KR20110003526A - 3차원 미세유체 플랫폼 및 이의 사용 방법 - Google Patents

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로저 디. 캄
석 정
버넬라 브이. 빅커맨-켈리
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메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지
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Abstract

본 발명은, 원핵 및 진핵 세포 이동, 증식, 및 분화를 포함하는, 3차원 생물학적 시스템의 연구 및 형성을 위한 방법 및 장치를 제공하는 것이다.

Description

3차원 미세유체 플랫폼 및 이의 사용 방법{THREE-DIMENSIONAL MICROFLUIDIC PLATFORMS AND METHODS OF USE THEREOF}
관련 출원
본 출원은 2008년 4월 8일에 출원된 미국 가특허 출원 제 61/123,344호의 우선권의 이익을 주장한다.
정부 지원
본 발명은, 내셔널 인스티튜츠 오브 헬쓰(National Institutes of Health)의 더 내셔널 인스티튜트 오브 바이오메디칼 이미징 앤드 바이오엔지니어링(the National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering)에 의해 수여된 보조금 번호(Grant No.) I-R01-EB-003805-01Al 하에 정부 지원을 받아 이루어졌다. 정부는 본 발명에 대해 특정 권리를 가진다.
세포 이동은 여러 생리학적 및 병리학적 과정, 예컨대 혈관신생, 암 전이, 상처 치유 및 염증을 위해 필수적이다. 혈관계에서, 모세관 형태형성과 관련된 세포 이동에 많은 노력이 집중되었다. 이 연구를 통해, 여러 기계적 그리고 생화학적 인자, 예를 들어 단일 또는 다수의 성장 인자1, 간질액(interstitial fluid) 흐름2 ,3 및 매트릭스 강성도(matrix stiffnes)4 ,5의 화학주성 또는 화학운동성(chemokinetic) 효과가 내피 세포 이동 및 관(tube) 형성을 조절함에 있어서 결정적인 것으로 확인되었다. 개별 성분들의 상세한 이해에도 불구하고, 어떻게 이러한 인자들이 특정 세포 반응을 생성시키도록 통합되는 지가 밝혀져야 하는데, 이는 이러한 환경 인자들이 제어된 방식으로 연구될 수 있는 다목적 시험관내 시스템에 대한 필요를 만들어낸다. 이를 달성하는 것은, 어떻게 생화학적 및 기계적 인자가 생리학적 및 병리생리학적 과정에서 함께 작용하여 궁극적으로 개선된 조직 공학(tissue engineering) 및 치료 전략에 기여하는 지를 보다 잘 이해하는 조사를 촉진시킬 것이다.
모세관 형태형성에서의 세포 이동을 이해하는 것은, 인간 질병 및 발생 현상에 대한 이의 관련성6 때문에 치료학적으로 중요하다. 전형적 세포 이동 분석은, 복잡한 환경 인자들, 특히 3차원 환경내에서 세포 단층(monolayer) 또는 미리 형성된 모세관으로부터 신규한 관-유사(tube-like) 구조의 형성을 촉진하는 환경 인자들을 통합시킬 수 없다. 현재의 모세관 형태형성 분석 중 하나는 ECM-유사 기판7 -9상에 평면적 관형 네트워크를 생성시킨다. 그러나 이 기술로 형성된 모세관-유사 구조는 외측상의 배지 및 내측상의 골격 물질(scaffolding material)과 반대되는 세포 극성을 지닌다7. 다른 방법들은 두 층의 골격 물질의 두 단층 사이에 하나의 세포 단층을 샌드위칭하고8, 화학적 구배를 도입함에 의해 모세관 침입을 유도9하는 것을 포함한다. 이 실험들은 모세관 형태형성을 이해하는 기초를 제공하였지만, 세포 침입을 평면적(in-plane)으로 이미징할 수 없음에 의해 제한을 받으며, 이는, 이러한 생물학적 방법에 영향을 주는 인자들을 더욱 상세히 특성화하게 한다.
역사적으로, 많은 분석이 세포 이동10을 연구하기 위해 사용되었으며, 예컨대, 상처 분석11 ,12, TEFLON® 펜스(fence) 분석13 및 Boyden 챔버14 ,15가 있다. 상처 분석 및 TEFLON® 펜스 분석 둘 모두는 2D로 세포 이동을 연구하는 것으로 제한된다. Boyden 챔버는 생리적 3D 환경을 가장 근접하게 흉내내지만, 세포 이동을 실시간으로 정량화하는데 도움이 되지 않는다. 콜라겐 젤내에 엠배드된(embeded) 내피 세포 코팅된 비드(bead) 또는 스페로이드(spheroid)를 사용하는 또 다른 분석은 3차원 환경으로 관-유사 구조를 생성시킬 수 있었다. 이 분석은 안정한 관-유사 구조의 생성 및 다른 세포 타입과의 공배양을 가능하게 하였지만16-18, 최초의 내피 세포 시딩 표면은 생체내에서 내피 세포가 겪게되는 유체-매트릭스 계면 및 유체 흐름과 같은 생리학적 인자를 고려하지 않은 경직성 비드이다. 더구나, 현재 분석으로, 화학운동성 및 화학주성 효과를 구별하기 어렵다. 세포 이동에 있어서, 화학주성(chemotaxis)은 화학주성물질을 향한 세포 이동을 나타내며, 한편, 화학운동성은 특정한 생화학적 인자의 존재하에서의 운동성(motility) 증가를 나타낸다. 제어된 구배를 유지함에 있어서의 기술적 어려움 때문에, 상기 두 개의 효과는 쉽게 구별되지 않는다. 현존하는 기술에 대한 도전은 (i) 생리학적으로 관련된 조건에서 기계적 그리고 생화학적 인자들의 정확한 제어를 제공하고; (ii) 우수한 광학적 해상도를 실시간으로 제공하고; (iii) 정량화를 위해 샘플 가변성을 최소화하고 민감도를 향상시키는 것이다.
미세제조 및 미세유체 기술은 다수의 환경 인자들의 정확한 제어를 가능하게 함에 의해 세포 이동을 연구함에 있어서 이 도전들을 극복하는 잠재성을 가진다. 그러나 이러한 영역에서의 현재의 노력은, 고립 인자(isolated factor)들을 계속 조사하는 것이었다. 예를 들어, 미세제조된 패턴은 증가된 강성도19 ,20의 방향으로의 우선적 이동의 증명을 가능하게 하였다. 미세유체 기술은 또한 생화학적 구배의 정확한 제어 및 일어난 세포 이동의 정량화를 가능하게 하였다21.
본 발명은, 원핵 및 진핵 세포 이동, 증식 및 분화를 포함하는 3차원 생물학적 반응의 형성 및 연구를 위한 그리고 중요한 생물학적 기능을 복제할 수 있는 시험관내 시스템의 개발을 위한 장치 및 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적 및 이점은 상세한 설명 및 청구범위로부터 명백하게 될 것이다.
도 1은 두 개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치(microfluidic device)의 개략적 도면이다.
도 2는 두 개의 유체-흐름을 가지는 미세유체 장치의 사진이다. 관심 세포는 상기 두 개의 흐름 경로의 어느 하나 또는 둘 모두에 도입(또는 "시딩(seeding)")되거나 또는 젤 골격에서 부유된다.
도 3은 세 개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사진이다. 관심있는 하나 또는 그 초과의 세포 타입은, 상기 세 흐름 경로 중 하나 이상의 경로의 임의의 조합으로 도입(또는 "시딩")되거나, 젤 골격에서 부유된다.
도 4a는, 3차원 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 개략도이다.
도 4b는 3개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사진이다. 진핵 세포가 상기 내부 흐름 경로내로 도입되었고, 외부 흐름 경로로 화학주성에 의해 이동되었다.
도 5는 3개의 유체-흐름 경로 및 2개의 횡단(transverse) 경로를 가지는 미세유체 장치의 개략도이며, 임의로 입구(예컨대 가압되거나 가압되지 않은 공기에 대한 입구) 및 흐름 경로들 중 하나 이상에서 유체 흐름을 제어하기 위한 밸브를 제공한다.
도 6은 박테리아를 위한 화학주성 분석에서 3개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사용을 보여주는 막대 그래프이다. 박테리아는 내부 흐름 경로내로 도입(또는 "시딩")되었고, 하나의 외부 흐름 경로에 배치된 자극 (또는 "조건(condition)") 쪽으로의 박테리아의 화학주성 이동이 다른 외부 흐름 경로에 배치된 대조군쪽으로의 박테리아 이동에 대해 측정되었다.
도 7a는 혈관신생 분석에서 미세유체 장치의 사용을 보여주는 그래프이다.
도 7b 및 7c는 관 형성이 계산되고 단순한 세포 이동과 구별되는 방식을 도시한다.
도 8은 세포 공-배양 분석에서 3개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사용의 개략도이다. U87MG 세포를 상기 내부 흐름 경로내로 도입되고, 인간 표피 성장 인자("hEGF")는 하나의 외부 흐름 경로내로 도입되고, 1차 피질 뉴런이 다른 외부 흐름 경로내로 도입된다.
도 9a는 세포 공-배양 분석에서 2개의 유체-흐름 경로를 가지는 미세유체 장치의 사용의 개략도이다. 이 장치에서, 골격은 콜라겐을 포함하고, 광학적으로 투명한 물질은 현미경 커버 글래스이며, 기판 (폴리-디메틸 실록산 또는 "PDMS") 및 커버글래스는 다양한 물질, 예컨대 콜라겐 또는 폴리-D-리신("PDL")으로 코팅된다. 간세포가 제 1 유체-흐름 경로내로 도입되어, 이들 세포가 콜라겐 골격의 표면에서 하나 이상의 세포층을 형성하도록 하는 조건 하에서 성장된다. 인간 미세혈관 내피 세포("MVEC")가 제 2 흐름 경로내로 도입되고 흐름 경로를 통한 유체 흐름이 있거나 유체 흐름이 없는("정적" 조건) 조건에서 성장된다. 간세포의 방향으로 상기 골격내로의 내피 세포 이동 및 세관(tubule)으로의 내피 세포 분화가 검출된다. 도 9b는 MVEC-간세포 공-배양 실험의 시간 경과(time-course)의 개략도이다. 세포 타입의 다양한 조합물이 본 발명의 다양한 구체예에서 상기 장치내로 도입된다.
도 10은 본 발명의 구체예의 사진으로서, 여기서 미세유체 장치가 멀티-웰(multi-well) 조직 배양 플레이트의 인접 웰들에 배치되고; 상기 장치의 고처리량 용도를 가능하게 하기 위해 추가의 변화가 이루어진다.
도 11a는 골격을 가로지르는 구배의 형성을 증명하는 선 그래프이다. 도 11b는 상기 미세유체 장치의 일부에서 세포 위치를 보여주는 개략도이다. 유체-흐름 경로내로 도입된 세포는 상기 골격의 표면에 부착될 수 있거나 상기 골격 물질에 침입할 수 있다. 대안적으로, 세포는 유체-흐름 경로와 접촉하고 있는 광학적으로 투명한 물질(여기서 유리 커버슬립)에 부착될 수 있다. 도 11c는 본 발명의 일 구체예를 나타내는 개략도로서, 여기서 상기 유체(배지 저장소로부터)는, 유체 출구에 진공을 적용함에 의해 (펌프 소스로부터) 또는 모세관 작용에 의해, 상기 장치에 도입된다.
도 12a는 어떻게 온도 및 습도가 장치에서 조절되는지를 증명하는 미세유체 장치의 일부의 개략적 단면도이다. 도 12b는 미세유체 장치 및 미세유체 장치 환경에서 생리학적 조건을 유지하기 위한 관련 시스템의 사진이다.
도 13는 도 12b에 어셈블링되어 도시된 미세유체 장치 및 관련 시스템의 사진이다.
도 14a는, 골격이 내부에 형성되어 있는, 스태거드(staggered) 마이크로-필라 어레이를 나타내는 미세유체 장치의 일부의 개략도이다. 도 14b는 상기 미세유체 장치의 골격 및 어셈블리의 형성을 보여주는 개략도이다. 도 14c는 미세유체 장치 및 관련된 시스템의 사진이다. 도 14d는 쿠마시 블루(Coomassie Blue)로 염색된 콜라겐을 함유하는 골격을 예시하는 미세유체 장치의 일부의 사진이다. 유체-흐름 경로는 상기 사진의 상부 및 하부에 도시되어 있다.
도 15는 미세유체 장치의 일련의 사진이며, 이 장치내에서 내피 세포가 MTLn3 래트 유방 선암 세포, U87MG 인간 교아종 세포 또는 평활근 세포(SMC)와 공배양된다.
도 16a-l은 미세유체 장치의 골격에서 세관을 형성한 내피 세포의 일련의 타입-랩스(time-lapse) 사진이다.
도 17a-k는 미세유체 장치의 골격에서 세관을 형성한 내피 세포의 일련의 타입-랩스 사진이다.
도 18a-c는 미세유체 장치의 골격에서 세관을 형성한 내피 세포의 일련의 사진이다.
도 19a는 다수의 (예를 들어, 3개의) 유체-흐름 경로 및 골격을 나타내는 미세유체 장치의 일부의 개략적 단면도이다. 도 19b는 미세유체 장치의 골격의 사진이다. 도 19c-d는 시간에 따른 골격을 통한 용질 확산을 보여주는 선 그래프이다.
도 20a-c는 다수의 유체-흐름 경로 및 골격을 나타내는 미세유체 장치의 일부를 보여주는 일련의 사진이다. 도 20d-g는 VEGF와 같은 자극에 반응한, 시간에 따른 골격을 통한 유도된 세포 이동을 보여주는 일련의 선 그래프이다.
도 21a-d는 루멘-함유 세관으로 분화되도록 0.2% 콜라겐 골격을 통해 이동하는 내피 세포를 보여주는 일련의 사진이다.
