KR101896618B1 - 세포외소포체 추적 관찰 시스템 - Google Patents

세포외소포체 추적 관찰 시스템 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포간 물질 이동 관찰용 미세유체 칩 및 이를 이용한 세포간 물질 이동 관찰 방법에 관한 것으로서, 공여세포 수용부, 세포외소포체 이동부 및 수용세포 수용부를 포함하고, 상기 세포외소포체 이동부는 상기 공여세포 수용부에서 방출되는 엑소좀이 경사 (gradient)에 따라 상기 수용세포 수용부로 이동하도록 상기 공여세포 수용부와 상기 수용세포 수용부와 각각 연통되게 함으로써, 세포간의 세포외소포체 전달 및 세포외소포체 전달에 의한 세포의 변화를 실시간으로 추적 관찰 및 영상화 할 수 있는 세포외소포체 추적 관찰 시스템에 관한 것이다.

Description

세포외소포체 추적 관찰 시스템 {System for transfer and tracking of extracellular vesicles}
본 발명은 세포외소포체의 추적 관찰을 위한 시스템에 관한 것이다.
세포간 정보의 상호교환은 생물의 생명유지 및 항상성 유지에 매우 중요한 것으로, 줄기세포의 성숙, 배 발생 과정의 재생 등과 밀접하게 관련되어 있다.
엑소좀은 세포간 정보의 교환을 위해 물질이동에 기여하는 매개체로서 거의 모든 세포에서 분비되며, 면역조절, 암전이, 신경세포와 신경교세포 사이의 신호 전달 매개체로서 작용하며, 엑소좀을 생체내와 같은 환경을 조성하여 관찰하는 것이 필요하다.
현재까지 세포간의 물질 이동, 엑소좀의 이동을 관찰하기 위한 실험기법으로는 transwell co-culture system이 가장 전통적인 방법으로 사용되어 왔다. 하지만, 이 방법은 엑소좀의 이동을 실시간으로 영상화하여 관찰할 수 없고 세포 배양시 신선한 배지를 계속적으로 공급하는데 한계가 있어 예를 들면 신경분화를 관찰하는 연구를 진행할 때와 같이 장기적인 연구진행 시 큰 제약이 따른다. 이는 또한, 세포와 세포외 기질간의 상호 작용 등을 3차원 형태로 관찰할 수 있는 기술적 제약이 있어 3차원 환경에서의 엑소좀의 행동 패턴 및 이동성을 실시간으로 분석하기 어려운 단점이 있다.
한편, 미세유체 기술은 혈관신생, 면역반응, 암의 전이 등 인체 내 다양한 현상에서 관찰되는 세포간 혹은 세포와 주변환경의 3차원 상호작용, 세포와 세포외 기질 (extracellular matrix) 과의 3차원 상호작용을 고해상도 수준에서 실시간으로 관찰하고 분석할 수 있는 기술이다. 생체환경을 생체외에서 쉽게 모방할 수 있고 다양한 세포-세포와 세포-세포외기질 환경 및 생체 물질 이동을 인위적으로 조절할 수 있기 때문에 원하는 생체환경 조절이 가능하다.
대한민국 특허 제1322798호는 세포배양 어세이에 관한 것으로 스캐폴드 채널과 미세유체 채널의 경계부의 천장면 또는 바닥면에 누출방지부가 연장되도록 함으로써, 세포가 다른 구조물과 먼저 반응하지 않도록 하여 세포배양의 관찰 및 반응시에 정확한 정량화가 가능하고 세포의 상호작용에 대한 연구가 가능한 미세유체시스템을 개시한다.
하지만 인체 내와 비슷한 간질성 흐름 (interstitial flow)이 모사되게 설계하여 생체 내에서 물질이 이동되는 속도와 매우 비슷하게 설계되어 실제 생체내에서의 엑소좀 이동을 그대로 모방한 시스템의 개발이 필요하다.
본원은 세포간 특정 물질 이동을 관찰할 수 있는 미세유체 칩, 시스템 및 방법을 제공하고자 한다.
1. 공여세포 수용부, 세포외소포체 이동부 및 수용세포 수용부를 구비하고, 상기 세포외소포체 이동부는 상기 공여세포 수용부에서 방출되는 엑소좀이 경사 (gradient)에 따라 상기 수용세포 수용부로 이동하도록 상기 공여세포 수용부와 상기 수용세포 수용부와 각각 연통되는, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
2. 위 1에 있어서, 상기 공여세포 수용부와 연통되는 웰 (well)부, 상기 세포외소포체 이동부와 연통되는 웰 (well)부 및 상기 수용세포 수용부와 연통되는 웰 (well)부를 더 구비하는, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
3. 위 1에 있어서, 상기 경사 (gradient)는 상기 공여세포 수용부와 상기 수용세포 수용부에서의 증발량의 차이에 의한 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
4. 위 2에 있어서, 상기 경사 (gradient)는 상기 공여세포 수용부와 연통되는 웰 (well)부와 상기 수용세포 수용부와 연통되는 웰 (well)부에서의 증발량의 차이에 의한 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
5. 위 1에 있어서, 상기 경사 (gradient)는 상기 수용세포 수용부와 상기 공여세포 수용부의 위치에너지의 차이에 의한 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
6. 위 1에 있어서, 상기 경사 (gradient)는 상기 수용세포 수용부와 상기 공여세포 수용부의 내부 압력의 차이에 의한 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
7. 위 1에 있어서, 상기 세포외소포체는 엑소좀 및 미세소포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
8. 위 1에 있어서, 상기 공여세포는 면역세포, 결합조직세포, 혈관세포, 신경조직세포, 암세포, 줄기세포, 및 외래세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나이고, 상기 수용세포는 면역세포, 결합조직세포, 혈관세포, 신경조직세포, 암세포, 줄기세포, 및 외래세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
9. 위 8에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포 (T cell), B 세포 (B cell), 대식세포 (macrophage), 백혈구 (white blood cell) 또는 수지상세포 (dendritic cell)이며, 상기 결합조직세포는 섬유아세포 (fibroblast)이며, 상기 혈관세포는 내피세포 (endothelial cell)이며, 상기 신경조직세포는 신경세포 (neuron) 또는 신경전구세포 (neuronal progenitor cells)이며, 상기 외래세포는 장내세균인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
10. 위 1에 있어서, 상기 세포외소포체 이동부와 상기 공여세포 수용부가 연통되는 부분 및 상기 세포외소포체 이동부와 상기 수용세포 수용부가 연통되는 부분 중 적어도 어느 한 부분에 필터를 구비한, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
11. 위 10에 있어서, 상기 필터는 공극이 1 ㎛인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
12. 위 10에 있어서, 상기 필터는 공극이 0.4 ㎛인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
13. 위 1에 있어서, 상기 세포외소포체 이동부는 투명한 젤로 충진된 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
14. 위 13에 있어서, 상기 젤은 하이드로젤인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
15. 위 13에 있어서, 상기 젤은 알지네이트 (Alginate), 콜라겐 (Collagen), 펩타이드 (Peptide), 피브린 (Fibrin), 히알루론산 (Hyaluronic Acid), 아가로즈 (Agarose), PHEMA (Polyhydroxyethylmethacrylate),　PVA (Polyvinyl alcohol), PEG (Poly(ethylene glycol)), PEO (Poly(ethylene oxide)),　PEGDA (Polyethylene (glycol) diacrylate), 젤라틴 (Gelatin), 매트리젤 (Matrigel),　PLLA (poly(L-lactic acid)),　카복시메틸셀룰로오스 (Carboxymethylcellulose),　SAP,　PHEMA-MMA, 덱스트란 (Dextran) 및 키토산 (Chitosan) 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
16. 위 13에 있어서, 상기 젤은 제1형 콜라겐을 포함하는 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 특정 세포외소포체의 세포간의 이동을 실시간 추적 관찰하기에 적합하다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 엑소좀, 미세소포 등 특정 크기의 세포외소포체를 선별적으로 추적 관찰하기에 적합하다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 생체와 매우 유사한 미세흐름을 인위적으로 유도하여 세포간 세포외소포체 이동을 모사할 수 있다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 미세흐름의 방향 및 속도를 정확히 제어할 수 있다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 미세흐름의 방향 및 속도에 영향을 주지 않으면서 배지를 지속적으로 공급할 수 있어 장기간의 추적 관찰 연구에 적합하다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 미세흐름의 방향 및 속도에 영향을 주지 않으면서 배지를 지속적으로 공급할 수 있어 약물 스크리닝에 적합하다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 개별 세포외소포체의 이동을 각각 추적 관찰하기에 적합하다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 특정 세포외소포체가 어느 특정 세포로부터 방출되어 어떤 경로를 통하여 이동한 후 어느 특정 세포로 전달되었는지를, 개별 세포외소포체 수준에서 그리고 개별 세포 수준에서 추적 관찰하기에 적합하다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 세포외소포체의 전달에 의한 특정 수용세포의 변화 및 그러한 변화를 야기한 특정 세포외소포체를 방출한 특정 공여세포를 세포수준에서 확인 (identify)할 수 있어, 특정 질병, 증상 및 암전이 등을 유발 및 전파하는 세포 (즉, 치료의 타겟이 될 수 있는 세포)를 스크리닝하기에 적합하다.
도 1은 D-F11 세포 유래의 엑소좀에서 miRNA의 농도가 증가된 결과를 나타내는 것이다.
도 1a는 10%의 FBS 및 분화된 F11 (D) 세포를 포함하는 DMEM 중에서 배양된 미분화된 F11 (UD) 세포를 0.5% dFBS 및 1 mM db-cAMP에서 3일간 배양한 후에 이를 위상차 현미경으로 관찰한 결과로 D 세포에서만 신경돌기가 자라나오고 있음을 나타내며, 스케일바는 10마이크로미터이며 (왼편 사진); UD-Exo와 D-Exo에서 엑소좀 마커인 CDS63 and TSG101가 고발현되고 있음을 웨스턴블랏으로 관찰한 결과이다 (오른편).
도 1b는 Nanosight system을 사용하여 UD-Exo와 D-Exo의 분포를 측정한 결과이다.
도 1c는 1 x 107F11 세포의 총단백질에서 측정된 UD-Exo와 D-Exo 총 수를 나타내는 그래프이다.
도 1d는 분화 또는 비분화 F11 세포에서 분리된 엑소좀으로부터 추출된 miRNA에 대한 정량 역전사 PCR을 수행한 결과이다. 72시간째 D-Exo에서 miRNA의 발현은 UD-Exo의 경우보다 높은 것으로 나타났다. 데이터는 3회 실험결과이다 (mean ± s.d), **P < 0.005.
