に記載の細胞積層体の製造方法。
前記多孔膜は、少なくとも細胞を培養する表面が、フィブロネクチン、コラーゲン、ラミニン、ビトロネクチン、ゼラチン、パールカン、ニドゲン、プロテオグリカン、オステオポンチン、テネイシン、ネフロネクチン、基底膜マトリックス及びポリリジンからなる群から選択される少なくとも１種によって被覆されている、請求項１〜請求項５のいずれか１項に記載の細胞積層体の製造方法。
前記第一の細胞と前記第二の細胞との２種の細胞が、実質細胞、間質細胞、筋細胞、線維芽細胞、神経細胞、内皮細胞、上皮細胞及びこれらのいずれかに分化する細胞からなる群から選択される２種の細胞である、請求項１〜請求項６のいずれか１項に記載の細胞積層体の製造方法。
前記第一の細胞が、平滑筋細胞又は平滑筋細胞に分化する細胞であり、
前記第二の細胞が、血管内皮細胞又は血管内皮細胞に分化する細胞である、
請求項１〜請求項７のいずれか１項に記載の細胞積層体の製造方法。