KR101621173B1 - 나노스케일의 전달가능한 막의 제조방법 및 그 용도 - Google Patents

Abstract

본원은 상대 습도가 조절되는 폐쇄 챔버에서 폴리머를 스핀 코팅하는 단계 및 상기 챔버의 습도를 조절하는 단계를 포함하며, 상기 습도는 적어도 하나의 과포화된 염 용액을 이용하여 수행되며, 이에 의해 상기 막의 구멍의 밀도가 조절되는, 본원은 비용제성 증기유도된 상분리 방법에 의한 나노스케일의 구멍 및 두께를 갖는 프리스탠딩의 전달가능한 막의 제조방법을 개시한다. 본원은 또한 상기 방법에 의해 제조된 막 및 그 용도를 개시한다. 본원에 따른 막은 다양하며 조절가능한 세포 공배양 분석을 가능하게 하는 공배양 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다. 본원에 따른 공배양 플랫폼은 인비보와 유사한 환경을 제공하여 세포간 예를 들면 암세포 및 상이한 스트로마 세포간의 파라크라인 소통의 정성적 분석이 가능하여, 질환의 치료제 개발에 중요한 주요 인자의 규명에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

나노스케일의 전달가능한 막의 제조방법 및 그 용도 {METHOD FOR PREPARING TRANSFERRABLE NANOSCALE TRANSFERRABLE MEMBRANE AND USE THEREOF}

세포간 상호작용 분석이 가능한 세포 배양 기술에 관한 것이다.

조직내의 세포는 생화학적 또는 기계적 자극에 반응하여 주변 세포와 상호작용을 하거나 또는 세포외메트릭스 (extracellular matrices ECM)와 상호작용하여 조직의 기능 및 항상성을 유지한다. 많은 생물학적 시스템에서, 세포는 직접 접촉 (즉 갭연결, 치밀 (tight) 연결) 또는 수용성 인자의 교환 (즉 사이토카인, 케모카인 및 성장인자를 통한 파라크라인 또는 엔도크라인 신호전달)을 통한 간접적 접촉을 통해 상호 소통 (communication) 한다.

예를 들어 암 발생은 암세포와 주변 다양한 스트로마 세포 (예를 들면 섬유모세포, 근모세포, 면역세포, 중간엽줄기세포) 간의 상호 소통의 결과인 것으로 생각된다. 종양 세포는 성장인자의 분비를 통해 그 스트로마 환경을 계속적으로 조절하며, 이로 인해 스트로마 세포가 파라크라인 방식으로 활성화되어 정상적 조직의 항상성을 와해시켜, 결국 추가의 성장인자 분비와 단백질분해효소의 분비로 이어지도록 한다. 활성화된 스트로마 세포는 또한 성장인자 및 ECM의 분해와 재구축에 관여하는 MMP (matrix metalloproteinases)를 분비하여 종양의 전이를 촉진하게 된다. 이러한 관점에서, 종양과 스트로마 간의 상호적 소통은 원발 종양 부위의 부근은 물론 멀리 떨어진 부위까지로 암의 진행을 촉진하게된다.

따라서 암의 발생 및 전이와 관련된 심도깊은 연구를 위해서는 암세포 및 스트로마세포 간의 파라크라인 상호작용에 대한 연구가 뒷받침되어야 하며, 이를 체계적으로 분석할 수 있는 세포 공배양 플랫폼의 개발이 요구된다.

종전에는 파라크라인 신호전달과 관련된 연구는 주로 상이한 세포간의 간접적 접촉을 매개하는 막으로 분리된 세포 공배양 플랫폼을 이용하여 수행되었다 (Kim, S. et al. A novel culture technique for human embryonic stem cells using porous membranes. Stem Cells 25, 2601-2609 (2007)).

그러나 위와 같은 막 기재의 공배양 시스템의 경우 사이토카인 매개된 세포-세포 상호작용의 분석이 가능하지 않아 관심있는 세포를 인비보와 같은 상황에서 그 기능을 분석할 수 없는 문제점이 있었다 (Karnoub, A. E. et al. Mesenchymal stem cells within tumour stroma promote breast cancer metastasis. Nature 449, 557-U554, (2007)). 이러한 문제점은 주로, 사용된 막 구멍의 밀도가 낮고, 두께가 마이크로미터 단위인 것에 기인하였다. 더구나 두 종류의 상이한 세포주 간의 밀리미터 단위에 달하는 간격은 외부 용액에 의한 사이토카인 및 효소의 희석을 초래하였으며, 불투명한 막은 영상획득 및 특정세포 분석에도 문제점을 초래하였다.

다른 종래 기술에 의하면 조직 배양 기판위에서 세포를 공배양하여 세포간 직접적 상호작용을 연구하였다 (Wallace, C. S. & Truskey, G. A. Direct-contact co-culture between smooth muscle and endothelial cells inhibits TNF-alpha-mediated endothelial cell activation. Am J Physiol - Heart C 299, H338-H346, (2010)). 이러한 방법은 인비보와 다소 유사한 환경을 제공하기는 하지만, 상호오염의 문제, 다양한 상이한 세포주의 이용, 개별 세포주의 분석 등에 있어서 한계점은 물론, 각 세포주에서 분비되는 총 사이토카인의 양을 구별할 수 없기 때문에 수용성 인자의 상대적 합성량을 평가하기 어렵다는 것이다 (Cenni, E., Perut, F. & Baldini, N. In vitro models for the evaluation of angiogenic potential in bone engineering. Acta Pharmacol Sin 32, 21-30, (2011)).

대한민국 등록특허공보 1353633호 (2008년 8월5일 공개)는 세포 배양 방법 및 세포배양 실행 장치에 관한 것으로 배양배지를 순환시키면서 세포를 배양할 수 있는 장치를 개시하고 있다.

따라서 암의 발생 및 전이 등을 포함하는 다양한 생물학적 현상에서 중요한 역할을 하는 세포간 상호작용에 관한 심도깊은 연구를 위해, 이를 체계적으로 분석할 수 있는 세포 공배양 플랫폼의 개발이 요구된다.

세포간 직접 및 간접적 상호작용을 체계적으로 분석할 수 있는 세포 공배양 플랫폼을 제공하고자 한다.

한 양태에서 본원은 비용제성 증기유도된 상분리 방법에 의한 나노스케일의 구멍 및 두께를 갖는 프리스탠딩의 전달가능한 막의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 상대 습도가 조절되는 폐쇄 챔버에서 폴리머를 스핀 캐스팅하는 단계 및 상기 챔버의 습도를 조절하는 단계를 포함하며, 상기 습도는 적어도 하나의 과포화된 염 용액을 이용하여 수행되며, 이에 의해 상기 막의 구멍의 밀도가 조절된다.

본원의 방법에서 막의 두께는 스피닝 속도, 과포화된 염의 농도 및 사용되는 폴리머 및 용매간의 용해도 파라미터에 의해 조절된다. 이러한 조건은 상호 연관적으로 작용하여 막의 두께를 결정한다. 일 구현예에서, 500nm 이하의 나노스케일 막의 제조를 위해서는 용액의 농도 약 4 중량% 이하, 스핀속도는 3000 rpm 이상의 조건이 사용된다.

본원에 따른 방법에 사용될 수 있는 폴리머는 방법에 사용되는 비용제 또는 용제의 유형을 고려하여 결정된다. 사용되는 폴리머의 종류에 따라 용질 흡착, 막의 수성 및 막의 열적 및 화학적 안정성이 결정된다. 비용제성 증기유도된 상분리 방법에서, 폴리머의 종류에 따라 사용될 수 있는 용제 및 비용제가 결정된다. 그리고 용제는 폴리머의 농도와 함께 막의 형성에 있어 중요한 역활을 한다. 이런 관점에서 상기 조건을 만족하는 각각의 특이적 열역학적 특성 및 혼화성을 갖는 다양한 용제, 비용제, 및 용제-비용제 쌍이 사용될 수 있다. 이러한 폴리머의 예로는 이로 제한되는 것은 아니나, 셀룰로스 아세테이트, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아릴로니트릴, 셀룰로식, 폴리비닐리덴플루오리드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리이미드 또는 폴리아미드를 포함하나 이로 제한하는 것이다.

본원에 따른 방법에서 막의 목적하는 구멍크기를 수득하기 위하여, 상대습도가 조절된다. 상대습도는 염을 사용하여 조절될 수 있고, 이러한 상대습도에 의해 구멍의 크기가 조절되며, 이 경우 물이 비용제로 사용된다. 예를 들면 상대습도의 조절을 위해, 상이한 종류의 과포화 염 용액이 사용되며, 이는 수화 정도가 염의 종류에 따라 다르기 때문이다. 일 구현예에서, 과포화된 염은 LiCl, CaCl₂, MgCl₂, KCO₃, NaBr, NaCl, 또는 KCl을 포함하며, 상기 염은 각각 실온에서 11, 29, 33, 43, 57, 75, 또는 85 % RH의 수득에 사용된다. 일 구현예에서, 본 방법에는 하나 이상의 염이 사용되며, 이러한 염은 CaCl₂ 및 KCl 이며, 상대습도는 25%부터 85%까지 점진적으로 또는 단계적으로 증가되며, CaCl₂ 는 상기 상대습도가 25-45% 인 경우에 사용되며, 상기 KCl은 상기 상대습도가 55-85% 인 경우에 사용된다. 일 구현예에서, 상기 상대 습도는 25, 35, 45, 55, 65, 75 및 85%로 단계적으로 증가된다.

본원에 따른 방법에서 상기 상대습도는 실온 (RT) 또는 30℃에서 조절된다.