도 2는 트랜스웰 시스템을 이용하여 분화세포 유래의 엑소좀을 미분화 세포로 이동하는 결과를 나타낸다.
도 2a는 GFP-엑소좀 생산 F11 세포를 10% FBS 또는 0.5% 및 1 mM db-cAMP의 존재 중에서 배양한 후 하루 후에 UD (미분화 F11 세포의 GFP엑소좀) 및 D (분화된 F11 세포의 GFP 엑소좀의 Tuj-1에 대하여 면역염색을 수행한 결과이며, 스케일바는 10 및 20 마이크로미터이다.
도 2b는 GFP-엑소좀을 생산하는 F11 세포 (공여 세포)를 DiI-표지된 F11 세포 (수용 세포)를 1:1로 혼합하여 2일간 배양한 결과이다.
도 2c는 GFP-엑소좀을 생산하는 F11 세포 (공여 세포) 및 미분화 F11 세포 (수용 세포)를 공배양하는 트랜스웰 시스템의 모식도이다.
도 2d는 CD63-GFP을 발현하는 UD 또는 D 공여 F11 세포에서 방출된 엑소좀이 공배양 2일째에 인서트 챔버에 있는 미분화 수용 세포인 F11으로 전달되었음을 나타내며, 스케일바는 5 및 20 마이크로미터이다.
도 2e은 미분화 F11/effLuc-miR-193_3XPT 세포 (수용 세포) 및 db-cAMP (공여세포)에 의해 분화된 엑소좀 생산 F11 세포의 트랜스웰 공배양 시스템을 도식적으로 나타내고, 실험결과를 나타낸 것이다. 상기 시스템을 이용하여 신경세포 분화 후 분비가 증가하는 miRNA-193a의 엑소좀 매개 세포간 이동을 관찰 하였다. 수용 세포의 루시퍼라제 활성은 미분화된 F11 세포에서 유의적으로 감소한 것으로 나타났다. 수치는 평균 루시퍼라제 활성 ± s.d 으로 나타냈다.
도 3은 엑소좀에 의해 매개된 miRNA의 전달에 의해 유도된 신경 분화 결과를 나타낸다.
도 3a는 미분화 F11 (UD) 또는 분화된 F11 (D) 세포 (공여 세포)로부터 UD-F11 (수용세포)로의 miRNA의 전달을 관찰하기 위한 공배양 시스템을 도식적으로 나타낸 것이다.
도 3b는 수용 세포에서 신경 마커인 Tuj-1, MAP2 의 발현을 정량 RT-PCR로 관찰한 결과이다. 결과는 3회 실험 결과이고 mean ± s.d.로 나타내고 **P < 0.005이다.
도 3c는 수용체 세포에서 UD 또는 D-F11 세포와의 공 배양 3일 및 5일 후에 Tuj-1, MAP2 마커에 대한 면역 염색 결과로 수용체 세포가 상기 세포로 염색된 결과를 나타낸다. 스케일바는 20 마이크로미터이다.
도 3d는 표적 유전자인 CCKAR 및 CYSLTR1에 대한 miRNA에 대하여 정량 RT-PCR을 수행한 결과로 표적 miRNA가 D-F11 세포와의 공배양 후 3일 및 5일 후에 유의적으로 감소하였음을 나타낸다. mean ± s.d.로 나타내고 **P < 0.005이다.
도 3e는 수용체에서 miR-193의 농도를 UD 또는 D-F11 세포와 공배양 3일 및 5일 후에 정량 RT-PCR로 관찰한 결과로, D-F11과 배양된 경우에만 miRNA의 발현이 증가되었음을 나타낸다. 3회 독립적 실험의 결과이며, mean ± s.d.로 나타내고 **P < 0.005이다.
도 4는 본원에 따른 미세유체 시스템을 이용하여 분화세포로부터 미분화세포로 엑소좀의 이동을 관찰한 결과이다.
도 4a는 본원에 따른 미세유체 시스템의 사진 (왼쪽 위)과 이를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 4b는 하이드로젤이 편입된 미세유체 세포 배양 시스템을 제조하는 과정을 나타낸다. 하이드로젤을 젤 영역으로 주입하고, 공여 세포로서 F11 세포를 미세유-체 채널에 시딩하였다. 공여세포를 db-cAMP 로 처리하고 48시간째에 하이드로젤 편입 F11 세포 (수용 세포)를 중앙 채널에 주입하였다.
도 4c는 F11 세포 (수용 세포)와 배양된 GFP-엑소좀 F11 세포 (공여 세포) 유래의 엑소좀의 이동을 추적한 라이브 영상이다. 엑소좀은 타임랩스 곤포칼 현미경을 이용하여 30초 간격으로 모니터링 하였다. 시간에 따른 공여 세포로부터의 엑소좀의 이동을 나타내고, 스케일바는 50 마이크로미터이다.
도 4d는 젤 영역에서 공여세포로부터 수용 세포로의 엑소좀의 이동을 나타내는 형광 사진으로, 하이드로젤로 편입된 수용 세포가 엑소좀을 취하는 것을 보여주는 타입랩스 영상이며, 스케일바는 50 마이크로미터이다.
도 4e는 하이드로젤로 편입된 수용 세포가 엑소좀을 취하는 것을 보여주는 타입랩스 영상이며, 스케일바는 50 마이크로미터이다.
도 4f 및 g는 도 4e 와 마찬가지로 하이드로젤 내의 수용세포가 엑소좀을 취하는 것을 나타낸 타임랩스 영상을 나타낸 것으로 다양한 세포에서 같은 현상이 나타난다는 것을 보여준다.
도 4h는 본 발명의 일 구현예로서의 미세유체 칩을 사용한 엑소좀 추적 관찰의 각 단계를 나타내는 흐름도이다.
도 5는 엑소좀 매개된 miRNA 전달을 미세유체 세포 배양 시스템을 이용하여 분석한 결과이다.
도 5a는 본원의 일 구현예에 따른 미세유체 공배양 시스템 및 세포를 도식적으로 나타낸 것이다.
도 5b는 분화 (D) 또는 미분화 (UD) F11 세포와 공배양 1일 또는 3일 후에 F11/effLuc-miR-193_3XPT (수용 세포)에서 엑소좀 매개 miRNA의 전달을 생물발광 영상으로 촬영한 것이다.
도 5c는 생물발광 정도를 정량하여 그래프로 나타낸 것으로 D-F11 세포와의 공배양 3일 후에 발광현상이 유의적으로 감소했음을 나타낸다. 3회 독립적 실험의 결과이며, mean ± s.d.로 나타내고 **P < 0.005이다.
도 5d는 공배양 4일째에 하이드로젤과 편입된 수용 세포의 형태를 보여주는 위상차 현미경 사진이다. 스케일바는 100, 250 마이크로미터이며, 신경돌기의 성장은 D-F11과 공배양된 수용 세포에서만 나타났다.
도 5e는 공배양 4일 및 7일 후에 공여 및 수용 세포에서 Tuj-1 and MAP2의 발현을 면역형광 염색으로 관찰한 결과로, 스케일바는 20마이크로미터 이며, 신경마커는 D-F11의 공여 및 수용 세포에서만 발현이 증가되었다.
도 5f는 엑소좀 매개된 miRNA 전달에 의해 상승된 신경 분화를 도식적으로 나타낸 것이다. db-AMP에 의해 유도된 F11 세포가 신경 분화를 유도한다. 분화된 F11 세포는 miRNA를 포함하는 엑소좀을 방출하고, 이는 근방의 미분화 F11 세포가 취한다. 이어 미분화 F11 세포는 엑소좀에 의해 자극되고, 엑소좀에 포함된 miRNA는 표적 miRNA 표적 유전자를 하향 발현시키는 방식으로 신경 분화를 유도한다.
도 5g는 분화된 신경전구세포 (neural precursor cell)로부터 방출된 엑소좀이 미분화 신경전구세포로 전달되어 분화를 유도하는 기작을 나타내는 모식도이다.
도 5h는 신경발생 (neurogenesis) 연구에 본 발명의 일 구현예로서의 미세유체 칩을 활용하는 예를 나타낸다.
도 6은 본원의 일 구현예에 따른 미세유체칩의 사시도이다.
도 7은 도 6의 I-I' 선을 따라 나타낸 사시도이다.
본 발명은 세포간 물질 이동 관찰용 미세유체 칩 및 이를 이용한 세포간 물질 이동 관찰 방법에 관한 것으로서, 공여세포 수용부, 세포외소포체 이동부 및 수용세포 수용부를 포함하고, 상기 세포외소포체 이동부는 상기 공여세포 수용부에서 방출되는 엑소좀이 경사 (gradient)에 따라 상기 수용세포 수용부로 이동하도록 상기 공여세포 수용부와 상기 수용세포 수용부와 각각 연통되게 함으로써, 세포간의 세포외소포체 전달 및 세포외소포체 전달에 의한 세포의 변화를 실시간으로 추적 관찰 및 영상화 할 수 있는 세포외소포체 추적 관찰 시스템에 관한 것이다.
본원은 세포간의 물질의 이동을 살아있는 세포에서 실시간으로 영상화할 수 있는 미세유체 장치 및 이를 이용하여 세포간 물질이동 과정을 신속하고 효율적으로 수행할 수 있는 기술의 개발에 근거한 것이다.
이하 본원의 미세유체 칩에 포함된 구성 및 그에 따른 명칭을 예로 들어 설명하나, 이에 한정되는 것은 아니며, 발명을 이해하고 해석함에 있어서는 상응하는 구성으로 해석되어야 한다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 공여세포 수용부, 세포외소포체 이동부 및 수용세포 수용부를 포함하고, 상기 세포외소포체 이동부는 상기 공여세포 수용부에서 방출되는 엑소좀이 경사 (gradient)에 따라 상기 수용세포 수용부로 이동하도록 상기 공여세포 수용부와 상기 수용세포 수용부와 각각 연통된다.
세포외소포체 (extracellular vesicle, EV)는 세포에서 생성되어 세포 외부로 방출되는 소포체로서, 엑소좀 (exosome) 및 미세소포 (microvesicle) 등을 포함한다. 세포외소포체는 세포간의 신호전달에 관여하는 것으로 알려져 있으며, 세포의 분화, 면역세포 활성화, 염증물질 분비, 암 악성화, 암 전이 등 다양한 현상에 있어서의 신호전달에 관여하는 것으로 알려져 있다. 세포외소포체는 세포로부터 유래한 단백질 및 RNA 등을 포함하고 있는데, 암 등의 특정 질병 세포로부터 유발된 세포외소포체는 해당 질병 특이적인 단백질 및 RNA 등을 포함하고 있어 질병의 진단에도 활용될 수 있다.
