JP2011516079A - 三次元マイクロ流体プラットホームおよびその使用方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2008年4月8日に出願された米国仮特許出願第61/123,344号の優先権の利益を主張する。
本発明は、米国国立衛星研究所、米国国立画像生物医学・生物工学研究所に授与された助成No.I−R01−EB−003805−01A1の下、政府支援を伴ってなされた。米国政府は本発明における一定の権利を有する。
細胞移動は、血管形成、癌転移、創傷治癒、および炎症等の種々の生理学的および病理学的過程に対して不可欠である。血管系では、顕著な努力が、毛細血管形態形成の関連において細胞移動に集中している。これらの研究を通して、単一または複数の成長因子の走化性または化学運動性効果[1(非特許文献1)]、間質流体流動[2(非特許文献2)、3(非特許文献3)]、およびマトリクス剛性[4(非特許文献4)、5(非特許文献5)]等、様々な機械的および生化学的要因が、内皮細胞移動および管形成を調節する際に重大であると特定されている。個々の構成要素の詳細な理解にもかかわらず、どのようにしてこれらの要因が一体化し、特定の細胞応答を引き起こすのかは、まだ解明されておらず、これらの環境要因が制御された方法で研究されることができる多様な体外系の必要性をもたらす。これに到達することは、どのようにして生化学的および機械的要因が、生理学的および病態生理学的過程において共に作用し、最終的に組織工学および治療方針の改善に貢献するかに関するより良い理解につながる調査を容易にする。
原核および真核細胞移動、増殖、および分化を含む、三次元の生物学的応答の形成および研究のため、ならびに重要な生物学的機能を復元することが可能な体外系の開発のためのデバイスおよび方法を提供する。
本明細書において明確に規定されない限り、全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。用語が単数形で提供される場合、発明者は、その用語の複数形も意図する。
ある実施形態では、本発明は、マイクロ流体デバイスに関し、
光透過性材料、
光透過性材料に連結される基板、および
三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組、
を備え、
基板は、支柱を備え、
骨組は、基板、支柱、および光透過性材料に接触し、
基板は、第1の流体流路および第2の流体流路を備え、
第1の流体流路は、第2の流体流路と交差せず、
骨組は、第1の流体流路と第2の流体流路との間に配置される。
光透過性材料、
光透過性材料に連結される基板、および
三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組、
を備え、
基板は、支柱を備え、
骨組は、基板または光透過性材料もしくは両方に接触し、骨組は、支柱に接触し、基板は、第1の流体流路、第2の流体流路、および第3の流体流路を備え、
骨組は、第1の流体流路と第2の流体流路との間に配置される第1の固体または半固体生体適合性ポリマー、および第2の流体流路と第3の流体流路との間に配置される第2の固体または半固体生体適合性ポリマーを備える、
固体または半固体生体適合性ポリマーは、1つ以上の生物学的実体の通過を可能にする。
a)
i)第1の流体流路および第2の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、
ii)基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
b)細胞を第1の流体流路に導入するステップ、
c)生物学的実体を第2の流体流路に導入するステップ、および
d)骨組への細胞の有向移動を測定するステップ、
を含む。
a)
i)第1の流体流路および第2の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、
ii)基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組であって、骨組は、第1の流体流路と第2の流体流路との間に配置される骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
b)内皮細胞または内皮細胞前駆体を第1の流体流路に導入するステップ、
c)生物学的実体を第2の流体流路に導入するステップ、および
d)骨組における血管の形成を測定するステップ、
を含む。
第3の流体流路、および
基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する第2の骨組であって、第2の骨組は、第1の流体流路と第2の流体流路との間に配置される第2の骨組、
をさらに備える。
a)
i)第1の流体流路および第2の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、および