다른 측면에서 본원에 따른 방법에 의해 제조된 나노스케일의 관통하는 다수의 구멍을 포함하며 두께가 500 nm 이하인 하나 이상의 프리스탠딩 나노스케일 막 및 상기 막에 의해 분리되는 제1 및 제2 챔버를 포함하는 세포배양 장치를 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 장치에 포함되는 상기 제1 및 제2 챔버는 상기 나노스케일 막의 관통하는 다수의 구멍을 통해 소통가능하다. 다른 구현예에서, 상기 제1 및 제2 챔버는 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 제1 챔버는 제1 세포를 포함하며, 상기 제2 챔버는 제2 세포를 포함할 수 있으며, 상기 제1 및 제2 세포는 동일하거나 상이할 수 있으며, 상기 제1 또는 제2 세포는 각각 한 종류의 세포로 구성되거나 또는 제1 세포 및 제2 세포 중 하나 이상은 두 종류 이상의 세포가 혼합된 것일 수 있다.

본원에 따른 장치는 제1 챔버 및 상기 제2 챔버 사이에 하나 이상의 중간 챔버 (intermediate chamber)를 포함하며, 상기 중간 챔버는 상기 제1 및 상기 제2 챔버 각각과 나노스케일 막에 의해 분리된다.

일 구현예에서 본원에 장치에서 상기 중간 챔버는 두 개 내지 열 개를 포함할 수 있다.

다른 구현예에서, 상기 제1, 제2 및 중간 챔버는 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 적어도 하나의 챔버는 동일 또는 상이한 세포 또는 상이한 세포의 혼합물을 포함한다.

다른 구현예에서, 본원의 장치에 포함되는 나노스케일 막의 구멍 밀도는 제곱 센티미터 당 10⁵ 내지 10⁶ 이다.

다른 구현예에서, 본원의 장치에 포함되는 나노스케일 막의 구멍의 평균 크기는 50 내지 100nm이다.

다른 측면에서 본원은 또한 두 종류 이상 세포의 공배양 방법으로, 상기 방법은 두 개 이상의 챔버를 포함하는 본원에 따른 방법에 의해 제조된 나노스케일 막을 제공하는 단계, 상기 나노스케일 막이 두 개 이상 포함되는 경우, 상기 막은 위아래 또는 좌우 방향으로 층으로 배열되고, 상기 각 막에 세포를 씨딩하는 단계, 상기 각 막에 씨딩되는 세포는 동일 또는 상이한 종류이거나, 두 종류 이상의 세포의 혼합 세포이고, 그리고, 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 막의 구멍을 통해 서로 소통가능한 것이다.

일 구현예에서, 배양 중 세포는 치밀연결 또는 갭연결을 포함하는 직접 접촉에 의한 소통, 또는 파라크라인 또는 엔도크라인 신호전달을 포함하는 가용성 인자의 교환에 의한 간접 소통을 통해 소통한다.

일 구현예에서, 본원에 따른 방법에 의해 배양가능한 세포는 동물, 식물, 박테리아 진균류, 이스트 또는 조류 (algae)유래이다. 일 구현예에서 세포는 암세포 또는 스트로마 세포이며, 암세포 및 스트로마 세포는 상이한 막에 씨딩된다.

일 구현예에서, 막의 상대적 위치는 변할 수 있거나, 또는 상기 막 중의 적어도 하나는 새로운 막으로 대체될 수 있으며, 상기 새로운 막은 이미 존재하는 막에 씨딩된 세포와 동일 또는 상이한 것일 수 있다.

다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 방법에 의해 제조된 막, 하나 이상의 세포배양 배지, 하나 이상의 세포 주 및 상기 세포를 공배양하는 안내서를 포함하는 세포 공배양 키트를 제공한다.

본원에 따른 방법은 프리스탠딩이 가능한 투명한 나노구멍크기를 갖는 전달가능한 막 (Transparent, Nanoporous, Transferrable, TNT)의 제조가 가능하다. 본원에 따른 방법에 의해 제조된 막은 다양하며 조절가능한 세포 공배양 분석을 가능하게 하는 공배양 플랫폼으로 유용하게 사용될 수 있다. 본원에 따른 공배양 플랫폼은 인비보와 유사한 환경을 제공하여 세포간 예를 들면 암세포 및 상이한 스트로마 세포간의 파라크라인 소통의 정성적 분석이 가능하여, 질환의 치료제 개발에 중요한 주요 인자의 규명에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본원에 따른 막 또는 막을 포함하는 장치는 상이한 종류의 세포를 동시에 공배양하여 관심있는 특정 세포를 분석할 수 있는 수단을 제공한다. 또한 본원의 TNT 막은 아래 위 또는 좌우의 층으로 배열되어 다양한 세포 분석 및 조직 공학 등의 응용분야에 사용될 수 있다. 예를 들면 줄기세포의 분화, 신경시스템에서의 세포간 소통을 막 구멍의 밀도 및/또는 크기는 물론 함께 배양되는 다른 세포의 종류, 또는 세포의 순서를 세밀하게 조절하면서 분석할 수 있다.

본원에 따른 세포배양 장치는 교차 오염 없이, 다양한 세포를 이용하여 간편하게 세포간 간접적 및/또는 직접적 접촉을 통한 소통 (communication)이 가능한 세포 배양에 유용하게 사용되어 세포간 상호작용을 통한 다양한 생물학적 현상의 규명에 유용하게 사용될 수 있다.

나아가 본원에 따른 공배양 방법 및 장치는 세포간 소통을 통해 세포의 특정 표현형, 특징을 결정짓는 사이토카인과 같은 주요 인자의 규명에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본원에 따른 장치 및 막은 TNT 막을 이용한 공배양을 통해 두 종류 이상의 세포를 동시에 배양하여, 함께 존재하는 세포를 인비보에서와 같이 관찰에 유용하게 사용될 수 있다.

또한 본원에 따른 방법을 이용한 TNT membrane sequential co-culture 방법 은 암세포 진행 연구에 사용될 수 있으며, 신호전달 분자의 스크리닝을 통해 암치료제 표적 분자의 발굴에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 세포를 포함하는 주변인자의 연속적 변화를 통해 줄기세포의 분화 조절 연구에도 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 TNT를 포함하는 세포배양 플랫폼은 세포의 층쌓기 및 층분리가 용이하여, 세포 공배양을 통해 편리하고, 간편하며, 저렴하게 세포간 소통의 상세한 분석에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 비용제성 (물) 증기 유도된 상분리 (VIPS)를 이용하여, 왼편에 기재된 상대적 습도가 조절되는 폐쇄 스핀 코팅 챔버에서 제조된 나노구멍의 프리스탠딩 CA 막의 제조과정을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 1b는 공기 쪽 면 (a), 기질 쪽 면 (b)의 AFM 영상과 공기 쪽 면의 공기 (c) 및 물 (d)과 접촉한 면의 AFM 영상이다.
도 2a는 본원의 방법에 따라 제조된 TNT 막의 특징을 규명한 것으로, 투명성, 나노스케일의 구멍, 및 수성 환경에서 초박의 TNT 막의 전달성을 보여준다.
도 2b는 본원에 따른 막을 이용하여 파라크라인 신호전달 분석을 위한 MDA-MB-231 및 hMSC의 공배양을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 2c는 상이한 RH 조건 (45, 65, 및 85 %)에서 4 중량%의 아세톤 CA용액으로 제조된 TNT 막의 AFM 영상이다. TNT 막에서 구멍의 크기 및 수는 RH로 조절하였으며, 스케일바는 500nm이다.
도 2d는 MDA-MB-231 및 hMSC 간의 사이토카인 매개된 소통에 의해 야기된 RANTES 발현에 미치는 구멍크기의 영향을 나타낸 결과이다.
도 2e는 비용제 액체 유도된 상분리 (LIPS)에 의해 제조된 마이크로포러스의 10 μm 두께의 CA 막의 SEM 영상이다.
도 2f는 막의 두께가 RANTES 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.
도 3a 내지 도 3e는 TNT 막을 층으로 배열하여 이를 암세포와 스트로마 세포간 파라크라인 소통 또는 신호전달 분석에 이용한 것과 관련된 것이다.
도 3a는 TNT 막을 층으로 배열하여 사용하는 세포배양 방법을 사용하여 MDA-MB-231 및 세 종류의 상이한 스트로마 세포를 공배양하는 것을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3b는 루미네슨스 기재 방법을 이용한 사이토카인 분석 결과로, 이 결과는 MDA-MB-231 세포 (M)와 상이한 세 종류의 세포 [hMSC (H), NIH-3T3 (N) 및 C2C12 (C), 각각 MH, MN 로 MC 칭함]를 이틀간 공배양 후, 이의 세포배양 배지로부터 수득한 것이며, 결과는 다수의 독립적인 실험결과이며, means ± standard deviation. (*; P <0.05, ***; P< 0.01)로 나타냈다.
도 3c는 트랜스웰 시스템을 이용한 M의 이동 분석결과로, 560nm에서의 흡광도(O.D)가 이동의 정도를 나타내고, 아래 젤 사진은 M의 비교 침투성 분석을 위한 젤라틴 자이모그래피 결과로, 밴드의 강도는 활성 MMP의 활성정도를 나타낸다.
도 3d는 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)을 이용하여 수득한 상이한 두 종류의 세포주(N: Green 및 M: Red)를 포함하는 다중으로 쌓인 TNT 막의 형광 영상을 나타내고 TNT 상의 세포의 DIC 영상은 광학현미경으로 수득하였다.
도 3e는 TNT 막을 이용하여 다층으로 배열된 세 종류의 상이한 세포주 배양 후 사이토카인 분석 결과를 나타낸다.
도 4a 및 도 4b는 MDA-MB-231 (a) 및 hMSC (b)세포간의 갭연결을 칼세인 AM 염색으로 관찰한 결과이다. 칼세인 AM은 갭연결을 통해서만 전달 될 수 있는 것으로, 갭연결을 통한 직접적 소통이 가능하면, 세포간 물리적 접촉은 없음을 나타낸다.
도 5a 내지 도 5d는 TNT 막을 통한 단백질 확산 결과를 나타낸다.
도 5a는 나노스케일 TNT 막의 두께가 MDA-MB-231 및 hMSC 간의 파라크라인 소통에 의해 촉발된 RNATES 발현/분비에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5b는 세포간의 거리가 RNATES 분비에 미치는 영향을 나타낸다.
도 5c는 TNT 막의 나노스케일 구멍을 통한 단백질의 확산을 나타낸다. 삽입도면은 TNT 막을 통한 모델단백질로 EGF의 확산을 측정하는 실험장치를 도식적으로 나타낸다.
도 5d는 모델단백질로 EGF 단백질을 이용하여 TNT 막의 층의 갯수에 따른 단백질 확산 정도를 나타내는 결과이다.
도 6a 및 6b는 TNT 막을 이용하여 연속적 세포 전달 및 셔플링 분석 (TNT-CTS, cell transfer and shuffling) 결과이다.
도 6a는 암 전이 (metastasis) 및 전이-모방 TNT-CTS 분석을 도식적으로 나타낸 것으로, M을 포함하는 TNT 막은 스트로마 세포 (H, N 또는 C)와 배양된 후에 스트로마 세포를 포함하는 다른 TNT 막층으로 전달되었다.
도 6b는 M 과 하룻동안 공배양된, 스트로마 세포 시스템을 이용한 사이토카인 분석 결과로, H (적색)로 미리 활성화된 M을 N (노란색) 또는 C (청색)으로 옮긴 경우의 결과이다.
도 6c는 N (노란색)로 미리 활성화된 M을 H (적색) 또는 C (청색)으로 옮긴 경우의 결과이다.
도 6d는 C (청색)로 미리 활성화된 M을 H (적색) 또는 N (노란색)으로 옮긴 경우의 결과이다.
도 7a 내지 도 7e는 본원에 따른 막을 포함하는 다양한 장치를 나타낸다.