도 22a는 젤 "케이지(cage)"를 가로지르는 구배를 보여준다. 형광 덱스트란 (40 kDa)을 사용하여 μFD로 생성 구배의 능력을 나타내었다. 상기 젤 "케이지"를 가로지르는 (그러한 크기 범위내에서 비반응성 용질을 시뮬레이션하기 위해 사용된) 덱스트란의 형광 강도 및 농도의 시간-경과가 도시되어 있다. 상기 플롯은 40시간 초과 동안 플롯된 대표적 실험 곡선을 보여준다. 도 22b는 세포 배양 분석의 개략도이다. (상부) EC 스프라우팅(sprouting) 분석. 세포는, 생리학적 관련 극성을 가지는 3차원 젤 상에서 배양된다, (중간) 3D 캡슐화 분석. 세포는, 젤내에 부유되어 있고 처음에는 서로 분리되어 있다, (하부) 2D 이동 분석. 세포는 주로, ECM 물질 (피브로넥틴)로 코팅된 유리 기판 (넌-컴플라이언트(non-compliant))상에 단층을 형성한다. 도 22c는 다양한 배양 흐름 구성을 묘사한다. (1) 정지 배양을 위해, 배지의 점적(droplet)이 입구 및 출구 포트상에 배치된다. 장치는 인큐베이터내의 국소적 고습도 (수분 함유 페트리 디쉬) 2차 컨테이너에서 유지된다. (2) 액체 저장소의 높이 차이, 젤 케이지를 가로지르는 압력 구배를 부과하기 위한 셋업이 사용된다. (3) 미세유체 플랫폼. 마이크로 채널내 전단 스트레스의 생리학적 수준을 만들기 위해 사용되는 플랫폼의 개략도이다. 도 22d는 젤 영역내의 고정된 위치에서의 표준화된 강도의 값을 보여주는 플롯을 묘사하고, 실선은 이론적 예상치이고, 형태-마커(원 (백색(open)-중간, 흑색-싱크 채널 근처) 및 정사각형은 예시적 장치에 대한 것임)가 도시되어 있다. 도 22e는 DFD에서 3차원 골격을 통한 가질 흐름을 만들기 위한 표준화된 압력 차이(dP/dPmax)의 전개에 대한 실험 결과를 묘사하며, Pa의 값은 최초 압력 차이를 가리킨다.
도 23은 미세유체 분석 개발을 위한 실험 프로토콜을 묘사한다. 도 23a는 소프트 리소그래피(soft lithography) 및 표면 처리에 의해 만들어진 제조된 PDMS 장치를 보여준다. 도 23b는 채널 사이의 골격 채널내의 채워진 젤 골격(음영짐)을 묘사한다. 도 23c는 두 채널을 채우는 배지(왼쪽, 오른쪽 및 중심)을 묘사한다. 도 23d는 중심 세포 채널내의 세포 시딩(구체(sphere))을 묘사한다. 도 23e는 상기 조건 채널(condition channel)에 적용된 화학적 인자(오른쪽)를 묘사한다. 도 23f는 배지 및 화학적 인자가 채워진 후의 미세유체 장치를 묘사한다. 점적은 상기 채널로부터 배지의 증발을 피하기 위해 모든 입구 포트에 배치된다. 배지는 간단히 기존의 점적을 흡인하고 새로운 점적을 부가함에 의해 만들어진 모세관 힘에 의해, 대체될 수 있다. 도 23g는 조건 측면(condition side) 및 대조군 측면(control side) 사이의 세포 이동 거동의 직접 비교를 가능하게 하는 미세유체 세포 이동 분석을 위한 개략도이다.
도 24는 (a) pH 7.4에서 중합된 0.2%(2.0mg/mL) 콜라겐 젤 골격에서 이동된 세포의 표준화된 상대적 주계(perimeter)의 그래프를 묘사한다. 'No VEGF'는 VEGF 구배 없는 네거티브 대조군으로서 기능한다. 'n 일째에서의 VEGF'는 VEGF가 세포 시딩후 n일째에 처음 적용되어 상기 실험의 종료시까지 계속됨을 의미한다. (b) 콜라겐 젤 골격내의 이동된 세포의 표준화된 상대적 면적의 그래프이다. (c 및 d) 콜라겐 젤 골격내의 이동된 세포의 표준화된 상대적 주계 및 면적의 그래프이다. 각 포인트는 각 조건에 대해 n ¼ 8 (8개 골격; 4개 장치)을 사용한 평균을 나타낸다. 에러 바(error bar)는 표준 편차를 보여준다.
도 25는 VEGF 구배와 함께 다른 세포 타입(U87MG, MTLn3, 1OT 1/2)으로부터의 신호에 따른 HMVEC 세포의 이동을 묘사한다. 세포 채널 내 배양된 HMVEC의 표준화된 상대 면적의 변화가 도시되는데, 다양한 세포 타입이 조건 채널에서 사용되고 (U87MG 세포, 다양한 시딩 밀도의 MTLn3 세포 및 10T 1/2 세포), 세포가 없는 대조 배지 단독 (대조 배지), 및 20 ng/mL VEGF (VEGF, 20 ng/mL)를 지닌 대조 배지가 사용된다. 고밀도로 시딩된 MTLn3 세포 및 VEGF 함유 배지는 강하게 HMVEC를 유인하였고, 한편 저밀도 MTLn3 세포 및 U87MG 세포는 그렇제 못하였다. 조건 채널에서 1OT 1/2을 사용한 경우, HMVEC는 대조군 측면으로 이동하는 경향이 있었다. 각 지점은 각 조건을 위한 n ¼ 8(8개 골격; 4개 장치)을 사용한 평균을 보여준다. 에러 바는 표준 편차를 보여준다.
도 26은 조직-공학처리된 구조물의 혈관신생을 위한 미세유체 공배양 플랫폼을 묘사한다. A) PDMS로 만들어진 미세유체 장치의 개략도 및 치수. 두 평행한 미세유체 채널이 마이크로패턴화된 PDMS 장치와 커버슬립 사이에 형성된다. 젤 골격(예를 들어, 타입 I 콜라겐)은 PDMS 포스트(post)에 의해 기계적으로 지지되는 상기 미세유체 채널 사이에 위치된다. B) 정지(왼쪽) 및 흐름(오른쪽) 조건 하에서 배양된 상기 미세유체 장치의 사진. 배양 배지의 점적은 정지 배양을 위해 미세유체 채널의 각 출구상에 배치된다. 저장소는 흐름 배양을 위해 미세유체 채널에 연결되어 있다.
도 27은 두 미세유체 채널 사이의 5-mm H2O 압력 차이에 의해 발생된 젤 골격을 가로지르는 간질 흐름을 묘사한다. 간세포에 의한 콜라겐 젤의 침투율은, 저장소내 배지 수준의 변위를 측정함에 의해 결정되었고, 속도는 젤 침투율 및 분석 솔루션(analytical solution)에 기초하여 계산하였다. 상기 속도는 시간에 따라 감소되지만 상기 배양 배지를 변화시킴에 의해 복원된다.
도 28은 간세포에 의해 3D 조직-유사 구조의 형성에 대한 간질 흐름 방향의 효과를 묘사한다. A) 정방향 흐름(화살표, 0일째)에 이어 역방향 흐름(화살표, 1일째 초과)으로 배양된 간세포의 상응하는 상-컨트라스트(phase-contrast) 이미지. 간세포가 점차 3D 조직-유사 구조로 조직화됨이 주목된다. B) 역방향 흐름으로 배양된 간세포의 상응하는 상-컨트라스트 이미지. 2일째에 미세유체 채널상에 세포가 퍼지기 시작하였다 (화살표 머리, 2일째). 상기 미세유체 채널상으로 세포가 이동함에 따라, 세포 구조가 얇게 되었다.
도 29는 C) 3일째의 간세포 형태형성의 정량화를 묘사한다. 상기 미세유체 채널상에 퍼져있는 간세포의 면적은, 상기 미세유체 채널의 면적에 의해 측정되었고 표준화되었다. 에러 바 = SEM (n=10, N=3). *정방향에 이은 역방향에 대해 P < 0.05. D) 액틴 필라멘트가 염색되었고, z-스택(stack) 이미지를 하부(커버슬립 근처), 10 ㎛, 및 40 ㎛ 높이의 z-면에서 공초점 레이저-스캐닝 현미경에 의해 촬영하였다. 화살표 머리는 간세포 조직-유사 구조의 가장자리를 가리킨다. 세포는 역방향 흐름 단독의 경우의 구조 보다 정방향 흐름에 이은 역방향 흐름의 경우에 더 두꺼운 구조를 형성하였다.
도 30은 상기 미세유체 플랫폼에서 만들어진 3D 혈관신생 모델을 묘사한다. A) 정지 조건 하에서 배양된 hMVECs의 상응하는 상-컨트라스트 이미지. 세포들은 상기 콜라겐 젤 골격내로 침투하였고, 혈관 스프라우트를 형성하였다 (화살표 머리, 1일째). 스프라우트는 신장되었고 모세관-유사 구조를 형성하였다(화살표 머리, 2일째 및 3일째). B) 상응하는 상-컨트라스트 및 형광 이미지. hMVECs는 5일째에 고정되었고 액틴 필라멘트 및 핵을 위해 염색되었다. 단면 이미지는 hMVEC가 루멘을 가진 모세관-유사 구조를 형성하였고 (i,ii), 반면에 팁 세포는 루멘을 형성하지 못하였음 (iii)을 보여준다. C) 정지 조건 하에서 배양된 rMVEC의 상응하는 상-컨트라스트 이미지. 세포들은 시트-유사 구조로서 젤 골격내로 이동되었다 (화살표 머리). D) 상응하는 상-컨트라스트 및 형광 이미지. rMVEC는 7일째에 고정되었고 액틴 필라멘트를 위해 염색되었다. 단면 이미지는, 세포들이 시트-유사 구조를 형성하였음을 보여주었다(i-iii).
도 31은 미세유체 플랫폼에서 간세포-rMVEC 공배양을 묘사한다. A) 공배양을 위한 실험 프로토콜. B) 상응하는 상-컨트라스트 이미지. 간세포는 콜라겐 젤 골격의 측벽 상에 시딩되었고, 간질 흐름은 적용되었다(화살표, 0일째). 흐름 방향은 1일째에 거꾸로 되었다(화살표, 1일째). 간질 흐름은 정지되었고 rMVECs은 2일째 상기 젤 골격의 다른 측면에 더해졌다(2-0일째). 간세포는 3D 조직과 유사한 구조를 형성하였다(3-1일). 일부 rMVECs는 4-2일째 혈관 스프라우트를 형성하기 시작하였다(화살표 머리, 4-2일째). 혈관 스프라우트는 상기 젤 골격을 가로질러 신장되었고 간세포 조직-유사 구조(화살표 머리)에 도달되었다. 일부 간세포는 또한 rMVECs의 모세관과 같은 구조를 향하여 이동되었다(화살표, 7-5 및 8-6일째).
도 32는 rMVEC 형태형성의 양화를 묘사한다. 그래프는 n일째의 이동하는 rMVEC의 표준화된 영역 증가 A~n와 주계 증가 P~n 사이의 관계를 보여준다. 공배양에서, 상기 데이터는 대조 배양 보다 더 큰 P~n 및 더 작은 A~n를 보여준다. 각 플롯은 각 일째의 값을 보여준다. "3-1일째"는 간세포의 3일째 및 rMVEC의 1일째를 보여준다. 에러 바 = SEM (간세포-rMVEC 공배양의 경우, n=16, N=A; rMVEC 배양의 경우, n=15, N=3). 사진은 간세포 조직-유사 구조의 상응하는 상-컨트라스트 및 형광 이미지를 보여준다. 왼쪽 패널: 공배양의 13-11일째의 간세포에서 BC(화살표머리)내로 분비된 FD의 대사산물. 오른쪽 패널: 공배양의 10-8일째의 간세포의 EROD 활성.
도 33은 간세포-rMVEC 공배양에서 rMVEC의 튜브 형성 과정을 묘사한다. A) 공배양에서 rMVEC의 상-컨트라스트 이미지. B) 로다민-팔로이딘으로 염색된 모세관과 같은 구조의 z-프로젝션 이미지. 세포들은 정지 조건 하에서 배양되었고, 공배양의 12-10일째에 고정되었다. 이미지 필드는 A의 점선 프레임(dotted frame)에 상응한다. C) 구조의 방향을 따른 모세관-유사 구조의 단면 이미지. rMVEC가 루미날(luminal) 구조를 형성하였지만, 어떠한 루멘도 팁 영역에서 발견되지 않았음이 주목된다. D) B의 모세관-유사 구조의 수직 단면 이미지. 숫자들은 B에서 점선에 상응한다. 스케일 바(scale bar) = 50 ㎛ (B); 20 ㎛ (C).
도 34는 젤 골격에서의 확산 분석을 묘사한다. A) 0, 5 및 30분째에서의 미세유체 플랫폼내의 젤 골격을 가로지른 40-kDa 형광 덱스트란의 분포. B) 정상 상태(왼쪽) 및 상응하는 수치적 시뮬레이션(numerical simulation)(오른쪽으로) 표현된 실험 결과. 강도는 실험 결과를 시뮬레이션과 비교하기 위해 최대 값으로 표준화되었다. 표준화된 농도를 위해 이미지가 도시된다.
본원에 명백하게 정의되지 않았다면, 모든 기술적 및 과학적 용어는, 당업자에 의해 공통적으로 이해되어 지는 바와 같은 동일한 의미를 가진다. 용어가 단수로 제공된다면, 본 발명자는 또한 그 용어의 복수를 고려하고 있다.
본 발명의 한 측면은, 장치 또는 시스템에 관한 것이며, 특히 다중-경로 미세유체 장치에 관한 것이다. 본원에서 사용된 바와 같이, "미세유체 장치"는, 10 또는 5 밀리미터(mm) 이하의 치수(예를 들어, 높이, 길이 또는 깊이)을 가지는 하나 이상의 유체-흐름 경로를 포함하는 장치, 기구 또는 시스템을 지칭한다. 일반적으로, 상기 유체-흐름 경로는 1mm 이하의 너비를 가질 것이다. 본원에서 사용된, "유체-흐름 경로", "유체 경로" 또는 "흐름 경로"는 액체 또는 가스를 포함하는 유체가 지나갈 수 있는 임의의 채널, 튜브, 영역, 공간 또는 경로 또는 이의 일부를 지칭한다. "유체 흐름 경로"는 유체-흐름 경로의 일부를 포함한다.
일 구체예에서, 상기 미세유체 장치는 기판을 포함하며, 여기서, 상기 기판 상에 또는 기판 내에, 둘 이상의 유체-흐름 경로가 배치된다. 상기 장치는 또한 상기 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질을 포함한다. 상기 장치는, 일반적으로 상기 장치의 한정된 영역 내에서, 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는 (예를 들어, 이들 사이의 공간을 채움에 의해) 골격을 추가로 포함한다. 이 골격은 대체로 약 1 ㎛ 이상의 최소의 직교 높이, 길이 및 깊이 치수를 가진다. 본원에서 사용된 바와 같이, "3차원 공간에서"란 문구는, 이러한 치수들이 3차원 유클리드 기하구조(Euclidean geometry)로 존재하는 경우, 3차원인 특성을 가지는 것을 지칭한다. 그러나, 비-유클리드의 공간 및 모양은 또한 본 발명에 포함된다. 임의로, 상기 장치는, 각 유체-흐름 경로를 위해 상기 유체 경로에 대한 입구를 가지고, 상기 유체 경로로부터의 출구를 가진다.