ii)基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
b)第1の物質を第1の流体流路に導入するステップ、および
c)骨組への第1の物質の浸透性を測定するステップ、
を含む。
a)
i)第1の流体流路および第2の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、および
ii)基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
b)第1の物質を第1の流体流路に導入するステップ、
c)第2の物質を第1の流体流路に導入するステップ、および
c)骨組への第2の物質の浸透性を測定するステップ、
を含む。
a)
i)第1の流体流路および第2の流体流路を備える基板に連結される光透過性材料、および
ii)基板および光透過性材料に接触する、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組、
を備える、デバイスを提供するステップ、
b)細胞追跡剤を第1の流体流路に導入するステップ、および
c)骨組への細胞追跡剤の拡散を測定するステップ、
を含む。
a)液体骨組材料を、第1の流体流路、第2の流体流路、および支柱を備える基板に接触させるステップ、および
b)光透過性材料を基板に動作可能に接続するステップ、
を含む。
概説された本発明は、本発明のある局面および実施形態の説明の目的のためのみに含まれ、いかなる方法でも本発明を限定するものではない、以下の実施例を参照することによってより容易に理解され得る。全ての見出しは、読者の便利のためであり、特定されない限り、見出しに続く本文の意味を限定するために使用されるべきではない。
マイクロ流体ネットワークの設計は、表1に提供されるマイクロ流体流路(または「チャネル」)、ゲル「ケージ」、およびマイクロピラーの寸法によりAutoCAD(登録商標)ソフトウェア(Autodesk,San Rafael,CA)において作製した。
マイクロ注入台は、細胞培養骨組(サブμL体積)をデバイスに無菌状態で装填するために作製した。システム構成要素は、手動の極微操作デバイス(H−7ピペットホルダ付きMN−151ジョイスティック極微操作デバイス、NARISHIGE,NY)、マイクロリットルシリンジ(Hamilton、62RNR、2.5μL SYR、22s/2’’/3、VWR)、デジタル顕微鏡(Big Blue QX5、COMPUVISOR.COM,TX)(全て層流フードに収容される)、および視線誘導のためのモニタを含んだ。MN−151ジョイスティックの特色は、X、Y、およびZ軸に沿った付加的な粗調整と共に、XY平面における微調整の制御を提供した。
表面を上述のように親水性にした滅菌済みPDMSデバイスは、「ゲルケージ」がビデオモニタ上ではっきりする状態で顕微鏡台状に位置付ける(パターン表面を上)。極微操作デバイスに取り付けられたマイクロリットルシリンジ(プレポリマー溶液が予め組み込まれている)の先端は、「ゲルケージ」の数ミクロン上に位置付け、プレポリマー溶液の小液滴は、手動で作製し、液滴が最初にマイクロピラーに接触するまで下げる。液滴の大きさは、その直径がゲルケージの幅とほぼ同等から半分になるように制御する。小液滴は、ゲルケージの真上で作製し、下げ、分配し、この過程は、ゲルケージが満杯になるまで繰り返す。
ゲルプレポリマー溶液(これらの実験においてはコラーゲンI型、ラット尾)は、ゲルケージにマイクロ注入し、流体チャネルは、清潔なガラスカバースリップ(35mm、VWR)で密閉し、機械クランプで固定する。これは、一度に複数の装置に対して繰り返す。骨組注入の後、組み立てられたPDMS装置は、ゲルが乾燥しないように二次的加湿容器に配置する。ゲルは、加湿培養器において37℃で30分重合する。
コラーゲンを含有する骨組の重合の後、流体流路は、細胞培養培地で充填した(補充無し)。勾配研究は、1つの流路における培地を、20μg mL−1の初期濃度の蛍光デキストラン(40kDa、Invitrogen)の希釈溶液で置換し、静止条件下で行った。蛍光強度は、Nikon TE300顕微鏡(Nikon Instruments Inc.,NY)で視覚化した。ゲル領域の一連の蛍光画像(4倍率)は、Openlab(Improvision,MA)データ取得ソフトウェアを使用してHamamatsuカメラ(Hamamatsu,Japan)で取得し、さらなる分析のために保存した。画像を処理し、各時点でのゲルにわたる蛍光強度の変化を得た。微速度撮影の蛍光画像の画像処理は、特注のMATLAB(MathWorks,MA)コードを使用して行った。つまり、ゲル領域の各蛍光画像は、PDMSマイクロピラーを除いた長方形の区分に分割した。ピクセル強度および「ソース」チャネルからの対応する場所は、これらの長方形の区分のために記録した。平均蛍光強度は、ゲルの長さにわたる全てのピクセルのためのデキストランチャネルから同じ距離のピクセルに対して計算した。各時点で、ゲルにわたる正規化平均強度プロファイルのプロットを生成した。実験的拡散曲線は、FEMLAB(Comsol,USA)において生成した有限要素モデルから得た理論曲線と一致した。