한 양태에서 본원은 비용제성 증기유도된 상분리 방법에 의한 나노스케일의 구멍 및 두께를 갖는 프리스탠딩의 전달가능한 막의 제조방법 및 이에 의해 제조된 막에 관한 것이다.

본원에 따른 방법은 상대 습도가 조절되는 폐쇄 챔버에서 폴리머를 스핀 캐스팅하는 단계; 및 적어도 하나의 과포화된 염 용액을 이용하여 상기 챔버의 습도를 조절하는 단계를 포함하며, 이에 의해 상기 막의 구멍 크기가 조절된다.

본원에 따른 방법에 의해 제조된 막은 투명하고, 관통하는 나노크기의 구멍을 가지며, 전달가능한 막으로, 두께는 500nm 이하이며, 후술하는 바와 같이 관통하는 나노크기의 구멍을 통해 막에서 배양되는 세포간 소통이 가능하다. 또한 본원의 방법에 따라 제조된 막은 프리스탠딩이 가능하여 지지체와 같은 별도의 기판이 필요하지 않아, 층배열 및 층분리가 용이하다.

비용제성 증기유도된 상분리 방법에 관한 일반적인 사항은 Guillen, Y. Pan, M. Li, and E. M. V. Hoek, Preparation and Characterization of Membranes Formed by Nonsolvent Induced Phase Separation: A Review, Ind . Eng . Chem . Res . 2011, 50, 3798-3817에 기재된 것을 참조할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 막의 두께는 스피닝 속도, 과포화된 염의 농도 및 사용되는 폴리머 및/또는 용매간의 용해도 파라미터에 의해 조절된다. 이러한 조건은 상호 연관적으로 작용하여 막의 두께를 결정한다. 일 구현예에서, 500nm 이하의 나노스케일 막의 제조를 위해서는 용액의 농도 약 4 중량% 이하, 스핀속도는 3000 rpm 이상이의 조건이 사용된다.

본원의 방법에 따라 제조되는 나노스케일 막은 막이 사용되는 구체적 목적에 맞추어 적합하게 제작될 수 있다. 예를 들면 막을 통한 세포간 소통이 가능한 막을 그 두께, 구멍의 크기 및 개수 (밀도)의 조절을 통해 적합한 막을 제조할 수 있다. 일 구현예에서, 본원의 방법에서 막은 약 500nm 이하로 제조되며, 예를 들면 490nm 이하, 또는 480nm 이하 또는 470nm 이하로 제조될 수 있다.

본원에 따른 방법에 사용되는 폴리머는 사용되는 용제 또는 비용제의 종류를 고려하여 선택된다. 폴리머는 생적합성 유기성 폴리머로, 낮은 정전하, 높은 기계적 강도, 및/또는 미세구조의 조절이 쉬운 물성을 갖는 물질이다. 사용되는 폴리머의 종류에는 사용되는 폴리머의 종류에 따라 용질 흡착, 막의 수성 및 막의 열적 및 화학적 안정성이 결정된다. 비용제성 증기유도된 상분리 방법에서, 폴리머의 종류에 따라 사용될 수 있는 용제 및 비용제가 결정된다. 그리고 용제는 폴리머의 농도와 함께 막의 형성에 있어 중요한 역활을 한다. 이런 관점에서 상기 조건을 만족하는 각각의 특이적 열역학적 특성 및 혼화성을 갖는 다양한 용제, 비용제, 및 용제-비용제 쌍이 사용될 수 있다. 이러한 폴리머의 예로는 이로 제한되는 것은 아니나, 셀룰로스 아세테이트, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아릴로니트릴, 셀룰로식, 폴리비닐리덴플루오리드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리이미드 또는 폴리아미드를 포함하나 이로 제한하는 것이다.

본원에 따른 방법에서 막의 목적하는 구멍크기 및/또는 밀도를 수득하기 위하여, 상대습도가 조절될 수 있다. 상대습도는 과포화염을 사용하여 조절될 수 있고, 이러한 상대습도에 의해 구멍의 크기가 조절되며, 이 경우 물이 비용제로 사용된다. 예를 들면 상대습도의 조절을 위해, 상이한 종류의 과포화 염 용액이 사용되며, 이는 수화 정도가 염의 종류에 따라 다르기 때문이다. 일 구현예에서, 과포화된 염은 LiCl, CaCl₂, MgCl₂, KCO₃, NaBr, NaCl, 또는 KCl을 포함하며, 상기 염은 각각 실온에서 11, 29, 33, 43, 57, 75, 또는 85 % RH의 수득에 사용된다. 일 구현예에서, 본 방법에는 하나 이상의 염이 사용되며, 이러한 염은 CaCl₂ 및 KCl 이며, 상대습도는 25%부터 85%까지 점진적으로 또는 단계적으로 증가되며, CaCl₂는 상기 상대습도가 25-45% 인 경우에 사용되며, 상기 KCl은 상기 상대습도가 55-85% 인 경우에 사용된다. 일 구현예에서, 상기 상대 습도는 25, 35, 45, 55, 65, 75 및 85%로 단계적으로 증가된다.

본원에 따른 일 구현예에서는 본원에 따른 실시예에 기재된 바와 같이 유기성 폴리머로서, 셀룰로스아세테이트를 사용한 비용제성 유도된 상분리 방법 및 상대 습도 (RH) 조절을 통해 목적하는 막의 다공성 구조를 수득하였으며, 구체적으로 상이한 종류의 과포화 염 용액으로 패킹된 폐쇄 챔버에서 수증기를 이용하여 상대습도를 조절하여 구멍의 크기를 조절하였다.

본원에 따른 방법에서, 막의 구멍의 크기 및 밀도는 본원에 개시된 내용을 기초로 막이 사용되는 구체적 목적에 맞추어 제조될 수 있다. 일구현예에서는 막의 구멍의 크기는 약 100nm 내지 500nm이다. 막의 크기는 막에서 배양되는 세포의 종류 및 분석하고자 하는 상호작용의 종류에 따라 상이할 수 있다. 예를 들면 세포간 생화학 물질의 전달을 포함하는 파라크라인 신호전달의 경우, 400nm 미만의 구멍 크기가 바람직하고, 세포간 직접 접촉에 상호작용 분석이 필요한 경우에는 적어도 400nm 구멍크기가 바람직하다.

본원에 따른 나노스케일 막의 구멍의 밀도 또한 구체적 목적에 적합하도록 제작된 것이 사용될 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 고밀도의 막이 사용되며 예를 들면 제곱 cm 당 약 10⁶ 내지 약 10¹² 의 밀도가 사용될 수 있다. 특히 제곱 cm 당 약 10⁵ 내지 약 10⁶ 의 밀도가 사용될 수 있다.

다른 측면에서 본원에 따른 방법에 의해 제조된 나노스케일의 관통하는 다수의 구멍을 포함하며 두께가 500 nm 이하인 하나 이상의 프리스탠딩 나노스케일 막 및 상기 막에 의해 분리되는 제1 및 제2 챔버를 포함하는 세포배양 장치를 제공한다.

일 구현예에서 본원에 따른 장치에 포함되는 상기 제1 및 제2 챔버는 상기 나노스케일 막의 관통하는 다수의 구멍을 통해 소통가능하다.