공여세포 수용부는 세포외소포체를 방출하는 세포 (공여세포)를 수용하고, 수용세포 수용부는 위의 공여세포에서 방출된 세포외소포체를 받아들이는 세포 (수용세포)를 수용한다. 세포외소포체 이동부는 위의 공여세포 수용부 및 수용세포 수용부와 각각 연통되어 형성되는 것으로서, 공여세포 수용부로부터 수용세포 수용부로의 세포외소포체의 이동을 가능하게 한다.
일 실시예에 따르면, 세포외소포체 추적 관찰 시스템의 세포외소포체 이동부가 공여세포 수용부 및 수용세포 수용부와 각각 연통되기만 한다면, 공여세포 수용부, 수용세포 수용부 및 세포외소포체 이동부의 형태, 방향 및 개수 등은 필요에 따라 다양하게 구현될 수 있다. 예컨대, 일 실시예에 따르면 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 1개의 공여세포 수용부, 1개의 수용세포 수용부 및 이 둘과 각각 연통되는 1개의 세포외소포체 이동부를 구비하는 것일 수 있으며, 각각의 수용부 및 이동부의 형태는 직선 또는 곡선의 채널 형태일 수 있고, 공여세포 수용부, 수용세포 수용부 및 세포외소포체 이동부는 서로 평행하게 나란히 배치된 것일 수 있다. 또다른 일 실시예에 따르면 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 2개의 공여세포 수용부, 1개의 수용세포 수용부 및 2개의 세포외소포체 이동부를 구비하는 것일 수 있으며, 이 때 첫 번째 세포외소포체 이동부는 첫 번째 공여세포 수용부 및 수용세포 수용부와 각각 연통되고, 두 번째 세포외소포체 이동부는 두 번째 공여세포 수용부 및 수용세포 수용부와 각각 연통되는 것일 수 있으며, 각각의 수용부 및 이동부의 형태는 직선 또는 곡선의 채널 형태일 수 있고, 공여세포 수용부, 수용세포 수용부 및 세포외소포체 이동부는 서로 평행하게 나란히 배치된 것일 수 있다. 본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 위에 예시된 형태로 한정되는 것은 아니며, 그 이외에도 필요에 따라 공여세포 수용부, 수용세포 수용부 및 세포외소포체 이동부의 형태, 방향 및 개수 등을 달리하여 구현될 수 있다.
본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 공여세포 수용부와 연통되어 있는 웰 (well)부, 수용세포 수용부와 연통되어 있는 웰부 및 세포외소포체 이동부와 연통되어 있는 웰부를 추가로 구비할 수 있다. 이들 웰부에 배지를 공급함으로서, 공여세포 수용부, 수용세포 수용부 및 세포외소포체 이동부에 배지를 각각 공급할 수 있는데, 이 때 세포외소포체 이동부 내부의 배지의 미세흐름에 영향을 주지 않으면서 반복적 및 지속적으로 배지를 공급할 수 있어, 장기간의 추적 관찰 연구에 적합하다.
세포외소포체 이동부가 공여세포 수용부 및 수용세포 수용부와 각각 연통되는 부분에는 특정 크기의 물질만을 선택적으로 통과시키는 공극을 갖는 필터를 구비할 수 있다. 예컨대, 엑소좀의 이동을 추적 관찰하기 위해서는 공극의 지름이 약 0.4 ㎛인 필터를 구비할 수 있다. 엑소좀보다 크기가 큰 미세소포의 추적 관찰을 위해서는 공극의 지름이 약 1 ㎛인 필터를 구비할 수 있다.
공여세포 수용부에서 방출되는 세포외소포체는 경사 (gradient)가 형성된 세포외소포체 이동부를 따라 수용세포 수용부로 이동한다.
생체 내에는 세포와 세포 사이의 물질 이동을 위한 미세흐름 (interstitial flow)이 존재하는데, 본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 경사 (gradient)에 의하여 세포외소포체 이동부에 배지의 미세흐름을 유도하여 생체 내에서의 미세흐름과 매우 유사한 미세흐름을 유도한다. 따라서, 세포외소포체 이동부에 유도된 이러한 미세흐름에 의한 세포외소포체의 이동은 생체 내에서의 이동을 모사할 수 있다.
경사 (gradient)는 공여세포 수용부와 수용세포 수용부의 증발량의 차이, 위치에너지의 차이, 배지 유입 및 배출 컨트롤 등의 다양한 방법으로 형성될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 공여세포 수용부와 수용세포 수용부의 배지 증발량의 차이를 이용하여 경사 (gradient)를 형성할 수 있다. 예컨대, 수용세포 수용부에서의 배지 (medium) 증발량이 공여세포 수용부에서의 배지 증발량보다 크게 하여, 수용세포 수용부에 형성되는 음압이 공여세포 수용부에 형성되는 음압보다 크게 하여 경사 (gradient)를 형성하고, 이 경사를 따라 세포외소포체 이동부의 배지가 공여세포 수용부로부터 수용세포 수용부로 흐르게 할 수 있다. 공여세포 수용부, 수용세포 수용부 및 세포외소포체 이동부는 배지의 공급을 위한 각각의 웰 (well)부와 연통되어 있을 수 있는데, 이러한 경우에는 각각의 웰부에서의 배지의 증발량을 제어하여 공여세포 수용부, 수용세포 수용부 및 세포외소포체 이동부 각각의 증발량을 차별적으로 제어할 수 있다. 보다 구체적으로는, 각각의 웰부에 담겨진 배지의 표면적의 차이에 의해 증발량을 차별적으로 제어할 수 있다. 예컨대, 각각의 웰부가 모두 수직 원통형인 경우에는 수용세포 수용부와 연통된 웰부의 지름을 공여세포 수용부와 연통된 웰부의 지름보다 작게 하여 증발량을 차별적으로 제어할 수 있으며, 이때 유도되는 미세흐름의 속도는 위의 두 웰부의 개구부의 면적 (담겨진 배지의 표면적)의 차이에 의해 결정된다. 이와 같이, 공여세포 수용부와 수용세포 수용부의 배지 증발량을 조절하여 세포외소포체 이동부의 배지의 미세흐름의 방향 및 속도를 제어할 수 있다.
또 다른 일 실시예에 따르면, 공여세포 수용부와 수용세포 수용부의 위치 에너지의 차이를 이용하여 경사 (gradient)를 형성할 수 있다. 예컨대, 공여세포 수용부가 수용세포 수용부 보다 높은 위치에 있도록 하여 세포외소포체 이동부의 배지가 수용세포 수용부 쪽으로 흐르게 할 수 있다. 이와 같이 공여세포 수용부와 수용세포 수용부의 높이 차이를 조절하여 세포외소포체 이동부의 배지의 미세흐름의 방향 및 속도를 제어할 수 있다.
또 다른 일 실시예에 따르면, 공여세포 수용부와 수용세포 수용부의 내부 압력의 차이 의하여 경사 (gradient)를 형성할 수 있다. 예컨대, 공여세포 수용부와 수용세포 수용부에 배지를 공급할 때, 각각의 수용부에 별도의 펌프 등을 이용하여 배지를 공급하되, 공여세포 수용부의 배지 유입량 및 배출량을 서로 다르게 조절하여 공여세포 수용부의 내부 압력을 조절하고, 수용세포 수용부에서도 배지 유입량 및 배출량을 서로 다르게 조절하여 수용세포 수용부의 내부 압력을 조절하며, 이때, 공여세포 수용부의 내부 압력이 수용세포 수용부의 내부 압력보다 크게 함으로써 공여세포 수용부로부터 세포외소포체 이동부를 따라 수용세포 수용부로 배지의 미세흐름이 형성되도록 할 수 있다. 이 경우 각각의 수용부의 배지 유입량과 배출량의 차이를 조절하여 각각의 수용부의 내부 압력을 제어할 수 있으며, 공여세포 수용부와 수용세포 수용부의 각각의 내부 압력의 차이를 제어하여 세포외소포체 이동부의 배지의 미세흐름의 방향 및 속도를 제어할 수 있다.
본 발명에서의 경사 (gradient)의 형성 방법은 위에 예시된 방법으로 국한되는 것은 아니며, 공여세포 수용부와 수용세포 수용부의 위치에너지, 압력에너지 등을 비롤한 다양한 에너지의 차이를 형성할 수 있는 다양한 방법을 사용할 수 있다.
공여세포 및 수용세포로 사용될 수 있는 세포에는 특별한 제한은 없으며, 다양한 동물 유래 세포 뿐만 아니라 세균 등의 외래 세포 등의 다양한 세포가 사용될 수 있다. 예컨대, 면역세포, 결합조직세포, 혈관세포, 신경조직세포, 암세포, 줄기세포, 외래세포 등이 사용될 수 있다. 또한 예컨대, 면역세포는 T 세포 (T cell), B 세포 (B cell), 대식세포 (macrophage), 백혈구 (white blood cell) 또는 수지상세포 (dendritic cell)일 수 있으며, 그 밖의 다른 면역세포일 수 있다. 또한 예컨대, 결합조직세포는 섬유아세포 (fibroblast)일 수 있으며, 그 밖의 다른 결합조직세포일 수 있다. 또한 예컨대, 혈관세포는 내피세포 (endothelial cell)일 수 있으며, 그 밖의 다른 혈관세포일 수 있다. 또한 예컨대, 신경조직세포는 신경세포 (neuron) 또는 신경전구세포 (neuronal progenitor cells)일 수 있으며, 그 밖의 다른 신경조직세포 및 뇌세포일 수 있다. 또한 예컨대, 외래세포는 장내세균일 수 있으며, 그 밖의 다른 세균 등의 외래세포일 수 있다.
본 발명의 세포외소포체 이동부는 세포외소포체 이동의 실시간 추적 관찰을 가능하게 하기 위하여 투명한 젤 또는 하이드로젤로 충진될 수 있다. 일 실시예에 따르면, 위의 젤 또는 하이드로젤은 알지네이트 (Alginate), 콜라겐 (Collagen), 펩타이드 (Peptide), 피브린 (Fibrin), 히알루론산 (Hyaluronic Acid), 아가로즈 (Agarose), PHEMA (Polyhydroxyethylmethacrylate),　PVA (Polyvinyl alcohol), PEG (Poly(ethylene glycol)), PEO (Poly(ethylene oxide)),　PEGDA (Polyethylene (glycol) diacrylate), 젤라틴 (Gelatin), 매트리젤 (Matrigel),　PLLA (poly(L-lactic acid)),　카복시메틸셀룰로오스 (Carboxymethylcellulose),　SAP,　PHEMA-MMA, 덱스트란 (Dextran) 및 키토산 (Chitosan) 중 적어도 어느 하나를 포함할 수 있다. 예컨대, 세포외소포체 이동부는 제1형 콜라겐 (type I collagen)을 함유하는 투명한 젤 또는 하이드로젤로 충진될 수 있다.