(デバイスおよび骨組形成の説明)
二重流体流路デバイスは、本明細書において記載される標準的ソフトリソグラフィおよび複製成形技術を使用してPDMSから製造した。デバイスは、2つの平行流路、および細胞培養のための注入可能な生物学的に誘導されたか、または合成の骨組(ここでは、軟性ヒドロゲル)を含有するための中央「ゲルケージ」横断経路を含有する。本明細書において記載されるデバイスを使用して、(1)表面せん断応力、(2)マトリクスを通る間質流、(3)化学誘引物質またはケモレペラントにおける勾配、(4)骨組の特性、を制御し、(5)リアルタイムで細胞を同時に監視し、および(6)共培養され細胞の効果を監視することができる。
生物物理学的刺激の効果を証明するために、細胞は、小レベルの表面せん断応力に供した。骨組の表面上の内皮細胞を伴うデバイスを形成し、貯留部カラムにおける培養培地の高さの差を変化させることによって、圧力差(50Pa)を骨組にわたってかけた。
2つの異なる細胞播種プロトコルを使用して、内皮細胞が最初に融合性単分子層、すなわち、2Dおよび3D基板単分子層播種を形成する基板を制御した。コラーゲンゲル骨組は、前述されるように形成した。ゲル化の後、流体流路は、2mg/mL−1フィブロネクチン被覆溶液で充填し、一晩培養した。細胞播種の前に、被覆溶液は、完全培地で置換し、さらに2〜4時間平衡化した。2−3×106細胞mL−1の細胞懸濁液は、1つの流体流路に流し、細胞は、引力によって懸濁液懸濁から沈殿するため、剛性ガラスまたは適合骨組表面に付着させた。内皮細胞は、さらなる処理の前に、剛性(2D単分子層播種)または適合(3D単分子層播種)表面上で24〜48時間培養した。血管新生促進要因は、勾配としてか、または均一の濃度でのいずれかで提示された。この検定のために、VEGF(10〜50ng mL−1)およびSlP(250nM)を使用して、形態形成を促進した。
リアルタイムで細胞を監視する能力を証明するために、発芽血管形成中に内皮細胞の微速度撮影のビデオ画像を記録した。内皮単分子層は、本明細書において記載されるコラーゲンゲル骨組上に形成した。マイクロ流体デバイスは、37℃および5%CO2で特注の環境制御チャンバにおいて保ち、細胞は、Zeiss倒立顕微鏡で可視化した。実験の経過中の蒸発を最小限にするために、培地貯留部(高さの差を伴わない)を、各入口および出口ポートを直接接続した。その後、デバイスは、加湿局所環境、および可視化のための底部にある切り抜きガラス窓を伴う二次的容器に配置した。明視野画像は、AxioVision画像取得ソフトウェアにより、2分間隔でAxioCam MRm(Carl Zeiss)(単一の光軸面で)で撮った。
F−アクチン分布、および「毛細血管様」ネットワークまたは管構造に関与する細胞の数を、デバイスにおける2〜7日の培養後に評価した。F−アクチンおよび核染色を、4.0%PFA(30分)での固定の後に行った。固定サンプルは、IXリン酸緩衝食塩水(PBS)で2回濯ぎ、0.1%Triton−X(1〜2分)で処理し、IX PBSで濯ぎ、その後、DAPIおよびローダミン−ファロイジンの混合物の注入(30分)、およびIX PBSでの最終洗浄ステップを行った。
(PDMSマイクロ流体検定調製)
マイクロ流体検定は、SU−8パターン化ウエハによる一般的なソフトリソグラフィ過程によってPDMS(ポリジメチルシロキサン、Silgard184、Dow Chemical,MI)で作製された。4インチのシリコンウエハは、200℃のホットプレートで5分間脱水し、その後、SU−8 2050フォトレジスト(MicroChem,MA)によって被覆した。被覆されたウエハは、ホットプレート上でソフトベークし、UVアライナ(EVGroup,AZ)によって暴露させ、再度ベークした。パターンは、PMアセテートによって発展させ、イソプロピルアルコールで濯いだ。その後、ウエハは、トリデカフルオロ−1,1,2,2,−テトラヒドロオクチル−1−トリクロロシランで被覆して、ウエハから容易に取り外せる硬化PDMSを作製した。PDMS硬化キットは、混合し、ウエハ上に注ぎ、その後、それを、80℃で2時間オーブン内において硬化させた。硬化PDMSは、ウエハから取り外し、整え、マイクロ流体チャネルの入口および出口を画定するために穴を開けた。製造されたPDMSデバイスおよびガラスカバースリップは、加圧滅菌し、80℃で一晩、オーブン内で乾燥させた。その後、大気環境においてプラズマクリーナー(Harrick,CA)によって40秒間、プラズマ処理し、結合させて、閉じたマイクロ流体チャネルを形成した。結合したデバイスは、結合強度を強化するために、80℃で10分間、オーブン内に保ち、その後、被覆溶液をチャネルに充填して、チャネルを細胞播種に好適にした。その後、デバイスを吸引し、滅菌水で洗浄した。その後、被覆されたデバイスは、80℃で24時間、オーブン内で乾燥させて、チャネル表面を疎水性にした。その後、骨組材料をゲル領域に充填して、ゲル骨組を形成した。実験では、I型コラーゲン(BD Biosciences,MA)は、ピペットによって充填し、30分間、培養器内に保った。ゲル重合の後、細胞培養培地は、マイクロ流体チャネルに充填し、デバイスは、細胞播種のために培養器内に保った。