본원에서 세포간 소통이란, 직/간접적 소통을 포함하는 것으로, 직접적 세포간 소통은 갭연결 (Gap junction), 치밀 연결 (tight junction)을 통한 물질 교환 등을 포함하는 세포간 소통이며, 간접적 소통은 분비되는 사이토카인, 케모카인 및/또는 성장인자 등을 포함하는 수용성 인자의 교환 통한 파라크라인 또는 엔도크라인 신호전달을 통한 소통을 의미한다.

본원의 방법에 따라 제조된 막은 본원에 따른 장치가 사용되는 구체적 목적에 적합한 성능 개선을 위해 양쪽 또는 한쪽 표면 및/또는 구멍에 추가의 물질을 포함하도록 변형되거나 또는 코팅될 수 있다. 예를 들면 본원에 따른 일 구현예에서는 세포 부착을 향상시키기 위하여 코팅될 수 있으며, 예를 들면 폴리도파민을 사용할 수 있으며, 기타 Ku, S. H., et al., General functionalization route for cell adhesion on non-wetting surfaces. Biomaterials 31, 2535-2541 (2010))을 참조할 수 있다. 다른 구현예에서는 다양한 생물학적 제제 예를 들면 수용체, 항체, 리간드 또는 세포 표면에 존재하는 물질과 상호작용할 수 있는 저분자, 고분자 화합물 등으로 변형될 수 있다.

본원에 따른 일 구현예에서 본원에 따른 장치는 두 개 이상, 예를 들면 제1 및 제2 챔버를 포함하며, 각 챔버는 층을 이루어 존재할 수 있으며, 각 챔버는 나노스케일 막에 의해 분리되며, 각 챔버는 상기 막에 형성된 구멍을 통해 소통 가능하다.

본원에 따른 장치의 각 챔버의 전부 또는 일부는 세포배양 배지 및 세포간 상호작용 규명을 위해 다양한, 동일 또는 상이한 세포(주) 또는 혼합 세포주를 포함할 수 있다. 각 챔버에 포함되는 세포는 동물, 식물, 박테리아, 진균류, 이스트 또는 앨지(algae) 유래일 수 있으며, 한 구현예에서는 동물 유래의 암세포 또는 스트로마 세포이나, 이로 제한하는 것은 아니다.

본원에 따른 다른 구현예에서 본원에 따른 장치는 제1 챔버 및 상기 제2 챔버 사이에 중간 챔버로 예를 들면 추가의 제3 챔버, 제4 챔버 또는 제5 챔버를 포함하며, 상기 각 챔버는 상기 제1 및 상기 제2 챔버 사이에 위치하며 각각과 나노스케일 막에 의해 분리된다. 일 구현예에서 중간 챔버의 숫자는 2 내지 10개이다.

일 구현예에서는 본원에 따른 장치는 3개의 챔버를 포함하여, 제3 챔버는 제1 챔버 및 제2 챔버 사이에 위치하며, 막에 의해 분리된다.

일 구현예에서, 본원의 장치에 포함되는 막의 밀도는 제곱 cm 당 10⁵ 내지 10⁶ 범위의 밀도를 가지며 구멍의 평균 직경은 약 50-100nm이다.

본원에 따른 나노스케일 막은 하우징 예를 들면 배양 접시 등과 같은 용기에 도입되어 이와 함께 사용될 수 있다.

본원에 따른 하우장은 임의의 세포 배양에 적합한 적절한 물질로 제조될 수 있으며, 예를 들면 유리, 세라믹, 폴리카보네이트, 비닐, 폴리비닐클로라이드, 폴리디메틸실록산, 아크릴, 폴리프로필렌, 폴리에틸렌, 폴리에틸설폰 또는 메탈로 제조될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다.

또한 본원에 따른 장치에 포함되는 하우징은 본원의 장치가 사용되는 구체적 용도에 따라 임의의 구조를 취할 수 있다. 예를 들면 세포배양 또는 원심분리에 사용되는 시험관 등의 형태, 또는 세포배양 플레이트의 형태 등을 취할 수 있거나 또는 유체장치와 연결될 수 있으며, 커버를 포함할 수 있다.

본원에 따른 장치는 임의의 다양한 형태를 가질 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는, 도 7a 및 도 7b를 참조하면, 예를 들면 제1 챔버 및 제2 챔버를 포함하고, 하나 이상의 나노스케일 막은 상기 제1 및 제2 챔버 사이에 위치한다. 이러한 형태의 장치는 전형적으로 플레이트 또는 시험관 및 상기 플레이트 또는 시험관에 위치된 나노스케일 막을 포함하며, 막에 의해 상기 플레이트 또는 시험관이 제1 및 제2 챔버로 나뉠 수 있다. 다른 구현예에서는 상기 제1 챔버 및 제2 챔버 사이에 하나 이상의 중간 챔버 (또는 제3 챔버)를 추가로 포함할 수 있으며, 도 7c 내지 도 7e를 참조할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 두 개이상의 중간 챔버를 포함하며, 각 챔버는 층상구조 형태로 쌓여 사용될 수 있다.

본원의 일 구현예에 따른 도 3a 내지 도 3e를 참조하면 본원에 따른 장치의 각 챔버는 세포 배양 배지를 포함할 수 있으며, 각 나노스케일의 막의 한측 또는 양측에는 동일 또는 상이한 세포가 위치할 수 있다. 본원에 따른 장치를 이용하여 공배양 되는 세포는 막을 통해서만 상호작용하며 각 막에는 단일층으로 존재하며, 이러한 조건을 만족하는 막에서 다양한 배열을 가질 수 있거나, 양면 또는 한 면에 위치할 수 있다.

본원에 따른 장치에 포함되는 다수의 챔버는 그 전부가 세포배양 배지를 포함할 수 있으며, 그 전부 또는 일부의 챔버가 세포(주)를 포함할 수 있다. 세포는 막의 두 면 중 한 면 이상에 위치할 수 있다. 본원에 따른 장치에서 배양되는 세포는 단일층으로 존재하여 막의 구멍을 통해서만 다른 세포와 소통한다.

전술한 바와 같이 세포간 상호작용 분석이 필요한 다양한 세포주가 본원의 장치에 포함될 수 있으며, 예를 들면 본원에 따른 장치의 각 챔버의 전부 또는 일부는 세포배양 배지 및 세포간 상호작용 규명을 위해 다양한, 동일 또는 상이한 세포(주) 또는 혼합 세포주를 포함할 수 있다. 각 챔버에 포함되는 세포는 동물, 식물, 박테리아, 진균류, 이스트 또는 조류(algae) 유래일 수 있다.

또한 조직에서 분리된 일차 세포 또는 확립된 세포를 포함한다. 이러한 세포는 간, 신장, 폐, 위, 이자, 신경, 근육, 세포 및 뼈와 같은 장기의 유래는 물론 다양한 암조직 유래의 세포, 줄기세포 예를 들면 골수줄기세포, 암줄기세포, 중간엽줄기세포, 면역세포 예를 들면 T 세포, 수지상 세포, 항원제시세포, 표피세포 예를 들면 케라티노사이트, 혈관세포 예를 들면 혈관내피세포, 혈관근세포, 신경세포를 포함하나 이로 제한하는 것은 아니다. 확립된 세포로는 예를 들면 HeLa 세포, FL 세포, KB 세포, HepG2 세포, WI-88 세포, MA104 세포, BSC-1 cells, Vero 세포, CV-1 세포, BHK-21 세포, L 세포, CHL 세포, BAE 세포, BRL cells, PAE 세포, MDA-MB-231 세포 또는 이의 조합이 사용될 수 있다.

한 구현예에서는 동물 유래의 암세포 또는 이와 상호작용하는 스트로마 세포 예를 들면 섬유모세포 (Fibroblast), 근모세포 (Myoblast) 및 중간엽줄기세포 (Mesenchymal Stem cell)을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.

세포배양 배지는 사용되는 세포에 맞추어 적절한 것이 사용될 수 있으며, 예를 들면 일반적인 Fisher's medium (Gibco), Basal Media Eagle (BME), Dulbecco's Modified Eagle Media (DMEM), Iscoves's Modified Dulbecco's Media, Minimum Essential Media (MEM), McCoy's 5A Media, 및 RPMI 배지가 사용될 수 있거나, 또는 특수한 배지로서 MyeloCuht™ (Stem Cell Technologies) 및 Opti-Cell™ (ICN Biomedicals) 또는 무혈청배지로서 StemSpan SFEM™ (StemCell Technologies), StemPro 34 SFM (Life Technologies), Marrow-Gro (Quality Biological Inc.)가 사용될 수 있으며, 내피세포의 경우 EBM2 (Bio Whittaker), 골수세포의 경우 McCoy's 5A medium (Gibco) 등이 사용될 수 있으나 이로 제한하는 것은 아니다. 이러한 배지는 혈청, 항생제, 아미노산 및/또는 호르몬 등의 보충제를 포함할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 두 개 이상의 세포를 공배양 하는 방법에 관한 것으로 본원의 방법에 따라 제조된 하나 이상의 나노스케일 막 또는 본원에 따른 장치를 제공하는 단계, 상기 나노스케일 막이 두 개 이상 포함되는 경우, 상기 막은 위아래 또는 좌우 방향으로 층으로 배열되고, 상기 각 막에 세포를 씨딩하는 단계, 상기 각 막에 씨딩되는 세포는 동일 또는 상이한 종류이거나, 두 종류 이상의 세포의 혼합 세포이고, 그리고, 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 막의 구멍을 통해 서로 소통가능하다.