일 실시예에 따르면, 본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 기판의 형태로 구현될 수 있으며, 보다 구체적인 일 실시예에 따르면 미세유체 칩의 형태로 구현될 수 있다. 그러나 본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 기판 또는 미세유체 칩의 형태로만 한정되는 것은 아니며, 필요에 따라 다양한 형태로 구현될 수 있다.
이하, 본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템의 일 구현예를 설명한다. 아래의 내용은 본 발명이 구현될 수 있는 여러 가지 중에서 하나의 구현예일 뿐이며, 본 발명이 아래의 구현예로 한정되는 것은 아니다.
한 양태에서 본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 다음의 구성을 포함하여 구현될 수 있다:
기판 (100); 상기 기판에 형성되고 양 말단에 각각 외부와 소통되는 유입구 (11, 12)가 형성된 제1 채널 (10); 상기 제1 채널의 좌 및 우의 양측 각각에 상기 제1 채널과 일측이 소통가능하게 접하면서 나란히 형성되고, 양 말단에 각각 외부와 소통되는 유입구 (21, 22, 31, 32)가 형성된 제2 (20)및 제3 채널(3)); 상기 제2 및 제 3 채널의 상기 제1 채널과 접하지 않는 측에 상기 제2 및 제3 채널과 소통가능하게 접하면서 나란히 형성된 제4 (40) 및 제5 채널 (50); 및 상기 제4 및 제5 채널의 각각의 양 말단에 액체를 수용할 수 있는 웰 (41, 42, 51, 52)을 포함하며, 상기 제1 채널 및 제2 채널 및 제4 채널; 또는 상기 제1 채널 및 제3 채널 및 제5 채널에서 상기 소통가능하게 접하는 측은 필터로 형성된 것.
도 1을 참조하면, 본원에 따른 미세유체 칩은 직육면체 형상의 기판 (100)에 본원에 따른 채널, 유입구 및 웰이 형성된다. 기판은 본원에 따른 미세유체를 구현할 수 있는 소재로 제조될 수 있다.
본원의 미세유체 칩에 포함되는 각 구성은 광투과성이 있는 투명한 재질로, 사용되는 세포에 대한 독성이 없고 생물활성에 필요한 물질전달이 용이하거나 또는 상기 특징을 갖도록 전 처리된 재질로 제작되는 것이 바람직하다.
본원에 따른 미세유체 칩의 채널층은 고체의 기판 상에 형성될 수 있다. 특히 유리, 석영 또는 실리콘 재질의 기판, 또는 폴리디메틸실록산(poly(dimethylsiloxane); PDMS), 폴리메틸메타아크릴레이트(poly(methyl methacrylate); PMMA), 폴리카보네이트(polycarbonate; PC), 폴리스티렌(polystyrene), 셀룰로스아세테이트(cellulose acetate) 및 폴리에틸렌테레프탈레이트(poly(ethyleneterephthalate; PETP) 등의 고분자가 사용될 수 있다.
본원에 따른 미세유체 칩은 바텀-업(bottom-up) 또는 탑-다운(top-down) 방식으로 제조될 수 있다. 상기 바텀-업 방식은 매우 작은 크기 예컨대 나노스케일의 원자 또는 분자의 결합에 의해 보다 큰 스케일의 구조물을 형성하는 방법을 의미하며, 탑-다운 방식은 일정크기의 구조물을 깎아서 원하는 구조물을 형성하는 방법을 의미한다. 이들의 비제한 적인 예로는 자기조립, 포토리소그래피, 임프린트, 식각, 리소그래피 등이 있으며, 미세유체채널을 형성할 수 있는 것이면 제한없이 사용될 수 있다.
본원에 따른 미세유체 칩은 세포 간 물질 이동을 실시간으로 관찰하는데 유용하게 사용될 수 있다. 예를 들면 분화된 세포 (공여세포, Donor)에서 미분화된 세포 (수용세포, Recipient)로의, 물질의 이동이 발생할 수 있는 세포를 배양하면서, 배양 중의 세포사이에서의 물질의 이동을 실시간으로 관찰할 수 있다.
이를 위해 본원에 따른 미세유체 칩의 제1 채널 (10)은 스케폴드 및 수용(recipient) 세포가 위치한다. 제1 채널에는 양 말단에 각각 하나씩 두 개의 유입구 (11, 12)가 형성되어 있을 수 있다. 유입구는 상기 채널과 소통하는 것으로, 유입구를 통해 채널로 세포, 세포 배양액, 기타 유체 등의 출입이 이루어질 수 있다.
본원에 따른 제1 채널에 사용되는 스캐폴드는 유체 형태로 주입되어 젤화되거나, 젤화된 물질을 일컫는 것으로 세포유래 물질의 이동가능한 공극을 가진다.
이러한 스캐폴드는 알지네이트(Alginate), 콜라겐(Collagen), 펩타이드(Peptide), 피브린(Fibrin), 히알루론산(Hyaluronic Acid), 아가로즈(Agarose), PHEMA(Polyhydroxyethylmethacrylate),　PVA(Polyvinyl alcohol), PEG(Poly(ethylene glycol)), PEO(Poly(ethylene oxide)),　PEGDA(Polyethylene (glycol) diacrylate), 젤라틴(Gelatin), 매트리젤(Matrigel),　PLLA(poly(L-lactic acid)),　카복시메틸셀룰로오스(Carboxymethylcellulose),　SAP,　PHEMA-MMA, 덱스트란(Dextran), 키토산(Chitosan)　중 어느 하나의 재질 또는, 이들 중 둘 이상이 혼합된 재질을 포함하나, 이로 제한하는 것은 아니다.
제2 채널 (20) 및 제3 채널 (30)은 각각 제1 채널의 좌우 양측에 그 일측이 소통가능하게 접하면서 나란히 형성될 수 있다. 제2 채널 및 제3 채널에는 앞서 언급한 젤 (스캐폴드)이 충진되어 있을 수 있다. 아울러 제2 채널 및 제3 채널 각각의 양 말단에 각각 하나씩 두 개의 유입구 (21, 22; 31, 32)가 형성될 수 있다. 유입구는 상기 채널과 소통하는 것으로, 유입구를 통해 채널로 세포, 세포 배양액, 기타 유체 등의 출입이 이루어질 수 있다.
제4 채널 (40)은 제2 채널, 제5 채널 (50)은 제3 채널의 일측 - 제1 채널과 접하지 않는 일측- 과 소통가능하게 접하면서 나란히 형성될 수 있다. 제4 채널 및 제5 채널 중 하나의 채널에는 공여세포가 위치하며, 공여세포가 위치하는 쪽에 형성된 제4 및 제2 채널, 또는 제3 및 제5 채널은 필터를 통해 소통가능하게 접할 수 있다. 제4 채널 및 제5 채널의 각각의 양 말단에 각각 하나 씩 두 개의 웰 (41, 42; 51, 52)이 형성될 수 있다. 웰은 세포 배양을 위한 세포 배지가 들어가는 부분이다.
본원에 따른 미세유체 칩에서 제1 채널을 중심으로 좌 또는 우측편 채널은 필터를 통해 소통가능하며, 필터가 장착되지 않은 나머지 좌측 또는 우측편의 채널이 접하는 측은 작은 기둥이 일정 간격을 두고 형성될 수 있다. 즉, 제1 채널 및 제2 채널 및 제4 채널; 또는 제1 채널 및 제3 채널 및 제5 채널 중 한쪽 편의 소통가능하게 접하는 측은 필터가 형성될 수 있다. 필터는 특정 크기의 물질만을 선택적으로 통과시키는 공극을 갖는 것으로, 예컨대, 엑소좀의 추적 관찰을 위해서는 엑소좀 통과에 적합한 크기의 공극을 갖는 필터를 구비하여 엑소좀보다 큰 물질은 통과하지 못하도록 할 수 있다. 예컨대, 엑소좀의 추적 관찰을 위해서는 공극의 지름이 약 0.4 ㎛인 필터가 사용될 수 있고, 엑소좀보다 크기가 큰 미세소포의 추적 관찰을 위해서는 공극의 지름이 약 1 ㎛인 필터가 사용될 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명의 세포외소포체 추적 관찰 시스템은 본 발명의 일 구현예에 따른 미세유체 칩 및 상기 미세유체 칩에서 배양되는 제1 및 제2 세포를 구비하고, 상기 제1 또는 제2 세포 중 하나는 검출가능한 신호를 발현하며, 상기 검출가능한 신호를 검출할 수 있는 검출기를 구비하는 것일 수 있다. 본원에 따른 시스템에 포함되는 세포, 검출가능한 신호, 검출기는 하기를 참조할 수 있다.
도면을 참조하여 본원에 따른 미세유체 칩의 일 사용양태를 설명한다.
제1, 제2 및 제3 채널의 유입구를 통해, 상기 채널에 스케폴드가 충진된다. 이어 제4 또는 제5 채널 중 한 쪽 채널에 그 유입구를 통해 공여세포를 시딩하고 곧이어 배양배지를 해당 웰을 통해 공급하고, 배지에 공여세포를 분화시킬 수 있는 물질을 추가하여 공여세포가 분화되도록 한다. 이어 제1 채널에 수용세포 또는 미분화된 세포를 시딩하고 공여세포가 시딩되지 않은 채널 (제4 또는 제5 채널 중 공여세포가 시딩되지 않은 채널)에 배지가 공급된다. 이를 통해 분화된 공여세포 (제4 또는 제5 채널)로부터 제2 채널 (또는 제3 채널)을 통해 분화되지 않은 수용세포 (제1 채널)로의 물질이동을 관찰할 수 있다. 공유세포가 포함된 제4 채널 그리고 이와 접하는 제2 및 제1 채널의 측면에는 필터가 설치되어 있어 특정 물질만을 선택적으로 이동할 수 있어, 특정 물질의 이동만을 선택적으로 검출할 수 있다.