充填された培地は、培地の蒸発を回避するために入口および出口上の液滴として保つべきである。既存の液滴を吸引し、培地の新規の液滴を片側に添加することは、細胞に対する最小のせん断応力で、チャネルにおける古い培地を置換する毛細管力のために微小の流れを生成することができる。流体せん断応力または圧力勾配等の機械的血管新生因子を適用するために、管およびポンプから成る流体回路は、精密に制御された流れを適用するために、デバイスの入口および出口に接続することができる。条件チャネルから細胞チャネルへの生化学的要因の拡散を可視化するために、40kDaの分子量を伴うデキストランは、0.5μg/mLの最終濃度まで内皮成長培地と混合し、条件チャネルに添加した。拡散プロファイルは、蛍光顕微鏡(Nikon Instruments,NY)によって取り、Matlabで分析し、画像から強度グラフを得た。コラーゲンゲル骨組への蛍光デキストランの微速度撮影の拡散を測定した。安定した線状勾配を得て、数時間維持した。画像は、デキストラン混合培地を条件チャネルに適用した10時間後に得た。デキストランの分子量は、40kDaであり、VEGFと類似した分子量である。使用したコラーゲン骨組は、pH7.4で重合された2.0mg/mLの濃度を有する。コラーゲンゲル骨組へのデキストランの一時的拡散曲線は、デキストランが、30分で、1つの流体流路から骨組を通って別の流体流路へ移動することを示す。
細胞懸濁培地は、2×106細胞/mLで調製し、細胞培養チャネルに充填した。充填の後、デバイスは、培地が置換される前に細胞が沈殿し、基板上に付着するように、30分間培養器内に保った。細胞付着時間は、細胞型により、30分から数時間の範囲である。ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HMVEC)は、市販され(Lonza,NJ)、コラーゲンI(BD Biosciences,MA)で事前に被覆された通常の培養フラスコ上の内皮成長培地(例えば、EGM−2MV;Lonza,NJ)により9継代以下で増加させた。組み換えヒト血管内皮成長因子(VEGF;R&D Systems,MN)は、20ng/mLの作用濃度の細胞培養培地と混合し、その後、条件チャネルに充填して、勾配を生成した。
デバイスは、37℃で5%CO2を含有する培養器内に保ち、細胞移動を、位相差顕微鏡検査(Nikon Instruments,NY)によって毎日監視した。移動細胞外観の長さおよび面積は、ImageJによって測定した。免疫蛍光染色を行い、最終細胞移動結果を視覚化した。アクチンフィラメントおよび核は、ローダミン−ファロイジン(Sigma−Aldrich,Switzerland)およびDAPI(Sigma−Aldrich,Switzerland)でそれぞれ染色した。
1)MTLn3/U87MGおよびHMVEC共培養;ラット乳腺腺癌細胞株(MTLn3)は、5%ウシ胎仔血清(FBS)、1mMのNa(HCO3)2、4mMのL−グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充されたα−最小必須培地(α−MEM;Invitrogen,CA)において成長させた。ヒト膠芽腫細胞株(U87MG)は、10%FBS、1mMのNa(HCO3)2、4mMのL−グルタミン、およびペニシリン/ストレプトマイシンを補充されたダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)において成長させた。U87MG細胞懸濁液は、1×106細胞/mLの濃度で調製し、条件チャネルに充填した。高密度用MTLn3細胞懸濁液は、1×106細胞/mLの濃度であり、低密度用は、0.5×106細胞/mLの濃度であった。HMVEC懸濁液は、上述のように2×106細胞/mLの濃度で調製し、MTLn3またはU87MG細胞播種1日後に細胞培養チャネルに充填した。細胞培養チャネルは、内皮成長培地で充填し、対照/条件チャネルは、上述のMTLn3またはU87MG成長培地で充填した。培地は、毎日交換した。アクチンフィラメントおよび核は、ローダミン−ファロイジンおよびDAPIでそれぞれ染色し、GFP発現MTLn3およびU87MG細胞は、HMVECと区別するために使用した。平滑筋細胞(SMC)は、上述のHMVEC培地において成長させ、懸濁液は、0.5×106細胞/mLの濃度で調製した。懸濁液は、細胞チャネルへのHMVEC播種1日前に条件チャネルに充填した。培地は、毎日交換した。アクチンフィラメントおよび核は、ローダミン−ファロイジンおよびDAPIで染色した。上述の同じ細胞懸濁液を調製し、U87MG細胞の走化性評価のために細胞チャネルに充填した。対照チャネルは、細胞チャネルと同じ培地で充填し、条件チャネルは、20ng/mLまたは200ng/mLのhEGFを補充された培地で充填した。hEGF勾配は、細胞播種の1日後に適用し、チャネルにおける全ての培地は、毎日交換した。アクチンフィラメントおよび核は、ローダミン−ファロイジンおよびDAPIでそれぞれ染色した。実験において使用した全てのコラーゲンゲル骨組は、pH7.4または11.0、2.0mg/mLまたは2.5mg/mLの濃度で重合した。