상기 기판은, 일반적으로, 소프트 리소그래피 방법에 의해 형성된, 폴리-디메틸 실록산(PDMS)과 같은 고체 물질이며, 여기서, 상기 유체-흐름 경로는 상기 기판내의 채널이다. 두 개의 유체-흐름 경로가 동일한 기판에 존재하는 경우, 이 유체-흐름 경로들은, 이들의 길이의 일부 또는 전부에 걸쳐 실질적으로 평행하다. 각 유체-흐름 경로는 유체 입구 및 유체 출구를 포함할 수 있다. 유체 입구는 홀(hole), 채널 또는, 상기 장치의 외부로부터 상기 유체-흐름 경로내로 세포 배양 배지와 같은 유체가 이동되도록 하는 다른 수단이다. 유체 출구는 또한 홀, 채널 또는, 컨디셔닝된(conditioned) 또는 폐기용 세포 배양 배지와 같은 유체가 상기 장치로부터 배출되도록 하는 다른 수단이다. 당업자는, 마이크로제조 또는 미세유체학 분야에서 사용되는 다른 물질들이 본 발명의 기판을 생산하는데 유용하다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 기판은 실리콘, 유리, 석영, 또는 플라스틱(예를 들어, 기판으로서 기능하는데 필요한 구조적 속성을 가지는 임의의 합성 또는 반-합성 폴리머)으로부터 형성될 수 있거나 이를 함유할 수 있다. 유용한 플라스틱은, 당업자에 알려져 있다.
상기 유체-흐름 경로는 요망되는 흐름 저항을 만들기 위해 임의의 치수(예를 들어, 길이, 너비 또는 깊이)로 다양할 수 있다. 예를 들어, 흐름 경로를 통과하는 흐름 속도는 입구 및 출구를 가로지르는 유체정역학적(hydrostatic) 압력 구배에 따라 조절될 수 있다. 하나 또는 그 초과의 유체-흐름 경로는 저항 채널로서 기능할 수 있으며, 이는 상기 유체-흐름 경로가 사실상 연속식 또는 불연속식(박동성)으로, 유체 흐름에 대해 증가된 저항을 지님을 의미한다. 저항 채널은, 예를 들어, 유체 저항성을 증가시키는 구불구불한 곡선(tortuous curve) 또는 다른 기하학적 형태를 함유할 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 압력 조절장치를 함유하는 미세유체 장치를 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 압력 조절장치는, 흐르는 유체의 하나 또는 그 초과의 특성(예를 들어, 압력 또는 부피)의 제어를 가능하게 하는 임의의 기계적, 화학적 또는 다른 시스템을 포함한다. 압력 조절장치는 둘 또는 그 초과의 유체-흐름 경로 사이에 압력 차이를 만드는 하나 또는 그 초과의 밸브를 포함할 수 있다.
상기 장치 내 함유된 상기 골격은 상기 유체-흐름 경로를 분리시키고 다작용성 지지부를 제공하며, 상기 지지부 상에서 세포는 상기 장치에 제공된 생리학적 조건에 의존하여 이동, 증식 또는 분화할 수 있다. 박테리아를 포함하는 원핵 세포가 포함되며, 진핵 세포도 포함된다. 하나 초과의 세포 타입이 동시에 또는 연속적으로 상기 골격에 도입될 수 있다. 일반적으로, 상기 골격은 고체 또는 반-고체 생물학적 또는 생체적합성 물질(또는 바이오물질)을 함유하며, 종종 이는 폴리머의 형태이다. 유리한 폴리머는 콜라겐이며, 이는 모노머가 풍부한 용액으로 존재할 수 있고 상기 골격을 형성하도록 인 시튜(in situ) 중합될 수 있다. 콜라겐 또는 다른 폴리머 및 임의로 다른 성분을 함유하는 골격은, 생물학적 엔티티(biological entity)의 확산 뿐만 아니라 박테리아 및 동물 세포의 유도된 이동을 가능하게 한다. 예를 들어, 생물학적 엔티티는 세포 또는 세포소기관(subcellular) 성분, 예컨대 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 또는 효소이다. 성장 인자 또는 다른 생물학적 엔티티는 골격 내에서 균일하게 분포되거나 제어된 구배로 분포될 수 있거나, 상기 골격에 구속(tethered)될 수 있다. 골격은, 상기 유체-흐름 경로 내 함유된 세포와 상호작용할 수 있는 약물 및 다른 작은 분자를 확산시킬 수 있다. 본원에 기재된 상기 장치는, 약물 및 다른 화합물의 세포 단층 또는 골격 침투율을 측정하는 것에 더하여, 시험 화합물의 확산 계수를 계산하는데 유용하다.
특정 구체예에서, 상기 골격은 골격 물질과 다양한 세포의 상호작용을 평가하는데 사용될 수 있다. 여러 골격 물질은 사용될 수 있다. 다양한 골격 물질에 대한 여러 생물학적 엔티티의 결합 친화도가 시험될 수 있다.
일부 구체예에서, 상기 골격은 Matrigel™ (BD Biosciences, San Jose, CA)를 함유한다. 특정 구체예에서, 상기 골격은 광경화성 폴리머, 예컨대 디메트아크릴레이트을 함유하거나 이로부터 형성된다. 참조 [Gerecht, et al, Biomaterials 28 (32): 4826-4835 (2007)]. 특정 구체예에서, 상기 골격은 펩티드를 함유하거나 이로부터 형성된다. 특정 구체예에서, 상기 골격은 PEG와 같은 합성 폴리머를 함유하거나 이로부터 형성된다.
따라서, 상기 미세유체 장치는 상기 골격이 삽입되기 전의 형태로 제공될 수 있다. 예를 들어, 상기 유체-흐름 경로는 리소그래피에 의해 상기 기판에 생성되며, 이는 또한 횡단 경로를 제공하는데, 이러한 횡단 경로내로 상기 골격의 성분(들)이 배치되거나, 주입되거나, 채워지거나 다른 방식으로 삽입된다. 상기 장치가 3개 또는 그 초과의 유체-흐름 경로를 포함하고 이에 따라 둘 또는 가능하게는 그 초과의 개재(intervening) 골격을 포함하는 경우, 하나, 둘 또는 그 초과의 횡단 경로가 임의로 상기 장치 내에 제공된다. 횡단 경로는 유체 입구, 제 1 유체-흐름 경로로부터 제 2 유체-흐름 경로까지 이어져 있는 횡단 통로, 및 유체 출구를 포함할 수 있다. 상기 횡단 경로는 흐름 경로에서의 흐름을 제어하기 위해 만들어질 수 있다. 예를 들어, 횡단 경로는 일체형 밸브 또는 펌프로서 기능할 수 있다.
상기 기판의 내부 표면은 이러한 표면상에 또는 표면내에 상기 골격을 형성하기 전에 변화될 수 있다. 예를 들어, 폴리-D-리신 (PDL)의 코팅은 상기 골격과 상기 기판 사이의 결합의 강도를 증가시킨다. 상기 기판의 내부 표면에 대한 다른 변화는, 상기 기판의 소수성, 친수성, 골격 부착 특성, 또는 세포 친화성을 변경시킨다(즉, 증가시키거나 감소시킨다). 특정 구체예에서, 상기 기판의 내부 표면은, 플라즈마에 노출되어서, 이로써 기판의 내부 표면의 친수성을 증가시킨다. 특정 구체예에서, 상기 기판의 내부 표면은, 폴리-D-리신에 노출된다.
골격이 형성되는 장치내의 공간은, 또한 하나 또는 그 초과의 "마이크로-필라(micro-pillar)"를 함유할 수 있으며, 이는, 상기 골격의 기계 안정성을 개선시키는 리소그래피 방법에서 형성된 구조이다. 예를 들어, 상기 마이크로-필라는 상기 골격을 형성시키기 위해 사용된 물질의 표면 장력을 증가시키고, 따라서 상기 유체-흐름 경로내로의 상기 골격 물질의 흐름이 감소된다. 다수의 마이크로-필라가 패턴을 이루며 존재한다는 것은 상기 골격이 "젤 케이지(gel cage)"의 형태임을 시각적으로 제시한다 (도 1 참조). 마이크로-필라의 모양은, 더 우수한 골격 안정성을 제공하도록 변화될 수 있다. 예를 들어, 6각형 모양은 상기 골격 물질에 더 강한 표면 장력을 제공할 수 있다.
본 발명은 또한 세포 거동의 분석에 유용한 방법에 관한 것이다. 일 구체예에서, 미세유체 장치에서 세포의 유도된 이동을 측정하기 위한 방법이 제공된다. 일반적으로, 세포는 제 1 유체-흐름 경로내로 도입되고, 상기 흐름 경로내의 표면들 중 하나 이상에 부착될 수 있다. 상기 세포는 또한 상기 골격에 부착될 수 있다. 상기 세포가 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 도입됨과 동시에 또는 상이한 시간에, 생물학적 엔티티가 제 2 유체-흐름 경로내로 도입된다. 이 생물학적 엔티티는 세포 또는 세포소기관 성분, 예컨대 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 및 효소, 뿐만 아니라 약물 및 다른 작은 분자일 수 있다. 주어진 시점에서, 세포가, 예를 들어 상기 골격로 그리고 임의로 상기 제 2 유체-흐름 경로내로, 이동한 정도가 측정된다. 특정 구체예에서, 내피 세포 또는 내피 세포 전구체가 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 도입되고 세포 이동을 측정하는 대신에, 신생 혈관의 형성이 측정된다. 본 발명의 방법은, 변화된 면역 반응을 포함하는 질병의 진단 및 특성화뿐만 아니라 잠재적인 치료 화합물의 확인을 포함한다. 예를 들어 호중구가 제 1 유체-흐름 경로내로 도입되고, 내피 세포의 단층이 상기 호중구의 도입과 동시에 또는 이에 연속하여 제 2 유체-흐름 경로 또는 상기 골격내로 도입된다. 상기 호중구는, 예를 들어 면역 질병 또는 장애를 지니거나 이를 발생시킬 위험이 있는 포유류 피검체(즉, 시험 피검체)로부터, 또는 면역 질병 또는 장애를 지니지 않거나 이를 발생시킬 위험이 없는 포유류 피검체(즉, 대조 피검체)로부터 수득된다. 호중구 이동 동역학의 측정이 시험 피검체 및 대조 피검체에 대해 상기 장치에서 측정되고, 잠재 치료 화합물이 효능에 대해 시험될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 세포는 당뇨병 피검체 및 비-당뇨병 피검체로부터 단리된다. 또한, 세포는, 주어진 피검체의 암의 전이 잠재성이 본 발명의 장치를 사용하여 측정될 수 있도록 하는 조건 하에서, 전이성 또는 비전이성인 암에 걸린 포유류 피검체로부터 얻을 수 있다. 암에 걸리지 않은 피검체로부터 단리된 세포는 대조 세포로서 기능한다.
특정 구체예에서, 내피 세포는 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 도입될 수 있다. 그 후, 종양 세포가 상기 제 1 유체-흐름 경로, 상기 제 2 유체-흐름 경로, 또는 상기 골격내로 도입될 수 있다. 상기 종양 세포 및 상기 내피 세포는 동일한 피검체 또는 상이한 피검체로부터 얻을 수 있다. 이 구체예들은, 내피를 통과하여 순환으로 들어가거나(침입(intravasate)) 또는 순환으로부터 배출되거나(침출(extravasate)) 또는 둘 모두를 수행하는 종양 세포의 능력을 감소시키는 화합물 또는 바이오분자의 능력을 시험할 수 있다.
본 발명의 장치는 또한 조직 공학처리와 같은 시험관내 및 생체내 시스템에서 유용한, 다중 세포 타입 바이오물질을 생성시키는 데에 또한 유용하다. 본원에 기재된 장치는 둘 또는 그 초과의 타입의 진핵 세포를 함유하는 생물학적 또는 생체적합성 물질을 제조하기 위해 사용된다. 하나 또는 그 초과의 세포 타입(예를 들어, 둘, 셋, 넷 또는 그 초과의 세포 타입)을 함유하는 이러한 장치가 진단 또는 치료 목적을 위해 살아 있는 동물내로 이식되거나 다른 방식으로 도입될 수 있다. 추가로, 본원에 기재된 시험관내 시스템은, 조직 또는 기관 시스템의 생리학적 기능을 복제하고, 따라서 예를 들어, 약물 시험 또는 시험 화합물의 독성 스크리닝에서 유용하다.
예시적 장치
특정 구체예에서, 본 발명은
광학적으로 투명한 물질;
상기 광학적으로 투명한 물질에 커플링된 기판; 및
3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는, 미세유체 장치에 관한 것이며,
여기서
상기 기판은 포스트를 포함하고;
상기 골격은 상기 기판, 상기 포스트 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하며;
상기 기판은 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하고;
상기 제 1 유체-흐름 경로는 상기 제 2 유체-흐름 경로와 교차하지 않으며;
상기 골격은 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치되어 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은, 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서, 상기 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로는 상기 기판내의 채널이다.
특정 구체예에서, 본 발명은, 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로는 실질적으로 평행하다.