본원에 따른 일 구현예에서는 엑소좀의 이동성을 관찰할 수 있게 엑소좀 분비세포 (공여세포)에 엑소좀만을 특이적으로 형광 표지할 수 있는 벡터 CD63-GFP 벡터를 이입시켜 세포내 엑소좀을 형광 표지하고 분비세포와 이동된 엑소좀을 받아들이는 세포 (수용세포 recipient) 를 각각 미세유체 소자의 서로 다른 채널에서 함께 배양시킨 뒤 1) 신경세포로 분화가 유도된 세포에서 분비되어 나오는 엑소좀이 분화전 세포로 이동되는 것을 고해상도 형광 현미경을 이용하여 실시간으로 관찰 함으로써 신경세포 분화 후 분비되는 엑소좀의 이동성을 미세유체 칩에서 관찰할 수 있으며, 엑소좀을 통해 유도된 분화전 세포의 신경분화 촉진 과정을 평가함으로서 엑소좀 매개 신경분화 유도과정을 미세유체칩 환경에서 용이하고 효율적으로 관찰할 수 있다.
또 다른 양태에서 본원은 본원에 따른 미세유체 칩 또는 시스템을 사용한 세포간 물질 이동을 실시간 검출하는 방법에 관한 것이다.
본원에 따른 방법은 공여 및 수용세포를 제공하는 단계; 상기 공여세포에 검출가능한 발광 또는 형광단백질을 코딩하는 유전자 또는 이를 포함하는 벡터를 전달이입하여 발현되도록 하는 단계; 및 상기 수용세포 및 공여세포를 소통가능하게 배양하는 단계로, 상기 배양은 상기 수용세포를 중앙에 배치하고, 상기 수용세포의 양측에 상기 수용세포 및 공여세포 사이에 세포 유래의 물질이 이동가능한 스캐폴드가 위치하고, 상기 스캐폴드의 일 측에는 공여세포를 배치하고, 다른 일측에는 세포 배양 배지를 배치하는 방식으로 배양되며, 상기 수용세포는 상기 스캐폴드 중에서 배양되며, 상기 배양 단계에서, 상기 공여세포에서 발현되는 발광단백질의 수용세포로의 이동 경로를 추적하는 단계를 포함한다.
본원에 따른 방법에서 공여세포에서 물질의 전달에 관여하는 엑소좀과 같은 세포 소기관은 형광 또는 발광 물질로 표지되어, 엑소좀을 통한 물질의 이동을 실시간으로 관찰할 수 있다. 본원에 따른 일 구현예에서는 공여세포를 엑소좀을 특이적으로 표지할 수 있는 벡터를 이용하여 전달이입하여 사용된다. 엑소좀 특이적 표지 및 전달이입과 관련되서는 본원 실시예에 기재된 바를 참고할 수 있다.
공여세포의 엑소좀은 미세유체 칩의 제1 채널을 중심으로 좌측 또는 우측에 시딩되어, 그로부터 다른 방향으로 이동을 하며, 이동하는 엑소좀은 이로부터 방출되는 형광 또는 발광 신호를 통해 실시간으로 검출될 수 있다.
본원에 따른 미세유체 칩, 시스템 및 방법은 엑소좀 특이적 필터 및 스케폴드의 공극을 변화시켜 엑소좀 특이적으로 세포간의 이동을 관찰할 수 있으며, 또한, 정적 조건에서 크기가 다른 웰들을 인위적으로 확보하고, 각각의 reservoir에서의 서로 다른 증발량과 그로 인한 표면장력 차이를 이용하여 생체와 매우 유사한 미세흐름을 인위적으로 유도할 수 있는 장점이 있다.
또한 본원에 따른 미세유체 칩을 이용할 경우 세포간에 이동하는 엑소좀을 형광 표지하면 3차원 환경에서 세포와 주변환경과의 상호 작용하는 엑소좀을 실시간으로 추적할 수 있고 배지의 증발로 인해 발생하는 문제에 대해 세포와 엑소좀 이동에 관여하는 미세흐름에 영향을 최대한 주지 않도록 설계하여 배지를 매일 공급할 수 있어 장기간 관찰 해야 하는 연구에도 적합하다. 특히 신경계 질환 치료 연구시 분화가 유도 된 신경 줄기세포에서 분비되는 엑소좀이 주변의 손상을 입은 세포에 전달되어 세포의 회복을 유도하는 기능을 평가하는 연구에도 장기적인 관찰 시간이 필요하기 때문에 장기적으로 세포간 물질의 이동을 평가하는 연구에도 활용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예
Microarray Analysis
Trizol 을 이용하여 Ngn1 이 처리되어 신경세포로 분화된 F11 세포로부터 모든 RNA를 분리한다. 대조군과 실험군 RNA를 위해 GenoExplorerTMmiRNALabelingKit를 이용하여 타겟 miRNA 의 probe의 합성과 혼성결합을 수행한다. 5-말단이 노출된 RNA 의 biotin 표지를 위해 총 RNA의 5~10μg 을 Enzyme L을 이용하여 37℃에서 3시간동안 표지하였다. Biotin 이 표지된 RNA 는 동일 볼륨의 Hyb buffer 와 섞어 5분간 끓인 후 GenoExplorerTMmiRNABiochip에 넣어 준다. 혼성결합은 LifterSlipTM을 이용하여 42℃에서 16시간 동안 수행되어진다. 혼성결합 반응 후에는 첫 번째 워싱을 하고 microarrays를 돌려서 말리게 된다. 형광 염료 염색을 위해 SA-S (streptavidin-stain) 염료를 biotin이 표지된 RNA와 혼성결합된 칩 위에 넣은 후 25℃에서 30분 동안 반응 시킨다. 마지막으로 혼성화된 microarray는 워싱하여 비 특이적인 결합을 제거하고 말린 뒤 GenePix 4000B scanner로 스캔한다. 혼성화된 이미지들은 GenePix Software로 정량화 되었다. 모든 결과의 보정과 유전자 변화 비율의 선별은 GeneSpringGX 7.3로 시행하였다. 보정된 비율의 평균은 보정된 대조군 채널의 intensity의 평균으로 보정된 실험군의 채널 intensity의 평균을 나눈 값으로 계산하였다.
Gene Annotation Analysis.
선별된 miRNA의 타켓 유전자에 대한 기능적인 주석은 Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery (DAVID 6.7) 를 조사함으로써 진행되었다. 기능적인 주석에 대한 카테고리는 Gene ontology (GO) 와 단백질간의 상호작용, 분자적인 기능, 세포의 조성, 단백질의 기능적인 도메인, 생물학적인 pathway 등을 포함한다. 이 프로그램은 각 리스트의 주석 용어와 그와 관계된 유전자들을 나열한 기능적인 주석을 제공한다. 유전자들의 중복 포함을 피하기 위해 DAVID gene IDs를 기초하는 Fishers exact test가 계산방법으로 사용하였다.
세포 배양 및 전달이입
rat dorsal root ganglion 과 mouse neuroblastoma hybrid 세포인 F11 세포와 HeLa 세포를 10% FBS 1% 항생제를 포함한 DMEM 에 함께 배양을 하였다. 이 세포들은 37℃, 5% CO2상태에서 배양되었다. HeLa 세포는 24 well plate 에 배양 후 Lipofectamine2000을 사용하여 pRV-effluc-miR-193a_3XPT 리포터 유전자와 화학적으로 변형된 miRNA-193 와 miRNA-scr 등과 같이 세포에 처리 되었다. 벡터들이 처리된 세포는 DMEM 10% FBS 메디아에 2일간 배양되었다. miR-193a에 대한 3개의 결합 부위를 가지는 effLuc을 발현하는 F11 세포는 레트로 바이러스 감염을 통해 만들어졌다. 신경세포 분화를 유도하기 위해 F11 세포는 1 mM db-cAMP 이 함유된 DMEM 0.5% FBS를 처리하거나 miR-193a을 Lipofectamine2000을 사용하여 처리 하였다.
역전사 정량 PCR
Trizol reagent (Invitrogen) 와 mirVana™ miRNA Isolation Kit을 이용하여 분화가 유도된 F11 세포로부터 총 RNA를 분리 하였다. 그리고 Nanodrop-1000 Spectrophotometer을 이용하여 농도 측정을 하였다. 1μg/ml 의 총 RNA는 qRT-PCR 분석을 위해 역전사 과정을 거쳤다. qRT-PCR은 Table 2에 명시한 신경 특이적인 마커와 miR-193a의 타겟 유전자에 대한 프라이머를 이용하여 수행하였다. PCR반응은 TaKaRa SYBR Green Master mix 시약을 이용하여 ABI　7500에서 수행되었다. 각 실험 샘플에 대한 보정을 위해 β-actin을 보정용 컨트롤로 사용하였다. miRNA 에 대한 역전사 반응은 miRNA 1st-strand cDNA synthesis kit를 이용하여 진행하였고 특정 miRNA의 발현 조사를 위해 TaKaRa SYBR Green Master mix를 이용하였다. U6 snRNA를 내부 대조군으로 사용하였다. Exosomal miRNA는 ExoMir™ PLUS Kit를 사용하여 분리하였고, 분리된 miRNA는 miRNA 1st-strand cDNA synthesis kit를 통해 역전사 과정을 거쳤으며 TaKaRa SYBR Green Master mix를 이용해 특정 miRNA에 대한 발현을 조사하였다. U6 snRNA를 내부 대조군으로 사용하였고 모든 실험은 세 번 반복 실험 하였다.
면역형광 염색
F11 cells은 실온에서 4% paraformaldehyde (PFA) in PBS 에서 15분 동안 고정 된 다음 PBS로 3번 워싱 하였다. 세포의 투과성을 높이기 위해 0.5% Triton X-100 in PBS를 이용하여 4℃에서 5분간 반응 시켰다. 각 샘플들은 PBS로 워싱해주었고, 비특이적인 결합을 막기 위해 1% normal goat serum in PBS을 이용하여 실온에서 1시간가량 블록킹을 시켜줬다. PBS에 희석된 각 항체들 Anti- rabbit Tuj-1 (1:1300 dilution; Sigma), anti-rabbit NeuroD (1:500 dilution; Abcam), anti-rabbit MAP2 (1:1000 dilution; Sigma), anti- rabbit GAP43 (1:2000 dilution; Sigma), and anti- rabbit PSD-95 (1:100 dilution; MILLIPORE) 위의 항체들을 이용하여 각 샘플들을 4℃에서 다음날까지 반응을 시켰다. 각 샘플들은 2차 항체인 Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit을 이용하여 실온에서 1시간 가량 반응 시켰다. DAPI 를 이용하여 핵을 형광 염색 하였다. microfluidic device에서 3차원으로 배양된 F11 cells은 실온에서 4% PFA-PBS를 이용하여 15분간 반응시켜줬고 PBS로 3번 워싱하였다. 고정과정을 거친 후에 세포들을 투과성을 높이기 위해 0.5% Triton X-100으로 5분간 반응시킨 후 PBS로 3번 워싱하였다. 그리고, 1% normal goat serum in PBS로 실온에서 1시간 반응시켜 블록킹을 시켜주었다. Anti- rabbit Tuj-1 (1:1300 dilution; Sigma), anti- rabbit MAP2 (1:1000 dilution; Sigma) 의 항체를 이용하여 4℃에서 다음날까지 반응을 시켰다. 그리고, 2차 항체인 Alexa Fluor 488-conjugated anti-rabbit을 이용하여 4℃에서 다음날까지 반응을 시켰다. DAPI를 이용하여 핵을 형광 염색 하였다. 형광 이미지들은 confocal laser scanning microscope을 이용하여 촬영하였다.