본원에 따른 세포 공배양 방법에서 막의 상대적 위치는 가변적이며, 채용되는 막의 일부 또는 전부를 새것으로 교체할 수 있다. 새로운 막은 기존의 막과 동일 또는 상이한 세포를 포함할 수 있다.

본원에 따른 방법에서 상기 소통은 직접 또는 간접 소통을 포함하는 것이며, 이러한 소통은 앞서 설명한 바를 참조할 수 있다. 일 구현예에서 소통은 세포간 물리적 접촉없는 막을 통한 소통이다. 본원에 따른 방법은 세포 상호작용 및/또는 소통의 분석이 필요한 다양한 세포를 이용하여 수행될 수 있으며, 이에 대하여는 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다. 일 구현예에서 세포는 동물 유래의 암세포 또는 스트로마 세포이며, 암세포 및 이와 상호작용하는 스트로마 세포가 사용된다.

기타 본원의 방법에 사용되는 장치, 나노스케일 막 및 세포의 종류 등은 앞서 언급한 바를 참조할 수 있다.

다른 측면에서 본원은 본원에 따른 세포배양 장치 또는 본원의 방법에 따라 제조된 막을 포함하는 세포 공배양 키트에 관한 것이다. 본원에 따른 키트는 추가로 하나 이상의 세포 배양 배지; 하나 이상의 세포주; 및/또는 키트를 이용한 상기 하나 이상 세포주의 공배양 방법에 관한 안내서를 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예

실시예 1 다공성 프리스탠딩 폴리머 박막 필름의 제조 및 특징 규명

평균 분자량(Mn)이 30,000g/mol (39.8wt% 아세틸 표지 정도)인 셀룰로스 아세테이트 (CA)는 Aldrich에서 수득한 상태로 사용하였다. CA는 아세톤 용매에 4 wt% 농도로 용해하였다. CA 박막 필름의 다공성 구조를 수득하기 위하여, 섭씨 30도에서 상대적 습도 (RH)가 조절되는 폐쇄된 습한 챔버의 자동 스핀 코팅기를 이용하여 회전속도 3000rpm으로 20초 동안 스핀하여 CA 용액을 스핀 캐스팅 하였다. 물은 CA 폴리머에 대하여 비용제성이기 때문에, CA 박막의 다공성 구조는 비용제성 증기 유도된 막 분리 (N-VIPS)로 수득될 수 있으며, 구멍의 숫자는 상이한 종류의 과포화 염 용액으로 패킹된 폐쇄 챔버에서 RH (즉, 수증기압)로 조절될 수 있다 (CaCl₂ 및 KCl: 각각 RH 25-45% 및 55-85% ). 나노구멍을 갖는 CA 막은 습한 환경의 VIPS로 제조되었기 때문에, 45% RH에서 디스크리트한 구멍이 65% RH에서 점차적으로 최대 구멍 밀도를 갖는 잘 디파인된 구멍으로 전환되며, 최종적으로 85% RH에서 바이모달 구멍 형태를 갖게 되었다. 막의 두께는 RH 와 관련없이 500nm에서 유지되었다. CA막의 평균 두께는 동일한 조건에서 제조된 6개의 상이한 막의 평균값이다. CA 막 두께 평균치는 65% RH에서는 482.25nm 이었으며, 표준편차는 6.99nm이었으며, 이는 본원의 방법에 따라 제조된 나노스케일 다공성 막의 매우 균일한 두께를 가지는 것을 나타낸다. 프리스탠딩 CA 박막은 막을 물에 침지한 상태에서 Si 기판에서 벋겨내는 방식으로 쉽게 수득하거나 또한 프리스탠딩 CA 박막 필름은 시료를 충분히 말린 후 CA 코팅된 NaCl 기판을 물에 10분간 침지하여 수득하였다.

막 두께의 영향을 보기위해 다공성의 10-μm 두께의 CA 필름은 비용제성 액체 유도된 상분리 (N-LIPS)를 이용하여 다음과 같이 제조하였다. 20 wt%의 CA 용액을 2-에틸-1,3-헥산디올에 용해 한 후 10μm 측벽으로 제조된 Si 웨이퍼상에 적가하였으며, 블레이드 (Blade) 방법을 이용하여 캐스팅 하였다. 제조한 CA 필름은 물에 1시간 동안 침지한 후 진공에서 12시간 동안 건조하여, 기판으로부터 필름을 분리하였다. CA 필름의 표면 형태는 AFM (diInnova, Veeco Instruments Inc.) 및 FE-SEM (JSM-6701F, JEOL)으로 촬영하였다. CA 박막의 두께는 스텝 높이 측정으로 수득하였다 (AlphaStep IQ (Rev. Al-1), KLA Tencor). 세포 부착을 향상시키기 위하여, CA 막을 우선 도파민 하이드로클로리드(Sigma) 용액에서 16시간 동안 두어 폴리도파민으로 코팅하였다. 도파민 하이드로클로리드는 2 mg/ml의 농도로 10mM 트리스 완충액에 용해하였으며, 용액의 pH는 묽은 NaOH 용액으로 8.5로 조정하였다.

결과는 도 1a 내지 2f에 기재되어 있다. 도 1a는 비용제성 (물) 증기 유도된 상분리 (VIPS)를 이용하여, 왼편에 기재된 상대적 습도가 조절되는 폐쇄 스핀 코팅 챔버에서 제조된 나노구멍의 프리스탠딩 CA 막의 제조과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 도 1b는 공기 쪽 면 (a), 기질 쪽 면 (b)의 AFM 영상과 공기 쪽 면의 공기 (c) 및 물 (d)과 접촉한 면의 AFM 영상이다. 이에 나타난 바와 같이 구멍이 구조가 수성 환경에서도 변하지 않는 것으로 나타났다.

도 2a에 나타난 바와 같이, 본원의 방법에 따라 제조된 막은 프리스탠딩이 가능하며 초박 TNT 막의 투명성, 나노포러스성 및 전이성을 갖는다. 이러한 투명성은 나노미터 스케일의 두께 (482 ± 7 nm) 및 구멍 직경 (≤ 500 nm)에 기인한다. 즉 본원이 방법에 따라 제조된 막은 잘 규정된(defined) 나노크기의 다공성 구조를 갖는 수성환경, 예를 들면 세포 배양 배지와 같은 액체 상태에서 투명성과 전달성과 같은 특유의 특성을 가진다. 도 2c에 나타난 바와 같이 상이한 RH 조건 (45, 65, 및 85 %)에서 제조된 TNT 막의 AFM 영상은 본원에 따른 막은 상대습도의 조절을 통해 구멍크기의 조절이 가능한 것을 나타낸다. 이러한 막은 파라크라인을 통한 세포간 소통에 기능할 수 있음은 도 2d에 기재되어 있다. 도 2d는 MDA-MB-231 및 hMSC 간의 사이토카인 매개된 소통에 의해 야기된 RANTES 발현에 미치는 구멍 크기의 영향을 나타낸 결과로, 고밀도 나노구멍 (50-100nm)의 475 nm-두께의 RH 65 %에 제조된 막의 효과가 가장 좋은 것으로 나타났다. 나아가 기존의 PET (polyethylene terephthalate) 막과 비교하여 고동도의 분비물질 (RANTES)이 본원의 막을 이용한 세포간 소통 실험에서 확인되었다. 또한 도 2e는 비용제 액체 유도된 상분리 (LIPS)에 의해 제조된 마이크로포러스의 10 μm 두께의 CA 막의 SEM 영상으로 이를 이용하여 세포간 소통에 미치는 막의 두께를 RNATES 농도로 확인하였다. 도 2f에 나타난 바와 같이 세포간 소통이 막의 두께로 인한 세포간 거리에 의해 영향을 받는 것을 나타낸다.

실시예 2 본원의 방법에 의해 제조된 막을 이용한 세포 공배양

본원에 사용된 세포는 다음과 같다: MDA-MB-231(ATCC Num. HTB-26), NIH-3T3 (ATCC Num. CRL-1658), 및 C2C12 (ATCC Num. 1772) 세포는 ATCC (American type culture collection)에서 수득하였으며, 인간 중간엽줄기세포(hMSC)는 Merk Millipore (Part # SCC034, MA, USA)에서 구입하였다. 배양은 다음과 같이 하였다. 전이성 유방암 세포주인 MDA-MDA-231은 100 units/ml 페니실린 스트렙토마이신 및 10% 소태아혈청 (FBS)을 포함하는 RPMI 배지 (Gibco, USA)에서 배양하였다. NIH-3T3 및 C2C12 세포는 10% 소태아혈청 (FBS) 및 항생제를 포함하는 DMEM에서 배양하였다. hMSC은 중간엽줄기세포 증폭 배지(SCM015, Merk Millipore, USA)에서 배양하였다. hMSC는 4 내지 8 계대 사이의 것을 사용하였으며, 모든 세포주는 37℃, 5% CO₂.에서 배양되었다.

도 3a는 사이토카인 분석을 위해 실시예 1에서 제조된 TNT 막을 층으로 배열하여 사용하는 세포배양 방법을 사용하여 MDA-MB-231 및 세 종류의 상이한 스트로마 세포를 공배양하는 것을 도식적으로 나타낸 것이다. 세포 공배양을 위한 층 쌓기는 다음과 같이 수행하였다: 유방암 세포 (6.6 X 10⁴ 개) 및 스트로마 세포 (3.3 X 10⁴개)를 2:1의 세포수 비로 투명한, 위에서 제작한 나노포러스의 전이성 (TNT, Transparent, nanoporous, transferable) 셀룰로스 아세테이트(CA)막에 씨딩하였다. 사용된 hMSC는 7 계대 미만의 세포주였다. 세포배양 동안 TNT 막이 뜨는 것을 막기 위하여, TNT 막과 거의 동일한 직경의 스테인레스 링으로 막을 눌렀다. 세포 시딩 4시간 후 (4시간은 CA 막에의 세포 부착에 충분한 시간으로, 전이성 암세포와 스트로마 세포의 직접 접촉이 방지될 수 있다), 암세포가 배양된 막 및 스트로마 세포가 배양된 필름을 클린한 웰에서 쌓아 세포-세포 상호작용을 관찰하였다. 공배양 효과의 보다 면밀한 관찰을 위해, 세포를 37℃, 5% CO₂. 조건에서 2일간 배양하였다.