특정 구체예에서, 본 발명은, 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 플라스틱을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 PDMS를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 일시적으로 또는 영구적으로 변화된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 변화된 기판은 폴리-D-리신에의 기판의 노출, 플라즈마에의 기판의 노출, 또는 기판의 표면 패턴화의 결과이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 일시적으로 변화된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 영구적으로 변화된다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판의 내부 표면은 일시적 또는 영구적으로 변화된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 고체 또는 반고체 생물학적 또는 생체적합성 폴리머를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 콜라겐, 아가로스, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 펩티드를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 광경화성 폴리머를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 제 1 생물학적 엔티티를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 상기 기판에 실질적으로 부착된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 압력 조절장치를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 압력 조절장치는 유체가 상기 유체-흐름 경로내로 도입되는 경우에, 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체 흐름 경로 사이에 압력 차이를 만드는 밸브이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 압력 조절장치는 유체가 상기 유체 흐름 경로내로 도입되는 경우에, 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 흐름 속도의 차이를 만드는 밸브이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 제 1 유체-흐름 경로 또는 제 2 유체-흐름 경로는 저항 채널을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 제 1 유체-흐름 경로는 상기 제 2 유체 흐름 경로와 상이한 치수를 가진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 유체 입구를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 유체 출구를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 유체 입구를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 유체 출구를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 저장소를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 저장소를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은, 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머를 포함하며; 상기 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머는 제 2의 생물학적 엔티티를 통과시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 콜라겐, 아가로스, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 펩티드를 포함하고; 상기 제 2의 생물학적 엔티티는 진핵 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 콜라겐을 포함하고; 상기 제 2의 생물학적 엔티티는 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 기판내에 구획을 추가로 포함하여, 이로써 제 3 생물학적 엔티티의 배치를 위한 영역을 제공한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 상기 기판내에서 구획을 추가로 포함하여, 이로써 조직 또는 생체검사 표본의 배치를 위한 영역을 제공한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 광학적으로 투명한 물질은 유리를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 이러한 장치는 제 3 유체-흐름 경로, 제 3 유체 입구, 및 제 3 유체 출구를 추가로 포함하고; 여기서 상기 제 3 유체 입구 및 상기 제 3 유체 출구는 상기 제 3 유체-흐름 경로에 각각 작동가능하게 연결되어 있다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 골격은 상기 제 3 유체-흐름 경로의 실질적으로 전부를 차지한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 미세유체 장치에 관한 것이며, 이러한 장치는,
광학적으로 투명한 물질;
상기 광학적으로 투명한 물질에 커플링된 기판; 및
3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하고,
여기서,
상기 기판은 포스트를 포함하고;
상기 골격은 상기 기판 또는 상기 광학적으로 투명한 물질 또는 둘 모두와 접촉하고; 상기 골격은 상기 포스트와 접촉하고; 상기 기판은 제 1 유체-흐름 경로, 제 2 유체-흐름 경로, 및 제 3 유체-흐름 경로를 포함하고;
상기 골격은 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치된 제 1의 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머 및 상기 제 2 유체-흐름 경로와 제 3 유체-흐름 경로 사이에 배치된 제 2의 고체 또는 반-고체 생체적합성 폴리머를 포함하고,
상기 고체 또는 반-고체 생체적합성 폴리머는 하나 또는 그 초과의 생물학적 엔티티를 통과시킬 수 있다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서, 상기 골격은 3차원 공간에서서 2 ㎛ 이상, 3 ㎛ 이상, 4 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 또는 10 ㎛ 이상의 치수를 가진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서, 상기 기판은 다수의 포스트를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 규칙적인 방식으로 배열된 다수의 포스트를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 기판은 무작위 패션으로 배열된 복수의 포스트를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 포스트은 6각형, 원형, 정사각형, 직사각형 또는 불규칙 형태이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 포스트의 치수는 약 0.01 ㎛2 내지 약 1 mm2이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나에 관한 것이며, 여기서 상기 포스트의 치수는 약 0.01 ㎛2, 약 0.05 ㎛2, 약 0.1 ㎛2, 약 0.5 ㎛2, 약 1.0 ㎛2, 약 5.0 ㎛2, 약 10.0 ㎛2, 약 25.0 ㎛2, 약 50.0 ㎛2, 약 100 ㎛2, 약 250 ㎛2, 약 500 ㎛2, 약 1000 ㎛2, 약 2500 ㎛2, 약 5,000 ㎛2, 약 10,000 ㎛2, 약 20,000 ㎛2, 약 22,500 ㎛2, 약 25,000 ㎛2, 약 50,000 ㎛2, 약 62,500 ㎛2, 약 75,000 ㎛2, 약 0.1 mm2, 약 0.5 mm2, 내지 약 1 mm2이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 장치 중 어느 하나를 다수개로 포함하는, 고처리량 분석을 위한 시스템에 관한 것이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 세포의 유도된 이동을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
a) (i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
(ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 세포를 도입하는 단계;
c) 상기 제 2 유체-흐름 경로내로 생물학적 엔티티를 도입하는 단계; 및
d) 상기 골격내로 상기 세포의 상기 유도된 이동을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 생물학적 엔티티는 원핵 세포, 진핵 세포, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 약물, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 호중구이며, 상기 생물학적 엔티티는 내피 세포이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포가 당뇨병이 있는 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 당뇨병이 없는 인간 피검체로부터 얻어진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 당뇨병이 없는 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 당뇨병이 있는 인간 피검체로부터 얻어진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 암에 걸리지 않은 인간 피검체로부터 얻어진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 암에 걸리지 않은 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포는 내피 세포이고, 상기 생물학적 엔티티는 제 2 세포이며, 상기 제 2 세포는 종양 세포이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 세포 및 제 2 세포는 동일한 피검체로부터 얻어진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어진 상기 생물학적 엔티티는 단일 세포, 스페로이드 보디(spheroid body) 또는 종양 조직이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 혈관 형성을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간의 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격로서, 상기 골격이 상기 제 1 유체-흐름 경로와 상기 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치된, 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 내피 세포 또는 내피 세포 전구체를 도입하는 단계;
c) 상기 제 2 유체-흐름 경로내로 생물학적 엔티티를 도입시키는 단계; 및
d) 상기 골격내에서의 혈관의 형성을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 생물학적 엔티티는 원핵 세포, 진핵 세포, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 약물, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 장치는
제 3 유체-흐름 경로; 및
상기 기판과 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 제 2 골격을 추가로 포함하고,
여기서 상기 제 2 골격은 상기 제 1 유체-흐름 경로와 상기 제 3 유체-흐름 경로 사이에 배치된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 이러한 방법은, 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 제 2의 생물학적 엔티티를 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 내피 세포 또는 내피 세포 전구체는 공-배양물에 불균일 혼합물로서 도입된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 이러한 방법은, 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 혈관 단편(fragment)을 도입시키는 단계를 추가로 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 침투율을 측정하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 제 1 물질을 도입시키는 단계; 및
c) 상기 골격내로의 상기 제 1 물질의 침투율을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 제 1 물질은 유체 또는 작은 분자이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 골격은 세포 단층을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 제 1 물질은 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 세포는 내피 세포이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 골격은 제 2 세포를 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 2 세포는 종양 세포이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 1 물질은 세포를 포함하고, 상기 세포가 내피 세포이며, 상기 골격은 제 2 세포를 포함하고; 상기 제 2 세포는 종양 세포이고; 상기 내피 세포 및 상기 종양 세포는 동일한 피검체로부터 얻는다.
특정 구체예에서, 본 발명은 침투율을 측정하는 방법으로서,
a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 제 1 물질을 도입시키는 단계;
c) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 제 2 물질을 도입시키는 단계; 및
c) 상기 골격내로의 상기 제 2 물질의 침투율을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 1 물질은 제 1 세포이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 1 세포는 내피 세포이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 2 물질은 제 2 세포이다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 2 세포는 종양 세포이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서 상기 제 1 세포와 상기 제 2 세포는 동일한 피검체로부터 얻어진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 세포 추적제(cell tracking agent)를 평가하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격을 포함하는 장치를 제공하는 단계;
b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 세포 추적제를 도입시키는 단계; 및
c) 상기 골격내로의 상기 세포 추적제의 확산을 측정하는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 이러한 방법은, 파라미터를 모니터하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 이러한 방법은, 둘 이상의 파라미터를 모니터하는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 파라미터는 표면 전단 스트레스, 상기 골격을 통한 간질 흐름, 비-반응성 용질에서의 구배, 세포-배양 골격의 특성, 또는 실시간 세포의 특성이다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 장치는 상기 언급된 장치 중 어느 하나가다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로서, 여기서, 상기 골격은 3차원 공간에서 2 ㎛ 이상, 3 ㎛ 이상, 4 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 또는 10 ㎛ 이상의 치수를 가진다.
특정 구체예에서, 본 발명은 장치를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 이러한 방법은,
a) 제 1 유체-흐름 경로, 제 2 유체-흐름 경로, 및 포스트를 포함하는 기판과 액체 골격 물질을 접촉시키는 단계; 및
b) 상기 기판에 광학적으로 투명한 물질을 작동가능하게 연결시키는 단계를 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 장치는 상기 언급된 장치 중 어느 하나가다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 액체 골격 물질은 단량체 콜라겐(monomeric collagen)을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 이러한 방법은, 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉시키기 전에 상기 기판을 변화시켜서 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성, 또는 골격 부착 특성을 변경시키는 단계를 추가로 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 기판을 변경시키는 단계는 상기 기판을 폴리-D-리신에 노출시키거나, 상기 기판을 플라즈마에 노출시키거나, 상기 기판을 패턴화하는 것을 포함한다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 기판은 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉시키기 전에 일시적으로 또는 영구적으로 변화되어서, 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성 또는 골격 부착 특성을 일시적으로 또는 영구적으로 변경시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 기판은 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉시키기 전에 일시적으로 변화되어서, 일시적으로 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성, 또는 골격 부착 특성을 변경시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 기판은 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉하기 전에 영구적으로 변화되고, 이로써 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성, 또는 골격 부착 특성을 영구적으로 변경시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서 상기 기판의 내부 표면이 변화된다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 액체 골격 물질을 상기 기판과 접촉하는 단계는 상기 제 1 및 제 2 유체-흐름 경로와 실질적으로 불연속적인 상기 기판의 한정된 영역내로 압력하에서 상기 액체 골격 물질을 주입시키는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 액체 골격 물질을 상기 기판과 접촉시키는 단계는 상기 액체 골격 물질을 미세 주입하는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 액체 골격 물질을 상기 기판과 접촉시키는 단계는 제 1 유체-흐름 경로 또는 제 2 유체-흐름 경로내로 상기 액체 골격 물질을 도입시키는 것을 포함한다.
특정 구체예에서, 본 발명은 상기 언급된 방법 중 어느 하나에 관한 것으로, 여기서, 상기 골격은 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상, 2 ㎛ 이상, 3 ㎛ 이상, 4 ㎛ 이상, 5 ㎛ 이상, 또는 10 ㎛ 이상의 치수를 가진다.
예증
일반적으로 기재되어 있는, 본 발명은, 하기 예를 참조함에 의해 더욱 쉽게 이해될 수 있으며, 이 예들은, 본 발명의 특정 측면 및 예의 예시의 목적을 위해서만 포함되어 있고, 임의의 방법으로 본 발명을 제한하려는 의도는 없다. 모든 표제는 독자의 편의를 위한 것이고, 달리 특정되지 않는다면, 상기 표제를 따르는 본문의 의미를 제한하려고 사용되어서는 아니된다.
실시예 1: 미세유체 장치 제조 및 표면 변화
미세유체 네트워크의 디자인은, 표 1에 제공된, 미세유체 유체-흐름 경로 (또는 "채널"), 젤 "케이지" 및 마이크로-필라의 치수를 이용하여, AutoCAD® 소프트웨어(Autodesk, San Rafael, CA)로 이루어졌다.
Figure pct00001
당업자는, 상기 장치의 각 구성요소의 치수 및 모양이 주어진 용도를 위해 특정될 수 있음을 인식할 것이다. 상기 채널 너비 및 높이는 독립적으로 수 마이크론(㎛) 내지 수 mm일 수 있고, 직사각형, 원형 또는 제조될 수 있는 여러 다른 모양일 수 있다. 상기 젤 케이지의 치수는 포스트, 필라 또는 다른 구조에 더하거나 이를 포함하여, 수 ㎛ 또는 그 미만 내지 수 mm 또는 그 초과로 특정될 수 있다. 필라 크기는 수 ㎛ 또는 그 미만 내지 수 mm 또는 그 초과 (예컨대 100 ㎛, 150 ㎛, 또는 250 ㎛, 그리고, 직사각형, 원형 또는 다른 모양으로 제조됨)일 수 있다. 젤 케이지의 높이는, 주어진 채널의 높이와 동일하거나, 이를 초과하거나 그 미만일 수 있다. 상기 골격은 또한 하나 또는 그 초과의 미세유체 채널을 함유할 수 있다.
투명 마스크(transparency mask)는 약 수 100 ㎛의 최소 기하학 피처(feature) 크기를 지니는 상기 CAD 파일로부터 만들어졌고, 고해상도 프린터(PageWorks, MA)로 인쇄되었다. 다른 타입의 마스크는 페이즈-시프트 마스크(phase-shift masks), 및 함침 포토리소그래피 함침(immersion photolithography immersion), 뿐만 아니라 MoSi 및 TaZSiO2 마스크이다. 이 투명 마스크는 실리콘 웨이퍼 마스터를 만들도록 SU-8 포토레지스트의 포토리소그래피에서 사용되었다. 미세유체 장치는 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) (Dow Corning, USA)를 레플리카 몰딩(replica-molding)18하고 2시간 동안 80℃ 오븐에서 상기 실리콘 마스터에 대해 탈기된 엘라스토머 믹스(10:1, 베이스:경화제)를 경화시킴에 의해 제조되었다. PDMS 생체적합적이고, 훌륭한 광학 투명성을 가진다. 중합된 PDMS 기구들은 실리콘 마스터로부터 필링 오프(peel off)되었고, 개별 바이오리액터 기구들(35-mm 직경, 0.8-1 cm 높이)은 커팅 아웃(cut out)되었고 입구 및 출구는 뾰족한 플랫-마무리된(sharpened flat-ended) 16-게이지 바늘을 사용하여 개별 유체-흐름 경로로 코어 다운(core down)되었다. 세포 배양 전에, PDMS 기구들은 세척되었고, 20분 동안 120℃에서 습식 사이클에서 살균되었으며, 후속하여 35분 동안 120℃에서 건식 사이클을 거쳤다(20분 살균/15분 건조). 다음에, PDMS 표면은 골격 형성을 용이하게 하기 위해 공기 플라즈마에 노출시킴에 의해 친수성이 되도록 하였다. 살균된 장치는 플라즈마 클리너(plasma cleaner)(Harrick, CA) 챔버 (pattern side up) 내의 트레이상에 배치되었다. 펌프-다운 사이클(~2분)을 개시하였고, 후속하여, 핑크 플라즈마로 2분 동안 조사(irradiation)하였다. 표면 처리된 기구를 살균 컨테이너 내에서 저장하였고 플라즈마 처리 후 0.5 - 2 h 이내에 사용하였다. 중합 후, 플랫 PDMS 표면은 소수성이고 불량한 습윤성(wetability)을 나타낼 수 있고; 미처리된 PDMS 기구들내로의 골격 주입은 종종 유체-흐름 경로내로 삼출되는 젤을 생성시키며, 종종 젤 케이지를 채우지 못하여, 마이크로-필라에 인접한 위치에 작은 버블을 생성시켰다. PDMS의 소수성은 미세조정될 수 있고 PDMS 표면은 공기 플라즈마19에의 노출에 의해 일시적으로 친수성이 될 수 있다. 플라즈마 처리에 후속하여, 소수성 회복 시간은 제조 및 저장 방법에 의존한다. 예를 들어, 열 노화, 더 긴 산화 시간 및 질소내 저장은 소수성의 회복을 지체시키는데 효과적이다20. 여기서, PDMS는 유리로의 즉시 결합을 위해 전형적으로 요구되는 것보다 더 긴, 2분 동안 공기 플라즈마로 표면 처리되었다. 매크로-크기 플럼빙(plumbing)에 연결되는 경우에 밀봉(seal)을 유지하기 위해, 전형적 미세유체 장치는 누출을 방지하기 위해 유리 또는 PDMS 층에 영구적으로 결합되거나 진공 밀봉21되었다. 그러나 골격 퍼짐 및 충전을 봉쇄(contain)하도록 사용된 플라즈마 처리가 유리로의 결합을 촉진시키기에 충분하였고, 따라서 추가 접착 단계가 필요하지 않는 것으로 결정되었다.