In vitro 루시퍼라제 분석
세포들은 PBS로 워싱한 다음 lysis buffer를 이용하여 용해 되었다. 세포의 용출물은 96 well plate에 모아진 후 luciferase assay kit를 이용하여 luciferase assay를 시행하였다. 각 세포의 생물 발광 정도는 luminometer를 이용하여 측정하였다. 각 assay는 3번 반복실험을 시행하였으며 Luciferase 활성 정도는 단백질 양으로 정량하였다.
엑소좀 분리 및 특징 규명
엑소좀이 제거된 FBS는 4℃에서 150000 × g 로 16시간 초원심 분리를 통해 준비하였다. F11 세포는 DMEM 10% dFBS (엑소좀 제거된 FBS)에서 2일간 혹은 1mM db-cAMP를 함유한 DMEM 0.5% dFBS 에서 3일간 배양되었다. 세포와 잔해들은 4℃에서 500 × g 로 10분 그리고 3000 × g 에서 20분 동안 원심 분리 함으로써 제거하였다. 그리고, 엑소좀은 4℃에서 150000 × g 로 2시간 동안 초원심 분리 함으로써 분리하였고 분리된 엑소좀은 PBS에 녹였다. 단백질은 bicinchoninic acid assay를 통해 측정하였다. Nanoparticle tracking analysis (NTA) system을 이용하여 엑소좀의 사이즈 및 입자의 개수를 측정하였다.
엑소좀 및 세포의 형광 염색
F11 cells (0.8 ×105cellsperwell)은 24-well plates에 준비 하였고 CD63-GFP 벡터를 Lipofectamine2000를 이용하여 F11 세포에 처리 하였다. 벡터가 처리된 세포는 DMEM 10% FBS 나 1mM db-cAMP를 함유한 DMEM 0.5% FBS에 2일간 배양 되었다. F11 세포는 CM-DiI cell labeling solution을 처리하여 37℃ 에서 5분, 그리고 추가적으로 4℃에서 15분 반응시켜 세포를 형광 염색 하였다. 형광 염색된 F11 세포는 CD63-GFP 벡터가 처리된 세포와 함께 준비하여 배양한다. 형광 영상 이미지들은 confocal laser scanning microscope을 이용하여 촬영한다.
트랜스웰 분석
엑소좀의 이동을 관찰 하기 위해, 0.4-μm pore 사이즈의 PET membrane를 가지는 transwell chambers를 사용하였다 (CORNING). GFP-exosome을 생산하는 F11 cells (0.8 × 105cellsperwell)을 아래쪽 well에 배양하고 위쪽 챔버에는 F11 세포를 배양시킨 뒤 두 개의 세포를 같이 3일간 배양 시켰다. 엑소좀 매개 miR-193a의 이동을 확인하기 위해 F11 세포를 아래 챔버에 넣은 후 DMEM 10% FBS 혹은, 1mM db-cAMP이 첨가된 DMEM 0.5% FBS 에 2일간 배양 시켰다. 이틀 후, 1mM db-cAMP 가 처리된 세포는 PBS로 워싱을 하였고 DMEM 0.5% FBS로 메디아를 갈아주었다. F11/effLuc-miR-193_3XPT cells을 위쪽 챔버에 넣은 후 아래쪽 챔버에 있는 세포와 함께 3일간 배양 하였다. 분화한 세포로부터 분비되는 엑소좀에 의한 신경세포 분화를 관찰하기 위해 F11 세포는 아래쪽 챔버에 깔고 DMEM 10% FBS 혹은, 1 mM db-cAMP 이 첨가된 DMEM 0.5% FBS에 2일간 배양 시켰다. 1mM db-cAMP가 처리된 세포는 PBS로 워싱을 하였고 DMEM 0.5% FBS로 메디아를 갈아주었다. F11 세포는 위쪽 챔버에 깔고 아래쪽 챔버에 있는 세포와 각각 3일과 5일동안 같이 배양시켰다. 모든 실험은 3번 반복 시행하였다.
웨스턴 블랏 분석
RIPA buffer로 세포를 용해 시킨 후 12,000 rpm 에서 30분간 원심 분리하여 세포 잔해를 제거하였다. 단백질 농도는 BCA assay를 통해 측정하였다. 동일양의 단백질을 SDS-PAGE로 분리하였고 PVDF membranes로 단백질을 이동시켰다. 단백질을 이동시킨 membrane은 1차 항체로 anti-rabbit KRAS, PLAU, CCKAR, CYSLTR1 and GALR1 (1:1000 dilution; Abcam) and exosomal markers such as anti-mouse TSG101 (1:1000 dilution; Abcam), anti-rabbit CD63 (1:1000 dilution; Santa Cruz biotechnology), and the ER membrane marker, anti-rabbit Calnexin (1:1000 dilution; Abcam) 4℃에서 다음날까지 반응 시켰다. 그리고 나서 Membranes은 HRP 가 합성된 2차항체를 사용하여 실온에서 2시간 반응하였다. 단백질은 chemiluminescence detection system을 이용하여 시각화 하여 확인 하였다. 단백질 밴드는 AlphaView Software를 이용하여 정량화 하였다. 모든 실험은 3번 반복실험을 시행하였다.
미세유체 세포 배양 장치 제작
Microfluidic Device의 제작: Microfluidic Device는 microchannel-patterned PDMS를 유리 커버슬라이드에 붙여서 제작 하였다. photoresist SU-8은 주요 형틀로 사용되었고, soft-lithography process를 따라 제작 되었다. PDMS는 경화제와 같이 10:1 의 비율로 믹스 한 뒤 80℃에서 1시간 30분 동안 구워졌다. 구워진 PDMS는 웨이퍼로부터 분리해 내고 punches를 사용하여 각 reservoir를 뚫어 주었다. PDMS와 유리 커버슬립은 산소 plasma 가공을 통해 두개를 본딩하고 멸균을 시킨 뒤 80℃ 에 보관하여 microchannel 표면의 소수성인 특성을 회복시켰다.
미세유체 칩을 이용한 F11 세포 공배양 : Collagen type 1 hydrogel을 2개의 젤 채널에 주입한 뒤 30분 동안 젤을 굳힌다. 배지는 세포를 microchannel에 시딩하기 전에 미리 채워 놓았다. F11 (donor) 세포는 왼쪽 세포 채널에 넣어 준비하고 오른쪽 세포채널에는 일반 배지로 채워 놓았다. 세포가 바닥에 붙은 후 분화를 시킬 donor 세포 그룹만 분화 배지로 DMEM (0.5% FBS 및 1mM db-cAMP 포함)로 바꿔 준 후 배양하였다. F11 세포 (수용세포)을 포함하는 스케폴드로서 type 1 collagen hydrogel 은 가운데 젤 체널에 주입 후 37℃ in 5% CO2에서 30분간 반응시켜 3차원으로 배양할 수 있게 준비하였다. type 1 collagen solution 과 함께 주입하는 세포의 양은 1 × 106cells/mL이었다. Hydrogel 은 PBS 와 3차증류수로 희석시켜 2 mg/mL 의 양으로 만든 후 0.5 N NaOH 을 이용하여 pH 7.4 으로 맞춰 사용하였다.
타임랩스 엑소좀 영상 촬영
F11 (donor) 세포는 제1 채널을 중심으로 왼쪽편의 세포 채널에 넣어 준비하고 오른쪽 편의 세포채널에는 일반 배지로 채웠다. 세포 부착 후에 공여세포에 Lipofectamine2000 을 이용하여 CD63-GFP (System Biosciences) 를 처리하였다. 벡터가 처리된 세포는 DMEM supplemented with 10 % 에서 2일동안 배양하였다. F11 (수용세포) 는 1 × 106cells/mL의 양으로 콜라겐 용액과 같이 젤 채널에 주입한 뒤 37 °C in 5% CO2에서 30분간 반응시켜 3차원 환경을 만들어 주었다. 실시간 세포 영상 촬영을 위해 세포는 37℃ in 5% CO2에서 유지 되었다. 엑소좀은 30초 간격으로 time-lapse confocal microscopy를 이용하여 촬영되었다. 형광 영상은 NIS-Elements Viewer 를 이용하여 재구성하였다.
생물발광 영상(Bioluminescence imaging)
F11 (수용세포)에 대한 생물 발광 이미지는 분화 전 혹은 분화 후 F11 (donor) 세포와 함께 배양 후 1일과 3일째 측정 하였다. 각 세포 채널로부터 메디아를 제거 후 PBS 로 세포를 워싱하였다. 150μg/ml D-luciferin 을 PBS에 섞어 각 세포 채널에 주입 하였다. 그리고 나서, 미세유체 칩을 IVIS-100 imager에 위치 시켰다. Fluc 활성에 대한 생물 발광 이미지는 D-luciferin 처리 후 5분에 측정하였다. 이미지를 촬영 후 D-luciferin 은 세포로부터 바로 제거하였고 각 세포 채널에 새로운 메디아를 넣어 주었다. 세포는 2일간 추가적으로 더 배양 되었다. 생물 발광 이미지에 대한 ROI 정량 분석은 초당 광자의 양으로 표현 되었다.
통계분석
모든 결과들은 평균 ± 표준 편차 (SD) 로 나타내었으며 Students t-test 를 이용하여 평가 하였다. 통계적 유의성은 P-values < 0.05 로 평가하였다.