실시예 3 파라크라인 소통을 통한 세포간 소통 확인

세포간 소통은 도 3a에 나타난 바와 같이 전이성 세포주로 유방암 세포주인 [MDA-MB-231 (M)]와 상이한 세종류의 스트로마 세포인 [hMSC (H), fibroblast NIH-3T3 (N), 및 myoblast C2C12 (C)]를 실시예 1에서 제조된 막을 이용하여 다음과 같이 분석하였다. 암세포는 다양한 엔도크라인 및 파라크라인 신호를 분비하여 MSC를 끌어들이며, Fibroblast와 myoblast는 사이토카인을 분비하여 암세포의 성장과 전이에 기능을 한다 (Nicolini, A., Carpi, A. & Rossi, G. Cytokines in breast cancer. Cytokine & amp ; Growth Factor Reviews 17, 325-337 (2006)). 따라서 4 종류의 상이한 세포주 [전이성 세포주 (M) 및 세 종류의 스트로마 세포주 (H, N 및 C)]를 사용하여 암세포와 스트로마 세포간의 상호작용을 분석하였다. 도 3b에 나타난 바와 같이 루미넥스 비드 기재의 현탁 어레이 시스템을 사용한 세포 층쌓기 공배양 결과로부터 M_bottomH_top 에서 RNATES 농도가 가장 유의적으로 증가하였으며, VEGF 양은 M_bottomN_top 및 M_bottomC_top 에서 증가되는 것으로 나타났다.

실시예 4 사이토카인 분석

상이한 공배양 세포주의 세포 배양 배지에서 루미넥스 비드 기재의 현탁 어레이 시스템을 이용하여 다양한 사이토카인, 케모카인, 및 성장 인자의 농도를 측정하였다. 24시간 후에 배지를 수집하여 조건에 따른 사이토카인의 농도를 측정하였다. 실시예 2와 같이 세포를 공배양하였다. 세포 배양 후에, Milliplex Map (Merk Millipore, MA, USA)를 제조자의 방법대로 사용하여 17개의 상이한 사이토카인[EGF, FGF-2, G-CSF, GM-CSF, IFNγ, RANTES, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, TGFα, TNFα, 및 VEGF]에 대한 분석을 수행하였다. Milliplex Map은 루미넥스를 기반으로 한 것으로 내부에 두 개의 형광 염료로 칼라 코딩된 마이크로구를 사용한다.

요약하면, 시료를 특이적 바이오티닐화된 항체로 코팅된 비드와 인큐베이션한 후, 상기 반응 혼합물을 스트렙타비딘 PE 컨쥬게이트와 인큐베이션하였다. 마이크로구로부터 유래된 신호는 레이저로 검출하며, 레이저는 내부의 염료를 여기시켜 마이크로구 세트를 마킹하게 된다. 6회의 독립적인 실험을 수행하였으며 에러바를 계산하였다. 데이터의 노말라이즈를 위해 MDA-MB-231 세포 배양 배지에서 배경 신호를 수득하고 각 사이토카인의 표준곡선을 수득하였다.

결과는 도 3b에 기재되어 있다. 세포 단독을 이용한 경우, hMSC (H) 세포에서 매우 높은 농도의 RANTES가 검출되었다. NIH-3T3 (N) 및 C2C12 (C) 세포에서는 상대적은 높은 양의 VEGF (vascular endothelial growth factor)가 검출되었다. 공배양의 경우 상당히 증가한 양의 RANTES가 M_botH_top에서 관찰되었으며, 증가한 VEGF는 M_botN_top 및 M_botC_top의 경우에서 관찰되었다. 이러한 결과는 MDA-MB-231에 의한 사이토카인의 유도 및 변화를 나타내는 것으로, 이러한 유도 및 변화는 주변의 스트로마 세포 종류와 밀접하게 관련되어 있으며, 본원의 TNT 막이 세포-세포 소통의 정확한 분석을 위한 공배양 플랫폼으로 작용할 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 5: 세포의 이동( Migration ) 분석

이어 전이성 암세포의 이동 변화를 관찰하였다. 이를 위해 트랜스웰 시스템(ECM 508, Merck Millipore, MA, USA) 및 젤라틴 자이모그래피를 사용하였다.

트랜스웰 시스템 분석의 경우 우선 각 세포주를 세포농도 1.0x 10⁵개의 세포로 CA 필름 상에 배양하고 세가지의 상이한 공배양 조건에서 세포 (유방암 세포 : 스트로마세포의 비 = 2:1, 총 세포 농도. = 1.0 X 10⁵)를 2일 동안 배양하였다. 이어 배지를 수집하여 500μl를 이동분석 키트 (ECM508,Merk-Millipore,USA)의 바닥의 피더트레이에 추가하여 배지의 사이토카인이 암세포의 이동에 미치는 영향을 분석하였다. MDA-MB-231 세포는 37℃,5% CO₂ 조건에서 배양하였으며 10% FBS를 포함하는 RPMI 배지에서 컨플루언시 100% 까지 배양하였다. 이어 상기 세포를 수확하여 1 x 10⁶cells/mL 농도로 현탁한 후 이 중 300μl를 각 웰에 추가한 후 8μm 포어크기의 미세구멍 폴리카보네이트 막을 포함하는 인서트 웰의 상부에 놓았다. 플레이트의 커버를 덮고 37℃, 5% CO₂ 조건에서 24시간 배양하였다. 이동하는 세포는 막의 구멍을 통하여 이동하였으며 바닥 피더 트레이에 로딩된 일부 신호 분자에 반응하여 폴리카르보네이트 막의 바닥에 붙었다. 인서트의 상측으로부터 배지와 세포를 파이펫을 이용하여 조심스럽게 제거하였다. 이어 인서트 챔버를 400μl의 세포 염색 용액을 포함하는 새로운 웰로 옮긴 후, 실온에서 20분간 배양하였다. 이어 챔버를 물로 수회 세정하였다. 이어, 비 이동 세포 층은 면봉으로 제거하고, 염색된 인서트 챔버를 200μl의 추출완충액을 포함하는 새로운 웰에 넣고, 15분동안 실온에 두었으며, 이 과정에서 하측의 염색은 인서트 챔버를 앞뒤로 수회 가볍게 흔들어 제거하였다. 마지막으로 추출된 용액 100μl를 96 웰 플레이트로 옮기고 560nm에서 흡광도를 측정하였다.

젤라틴 자이모그래피 분석은 다음과 같이 수행하였다. 공배양 조건에서 세포 배양 후, 배지를 수집하였다. 자이모그래피 분석은 MMP의 발현을 결정하기 위한 것으로, 모든 조건화 배지를 정량한 후, 시료 완충액을 추가하여 희석하였다. (시료완충액은 0.5M 중 Tris HCl 0.2 M, SDS 4%, Glycerol 40%, Bromophenol blue 0.004%을 포함하였으며, 멀캡토에탄올을 포함하지 않았으며 끓이지 않았다. 위와 같이 준비된 시료를 0.2% 젤라틴 기질을 포함하는 10% SDS-polyacrylamide 젤에 로딩하여 분리하였다. 이어 젤을 2.5% Triton X-100을 포함하는 50 mM Tris-HCl (pH 7.4)에서 세척한 후, 50 mM Tris-HCl (pH 7.4) 완충액으로 세척하고, 이어 50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.02% sodium azide 및 10 mM CaCl₂.을 포함하는 완충액에 인큐베이션하였다. 이어 젤은 탈이온수에 세척하고 0.25% Coomassie Blue로 염색하고, 10% 아세트산을 포함하는 10% 메탄올 용액에서 탈염색하였다.

결과는 도 3c에 기재되어 있다. 이동분석에서, 공배양 시료 (MbotHtop,MbotNtopandMbotCtop) 의 흡광도가 단독 배양 (M,N 및 C) 보다 높은 것으로 나타났으며, 이는 공배양된 세포의 영향으로 인한 MDA-MB-231 세포의 이동을 나타낸다. 종양세포는 침투를 위해 기저 막을 통과해야 하며, 이를 위해 MMP (matrix metalloproteinase) 가 필요하기 때문에 이는 암 전이의 중요 마커로 작용한다. 젤라틴 자이모그래피 분석 결과 도 3c의 젤사진에 나타난 바와 같이 공배양된 MDA-MB-231 및 스트로마 세포에서 단독 배양세포와 비교하여 높은 농도의 MMP가 관찰되었다. 아울러 RNATES는 파라크라인 방식을 통해 암세포의 전이, 침투, 이동을 증가시키며 MMP9의 발현을 증가시키는 것으로 알려져 있다 (Azenshtein, E. et al. The CC Chemokine RANTES in Breast Carcinoma Progression. Cancer Research 62, 1093-1102 (2002)). VEGF 또한 전이, 이동 침투에 중요한 요소로서 스트로마 섬유모세포에서 분비된다 (Mishra, P. et al. Chemokines at the crossroads of tumor-fibroblast interactions that promote malignancy. Journal of Leukocyte Biology 89, 31-39). 이러한 결과는 M_botN_topandM_botC_top 공배양에 의해 상술한 인자의 발현이 증가했으며, 이에 의해 MDA-MB-231 세포의 이동 및 침투가 발생하였음을 나타낸다. 이러한 결과는 본원에 따른 공배양 방법이 세포간 소통을 통해 세포의 특정 표현형, 특징을 결정짓는 사이토카인과 같은 주요 인자의 규명에 유용하게 사용될 수 있음을 나타내는 것이다.