실시예 2: 미세유체 장치내에서의 골격의 형성
미세주입 스테이션을, 무균 조건 하에서 장치내로 세포 배양 골격(서브(sub) μL 부피)을 로딩하기 위해 만들었다. 이 시스템 구성요소는 매뉴얼 미세조작기(MN-151 Joystick Micromanipulator with H-7 Pipette Holder, NARISHIGE, NY), 마이크로리터 주사기(Hamilton, 62RNR, 2.5 μL SYR, 22s/2"/3, VWR), 디지털 현미경(Big Blue QX5, COMPUVISOR.COM, TX) (모두가 층류 후드(laminar flow hood) 내에 하우징되어 있음) 및 시각적 안내를 위한 모니터를 포함하였다. MN-151 조이스틱 피처는, XY 평면에서의 미세규모 조정의 제어를 제공하며, X, Y 및 Z 축을 따라 추가로 거친 조정(coarse adjustment)의 제어를 제공한다.
골격 미세주입. 상기 기재된 친수성으로 된 이의 표면을 가진 살균된 PDMS 장치는 비디오 모니터 상의 클리어 뷰(clear view)로 "젤 케이지"를 가진 현미경 스테이지 상에 위치된다(패턴화된 표면이 위쪽을 향함). 미세조작기에 부착된, 마이크로리터 주사기의 팁(프리-폴리머 용액으로 사전 로딩됨)은 "젤 케이지" 위쪽으로 수 마이크론되는 곳에 위치되고, 상기 프리-폴리머 용액의 작은 점적이 수동으로 만들어져서, 상기 점적이 상기 마이크로-필라와 처음으로 접촉할 때까지 하강된다. 점적 크기는 점적의 직경이 상기 젤 케이지의 너비의 반과 이의 직경이 거의 동일하게 되도록 조절된다. 작은 점적이 상기 젤 케이지 바로 위에 만들어지고, 하강되고, 분배(dispensed)되며; 이 방법은 상기 젤 케이지가 채워질 때까지 반복되었다.
골격 로딩 및 장치 어셈블리. 젤 프리-폴리머 용액(콜라겐 타입 I, 이 실험의 경우 래트 꼬리)은 상기 젤 케이지내로 미세주입되고; 유체 채널은 깨끗한유리 커버 슬립으로 밀봉되고(35 mm, VWR) 기계 클램프로 고정된다. 이는 다수의 기구에 대해 따로 따로 반복된다. 골격 주입 후, 어셈블된 PDMS 기구는 제 2의 습윤된 컨테이너에 놓여서, 상기 젤이 건조되는 것을 막는다. 젤은 상기 습윤된 배양기에서 37℃에서 30분 동안 중합되었다.
골격을 가로지르는 구배의 형성의 증명. 콜라겐을 함유하는 골격의 중합 후, 유체-흐름 경로는 세포 배양 배지(보충물 없이)로 채워졌다. 구배 연구는, 20 ㎍ mL-1의 초기 농도에서 형광 덱스트란(40 kDa, Invitrogen)의 희석 용액에 의해 하나의 흐름 경로내의 배지를 대체하며 정지 조건 하에서 수행하였다. 형광 강도는, Nikon TE300 현미경(Nikon Instruments Inc., NY)으로 가시화되었다. 젤 영역의 일련의 형광 이미지(4X 확대)는 Openlab(Improvision, MA) 데이터 획득 소프트웨어를 사용하는 Hamamatsu 카메라(Hamamatsu, Japan)로 얻었고, 추가 분석을 위해 저장하였다. 이미지는 각 시점에서 상기 젤을 가로지르는 형광 강도의 변화를 얻기 위해 가공되었다. 타입-랩스 형광 이미지의 이미지 프로세싱은 커스텀 리튼(written) MATLAB(Math Works, MA) 코드를 사용하여 수행하였다. 요약하면, 상기 젤 영역의 각 형광 이미지는 상기 PDMS 마이크로-필라를 배제시킨 직사각형 섹션으로 나눴다. 픽셀 강도 및 상기 "소스(source)" 채널로부터 상응하는 위치를 이 직사각형 섹션에 대해 기록하였다. 평균 형광 강도를, 상기 젤의 길이를 가로지르는 모든 픽셀들을 위한 덱스트란 채널로부터 동일한 거리에서 픽셀에 대해 계산하였다. 각 시점에서, 상기 젤을 가로지르는 표준화된 평균 강도 프로필의 플롯을 만들었다. 실험 확산 곡선을 FEMLAB(Comsol, USA)에서 만들어진 유한 요소 모델(finite element model)로부터 얻어진 이론적 곡선에 피팅(fitting)시켰다.
일 채널로 형광 덱스트란의 도입 후 상기 젤 케이지 내 농도 프로필의 전형적 시간 경과는 도 11a에 도시되어 있다. 상기 젤의 표준화된 형광 강도
Figure pct00002
는 상기 덱스트란(40kDa) "소스" 유체 경로로부터 표준화된 거리(x/xmax)에 의해 플롯된다. 정상 상태 농도 프로필은 40분 내에 도달되었다. 이 연구에서, 40 kDa 덱스트란이 선택되었는데, 왜냐하면 이는 VEGF, bFGF 및 IGF22를 포함하는 관심있는 여러 성장 인자와 크기가 유사하기 때문이다.
상기 정상 상태 실험 데이터를 1 x 10-6cm2s-1의 확산 계수를 가정한 유한 요소 모델로부터의 결과와 비교하였다. 이 값은, 문헌23 , 24에 기록된 값의 범위와 잘 맞는다. 3차원 매트릭스를 가로지르는 가용성 인자의 구배를 만드는 능력은 스프라우팅 혈관신생(sprouting angiogenesis), 종양 전이 및 면역 반응을 포함하는 유도성(directional) 이동 중 생리학적으로 관련한 메커니즘을 자극하는 잠재성을 제공한다. 이주 세포의 동적 운동성은 제어된 미세환경에서 프로빙(probed)될 수 있고 실시간으로 모니터될 수 있다. 추가로, 이러한 인자들의 공간적 그리고 시간적 프리젠테이션은, 비록, 일 군은 미세유체 래더(ladder) 챔버25에서 농도 구배를 만드는 능력을 증명하였지만, 제어의 또 다른 수준으로서, 상기 제어가 생리학적으로 관련되지만 대부분의 현 시스템에서 가능하지 않은 수준을 제공한다.
실시예 3: 듀얼 유체-흐름 경로 장치의 모세관 형태형성의 연구
장치 및 골격 형성의 설명. 듀얼 유체-흐름 경로 장치는 본원에 기재된 레플리카 몰딩 기술 및 표준 소프트 리소그래피를 사용하는 PDMS로부터 제조되었다. 상기 장치는, 두 개의 평행한 흐름 경로 및 중심 "젤 케이지" 횡단 경로를 함유하여, 세포 배양을 위해 주입가능한 생물학적으로-파생된 또는 합성 골격(여기서, 소프트 히드로젤)을 함유한다. 본원에 기재된 상기 장치를 사용하여, (1) 표면 전단 스트레스, (2) 상기 매트릭스를 통한 간질 흐름 (3) 화학주성물질 또는 화학반성(chemorepellants)의 구배 (4) 상기 골격의 특성, (5) 셀을 실시간으로 동시에 모니터링, 및 (6) 공동-배양 세포의 효과를 제어할 수 있다.
마이크로-필라의 스태거드 어레이를 상기 젤 케이지에 통합시켜서, 상기 골격을 위한 기계적 안정성을 제공하였으며, 이를 통해 상기 골격은 수 센티미터(cm)의 물의 과량의 압력 차이를 견딜 수 있었다. 제 위치의 상기 골격으로, 상기 두 개의 흐름 경로는 서로 실질적으로 분리되었고, 어떠한 액체도 상기 두 흐름 경로 사이에서 이동될 수 없었다; 그러나, 한 흐름 경로로부터 또 다른 흐름 경로로 상기 다공성 골격을 통해 가용성 인자의 확산 또는 대류는 제한되지 않는다. 모든 세포 배양을 5% CO2 및 37℃에서 습윤화된 인큐베이터에서 배양하였다. 인간 성인 피부 미세혈관의 내피 세포(HMVEC-ad, LONZA, USA)를 5% 우태아 혈청으로 EGM-2MV 배지 시스템에서 증식시켰다. 세포를 콜라겐-코팅된 플라스크에서 팽창시켰고, 계대 6-8에서 사용하였다. 세포는 2 mg mL-1의 최종 젤 농도로 빙냉 액체 타입 I 래트 꼬리 콜라겐에서 1 x 106 세포 mL-1에서 잘 현탁되었다. 액체 콜라겐은, 콜라겐 스톡 용액을 1OX PBS, 1 M NaOH 및 조직 배양 등급 물(water)의 혼합물에 첨가하여 2.5 mg mL-1 용액을 얻음에 의해 제조되었다. 고밀도 세포 현탁액의 미리 정해진 부피를 그 다음에, 상기 콜라겐 용액과 혼합시켜서 요구된 시딩 밀도를 얻었다. 상기 콜라겐/세포 혼합물을 본원에 기재된 바와 같이 마이크로리터 주사기 및 젤 캐스트에 로딩하였다. 상기 미세주입 프로토콜은, 직접 상기 디자인된 공간에, 세포를 가지고 또는 없이, 골격 물질의 미량의 부피를 로드하는 능력을 제공하였다. 대안적으로, 상기 골격의 살포 로딩은 제공되었다. 젤화 후, 유체-흐름 경로를 세포 배양 배지로 채웠고 24시간 동안 배양하였다. 생화학 인자의 효과를 증명하기 위해, 세포를, 완전한 배지(컨트롤) 또는 혈관생성 전구 인자(pro-angiogenic factors)(bFGF, VEGF 및 PMA 모두 50 ng mL-1)로 부화된(enriched) 배지로, 정지 조건 하에서 배양시켰다. 세포는 24시간 시점에서 보충된 bFGF/VEGF/PMA 칵테일로 보충된 배지 또는 완전한 배지에서 수일 동안 배양물에서 유지되었다. 샘플을 고정시켰고, 형광 마커로 태그 달았고 이미지화하였다.
3D 캡슐화된 세포 상의 표면 전단 스트레스. 생물 물리학 자극의 효과를 증명하기 위해, 세포에 작은 수준의 표면 전단 스트레스를 가하였다. 상기 골격의 상기 표면 상의 내피 세포를 가진 장치를 형성하였고, 압력 차이(50 Pa)를 상기 저장소 칼럼 내 배양 배지의 높이의 변화를 주면서 상기 차이를 가변시킴에 의해 상기 골격을 가로질러 부과하였다.
내피 세포 단층 형성. 두 개의 상이한 세포 시딩 프로토콜은 기판을 제어하기 위해 사용하였고, 상기 기판 상의 내피 세포는 초기에 컨플루언트 단층, 즉 2D 및 3D 기판 단층 시딩을 형성하였다. 콜라겐 젤 골격을 이미 기재된 방식과 같이 형성하였다. 젤화 후, 유체-흐름 경로를 2 mg mL-1 피브로넥틴 코팅 용액으로 채웠고, 밤새 배양하였다. 세포 시딩 전에, 상기 코팅 용액을 완전한 배지로 대체하였고, 또 다른 2-4시간 동안 평형을 유지하였다. 2-3 x 106 세포 mL-1의 세포 현탁액을 하나의 유체-흐름 경로로 흐르도록 하였고, 상기 세포를 단단한 유리 또는 컴플라이언트 골격 표면에 부착되도록 하였는데, 이는 이들이 중력에 의해 현탁액으로부터 정착되기 때문이다. 내피 세포를 추가 처리 전에 상기 단단한(2D 단층 시딩) 또는 유순한(3D 시딩) 표면 상에 24-48 시간 동안 배양시켰다. 혈관 생성 전구 인자는 구배 또는 균일한 농도로서 제시되었다. 이 분석을 위해 VEGF(10-50 ng mL-1) 및 SlP (250 nM)를 형태형성을 증진시키기 위해 사용하였다.
모세관 형태형성 및 튜브와 같은 구조의 특징. 주 메커니즘으로서 이에 의해 신 혈관 또는 모세혈관이 생체내에서 형성되는, 혈관신생26의 메커니즘은, 매트릭스 퇴보, 세포 이동, 증식 및 루멘 형성을 포함하는 일련의 잘-서술된 단계를 포함한다. 이는, 대사 스트레스27 ,28, 기계적 스트레스29 -31, 가용성 인자32 및 ECM 매트릭스 성분33 ,34에 의해 영향된 타이트하게 규정된 방법이다. 위상차 현미경, 형광현미경(epifluoresence) 및 공초점 현미경(confocal microscopy)을 내피 세포 구조의 3차원 형태 및 모세관 형태형성의 특징을 기술하기 위해 사용하였다. 형광 및 페이즈 컨트라스트 이미지를 Hamamatsu 카메라 및 Openlab 이미지 획득 소프트웨어가 장착된 Nikon TE300 현미경 상에 얻었다. 위상차 현미경으로, 매 12-24 시간의 살아있는 샘플의 타입-랩스 이미지를 취했다. 샘플을, 4.0% 파라포름알데히드(PFA)로 고정시켰고, 액틴 세포골격 및 세포 핵을 위해 형광 마커로 태그하였다. 공초점 이미지를 Imaging Suite(PerkinsElmer Life Science) 습득 소프트웨어로 공급된 스피닝 디스크 공초점 현미경(Zeiss Axiovert 200M)를 사용하여 수집하였다. 일련의 100 광학 시리얼 섹션(1 ㎛ thick)을 얻었다. 정렬된 이미지를 스태킹하고 Imaris (Bitplane, MN)를 사용하여 3D 가시화를 위해 랜더링 되었다. EGM-2MV 완전한 배지에서 콜라겐 코팅된 플라스크 상의 서브-컨플루언스가 수득되고 후속하여 미세유체 장치에서 배양될 때까지 HMVEC-ad를 배양하였다. HMVEC-ad는 수 일의 기간 동안 가시적으로 남아 있다. 세포 시딩 후 수 시간 내 내피 세포는 콜라겐 젤 상 단층을 형성한다.