실시예 1. D-F11 세포 유래 엑소좀에서 mi-RNA 농도 상승 확인
본 발명자는 엑소좀을 통해 분화된 세포에서 분비된 miRNA가 다른 세포로 운반될 수 있고, 상기 세포에서 신경생성이 가속화됨으로써 인접한 미분화 세포에 영향을 미칠 수 있다고 가정하였다. 이에 우선, 0.5% depleted-FBS 및 1mM db-cAMP를 함유하는 DMEM에서 3일 동안 F11 세포를 배양한 후 분화된 F11세포에서 엑소좀을 분리하였다. db-cAMP 처리 후에 기록된 바와 같이 F11세포에서 신경돌기(neurite)가 신장된 것으로 나타났다(도 1a). 분리된 엑소좀에 CD63 및 TSG101을 포함한 엑소좀의 단백질 마커가 포함되어있는지를 조사하기 위하여, 본 발명자는 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다. 미분화된 F11 세포(UN-Exo)에서 분리된 엑소좀 및 분화된 F11 세포(D-Exo)에서 분리된 엑소좀에서 엑소좀 마커 단백질인 CD63, TSG101를 재탐지되었으며, 이는 웨스턴 블랏 분석 결과로 입증되었다. 그러나 ER 멤브레인 마커인 칼넥신(Calnexin)은 어디에서도 탐지되지 않았다(도 1b). 이러한 결과는, 세포 파괴물과 같은 오염 없이 엑소좀이 정제되었다는 것을 말한다. 또한, 분리된 UD-Exo 및 D-Exo를 NTA(nanoparticle-tracking analysis)로 분석한 결과를 보면, 대략 150-200nm의 피크 지름을 지닌 상대적으로 균일한 사이즈 분포를 나타내었다(도 1c). 본 발명자가 UD 또는 D 세포에서 분비된 엑소좀을 정제하여 엑소좀의 총 단백질 농도를 측정하였을 때, 동일 세포수 당 엑소좀의 총 단백질이 UD-엑소와 비교하여 D-엑소에서 대략 6배 증가하였다(도 1d).
miRNA 발현이 증가된 D-F11 세포가 miRNA를 자신의 엑소좀에 다량 가지고 있는지를 확인하기 위하여, 본 발명자는 UD 또는 D-F11 세포의 엑소좀에서 분리된 엑소좀의 miRNA에 대하여 정량 RT-PCR을 수행하였다. 분리된 엑소좀의 miRNA에 대하여 정량 RT-PCR로 정량 분석하면, UD-F11 세포(UD-EXO)에서 분리된 엑소좀과 비교하여 D-F11 세포에서 분리된 엑소좀(D-Exo)에서 miRNA의 발현 레벨이 증가한 것으로 나타났다(도 1e). 이러한 결과는, 신경 분화동안 엑소좀의 양이 증가하였고 D-F11 세포에서 분비된 엑소좀에 miRNA가 상당히 많이 함유되어있다는 것을 말한다.
실시예 2. 분화 세포에서 유래한 엑소좀의 미분화 세포로의 이동확인
주변의 세포에 의한 정교한 조절 하에서 세포분화가 일어난다. 신경 전구 세포(또는 신경 줄기 세포)로부터의 신경 분화는 용해성 인자 교환 또는 직접적 세포 접촉에 의해 지배받는다(예를 들면, 노취-델타 반응(Notch-delta reaction)). 또한 세포 사이의 신경성 인자의 교환은 엑소좀과 같은 EV를 통해 세포 분화에 영향을 미칠 수 있다. 이렇게 정립된 개념내에서 본 발명자는 이종의 세포 집단에서 cAMP에 의해 유도된 초기에 분화된 단일 뉴우런이 미분화된 세포에 영향을 미칠 수 있고, 엑소좀을 통해 신경성 miRNA를 이동시킴으로써 이들의 신경세포로의 분화를 촉진시킬 수 있다고 가정하였다.
첫 번째로, 미분화 및 분화 F11 세포 사이의 엑소좀 이동을 추적해보기 위하여, GFP를 융합시킨 CD63을 함유한 벡터를 구축하였다. 기존에 GFP와 같은 형광 리포터 단백질이 융합된 엑소좀 멤브레인 단백질이 세포에서의 엑소좀-추적에 사용될 수 있다고 보고되어있다. 형광 단백질-표지된 엑소좀 멤브레인 단백질은 한 세포에서 다른 세포로의 엑소좀 이동을 가시화할 수 있다. GFP-표지된 CD63 플라스미드 벡터가 F11 세포로 트랜스펙트되었을 때, 세포의 세포질 부위에서 엑소좀이 선명하게 탐지되었다.
정상 조건 또는 신경 분화 하에서 내인성 엑소좀의 생산을 관찰하기 위하여, CD63-GFP-트랜스펙트된 F11 세포를 정상 또는 분화 유도 배지에서 3일동안 배양하였다. 내인성 엑소좀은 Tuj-1 분화 마커로 염색된 분화된 F11 세포의 초기 및 말기 신경 생성에서 생산되었다(도 2a). 분화된 세포에서 유래한 엑소좀의 미분화된 F11 세포로의 이동을 관찰하기 위하여, CD63-GFP-트랜스펙트된 F11 세포(공여 세포) 및 DiI-표지된 F11 세포(수용 세포)를 혼합하여(1:1) 2일간 배양하였다. 분화 그룹의 경우, 신경 분화를 유도한 후에 DiI-라벨 수용 세포를 CD63-GFP-트랜스펙트된 F11 세포(공여 세포)와 함께 공-배양(co-culture)하였다. 본 발명자는 분화된 F11 세포에서 유래한 CD63-GFP-엑소좀을 미분화 DiI-라벨 수용 F11 세포로 이동시켰다(도 2b).
0.4 ㎛ 공극의 PET(polyethylene terephthalate) 멤브레인을 가진 트랜스웰 챔버(Transwell chambers)에서는 엑소좀의 이동은 가능하지만 대부분의 쉐딩(shedding) 미세소포(지름 0.1 - 1 ㎛) 및 자살체(apoptotic bodies)(지름 > 1㎛)는 통과하지 못한다. F11 수용 세포를 위쪽 삽입 챔버에 첨가하고 GFP-엑소좀-생산 세포를 상기 웰의 바닥에 둔 다음 2일간 배양하였다.
F11 공여세포에서 방출된 GFP-엑소좀이 공배양 2일 동안 F11 수용 세포의 세포질 부위에서 탐지되었다(도 2c). 본 발명의 시간 코스 및 절차 도표는 도 4d에 기재되어 있다. miRNA의 엑소좀-매개 이동을 확인하기 위하여, 트랜스웰의 상부 삽입 챔버에서 F11 수용세포를 effLuc-miR-193_3XPT로 감염시켰다. 미분화 공여 세포 그룹에서는 자연적 세포 증식 때문에 수용 세포의 루시퍼라아제 시그널이 점차 증가하였다. D-F11 세포를 보면, 공여 세포에서 db-cAMP 처리 2일 후에 수용 F11/effLuc-miR-193_3XPT 세포를 GFP-엑소좀 생산 F11세포와 공-배양시켰을 때, 수용 세포에서 루시퍼라아제 활성이 D-F11 공여 세포 그룹에서만 상당히 감소하였다(도 2d). 이러한 결과는, 엑소좀을 통한 신경 분화과정동안 miRNA가 분화된 신경 세포에서 미분화된 세포로 이동된다는 것을 말해준다.
실시예 3. miRNA의 엑소좀 -매개 이동에 의한 신경 분화 유도 증가
다음으로 본 발명자는 F11 수용 세포에서 신경 분화 패턴의 변화가 D-F11 세포(공여 세포)에서 분비된 엑소좀을 통한 miRNA의 이동에 의해 유도되는지를 시험하였다. F11 수용 세포를 상기 상위 삽입 챔버에 첨가하고 나서 F11 공여 세포와 함께 공-배양하였다. D-F11 세포 그룹의 경우에는, 수용 세포를 db-cAMP 처리 2일 후에 공여세포와 같이 배양하였다(도 3a). 위상차 영상(phase contrast image)에서는, 공배양 3일 및 5일 후에 공여 세포와 같이 배양된 수용 세포에 신경돌기 신장이 확장되는 것과 같은 뉴우런-유사 특징이 나타났다. 수용 세포에서의 뉴우런 마커의 발현 변화를 입증하기 위하여, 정량 RT-PCR 분석법을 사용하여 공-배양 3일 및 5일 후에의 수용 세포에서의 Tuj-1 및 MAP2의 발현을 조사하였다. Tuj-1 및 MAP2 레벨은 D-F11 공여 세포와 같이 배양한 수용 세포에서만 상당히 증가하였다(도 3b). 면역 형광 염색 또한 공-배양 3일 및 5일 후에 D-F11공여 세포와 배양한 수용 세포에서 신경 마커 Tuj-1 및 MAP 만이 높게 발현되었다(도 3c). miRNA의 엑소좀-매개 이동에 의하여 miRNA의 타겟 유전자 조절을 확인하기 위하여, 정량 RT-PCR을 사용하여 수용 세포에서 신경활성-리간드 수용체에 관여된 타겟 유전자의 mRNA 레벨을 조사하였다. 정량 RT-PCR에 의한 정량 분석을 보면 D-F11 공여 세포와 함께 배양된 수용 세포에서 CCKAR, CYSLTR1의 발현 레벨이 상당히 감소한 것으로 나타났다(도 3d). 또한 본 발명자는 수용세포에서 신경생성 miRNA로 알려진 miRNA 및 miR-124a의 발현을 정량 RT-PCR을 사용하여 조사하였는데, 이들의 발현이 D-F11 세포와 같이 배양한 수용 세포에서 증가하였다는 것을 발견하였다(도 3e). 이러한 결과는, 분화된 F11 공여 세포가 miRNA를 함유하는 엑소좀을 방출하며, 이들은 수용세포로 이동되고, 따라서 수용 세포에서는 miRNA의 타겟 유전자가 하향-조절된다는 것을 나타낸다.