실시예 6: 공배양 세포의 액틴 염색

사층 쌓기를 통한 공배양 후, 세포배양 배지를 수확하고, 세포는 PBS 용액으로 2회 세척하였다. 세포를 이어 4% 포름알데하이드/PBS에서 15분간 고정하였다. 세포를 이어 PBS 용액으로 3회 세척 (각 5분씩)하였다. 비특이적 결합을 막기위해서, 1 % BSA/PBS/0.3 % tween 20으로 15분 처리한 후 PBS 용액으로 세척하였다. 이어 각 층을 분리하여 빈 웰로 옮긴 후 세포를 개별적으로 표지하였다. Phalloidin-Tetramethyl rhodamine isothiocyanate (TRITC) (Sigma-Aldrich, CA, USA) 및 phalloidin-Fluorescein isothiocyanate (FITC) (Sigma-Aldrich, CA, USA)을 5% PBS 용액으로 희석하였다. Phalloidin-TRITC 용액을 MDA-MB-231을 포함하는 웰에 추가하고 Phalloidin-FITC 용액을 세 종류의 스트로마 세포염색에 사용하였다. 이어 세포를 PBS로 2회 세척하였다. 마지막으로 염색한 세포 시료를 마운팅 완충액 (Abcam, United Kingdom)으로 마운트한 후 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경(Nikon, Japan)으로 관찰하였다.

공배양 중에 하층 및 상층 세포간의 교차 오염여부를 확인하기 위하여, 생 유방암 세포주를 염색하였다. 각 플레이트에 염색시약 (BacMam, Invitrogen, USA)을 제조자의 방법대로 이용하였으며, GFP 표지 분자를 살아있는 유방암 세포의 액틴 염색에 사용하였다. 염색 후에 층을 쌓아서 세포 다층을 형성하고 2일 동안 배양한 후 각 층을 분리하여 형광 이미지를 수득하였다.

결과는 도 3d에 있다. 본원에 따른 TNT 막은 투명성으로 인해 인시츄 상태에서 광학현미경 또는 콘포칼 레이저 스캐닝 현미경 (CLSM)을이용하여 각 층의 세포 형태의 모니터링이 가능하다. 또한 다층으로 쌓인 세포 배양 조건에서 영양분 및 산소 구배에 의해 유도되는 세포의 사멸을 관찰한 경우, 본원에 따른 막을 사용한 배양에서 공배양에서 4층에서까지 모든 세포주가 살아있었으며, 공배양에 의한 교차감염도 없었고, 증식도 정상적이었다.

나아가 사이토카인 분석을 수행한 결과 다층에서 세포간 소통이 유지되었음을 나타낸다 (도 3e 참조). 도 3e는 TNT 막을 이용하여 다중으로 쌓인 세 종류의 상이한 세포주 배양 후 사이토카인 분석 결과를 나타내며, 이러한 결과는 본원에 따른 TNT 막을 이용한 공배양에서 세포는 파라크라인 신호전달을 통해 상호 인지하며, 이로 인해 함께 배양되는 세포의 종류의 따라 상이한 양 및 종류의 사이토카인이 분비될 수 있음을 나타낸다. 이러한 본원의 세포배양 플랫폼은 두 종류 이상의 세포를 동시에 배양하여, 함께 존재하는 세포를 인비보에서와 같이 관찰에 유용하게 사용될 수 있다.

실시예 7: TNT - CTS ( TNT membrane - based cell transfer and shuffling ) 분석

본원에 따른 TNT 막을 이용한 전이 (translocation) 및 재배열에 의한 셔플링 분석은 MDA-MB-231 세포와 세 종류의 스트로마 세포간의 상호 소통에 의해 특이적으로 분비되는 사이토카인의 스크리닝을 위해 고안되었다.

우선, 세포를 본원의 TNT 막에 씨딩한 후 다음의 조합으로 층을 쌓았다 [MDA-MB-231과 hMSC / MDA-MB-231과 NIH-3T3 / MDA-MB-231과 C2C12]. 24시간 배양 후에 배지를 수집하여 사이토카인을 분석하였으며, 한 종류의 스트로마 세포와 공배양된 MDA-MB-231 TNT 막을 다른 종류의 스트로마 세포를 포함하는 TNT 막으로 다음과 같이 옮겼다:[hMSC→NIH-3T3, C2C12 / NIH-3T3 →hMSC, C2C12 / C2C12→hMSC, NH-3T3].

결과는 도 6a 내지 6d에 있다. TNT 막의 전달성에 근거한 TNT-CTS 분석을 수행한 결과, 전이성 암세포에 의한 스트로마 세포의 활성 히스토리를 추적할 수 있으며, 전이성 암세포와 스트로마 세포의 순서를 조절할 수 있었다. 이러한 결과는 암세포와 세 종류의 상이한 스트로마 세포의 연속적 공배양을 통해 전이성 세포와 세 종류의 상이한 스트로마 세포간의 전이 과정에서의 연속적(sequential) 신호전달을 통해 복잡한 인비보의 종양 미세환경을 모방하고 단순화하여 체계적인 암연구 수행이 가능한 것을 나타낸다 (도 6a). 동일한 스트로마 세포를 공배양 과정에서 상이한 순서로 배양한 경우 상이한 사이토카인 및 성장인자의 상이한 발현을 관찰 할 수 있었다. 특히 MH에서 생산되는 주요 단백질 종류 및 양은 배양 순서에 따라 크게 변하는 것으로 나타났다. RANTES는 전-배양이 없는 경우는 주요 단백질이었으나 (도 6b), M을 각각 N 및 C와 전 배양한 경우 FGF-2 및 IL-5가 주 단백질인 것으로 나타났다 (도 6c 및 6d).

이러한 본원의 TNT 막을 이용한 연속 공배양 (shuffling, 셔플링)은 활성화된 스트로마 세포에서 오토크라인 신호전달 뿐만아니라 암세포 전이과정에서 상이한 유형의 스트로마 세포의 파라크라인에 의한 연속적 활성화 연구에 유용하게 사용될 수 있다. 나아가 공배양 세포의 종류가 동일한 경우에도 세포의 순서에 따라서 발현되는 사이토카인이 상이한 것으로 나타났다. 예를 들면 FGF-2는 MN 상호작용의 연속효과 하에서 MH에서 증가하였으며, 반면 IL-5는 MC 상호작용의 영향 하에서 MH에서 발현이 증가한 것으로 나타났다. 특히 FGF2 및 IL-5의 농도로부터 연속공배양에서 스트로마 세포 간에 상승작용이 있는 것으로 나타났다 (단독 배양 M과 비교).

이러한 TNT 막 셔플링 공배양 방법은 암세포 진행 연구에 사용될 수 있으며, 신호전달 분자의 스크리닝을 통해 암치료제 표적 분자의 발굴에 유용하게 사용될 수 있으며, 또한 세포를 포함하는 주변인자의 연속적 변화를 통해 줄기세포의 분화 조절 연구에도 유용하게 사용될 수 있다.

본원에 따른 TNT를 포함하는 세포배양 플랫폼은 세포의 층쌓기 및 층분리가 용이하여, 세포 공배양을 통해 편리하고, 간편하며, 저렴하게 세포간 소통의 상세한 분석에 유용하게 사용될 수 있다. 또한 저렴한 비용으로 단순 세포 공배양에도 사용될 수 있다.

실시예 8: 갭연결 ( Junction )을 통한 유방암 세포주 및 hMSC 간의 세포간 소통 확인

전이성 유방암 (MDA-MB-231)을 단지 갭연결을 통해 전달되는 칼세인-AM (2.5 μM, Sigma-Aldrich, CA, USA) 으로 표지하였다. 표지된 유방암 세포는 TNT 막에서 비표지된 hMSC와 함께 공배양하였다. 배양 2일 후에, 칼세인-AM 전달정도는 형광현미경으로 관찰하였다 (Carl Zeiss, Germany; 10x objective lens). 결과는 도 4a 및 4b에 기재되어 있다. 이에 나타난 바와 같이 칼세인 AM은 갭연결을 통해서만 전달 될 수 있는 것으로, 갭연결을 통한 직접적 소통이 가능하며, 세포간 직접적 물리적 접촉은 없음을 나타낸다.

실시예 9: 막을 통해 확산된 표피성장인자 ( EGF )의 정량

막 두께의 증가에 따른 EGF의 나노포러스 막을 통한 확산을 조사하였다. 막 두께 조절을 위해 단층의 TNT 막을 3층, 5층, 및 8층으로 쌓았다. TNT 막 및 쌓인 막을 챔버의 웰 사이에 정치하였으며, 막이 웰을 분리하였다. 이어 EGF 단백질을 포함하는 PBS 용액을 각 웰에 추가하고, 동일 부피의 PBS를 다른 웰에 추가하였다. 단백질 확산은 막의 양 측에 있는 용액 중의 농도 차이로 계산하였다. 섭씨 37도에서 이틀간 배양 후에, 브래드포드 분석법(Bio-Rad, CA, USA)을 이용하여 확산된 단백질을 정량하였다.