타입-랩스 무비(movie)를 스프라우트 형성 중 세포 메커니즘의 특징을 기술하고 연구하기 위해 상기 미세유체 장치의 능력을 증명하기 위해 만들었다. 전통적 스프라우팅 모델에서, 세포가 단층을 통해 보이기 때문에, 이 능력은 제한된다. 본 발명의 미세유체 장치를 사용하여, 유도성 스프라우팅 및 이동은 현미경 관측 평면에서 발생된다. 타입-랩스 이미징은 "리드-세포(lead-cell)"를 보여주며, 이는 아래 3D 콜라겐 매트릭스를 침입한다. 싱글 스프라우트 형성의 경우에; 상기 리드-세포는 필로포디아 돌출부를 상기 아래 매트릭스로 연장시켰으며, 한편, 상기 단층 상의 상기 이웃하는 내피 세포는 비-침습성으로 남아 있다. 세포 침습은 동적 돌출 및 필로포디아의 퇴축의 기간을 따르며, 한편, 상기 단층과 접촉을 유지하고 높은 극성으로 남아 있다. 초기 루트와 같은 구조는 더욱 동적 더 작은 연장으로 수 분동안 지속되는 이동 방향으로 형성된다. 후속 형태 변화는, 증가된 침투 깊이, 필로포디아 직경 및 단층으로부터의 세포 전위(핵의 이동에 의해 보임)를 포함하며, 후속하여, 원뿔형 구조(루멘 형성의 개시)를 포함한다. 상기 침습성 세포는 후속적으로 열린 루멘 구조로 스프라우트를 형성한다. 이 시스템으로, 생체내 스프라우팅 혈관 신생 중 발생되는 모든 순차적 세포 메커니즘을 관찰하였고 증명하였다. 수일 동안 배양되어 유지된 내피 세포는 다중-세포 모세관과 같은 구조를 형성한다. 단점(Endpoint) F-액틴 및 DAPI 라벨링은 이 구조들의 조직화 및 복잡성을 보여준다. 그러나, 정지 조건 하에서 유지된 모세관은 퇴행(regress)하고 상기 단층과의 이의 연결을 잃는다. 모세관 형성의 특징 중 하나는 루멘 구조의 발달이다. 열린 루멘의 존재를 증명하기 위해, 형광 미세구체를 상기 단층의 정점(apical) 표면 상에 상기 채널에 더하였다.
콜라겐 젤에서 군집을 이룬 내피 세포의 배양은 매크로-크기 시스템35에서 이전에 연구되었지만, 미세규모 장치에서는 아직 연구되지 않았다. 3차원 골격에서 배양된 단리된 세포는 다중-세포 코드(chord) 및 내피 세포 링을 형성했다. 생화학 자극의 효과를 증명하기 위해, 3차원 캡슐화된 내피 세포를 bFGF, VEGF 및 PMA로 보충된 배지에서 배양시켰다. 예상되는 바와 같이, 대조 샘플에 비해 형태의 극적인 차이가 있었다. 대조 샘플에서, 세포는 단리된 다중-세포 링-유사 구조를 형성하기 위해 이동되고 조직된다. 전혈관형성 인자와 자극된 세포는 컴플렉스 상호연결된 멀티-세포 모세관과 같은 구조를 형성하기 위해 리모델된다. 간질 흐름의 존재에서, 내피 세포는 생기 젤/액체 인터페이스에서 상기 젤 및 상기 단층 내 다중-세포 구조를 형성한다.
미세유체 장치에서 배양된 미세 혈관 내피 세포는 넓은 형태형성을 경험하였다. 피브로넥틴 코팅된 채널 상의 내피 세포는 이의 특징적 조약돌 표현형(cobblestone phenotype)을 계속 유지하며, 한편 형태의 주목할만한 차이는 상기 젤 표면에서 명백하였다. 시트 또는 튜브 형성 전에, 세포는 연속적(contiguous) 구조로서 상기 젤 영역에 공포(vacuole) 및 소포(bleb)의 현저한 증가로, 이동되었다. 이 구조들은, 매우 동적이지만, 더욱 안정한 시트 및 튜브로 점차 진화된다. 내피 세포 네트워크의 공초점 이미지 및 후속 3D 재구조로부터 얻어진 고정된 샘플의 시리얼 섹션은 상기 용기의 길이를 통해 연장되는 원형 또는 평평한 루멘과 같은 구조의 존재를 확인한다. 연속 루멘의 존재는 작은 압력 강하 하에서 상기 용기를 통해 베드를 흘림에 의해 추가로 증명된다. 일부는 상기 젤 케이지를 가로질러 모든 길에서 흐르는 것이 관찰되며, 다른 것은 혈관 구조에서 넥-다운(necked-down) 영역에서 수집된다.
미세혈관 내피 세포 스프라우팅 비디오. 실시간 세포를 모니터하는 능력을 증명하기 위해, 스프라우팅 혈관신생 중 내피 세포의 타입-랩스 비디오 이미지를 기록했다. 본원에 기재된 콜라겐 젤 골격 상에 내피 단층을 형성했다. 상기 미세유체 장치를 37℃ 및 5% CO2에서 커스텀 빌트(custom built) 환경 대조 챔버에서 유지되었고, 세포는 Zeiss 인버트된 현미경으로 가시화되었다. 실험의 과정 중 증발을 최소화하기 위해, 배지 저장소(0 높이 차이로)를 각 입구 및 출구 포트에서 직접 연결시켰다. 그 다음에 상기 장치는 가시화를 위해 아래에 컷-아웃 유리 윈도우 및 습윤화된 로컬 환경을 가진 부 컨테이너에 배치되었다. 브라이트-필드 이미지를 Axio Vision 이미지 획득 소프트웨어로 2분 간격에서 AxioCam MRm(Carl Zeiss)(싱글 광학 플레인(single optical plane)에서)로 취했다.
세포 골격 및 핵 염색. "모세관-유사" 네트워크 또는 튜브 구조에 포함된 세포의 수 및 F-액틴 분배는 상기 장치 내 2-7일 배양 후 평가되었다. F-액틴 및 핵 염색을 4.0% PFA(30분)으로 고정 후 수행하였다. 상기 고정된 샘플을 IX 인산염 완충된 염수(PBS)로 두 번 세정하였고, 0.1% Triton-X(1-2 분)으로 처리하였고, IX PBS으로 세정하였고, 후속하여 DAPI 및 로다민 팔로이딘의 혼합물의 주입(30분)하였고, IX PBS으로 최종 세척하였다.
실시예 4: 다중 유체-흐름 경로 장치 내 세포 이동의 연구
PDMS 미세유체 분석 준비. 미세유체 분석을, SU-8 패턴화된 웨이퍼로 일반적 소프트 리소그래피 방법에 의해 PDMS(폴리-디메틸 실록산, Silgard 184, Dow Chemical, MI)로 하였다. 4-인치 실리콘 웨이퍼를 5분 동안 200℃ 핫 플레이트에서 탈수시켰고, 그 다음에, SU-8 2050 광레지스트(MicroChem, MA)에 의해 코팅하였다. 상기 코팅된 웨이퍼를 핫 플레이트에서 소프트 베이크하였고, UV 얼라이너(aligner)(EVGroup, AZ)에 노출시켰고, 다시 베이크 하였다. 패턴을 PM 아세테이트에 의해 발달시켰고, 이소-프로필 알코올로 세정하였다. 상기 웨이퍼를 그 다음에 트리데카플루오로-1,1,2,2,-테트라히드로옥틸-1-트리클로로실란으로 코팅하여 상기 경화된 PDMS를 쉽게 상기 웨이퍼로부터 탈착 가능하도록 하였다. PDMS 경화 키트를 혼합하였고, 상기 웨이퍼 상에 부었으며, 이를 그 다음에 80℃에서 2시간 동안 오븐에서 경화하였다. 상기 경화된 PDMS를 상기 웨이퍼로부터 탈착하였고, 트리밍하였고 펀칭하여 미세유체 채널의 입구 및 출구를 형성하였다. 제조된 PDMS 장치 및 유리 커버슬립을 고압멸균(autoclave)하였고 밤새 80℃에서 오븐에서 건조하였다. 그 다음에 이들을 공기 환경에서 플라즈마 클리너(Harrick, CA)에 의해 40초 동안 플라즈마 처리하였고, 닫힌 미세유체 채널을 형성하기 위해 함께 결합시켰다. 상기 결합된 장치를 10분 동안 80℃의 오븐에 유지시켜서 상기 결합 강도를 높였고 그 다음에 코팅 용액을 상기 채널에 채워서 상기 채널이 세포 시딩에 적합하도록 하였다. 상기 장치를 그 다음에 흡입시켰고 살균수로 세척하였다. 그 다음에 상기 코팅된 장치를 24시간 동안 80℃의 오븐에서 건조시켜서, 상기 채널 표면을 소수성을 만들었다. 골격 물질을 그 다음에 상기 젤 영역에 채워서 젤 골격을 형성하였다. 상기 실험에서, 타입 I 콜라겐(BD Biosciences, MA)을 피펫으로 채웠고 인큐베이터에 30분 동안 유지시켰다. 젤 중합 후, 세포 배양 배지를 미세유체 채널에 채웠고 상기 장치를 셀 시딩을 위해 인큐베이터에 유지시켰다.
배지 변화, 덱스트란 확산 실험 및 흐름 적용. 상기 채워진 배지는 상기 배지의 증발을 피하기 위해 입구 및 출구 상에 점적으로서 유지되어야 한다. 현존하는 점적을 흡입하고 일 측면 상의 배지의 새로운 점적을 더하는 것은, 모세관 힘에 의해 마이크로 흐름을 생성할 수 있어서, 상기 세포 상의 최소 전단 스트레스로 상기 채널 내 오래된 배지를 대체할 수 있다. 유체 전단 스트레스 또는 압력 구배와 같은 기계적 혈관 형성 인자를 적용하기 위해, 튜브 및 펌프를 구성하는 유체 서킷은 정확한 제어된 흐름을 적용하기 위해 상기 장치의 입구 및 출구에 연결될 수 있다. 조건 채널로부터 세포 채널로 생화학 인자의 확산을 가시화하기 위해, 40 kDa의 분자량을 가진 덱스트란을 최종 농도 0.5 ㎍/mL로 내피 성장 인자와 혼합하였고 조건 채널에 더해졌다. 상기 확산 프로필은, 형광 현미경(Nikon Instruments, NY)에 의해 취해졌고, Matlab에 의해 분석하여 이미지로부터 강도 그래프를 얻었다. 형광 덱스트란의 상기 콜라겐 젤 골격으로의 타입-랩스 확산을 측정하였다. 안정하고 선형 구배를 얻었고 수 시간 동안 유지하였다. 이미지를 상기 조건 채널로 덱스트란 혼합된 배지를 적용한 10시간 후에 얻었다. 덱스트란의 분자량은 VEGF의 40 kDa의 분자량이었다. 사용된 상기 콜라겐 골격은 pH 7.4에서 중합된 2.0 mg/mL 농도를 가졌다. 콜라겐 젤 골격으로 덱스트란의 일시 확산 곡선은 30분 내 일 유체-흐름 결로로부터 상기 골격을 통해 또 다른 유체-흐름 경로로 덱스트란 이동을 보여준다.
내피세포 배양. 상기 세포 현탁 배지를 2x106 세포/mL로 제조하였고 상기 세포 배양 채널로 채웠다. 채움 후, 상기 장치를, 상기 배지가 대체되기 전에, 상기 세포가 정착되고 상기 기판 상에 부착되도록 30분 동안 인큐베이터에 유지시켰다. 상시 세포 부착 기간은 상기 세포 타입에 의존하여 30분 내지 수 시간이다. 인가 피부 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 상업적으로 입수 하였고(Lonza, NJ), 9이하의 경과(passage)를 위해 콜라겐 I (BD Biosciences, MA)로 미리 코팅된 규칙적 배양 플라스크 상의 내피 성장 배지(EGM -2MV; Lonza, NJ)로 팽창시켰다. 재조합 인간 혈관 내피 성장 인자(VEGF; R&D 시스템s, MN)를 작업 농도 20 ng/mL로 세포 배양 배지와 혼합시켰고, 그 다음에, 상기 조건 채널에 채워서 구배를 만들었다.
세포 이동의 측정 및 정량화. 상기 장치를 37℃에서 5% CO2를 함유하는 인큐베이터에서 유지시켰고, 세포 이동을 위상차 현미경(Nikon Instruments, NY)에 의해 매일 모니터하였다. 이동된 세포 아웃라인의 상기 길이 및 영역을 ImageJ에 의해 측정하였다. 면역 형광법 염색을 수행하여 상기 최종 세포 이동 결과를 가시화하였다. 액틴 필라멘트 및 핵을 Rhodamine-Phalloidin(Sigma-Aldrich, Switzerland) 및 DAPI(Sigma- Aldrich, Switzerland)로 각각 염색하였다.
공배양 실험. 1) MTLn3/U87MG 및 HMVEC 공배양; 래트 유방 선암 세포 라인(MTLn3)을 5% 우태아 혈청(FBS), ImM Na(HCO3)2, 4 mM L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 α-최소 실제 배지(α-MEM; Invitrogen, CA)에서 성장시켰다. 인간세포주(Human glioblastoma cell line)(U87MG)를 10% FBS, ImM Na(HCO3)2, 4 mM L-글루타민, 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)에서 성장시켰다. 상기 U87MG 세포 현탁물을 농도 1 x 106 세포/mL에서 제조하였고, 상기 조건 채널에 채웠다. 고밀도의 MTLn3 세포 현탁물은 농도 1 x 106 세포/mL였고, 저밀도는, 농도 0.5 x 106 세포/mL였다. HMVEC 현탁물을 상기 기재된 바와 같이 농도 2x106 세포/mL에서 제조하였고, MTLn3 또는 U87MG 세포 시딩 1일 후 세포 배양 채널에 채웠다. 상기 세포 배양 채널을 내피 성장 배지로 채웠고 대조/조건 채널을 상기 기재된 MTLn3 또는 U87MG 배지로 채웠다. 배지를 매일 바꿨다. 액틴 필라멘트 및 핵을 Rhodamine-Phalloidin 및 DAPI로 각각 염색하였고, GFP-발현 MTLn3 및 U87MG 세포를 HMVEC과 구별짓기 위해 사용하였다. 평활근세포(SMCs)를 상기 기재된 HMVEC 배지에서 성장시켰고, 현탁물을 농도 0.5 x 1O6 세포/mL에서 제조하였다. 상기 현탁물을, 상기 세포 채널로의 HMVEC 시딩 1일 전에 상기 조건 채널로 채웠다. 배지를 매일 바꿨다. 액틴 필라멘트 및 핵을 Rhodamine-Phalloidin 및 DAPI으로 염색하였다. 상기 기재된 동일한 세포 현탁물을 제조하였고 U87MG 세포의 화학주성 평가를 위해 상기 세포 채널로 채웠다. 상기 대조 채널을 세포 채널과 동일한 배지로 채웠고, 상기 조건 채널을 20 ng/mL 또는 200 ng/mL hEGF로 보충된 배지로 채웠다. hEGF 구배를 세포 시딩 하루 후에 적용하였고, 상기 채널 내 모든 배지를 매일 바꿨다. 액틴 필라멘트 및 핵을 Rhodamine-Phalloidin 및 DAPI으로 각각 염색하였다. 실험에서 사용된 모든 콜라겐 젤 골격을 pH 7.4 또는 11.0에서, 농도 2.0 mg/mL 또는 2.5 mg/mL에서 중합하였다.