毛細血管形態形成の検定において、本明細書において記載されるマイクロ流体デバイスの機能性を証明するために、ヒト皮膚微小血管内皮細胞(HMVEC)を細胞チャネルに播種し、融合性単分子層が、細胞播種後1〜2日で形成された。周知の内皮細胞移動23,24の刺激剤である血管内皮成長因子−A(VEGF)を条件チャネルに適用し、細胞チャネルと条件チャネルとの間のゲル骨組におけるVEGF勾配を生成した。対照チャネルは、対照としてVEGFを伴わない正常細胞培養培地で充填した。培地液滴(40μL)は、チャネルに沿った、その間の気圧差を制御するために、チャネル入口および出口上に配置し(すなわち、培地交換および細胞播種中の流れを生成するため、および実験の間にわたって流動条件を維持しないため)、培地を補給するために十分強く、同時に、骨組または細胞へのいかなる損傷を回避するために十分弱い、安定した流れを生成するための、Walker et al.25によって上記に示される技術である。異なる剛性(pH7.4およびpH11)のコラーゲン骨組への移動細胞の長さおよび面積変化を数日にわたって観察し、定量化した。条件側では、細胞は、急速に骨組に移動したが、有意に少ない移動が、対照側で観察された。
ここで証明される、観察された内皮細胞移動パターンは、コラーゲンゲル剛性による。ゲル剛性は、より高いpH値での重合の前にコラーゲン溶液のpHを調整することによって制御されることができ、より堅いゲルを生じる5。pH7.4およびpH11ゲルの初期のゲル化条件を比較することは、より堅いコラーゲンゲル(pH11で重合された)は、内皮細胞集団移動を制限するが、20〜30μmの範囲にある直径を伴う管様構造の生成を促進することを明らかにした。形成された構造は、他の体内検定または3Dマクロ検定9,18において見られる管様毛細血管に類似し、内腔の存在は、その後、2μmのマイクロビーズを培養培地に導入し、蛍光顕微鏡検査を使用してマイクロビーズの動きを追跡することによって確認した。この確認のために、低間質流は、液滴の大きさ制御25により細胞培養チャネルと条件チャネルとの間の気圧差を維持することによって、細胞培養チャネルから条件チャネルへ適用した。マイクロビーズの微速度撮影の粒子追跡を行い、ビーズは、経時的に毛細血管構造の端部で蓄積されている管様構造内のみで流れた。
この新規の設計の主要な利点は、3Dマトリクスを通し、および内皮層にわたる細胞移動を研究するその能力である。癌細胞血管外漏出は、内皮細胞との相互作用に依存することが過去に示されている26,27。癌間質細胞が、血管形成のための内皮細胞に信号を送ることは十分に確立している。癌療法において、血管形成を妨げることは、化学療法および他の治療と共に重大である28。これらの効果を調査するために、癌細胞および内皮細胞の相互作用を、マイクロ流体デバイスにおいて2つの細胞型を共培養することによって研究した。ラット乳腺腺癌細胞株(MTLn3)およびヒト天然癌細胞(U87MG)を条件チャネルにおいて培養し、HMVECを細胞チャネルにおいて培養した。予備の観察では、高密度MTLn3は、HMVECをコラーゲン骨組に誘導したが、移動率は、VEGF勾配(20ng/mL)誘発HMVEC移動と比較して有意に遅く、MTLn3細胞によって生成された走化性要因は、VEGF勾配より刺激的ではないことが示唆された。移動の程度は、条件チャネルにおけるMTLn3細胞の数に正に相関した。低密度MTLn3細胞は、HMVECの有意な移動を誘発しなかった。U87MG細胞は、条件チャネルにおける高細胞密度およびコラーゲン骨組に移動する能力にもかかわらず、HMVECを引き付けないように思われた。MTLn3細胞と比較して、U87MG細胞は、より活性を有し、容易に骨組へ移動した。
当業者は、本明細書において記載される本発明の特定の実施形態との多くの均等物を認識するか、またはただの日常の実験を使用して把握することができる。対象の発明の特定の実施形態が記載されたが、上記の明細書は、例示的なものであり、限定的なものではない。本発明の多くの変形は、本明細書の再考により、当業者にとって明らかとなる。本発明の全範囲は、均等物の全範囲と共に請求項、およびそのような変形と共に明細書を参照することによって決定されるべきである。そのような均等物は、以下の請求項によって包含されることを意図する。