나아가 TNT 막을 통한 단백질 확산의 분석을 증명하기 위하여, 장치를 제조하였다. TNT 막은 두 챔버 사이에 위치하며, 챔버는 10% FBS를 포함하는 PBS 중에 80 μg/ml의 EGF (E9644, Sigma Aldrich, USA) (EGF 챔버) 또는 10% FBS를 포함하는 PBS만 포함(완충액 챔버)하였다. EGF는 막을 통해 EGF 챔버에서 완충액 챔버로 확산되었다. 배양시간 증가에 따라 측면에서 챔버 용액 일부를 제거하여 상이한 시간 지점 (1, 3, 6, 12, 및 24 h) 에서의 EGF의 양을 샌드위치 ELISA를 이용하여 정량하였다. 웰의 바닥은 EFG에 대한 토끼 폴리클로날 항체(ab9695, Abcam, Cambridge, England) 로 코팅되어 있었다. 정확한 정량을 위해 표준시료로 0, 1, 5, 10, 50 및 100 μg/ml의 EGF (ab10409, Abcam)를 사용하였다. 각 웰을 TBST 완충액으로 세척한 후 항 마우스 항체-호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)를 2차 항체로 사용하여 분석하고, 발색 기질은 TMB (3,3', 5,5' tetramethylbenzidine) (N301, Waltham, MA, USA)을 사용하였으며, 흡광도는 450nm에서 측정하였다.

결과는 도 5a 내지 도 5d에 기재되어 있다. 파라크라인 신호전달에 미치는 막 두께의 영향은 10μm 두께의 20 중량% CA 막 및 480nm 두께의 4 중량 % CA 막 및 PET 막을 이용하여 측정하였다. 도 5a에 나타난 바와 같이, 65% RH에서 제조된 480nm 두께의 4 중량 % CA 막을 이용한 경우에 가장 많은 RANTES 발현이 관찰되었다. 층쌓기의 층을 늘려 세포간의 사이토카인의 분비에 미치는 거리를 조사한 시험을 통해 세포간 파라크라인 소통의 결과로서 분비된 RNATES 양은 세포간 거리와 강한 상관관계를 나타냈다 (도 5b). 파라크라인 신호전달에서 신호전달 분자는 근접한 위치의 표적세포에 영향을 미치며, 분비세포에서 거리가 멀어질수록 신호전달 분자가 확산되면서 농도구배가 형성된다. 이러한 관점에서 공배양된 세포간의 근접한 거리는 세포간 신호분석에서 중요한 파라미터이고, 본원에 따른 막의 경우 상이한 세포주 간에 마이크로미터 이하의 거리를 유지하는 환경을 제공할 수 있다.

나아가 상술한 바와 같이 하나의 챔버는 EGF를 포함하는 완충액으로 채워져 있고, 다른 챔버는 완충액만 있는 챔버를 사용하여 EGF 확산을 시험한 결과, 막을 가로질러 EGF의 농도구배가 생성된 것으로 나타났으며, 확산된 EGF의 농도는 층의 갯수가 많아 질수록 감소하였다 (도 5c 및 5d). 특히 EGF에 대한 ELSIA 분석 결과 EGF는 6시간 배양에서 포화된 것으로 나타났다. 단백질 농도는 24시간 배양 후에도 동일하였다. 이러한 결과는 본원의 방법에 의해 제조된 나노스케일의 구멍 및 마이크로미터 아래의 두께를 갖는 TNT 막은 다른 챔버에 있는 세포사이에서 단백질을 효율적으로 전달 할 수 있음을 나타내며, 또한 6시간이 막을 통한 단백질 확산에 중요함을 나타낸다. 이러한 결과는 본원에 따른 잘 규정된 다공성의 초박 TNT 막이 세포간 소통의 연구에 중요한 신호전달 물질의 확산에 효과적임을 나타내는 것이다.

이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (22)

1. 비용제성 증기유도된 상분리 방법에 의한 나노스케일의 구멍 및 두께를 갖는 프리스탠딩의 전달가능한 막의 제조방법으로, 상기 방법은 상대 습도가 조절되는 폐쇄 챔버에서 폴리머를 스핀 코팅하는 단계; 및 상기 챔버의 습도를 조절하는 단계를 포함하며, 상기 습도는 적어도 하나의 과포화된 염 용액을 이용하여 수행되며, 이에 의해 상기 막의 구멍의 밀도가 조절되며, 상기 과포화된 염은 CaCl₂ 및 KCl이고, 이 경우 상기 상대 습도는 25%부터 85%까지 증가되고, 상기 CaCl₂ 는 상기 상대 습도가 25-45% 인 경우에 사용되며, 상기 KCl은 상기 상대습도가 55-85% 인 경우에 사용되는 것인 방법.
   
2. 제 1 항에 있어서,
   상기 폴리머는 셀룰로스 아세테이트, 폴리설폰, 폴리에테르설폰, 폴리아릴로니트릴, 셀룰로식, 폴리비닐리덴플루오리드, 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리이미드 또는 폴리아미드인, 방법.
   
3. 삭제
4. 삭제
5. 제 1 항에 있어서,
   상기 상대 습도는 점진적으로 증가되거나, 또는 25, 35, 45, 55, 65, 75 및 85%로 단계적으로 증가되는 것인, 방법.
   
6. 제 1 항에 있어서,
   상기 상대습도는 상온 또는 30℃에서 조절되는 것인, 방법.
   
7. 제 1 항에 있어서, 상기 막의 두께는 스피닝 속도, 폴리머 농도 또는 폴리머의 용제에 대한 용해도 중 하나 이상에 따라 결정되는 것인, 방법.
   
8. 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 의해 제조된 나노스케일의 관통하는 다수의 구멍을 포함하며 두께가 500 nm 이하인 하나 이상의 프리스탠딩 나노스케일 막 및 상기 막에 의해 분리되는 제1 및 제2 챔버를 포함하는 세포배양 장치.
   
9. 제 8 항에 있어서,
   상기 제1 및 제2 챔버는 상기 나노스케일 막의 관통하는 다수의 구멍을 통해 소통가능한 것인, 세포배양 장치.
   
10. 제 8 항에 있어서,
    상기 제1 및 제2 챔버는 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 제1 챔버는 제1 세포를 포함하며, 상기 제2 챔버는 제2 세포를 포함하는, 세포배양 장치.
    
11. 제 10 항에 있어서, 상기 제1 세포 및 상기 제2 세포는 동일하거나 상이하며, 또는 상기 제1 세포 및 제2 세포 중 하나 이상은 두 가지 이상의 상이한 세포의 혼합물인, 세포배양 장치.
    
12. 제 8 항에 있어서,
    상기 장치는 상기 제1 챔버 및 상기 제2 챔버 사이에 하나 이상의 중간 챔버를 포함하며, 상기 중간 챔버는 상기 제1 및 상기 제2 챔버 각각과 나노스케일 막에 의해 분리되는 것인, 세포배양 장치.
    
13. 제 12 항에 있어서, 상기 중간 챔버는 두 개 내지 열 개를 포함하는 것인, 세포배양 장치.
    
14. 제 12 항에 있어서,
    상기 제1, 제2 및 중간 챔버는 세포 배양 배지를 포함하며, 상기 적어도 하나의 챔버는 동일 또는 상이한 세포 또는 상이한 세포의 혼합물을 포함하는 것인, 세포 배양 장치.
    
15. 제 8 항에 있어서,
    상기 나노스케일 막의 구멍 밀도는 제곱 센티미터 당 10⁵ 내지 10⁶ 인, 세포 배양 장치.
    
16. 제 8 항에 있어서,
    상기 구멍의 평균 크기는 50 내지 100nm인, 세포 배양 장치.
    
17. 두 종류 이상 세포의 공배양 방법으로,
    두 개 이상의 챔버를 포함하는 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 나노스케일 막을 제공하는 단계, 상기 나노스케일 막이 두 개 이상 포함되는 경우, 상기 막은 위아래 또는 좌우 방향으로 층으로 배열되고,
    상기 각 막에 세포를 씨딩하는 단계, 상기 각 막에 씨딩되는 세포는 동일 또는 상이한 종류이거나, 두 종류 이상의 세포의 혼합 세포이고, 그리고,
    상기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 세포는 상기 막의 구멍을 통해 서로 소통가능한 것인, 세포의 공배양 방법.
    
18. 제 17 항에 있어서,
    상기 소통은 치밀연결 또는 갭연결을 포함하는 직접 접촉에 의한 소통, 또는 파라크라인 또는 엔도크라인 신호전달을 포함하는 가용성 인자의 교환에 의한 간접 소통인, 세포의 공배양 방법.
    
19. 제 17 항에 있어서,
    상기 세포는 동물, 식물, 박테리아 진균류, 이스트 또는 조류 (algae)유래인, 세포의 공배양 방법.
    
20. 제 19 항에 있어서,
    상기 세포는 암세포 또는 스트로마 세포이며, 상기 암세포 및 스트로마 세포는 각각 상이한 막에 씨딩되는 것인, 세포의 공배양 방법.
    
21. 제 17 항에 있어서,
    상기 막의 상대적 위치는 변할 수 있거나, 또는 상기 막 중의 적어도 하나는 새로운 막으로 대체될 수 있으며, 상기 새로운 막은 이미 존재하는 막에 씨딩된 세포와 동일 또는 상이한 것인, 방법.
    
22. 하나 이상의 세포배양 배지, 하나 이상의 세포 주 및 상기 세포를 공배양하는 안내서를 포함하는 제 1 항, 제 2 항 또는 제 5 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 제조된 막을 포함하는 세포 공배양 키트.

Images