실시예 4. 맞춤형 미세유체 시스템을 이용한 분화된 세포에서 방출된 엑소좀의 미분화된 세포로의 이동 관찰
뉴런 분화에서의 엑소좀의 세포간 전달을 가시화하기 위하여, 본 발명자는 엑소좀 수송의 타임랩스 라이브 영상을 촬영하기 위한 미세유체 장치를 고안하였다. 트랜스웰와 비교하여 미세유체 세포 배양 장치는, 마크로 스케일의 행동에서는 분명할 수 있는 간질 흐름에 의한 이류 엑소좀 이동 및 분자에서 실현가능한 마이크로-스케일의 유체 마이크로 환경에 대한 통제력(controllability) 및 고-해상 실시간 영상을 제공한다. 본 발명에서, UD 또는 D-F11 세포로부터 UD-F11 세포로의 엑소좀 수송을 가시화하기 위하여 하이드로겔-삽입 미세유체 장치가 사용되었다(도 4a). 엑소좀 전달을 가시화하기 위해 다음을 수행하였다. 세포를 타입 1 콜라겐 세포외(extracellular) 기질 하이드로겔에 3차원적으로 시딩한 후, 이어 멀티-컴파트먼트를 형성하기 위하여 수일동안 채웠다. 왼쪽 채널에 공여 F11 CD63-GFP 세포를 시딩하여 전달이입한 후에 수용 F 11 세포를 젤과 함께 중앙 채널에 주입하였다(도 4b). 30초 간격으로 라이브-세포 콘포칼 현미경을 사용하여 형광 영상을 얻었다. 공여세포에서 유래한 엑소좀이 처음 4분 30초 동안 세포 배양 채널에서 이동하였고 타입 1 콜라겐 하이드로겔의 섬유간 공간으로 이동하였다(도 4c, supp movie 1a, b). 상기 영상에서, 다음 8분 동안 타입 1 콜라겐 하이드로겔을 통해 3차원적으로 수용 세포로 엑소좀이 분명히 이동한다는 것을 나타났다(도 4d, supp movie 1c). 상기 엑소좀은 이류성의 확산성 유체 미세환경에 의해 수송되었다. 미세유체 장치 및 실험 프로토콜은 약 30의 페클레수(Peclet number)를 가지는 뇌 말초에서 간질성(interstitial) 수송을 모방하기 위하여 고안되었다. 배지의 높이 차이에 의해 생기고 각 저장고의 배지 표면에서의 증발에 의해 유지되는 약간의 압력 헤드에 의해, 간질 유체 유사 흐름은 큰 저장고(reservoir)를 지닌 왼쪽 채널에서부터 작은 저장고를 가진 중앙으로 생성되었다. 흐름의 페클레수는 21.5로 계산되었는데, 이는 세포상 및 주변의 엑소좀의 확산과 부착을 방해할 수 있는 높은 전단응력(shear stress)없이, 공여 세포로부터 수용세포로의 엑소좀의 능동 수송이 가능하도록 한다. 4 이하의 페클레수를 가진 흐름에서는 확산-동력의 수송은 단순히 엑소좀을 간질(interstitum) 전체에 균등하게 분배한다. 400이상의 페클레수 가진 흐름에서는 이류-동력 수송은 확산이 최소인 빠른 유선(streamline)을 보여준다.
CD63-GFP-태그된 엑소좀의 타임랩스 영상에서는, 엑소좀이 공여세포로부터 수용세포로 수송되고 1 내지 3분 내에 수용세포에 성공적으로 부착되어 흡수된다는 것을 보여준다(도 4e, 4f 및 4g). 수용 세포의 콘포칼 현미경을 사용한 Z-스택 영상을 통해, 공동-로컬화에 의해 엑소좀 색이 노란색으로 변함으로써, 수용체로의 엑소좀의 흡수가 입증되었다. Z-스택 영상을 3D로 재건하면, UD 또는 D 공여 세포와 공배양한 수용세포에 엑소좀이 축적되는 것이 나타났다. 이러한 현상은 또한 UD-F11 세포 그룹과 같이 공-배양된 수용세포에서도 관찰되었다. 엑소좀은 0(완전히 저지됨)에서 100(저지되지 않고, 이류에 의함)㎛/분의 광범위한 속도 분포로, 타입 1 콜라겐 ECM의 섬유질간 공간을 통해 수송되었다. 엑소좀의 최고 속도는 28.7의 페클레수인 것으로 계산되었는데, 설계(21.5)와 뇌 말초에서의 간질 수송과 관련이 있다. 도 4h는 본 발명의 일 구현예로서의 미세유체 칩을 사용한 엑소좀 추적 관찰의 각 단계를 나타내는 흐름도이다.
실시예 5. 미세유체에서 혈관신생동안 엑소좀을 통한 miRNA 수송에 miRNA -특이성 리포터 유전자가 관여함을 확인
엑소좀에 함유된 miRNA가 미분화 수용세포에 의해 흡수되는 지를 입증하기 위하여, F11 세포는 effLuc/3xPT_miRNA 광학 리포터로 감염시켰다. 본 발명 설계를 도식화한 것이 도 5a에 기재되어 있다. 공여 F11 세포를 왼쪽 세포 배양 채널에 시딩한 후 정상 또는 분화 배지와 함께 배양하였다. 2일 후에, 공여 세포의 배지를 db-cAMP가 없는 0.5% FBS를 함유하는 DMEM으로 변경하였다. F11 세포/effLuc/3xPT_miRNA(수용 세포)를 오른쪽 세포 배양 채널에 첨가하여 공배양하였다. 미분화 수용세포에서 1일 후에 생물발광 시그널이 감소하였고, 미분화-공여 F11 세포 그룹과 비교하여 분화 공여 F11 세포와 공배양한 지 3일 후에 상당히 감소하였다(도 5b). ROI 수치에 대한 정량 분석 또한 공배양 후 5일 후에 생물발광이 상당히 감소한 것으로 나타났다(도 5c). 이러한 데이터는, 분화 세포에서 유래한 엑소좀에 함유된 miRNA는 미분화 수용 세포로 수송되며, effLuc/3xPT_miRNA 리포터 시스템의 miRNA 결합 부위의 3개 카피에 결합함으로써 생물형광 시그널이 감소하였다는 것을 입증한다.
miRNA를 함유하는 엑소좀에 의한 신경 분화 유도를 입증하기 위하여, UD-F11 세포 또는 D-F11 세포(공여 세포)를 왼쪽 세포 배양 채널에 시딩하고 상기 F11 세포(수용 세포)를 하이드로겔과 함께 주입하였다. 공배양 4일 후, 위상차 영상에는 D-F11 세포와 같이 배양한 수용 세포에 수상돌기 생장과 같은 형태학적 변화가 나타났다(도 5d). 본 발명자는 또한 신경-특이성 마커인 Tuj-1 및 MAP2의 발현을 확인하기 위하여 면역형광 염색을 수행하였다. 면역형광 분석의 결과, 공배양 후 4일 및 7일 후에 D-F11 세포 그룹의 공여 및 수용 세포에서 신경 마커인 Tuj-1 및 MAP2의 발현 레벨이 매우 증가한 것으로 나타났다 (도 5e). 이러한 결과는 트랜스웰 배양 연구의 면역형광에서 발견한 것과 일치하는 것으로, 분화세포에서 miRNA가 엑소좀-매개에 의한 이동에 의해 유도된 신경 분화가, miRNA의 증식성 타겟 유전자를 하향 조절함으로써 증가된다는 것을 의미한다(도 5f). 도 5g는 분화된 신경전구세포 (neural precursor cell)로부터 방출된 엑소좀이 미분화 신경전구세포로 전달되어 분화를 유도하는 기작을 나타내는 모식도이다. 도 5h는 신경발생 (neurogenesis) 연구에 본 발명의 일 구현예로서의 미세유체 칩을 활용하는 예를 나타낸다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.

Claims (16)

  1. 공여세포 수용부, 세포외소포체 이동부 및 수용세포 수용부를 구비하고,
    상기 세포외소포체 이동부는 상기 공여세포 수용부에서 방출되는 엑소좀이 경사 (gradient)에 따라 상기 수용세포 수용부로 이동하도록 상기 공여세포 수용부와 상기 수용세포 수용부와 각각 연통되며,
    상기 경사는 상기 공여세포 수용부와 상기 수용세포 수용부에서의 증발량의 차이, 상기 수용세포 수용부와 상기 공여세포 수용부의 위치에너지의 차이, 또는 상기 수용세포 수용부와 상기 공여세포 수용부의 내부 압력의 차이에 의한 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 공여세포 수용부와 연통되는 웰 (well)부, 상기 세포외소포체 이동부와 연통되는 웰 (well)부 및 상기 수용세포 수용부와 연통되는 웰 (well)부를 더 구비하는, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  3. 삭제
  4. 청구항 2에 있어서, 상기 경사 (gradient)는 상기 공여세포 수용부와 연통되는 웰 (well)부와 상기 수용세포 수용부와 연통되는 웰 (well)부에서의 증발량의 차이에 의한 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외소포체는 엑소좀 및 미세소포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  8. 청구항 1에 있어서, 상기 공여세포는 면역세포, 결합조직세포, 혈관세포, 신경조직세포, 암세포, 줄기세포, 및 외래세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나이고, 상기 수용세포는 면역세포, 결합조직세포, 혈관세포, 신경조직세포, 암세포, 줄기세포, 및 외래세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 어느 하나인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 면역세포는 T 세포 (T cell), B 세포 (B cell), 대식세포 (macrophage), 백혈구 (white blood cell) 또는 수지상세포 (dendritic cell)이며, 상기 결합조직세포는 섬유아세포 (fibroblast)이며, 상기 혈관세포는 내피세포 (endothelial cell)이며, 상기 신경조직세포는 신경세포 (neuron) 또는 신경전구세포 (neuronal progenitor cells)이며, 상기 외래세포는 장내세균인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  10. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외소포체 이동부와 상기 공여세포 수용부가 연통되는 부분 및 상기 세포외소포체 이동부와 상기 수용세포 수용부가 연통되는 부분 중 적어도 어느 한 부분에 필터를 구비한, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 필터는 공극이 1 ㎛인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  12. 청구항 10에 있어서, 상기 필터는 공극이 0.4 ㎛인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  13. 청구항 1에 있어서, 상기 세포외소포체 이동부는 투명한 젤로 충진된 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  14. 청구항 13에 있어서, 상기 젤은 하이드로젤인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  15. 청구항 13에 있어서, 상기 젤은 알지네이트 (Alginate), 콜라겐 (Collagen), 펩타이드 (Peptide), 피브린 (Fibrin), 히알루론산 (Hyaluronic Acid), 아가로즈 (Agarose), PHEMA (Polyhydroxyethylmethacrylate),　PVA (Polyvinyl alcohol), PEG (Poly(ethylene glycol)), PEO (Poly(ethylene oxide)),　PEGDA (Polyethylene (glycol) diacrylate), 젤라틴 (Gelatin), 매트리젤 (Matrigel),　PLLA (poly(L-lactic acid)),　카복시메틸셀룰로오스 (Carboxymethylcellulose),　SAP,　PHEMA-MMA, 덱스트란 (Dextran) 및 키토산 (Chitosan) 중 적어도 어느 하나를 포함하는 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
  16. 청구항 13에 있어서, 상기 젤은 제1형 콜라겐을 포함하는 것인, 세포외소포체 추적 관찰 시스템.
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