以下に記載されるそれらの参考文献を含む、本明細書に言及される全ての公表文献および特許は、各個々の公表文献または特許が、特別および個々に参考として援用されるかのように、それらの全体が本明細書に参考として援用される。矛盾する場合、本明細書における任意の規定を含む本出願が統括する。
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Claims (56)
- 光透過性材料と、
該光透過性材料に連結される基板と、
三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組と
を備える、マイクロ流体デバイスであって、
該基板は、支柱を備え、
該骨組は、該基板と、該支柱と、該光透過性材料とに接触させ、
該基板は、第1の流体流路と、第2の流体流路とを備え、
該第1の流体流路は、該第2の流体流路と交差せず、
該骨組は、該第1の流体流路と該第2の流体流路との間に配置される、マイクロ流体デバイス。 - 前記第1の流体流路および前記第2の流体流路は、前記基板におけるチャネルである、請求項1に記載のデバイス。
- 前記基板は、プラスチックを含む、請求項1または2に記載のデバイス。
- 前記基板は、PDMSを含む、請求項1または2に記載のデバイス。
- 前記基板は、修正される、請求項1〜4のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記修正された基板は、ポリ−D−リシンへの該基板の暴露、またはプラズマへの該基板の暴露の結果である、請求項5に記載のデバイス。
- 前記骨組は、固体または半固体の生体または生体適合性ポリマーである、請求項1〜6のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記骨組は、コラーゲン、アガロース、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、またはペプチドを含む、請求項1〜6のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記骨組は、光硬化性ポリマーを含む、請求項1〜6のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記骨組は、第1の生物学的実体を含む、請求項1〜9のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記骨組は、前記基板に実質的に付着させられる、請求項1〜10のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 圧力調整器をさらに備える、請求項1〜11のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記圧力調整器は、流体が前記流体流路へ導入される時に、該第1の流体流路と該第2の流体流路との間の圧力差を作成する弁である、請求項12に記載のデバイス。
- 前記圧力調整器は、流体が前記流体流路へ導入される時に、該第1の流体流路と該第2の流体流路との間の流速の差を作成する弁である、請求項12に記載のデバイス。
- 前記第1の流体流路または前記第2の流体流路は、抵抗チャネルを備える、請求項1〜14のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第1の流体流路は、前記第2の流体流路とは異なる寸法を有する、請求項1〜15のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第1の流体流路に動作可能に接続される第1の流体入口をさらに備える、請求項1〜16のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第1の流体流路に動作可能に接続される第1の流体出口をさらに備える、請求項1〜17のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第2の流体流路に動作可能に接続される第2の流体入口をさらに備える、請求項1〜18のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第2の流体流路に動作可能に接続される第2の流体出口をさらに備える、請求項1〜19のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第1の流体流路に動作可能に接続される第1の貯留部をさらに備える、請求項1〜20のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記第2の流体流路に動作可能に接続される第2の貯留部をさらに備える、請求項1〜21のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記骨組は、固体または半固体の生体適合性ポリマーを含み、該固体または半固体の生体適合性ポリマーは、第2の生物学的実体の通過を可能にする、請求項1〜6のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記骨組は、コラーゲン、アガロース、ゼラチン、フィブロネクチン、フィブリン、ラミニン、またはペプチドを含み、前記第2の生物学的実体は、真核細胞を含む、請求項23に記載のデバイス。