세포 이동을 연구하기 위한 미세유체 바이오반응기를 하기 이점을 가지도록 고안하였고 제조하였다: 1) 실시간 가시적 검사 및 쉬운 정량화, 2) 세포 타입 및 배양 조건의 다기능성 및 3) 생화학 및 생역학적 자극에 대한 정확한 제어. 세포를 시딩 하였고 ECM-유사 물질로 만들어진 상기 골격과 직접 접촉한 일 미세유체 채널(세포 채널)에서 배양하였다. 상기 세포 채널 내 세포들은 생화학 및 기계적 인자의 영향 하에서 상기 골격을 통해 상기 대항하는 채널을 향해 이동된다. 기계적 인자 예컨대 압력 구배에 의해 만들어진 유체 전단 스트레스 및 간질 흐름은 적용될 수 있으며, 한편 생화학 큐(cue)는 세포 반응을 연구하기 위해 공간적으로 균일하게 또는 제어된 구배로 도입될 수 있다. 상기 골격은 또한 부동화된 리간드 또는 작용화된 ECM의 구배로 직접 이동을 위해 기능화될 수 있다. 마지막으로, 제 2 세포 타입은 상기 젤 영역 내에 정지될 수 있거나 대항하는 채널에서 배양되어 공배양물 의존적 세포 이동 및 상호작용을 평가할 수 있다.
상기 "세포 채널"은 두 측 상에 젤 골격을 가진 중심에 위치되어서, 세포들은 기계적 및 생화학적 인자((예를 들어, 화학주성물질 또는 성장 인자(VEGF, SlP)의 유체 전단 스트레스, 간질 흐름, 골격 단단함 및 고정된 구배)의 정확하게 제어된 조건 하에서 각 측면에 이동될 수 있다. 상기 3개의 채널 디자인은, 동일한 샘플에서 동시에 상기 대조 및 조건 실험이 수행되도록 하는 독특한 특징을 가진다. 상기 외부 채널 중 하나 ("조건 채널")은 시험 작용제를를 함유하고, 한편 다른 하나("대조 채널")는 대조 배지를 함유한다. 상기 조건 채널 또는 상기 대조 채널로의 세포 이동은 직접 비교될 수 있고, 세포 활성, 세포 시딩 밀도, 배지 조성물 및 다른 환경 조건의 적은 차이 때문에, 칩-투-칩(chip-to-chip) 에러를 최소화한다.
상기 생화학 확산 및 구배 생성의 특징은 형광 태그된 덱스트란을 사용하여 평가될 수 있다. 덱스트란 40 kDa 분자량을 사용하여 성장 인자 확산을 자극하였다. 덱스트란은 상기 조건 채널에 적용되었고, 3차원 골격 영역 내 그 결과의 형광 강도는, 상기 세포 채널로 확산된 덱스트란으로서 모니터되었다. 상기 중심 세포 채널로 덱스트란의 초기 확산은 30분 내에 발생되었다. 평형을 수 시간 후 얻었고, 선형 농도 프로필을 10시간 동안 유지시켰다.
내피 세포로의 정량화 된 화학주성 실험. 모세관 형태형성의 분석에서 본원에 기재된 미세유체 장치의 기능성을 증명하기 위해, 인간 피부 미세혈관 내피 세포(HMVEC)를 상기 세포 채널에서 시딩하였고 컨플루언트 단층을 세포 시딩 1-2일 후 형성하였다. 혈관 내피 성장 인자-A(VEGF), 내피 세포 이동의 알려진 자극제23 ,24를 상기 조건 채널에 적용하였고, 상기 세포 채널과 상기 조건 채널 사이의 젤 골격 내 VEGF 구배를 발생시켰다. 상기 대조 채널을 VEGF 없이 대조군으로서 정상 세포 배양 배지로 채웠다. 배지 점적(40μL)을 상기 채널 입구 및 출구 위에 배치하여 채널들 사이 및 이에 따른 압력 차이를 제어하고(즉, 배지 변화 및 세포 시딩 중 흐름을 발생 또는 상기 실험의 과정 중 흐름 조건을 유지하지 않음), Walker et al.25에 의해 이전에 보여진 기술은 배지를 보충하기에 충분히 강한 그리고 동시에 상기 골격 또는 세포에 임의의 손상을 피하기에 충분히 약한 안정적 흐름을 생성한다. 상이한 강성도(stiffness)(pH 7.4 및 pH 11)의 콜라겐 골격으로의 세포의 이동의 길이 및 영역 변화를 관찰하였고 수일에 거쳐 정량화하였다. 상기 조건 측면에서, 세포는 빠르게 상기 골격으로 이동하였고, 한편 훨씬 적은 이동을 대조군 측면 상에서 관찰되었다.
도 20a-g에 도시된 바와 같이, 내피 세포를 콜라겐 골격으로 이동하도록 자극하였다. 도 2Oa는 내피 세포 시딩 하루 후, 컨플루언트 단층을 상기 세포 채널에 형성하였고 성장 인자(20 ng/mL의 VEGF)는 그 다음에 상기 조건 채널에 적용되었음을 보여준다. 도 2Ob는 pH 7.4 및 (c) pH 11.0에서 중합된 콜라겐 젤 골격 내 미세혈관 세포의 이동 결과를 보여준다. 세포를 VEGF 구배 적용의 5일 그리고 배양의 6일 후 고정시켰고 Rhodamine-Phalloidin 및 DAPI로 염색하였다. 흰색 점선은 젤 골격의 아웃라인을 가리키고, 골격 내 작은 사각형은 150 ㎛ x 150 ㎛의 PDMS 포스트를 가리킨다. "0.2%"은 콜라겐 농도의 2.0 mg/mL을 가리킨다. 두 경우에, 세포들은 우선적으로 VEGF 구배를 향해 상기 조건 측면 상의 젤로 이동되었음을 인식될 수 있다. 도 2Od는 농도 2.0 mg/mL로 pH 7.4에서 중합된 콜라겐 젤 내 이동된 세포의 표준화된 상대적 길이의 그래프이다. 'No VEGF'는 VEGF 구배 없이 네거티브 대조군으로서 제공된다. VEGF를 여러 기간 동안 매일 적용하였다. 'VEGF 1일에'는 세포 시딩 1일 후 첫째로 적용하였음을 의미한다. 2일 또는 3일에 VEGF는 VEGF를 세포 시딩 후 2 또는 3일 후에 첫째로 적용하였음을 의미한다. 상대적 길이를 상기 대조군 측면과의 차이로서 계산하였다. 도 2Oe는 농도 2.0 mg/mL로 pH 7.4에서 중합된 상기 콜라겐 젤 골격에서 이동된 세포의 표준화된 상대적 영역의 그래프이다. 도 2Of 및 g는 농도 2.0 mg/mL로 pH 11에서 중합된 상기 콜라겐 젤 골격에서 이동된 세포의 표준화된 상대적 길이 및 영역의 그래프이다. 모든 그래프는 일 조건 하에서 n=8(총 8 골격)로 4 장치에서의 값의 평균에 의해 만들었다.
이 분석의 민감도를 평가하기 위해, VEGF를 세포 시딩 1, 2 또는 3일 후 상기 조건 채널에 적용하였다. 결과를 2 방식으로 표현하였다: 상기 표준화된 값 및 상기 상대적 표준화된 값. 상기 표준화된 값에 대해서, 상기 측정된 데이터를 초기 시점에서 이들의 자신의 베이스라인 데이터로 표준화하였다. (Eq. 1). 상대적 표준화된 값을 상기 조건 측면과 상기 대조군 측면의 표준화된 데이터 사이의 차이로서 평가하였다. (Eq. 2).
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여기서 F0는 초기 시점의 값이고, FB는 기초 값, Fn은 n 시점에서의 값, 및 [Fn]은 표준화된 값이다. F는 세포의 외부 외피(envelope)의 길이 L이거나, 돌출된 세포 영역, S이다. 어떠한 통계적으로 큰 차이도 단지 표준화된 값으로 관찰될 수 없었다. 그러나, 상대적 표준화된 값은 VEGF 적용의 상이한 기간을 위한 세포 이동의 길이 및 영역 변화를 비교할 때 통계적으로 큰 차이를 만들었다. 길이 및 면적 변화의 상기 상대적 표준화된 값은, pH 7.4에서 중합된 콜라겐 젤로, 세포 시딩 1일 및 2일에서 적용된 VEGF가 세포 이동을 유도하였고, 한편 3일 후에 VEGF는 그러하지 못하였음을 함축한다. pH 11.0에서 중합된 콜라겐 골격(강성 젤)에서, 상기 길이 변화의 상대적 표준화된 값은 여러 시점에서 세포 이동의 큰 변화를 보여주었다. 상기 영역의 상대적 표준화된 값은, 그러나, 너무 작아서 pH 11.0에서 중합된 콜라겐 골격에서 탐지되지 않는다. 상대적 표준화된 값은 표준화된 값만을 연구하는 경우에 명백하지 않았던 통찰을 제공한다. 높은 민간성은 동일한 장치 상의 대조 실험을 비교함에 의해 달성될 수 있었고 칩-투-칩 변화성을 제거하였다.
콜라겐 골격의 기계적 특성에 의해 유도된 혈관신생. 본원에서 증명된 상기 관찰된 내피 세포 이동 패턴은 상기 콜라겐 젤 강성도에 의존한다. 젤 강성도는 더 강한(stiffer) 젤5을 가져오는 더 높은 pH 값으로 중합 전에 콜라겐 용액의 pH를 조절함에 의해 제어될 수 있다. pH 7.4 및 pH 11 젤의 초기 젤화 조건을 비교하는 것은 더 강성인 콜라겐 젤(pH 11에서 중합)은 내피 세포 집단 이동을 제한하지만, 20-30 ㎛의 범위의 직경의 관-유사 구조의 생성을 증진시킴을 드러내었다. 형성된 구조는 생체내 분석 또는 3D 매크로 분석9 ,18에서 관찰된 관-유사 모세관을 닮았고, 루멘의 존재는 상대 배양 배지로 2-㎛ 마이크로베드를 도입하고 형광 현미경을 사용하여 상기 마이크로베드 이동을 추척함에 의해 후속적으로 확인되었다. 이 확인을 위해, 낮은 간질 흐름을 점적 크기 대조군을 통해 이들 사이의 압력 차이를 유지함에 의해 상기 조건 채널로 상기 세포 배양 채널로부터 적용하였다25. 마이크로베드의 시간 경과 입자 추적을 수행하였고 베드는 시간 경과에 상기 모세관 구조의 말단에 축적되는 관-유사 구조 내에만 흘렀다.
이동된 내피 세포의 구조 상의 젤 강성도의 역할은 또한 이동된 세포의 아웃라인 내 차이에 의해 예시될 수 있다. 더 유연한 골격에서, 상기 아웃라인은 상기 골격의 두 말단에 도달하도록 넓었고, 한편 더 강성 골격에서의 아웃라인은 매우 슬렌더(slender)하고, 관-유사 구조임을 보여주었다. 이 관찰은 상기 골격의 상이한 기계적 특성을 가진 이동된 세포 및 관-유사 구조의 구조를 제어하는 상이한 기계적 특성 및 능력을 가진 골격 내 세포 이동의 상이한 모드를 함축한다. 상기 골격의 기계적 특성이 핵의 위치에 영향을 주는 것은 알리는 것은 또한 의미 있다. 더 유연한 골격에서, 이동된 세포의 핵은 세포의 중심 근처에 위치하였다.
이동된 세포의 상이한 모드 또는 구조를 양적으로 묘사하는 시도에 있어서, 표준화된 영역은 표준화된 길이에 대항하여 플롯된다. 두 개의 새로운 파라미터가 정의된다, 공식 3에서 도시된 바와 같이, (이동된 세포 아웃라인의 가정된 길이) 및 K (이동된 세포 아웃라인의 너비의 가정된 합). 이러한 가정 하에서, 관-유사 구조는 3개의 바운더리, K = 50, K = 150 및 [Sn] = 8로의 실험 값에 의해 기술된다.
Figure pct00004
신규한 미세유체 플랫폼의 여러 어플리케이션. 새로운 디자인의 주된 이점은 3D 매트릭스를 통해 그리고 내피 층을 가로지른 세포 이동을 연구하는 이의 능력이다. 암 세포 분출(extravagation)은 내피 세포와의 상호 작용에 의존함을 이전에 도시하였다26 ,27. 암세포 기질 세포는 세포 신생을 위해 내피 세포에 신호를 보냄을 충분히 인식된다. 암 치료에서, 세포 신생을 방해하는 것은, 화학요법 및 다른 치료와 함께 결정적이다28. 이러한 효과를 조사하기 위해, 암 세포 및 내피 세포의 상호작용은, 미세유체 장치 내 상기 두 세포 타입을 공배양 함에 의해 연구되었다. 래트 유방 선암 세포 라인(MTLn3) 또는 인간 중성 암 세포(U87MG)는 상기 조건 채널에서 배양되었고 HMVEC는 상기 셀 채널에서 배양되었다. 예비적 관찰에서, 고밀도 MTLn3은 상기 콜라겐 골격으로 HMVEC을 유인하였지만, 상기 이동 속도는 VEGF 구배(20 ng/mL) 유도된 HMVEC 이동에서와 비교하여 크게 느려졌고, MTLn3 세포에 의해 발생된 화학 주성 인자는 VEGF 구배보다 덜 자극성임을 제안한다. 이동의 정도는 상기 조건 채널 내 MTLn3 세포의 수에 포지트브하게 상호관련되어 있었다. 저밀도 MTLn3 세포는 HMVEC의 큰 이동을 유도하지 않았다. U87MG 세포는, 상기 조건 채널 내 높은 세포 밀도 및 상기 콜라겐 골격으로의 이동하는 능력에도 불구하고 HMVEC를 유인하지 못한 것 같다. MTLn3 세포에 비해, U87MG 세포는 더욱 활성이었고 상기 골격으로 쉽게 이동되었다.
내피 세포 상의 혈관 평활근 세포(SMC)의 화학 주성 효과는 또한 상기 조건 채널 내 인간 대동맥 SMC 및 상기 세포 채널 내 HMVEC를 시딩함에 의해 증명되었다. 상기 조건 및 대조 젤 영역에서 HMVEC 이동을 모니터하는 것은 HMVEC에 대한 SMC의 안정화 능력을 증명하였다. HMVEC의 이동은 조건 측면에서 억제되었다. HMVEC에 대한 SMC 또는 SMC에 대한 HMVEC의 반응은 추가 연구를 위해 조사되고 있다. 미래에, 이 공-배양 전략은 새롭게 형성된 모세관을 안정화시킴에 있어서 내피 세포에 대한 SMC 회복(recruitment)의 역할을 조사하기 위해 사용될 수 있다29 -32.
U87MG 세포의 상기 이동 속도 및 전치(displacement)를 조사하기 위해, HMVEC를 상기 조건 채널에서 배양하였고, hEGF 구배를 만들었다. 우선, U87MG 세포의 제한된 이동은 HMVEC이 상기 조건 채널에 위치되는 경우에 관찰되었고, HMVEC은 U87MG 세포를 유인하지 못하였음을 제안한다. hEGF에서 구배가 상기 조건 채널 내 20 또는 200 ng/mL hEGF를 더함에 의해 만들어지는 경우에, 상기 조건 측면의 U87MG 세포의 이동 속도는 상기 대조군 측면의 것보다 더 높았고, 둘 모두, HMVEC 공배양의 속도보다 더 높았다. 이는 hEGF은 상기 매트릭스를 가로질러 확산되었고 상기 조건 측면과 상기 대조군 측면에 세포를 도달시켰음을 증명하고, 상기 관찰된 이동 속도 차이는 화학 주성에 대한 화학운동성에 기인한 것이었음을 증명한다. 또한 세포 이동에 대한 콜라겐 골격의 기계적 특성의 효과가 관찰되었다. 더 높은 농도 골격에서(0.25% 콜라겐), 상기 대조군 및 조건 측면 상의 이동 속도에서 큰 화학 주성 차이를 보이는 더 긴 시간을 요구하는, U87MG 세포의 이동 속도는 억제되었다. 이 결과들은 세포 이동에서의 ECM의 기계적 또는 화학적 특성의 효과를 조사하기 위해 본원에 기재된 상기 미세유체 장치의 능력을 증명한다. 암 세포를 위해, ECM 강성도는 암 세포 활성에 관련됨을 이전에 증명되었다.
상이한 시점, 상이한 밀도 및 상이한 시딩 배열에서 세포를 도입함에 의해, 혈관 신생, 혈관으로의 이동(intravasation) 및 분출의 일련의 단계를 통합하는, 암 진행의 모델 시스템이 개발될 수 있음은 예측될 수 있다34. 암의 혈관으로의 이동 분석(cancer intravasation assay)을 위한 예비적 실험에서, U87MG 세포는 상기 조건 채널에서 배양되었고, HMVEC은 상기 세포 채널에서 배양되었다. HMVEC 단층로의 GFP로의 녹색 채색된, U87MG 세포의 혈관으로의 이동(Intravasation)은, 관찰되었다. 여러 U87MG 세포는 단층을 통과하고, 후속하여 상기 세포 채널 내 배지 흐름에 의해 멀리 대류되거나 HMVEC 단층 상에 부착되어 남아 있고 성장된다. 이 증명은 생체내에서 보여줬던 내피 세포 단층의 내강(luminal side) 측면으로 암 세포의 이동을 연구하고 분석함에 있어서 이 분석의 능력을 증명한다35.
이 미세유체 플랫폼은 여러 생물학적 적용을 위해 세포 이동을 연구하기 위한 다재다능하고 파워풀한 도구임을 증명한다. 이는 실시간 증명될 수 있는 잘-제어된 세포 배양 환경을 제공한다. 더구나, 세포들은 지속적으로 이의 가용성 및 불용성 환경으로부터 신호를 수용하기 때문에, 생리학적 조건을 흉내에 필수적인 생물 물리학 및 생화학 인자의 통합은 가능하다. 이 장치는 생리학적 및 병리생리학적 현상 예컨대 혈관신생, 동맥 형성, 암 혈관으로의 이동(intravasation) 및 암 분출(extravasation)을 위한 모델 시스템으로서 활용될 수 있다.
등가물
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인용된 참조문헌
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Claims (56)

  1. 광학적으로 투명한 물질;
    상기 광학적으로 투명한 물질에 커플링된 기판; 및
    3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격(scaffold)
    를 포함하는, 미세유체 장치(microfluidic device)로서,
    여기서, 상기 기판이 포스트(post)를 포함하고;
    상기 골격이 상기 기판, 상기 포스트 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하며;
    상기 기판이 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하고;
    상기 제 1 유체-흐름 경로가 상기 제 2 유체-흐름 경로와 교차하지 않으며;
    상기 골격이 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치되어 있는, 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로가 상기 기판내의 채널임을 특징으로 하는, 장치.
  3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 기판이 플라스틱을 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  4. 제 1항 또는 2항에 있어서, 상기 기판이 PDMS를 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 기판이 변화됨을 특징으로 하는, 장치.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 변화된 기판이, 기판을 폴리-D-리신 또는 플라즈마에 노출시킨 결과임을 특징으로 하는, 장치.
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 고체 또는 반고체 생물학적 또는 생체적합성 폴리머를 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 콜라겐, 아가로스, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 펩티드를 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  9. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 광경화성 폴리머를 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 제 1 생물학적 엔티티(biological entity)를 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 상기 기판에 실질적으로 부착되어 있음을 특징으로 하는, 장치.
  12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 압력 조절장치를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 압력 조절장치는, 유체가 상기 유체-흐름 경로들내로 도입되는 경우에, 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체 흐름 경로 사이에 압력 차이를 만드는 밸브임을 특징으로 하는, 장치.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 압력 조절장치는, 유체가 상기 유체 흐름 경로내로 도입되는 경우에, 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 흐름 속도의 차이를 만드는 밸브임을 특징으로 하는, 장치.
  15. 제 1항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로 또는 상기 제 2 유체-흐름 경로가 저항 채널을 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  16. 제 1항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로가 상기 제 2 유체 흐름 경로와 상이한 치수를 가짐을 특징으로 하는, 장치.
  17. 제 1항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 유체 입구를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  18. 제 1항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 유체 출구를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 유체 입구를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 유체 출구를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 1 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 1 저장소를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제 2 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결된 제 2 저장소를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  23. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이, 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머를 포함하며; 상기 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머는 제 2의 생물학적 엔티티를 통과시킬 수 있음을 특징으로 하는, 장치.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 골격이 콜라겐, 아가로스, 젤라틴, 피브로넥틴, 피브린, 라미닌, 또는 펩티드를 포함하고; 상기 제 2의 생물학적 엔티티가 진핵 세포를 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  25. 제 23항에 있어서, 상기 골격이 콜라겐을 포함하고; 상기 제 2의 생물학적 엔티티가 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 장치.
  26. 제 1항 내지 제 25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 광학적으로 투명한 물질이 유리를 포함함을 특징으로 하는, 장치.
  27. 제 1항 내지 제 26항 중 어느 한 항에 있어서, 제 3 유체-흐름 경로, 제 3 유체 입구, 및 제 3 유체 출구를 추가로 포함하고, 여기서 상기 제 3 유체 입구 및 상기 제 3 유체 출구 각각이 상기 제 3 유체-흐름 경로에 작동가능하게 연결되어 있음을 특징으로 하는, 장치.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 골격이 상기 제 3 유체-흐름 경로의 실질적으로 전부를 차지함을 특징으로 하는, 장치.
  29. 광학적으로 투명한 물질;
    상기 광학적으로 투명한 물질에 커플링된 기판; 및
    3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격
    를 포함하는, 미세유체 장치로서,
    여기서, 상기 골격이 상기 기판 또는 상기 광학적으로 투명한 물질 또는 둘 모두와 접촉하고,
    상기 기판이 제 1 유체-흐름 경로, 제 2 유체-흐름 경로, 및 제 3 유체-흐름 경로를 포함하며;
    상기 골격이 상기 제 1 유체-흐름 경로와 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치된 제 1의 고체 또는 반고체 생체적합성 폴리머 및 상기 제 2 유체-흐름 경로와 제 3 유체-흐름 경로 사이에 배치된 제 2의 고체 또는 반-고체 생체적합성 폴리머를 포함하고,
    상기 고체 또는 반-고체 생체적합성 폴리머가 하나 또는 그 초과의 생물학적 엔티티를 통과시킬 수 있는, 장치.
  30. 제 1항 내지 제 29항 중 어느 한 항의 장치를 여러 개로 포함하는, 고처리량 분석용 시스템.
  31. 세포의 유도된 이동(directed migration)을 측정하는 방법으로서,
    a) (i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
    (ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격
    를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 세포를 도입하는 단계;
    c) 상기 제 2 유체-흐름 경로내로 생물학적 엔티티를 도입하는 단계; 및
    d) 상기 골격내로 상기 세포의 유도된 이동을 측정하는 단계를 포함하는, 방법.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 생물학적 엔티티가 원핵 세포, 진핵 세포, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 약물, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
  33. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 호중구이고, 상기 생물학적 엔티티가 내피 세포임을 특징으로 하는, 방법.
  34. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 당뇨병이 있는 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 당뇨병이 없는 인간 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.
  35. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 당뇨병이 없는 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 당뇨병이 있는 인간 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.
  36. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 암에 걸리지 않은 인간 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.
  37. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 암에 걸리지 않은 인간 피검체로부터 얻어지고, 상기 생물학적 엔티티가 암에 걸린 인간 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.
  38. 제 31항에 있어서, 상기 세포가 내피 세포이고, 상기 생물학적 엔티티가 제 2 세포이며, 상기 제 2 세포가 종양 세포임을 특징으로 하는, 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 세포와 상기 제 2 세포가 동일한 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.
  40. a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
    ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간의 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격로서, 상기 골격이 상기 제 1 유체-흐름 경로와 상기 제 2 유체-흐름 경로 사이에 배치된, 골격
    를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 내피 세포 또는 내피 세포 전구체를 도입하는 단계;
    c) 상기 제 2 유체-흐름 경로내로 생물학적 엔티티를 도입시키는 단계; 및
    d) 상기 골격내에서의 혈관의 형성을 측정하는 단계를 포함하는, 혈관 형성을 측정하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 생물학적 엔티티가 원핵 세포, 진핵 세포, 성장 인자, 사이토카인, 호르몬, 항체, 약물, 및 효소로 구성되는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는, 방법.
  42. 제 40항 또는 제 41항에 있어서, 상기 장치가 제 3 유체-흐름 경로; 및 상기 기판과 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 제 2 골격을 추가로 포함하며, 여기서 상기 제 2 골격이 상기 제 1 유체-흐름 경로와 상기 제 3 유체-흐름 경로 사이에 배치된, 방법.
  43. a) 제 1 유체-흐름 경로, 제 2 유체-흐름 경로, 및 포스트를 포함하는 기판과 액체 골격 물질을 접촉시키는 단계; 및
    b) 상기 기판에 광학적으로 투명한 물질을 작동가능하게 연결시키는 단계를 포함하는, 장치를 제조하는 방법.
  44. 제 43항에 있어서, 상기 액체 골격 물질이 단량체 콜라겐(monomeric collagen)을 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  45. 제 43항 또는 제 44항에 있어서, 상기 기판을 상기 액체 골격 물질과 접촉시키기 전에 상기 기판을 변화시킴으로써 상기 기판의 소수성, 친수성, 세포 친화성, 또는 골격 부착 특성을 변경시키는 단계를 추가로 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 기판을 변화시키는 단계가, 상기 기판을 폴리-D-리신에 노출시키거나 상기 기판을 플라즈마에 노출시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  47. 제 43항 내지 제 46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 액체 골격 물질을 상기 기판과 접촉시키는 단계가 상기 제 1 및 제 2 유체-흐름 경로와 실질적으로 불연속적(non-contiguous)인 기판의 한정된 영역내로 압력하에서 상기 액체 골격 물질을 주입시키는 것을 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  48. i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
    ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격
    를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 제 1 유체-흐름 경로로 제 1 물질을 도입시키는 단계; 및
    c) 상기 골격으로 상기 제 1 물질의 침투율을 측정하는 단계를 포함하는 침투율을 측정하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 상기 제 1 물질이 유체 또는 작은 분자임을 특징으로 하는, 방법.
  50. 제 48항 또는 제 49항에 있어서, 상기 골격이 세포 단층(monolayer)을 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  51. 제 48항에 있어서, 상기 제 1 물질이 세포를 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  52. 제 51항에 있어서, 상기 세포가 내피 세포임을 특징으로 하는, 방법.
  53. 제 48항, 제 51항 또는 제 52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 골격이 제 2 세포를 포함함을 특징으로 하는, 방법.
  54. 제 53항에 있어서, 상기 제 2 세포가 종양 세포임을 특징으로 하는, 방법.
  55. 제 48항에 있어서, 상기 제 1 물질이 세포이고; 상기 세포가 내피 세포이며, 상기 골격이 제 2 세포를 포함하고; 상기 제 2 세포가 종양 세포이고; 상기 내피 세포 및 상기 종양 세포가 동일한 피검체로부터 얻어짐을 특징으로 하는, 방법.
  56. a) i) 제 1 유체-흐름 경로 및 제 2 유체-흐름 경로를 포함하는 기판에 커플링된 광학적으로 투명한 물질; 및
    ii) 상기 기판 및 상기 광학적으로 투명한 물질과 접촉하는, 3차원 공간에서 1 ㎛ 이상의 치수를 가지는 골격
    를 포함하는 장치를 제공하는 단계;
    b) 상기 제 1 유체-흐름 경로내로 세포 추적제(cell tracking agent)를 도입시키는 단계; 및
    c) 상기 골격내로의 상기 세포 추적제의 확산을 측정하는 단계를 포함하는, 세포 추적제를 평가하는 방법.
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