- 前記骨組は、コラーゲンを含み、前記第2の生物学的実体は、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、および酵素から成る群より選択される、請求項23に記載のデバイス。
- 前記光透過性材料は、ガラスを含む、請求項1〜25のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 第3の流体流路と、第3の流体入口と、第3の流体出口とをさらに備え、該第3の流体入口および該第3の流体出口は、各々、該第3の流体流路に動作可能に接続される、請求項1〜26のうちのいずれか一項に記載のデバイス。
- 前記骨組は、前記第3の流体流路の実質的に全体を占有する、請求項27に記載のデバイス。
- 光透過性材料と、
該光透過性材料に連結される基板と、
三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組と
を備える、マイクロ流体デバイスであって、
該骨組は、該基板または該光透過性材料もしくは両方に接触させ、該基板は、第1の流体流路と、第2の流体流路と、第3の流体流路とを備え、
該骨組は、該第1の流体流路と該第2の流体流路との間に配置される第1の固体または半固体の生体適合性ポリマーと、該第2の流体流路と該第3の流体流路との間に配置される第2の固体または半固体の生体適合性ポリマーとを含み、
該固体または半固体の生体適合性ポリマーは、1つ以上の生物学的実体の通過を可能にする、マイクロ流体デバイス。 - 請求項1〜29のうちのいずれか一項に記載の複数のデバイスを含む、ハイスループット分析のためのシステム。
- 細胞の有向移動を測定する方法であって、
a)
i)第1の流体流路と、第2の流体流路とを備える基板に連結される、光透過性材料と、
ii)該基板および該光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組と
を備える、デバイスを提供するステップと、
b)細胞を該第1の流体流路に導入するステップと、
c)生物学的実体を該第2の流体流路に導入するステップと、
d)該骨組への該細胞の該有向移動を測定するステップと
を含む、方法。 - 前記生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞は、好中球であり、前記生物学的実体は、内皮細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞は、糖尿病を有する被験者から得られ、前記生物学的実体は、糖尿病を有さない被験者から得られる、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞は、糖尿病を有さない被験者から得られ、前記生物学的実体は、糖尿病を有する被験者から得られる、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞は、癌を有する被験者から得られ、前記生物学的実体は、癌を有さない被験者から得られる、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞は、癌を有さない被験者から得られ、前記生物学的実体は、癌を有する被験者から得られる、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞は、内皮細胞であり、前記生物学的実体は、第2の細胞であり、該第2の細胞は、腫瘍細胞である、請求項31に記載の方法。
- 前記細胞および前記第2の細胞は、同じ被験体から得られる、請求項38に記載の方法。
- 血管形成を測定する方法であって、
a)
i)第1の流体流路と、第2の流体流路とを備える基板に連結される、光透過性材料と、
ii)該基板および該光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組であって、該骨組は、該第1の流体流路と該第2の流体流路との間に配置される、骨組と
を備える、デバイスを提供するステップと、
b)内皮細胞または内皮細胞前駆体を該第1の流体流路に導入するステップと、
c)生物学的実体を該第2の流体流路に導入するステップと、
d)該骨組における血管の形成を測定するステップと
を含む、方法。 - 前記生物学的実体は、原核細胞、真核細胞、成長因子、サイトカイン、ホルモン、抗体、薬物、および酵素から成る群より選択される、請求項40に記載の方法。
- 前記デバイスは、
第3の流体流路と、
前記基板および前記光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する第2の骨組であって、該第2の骨組は、前記第1の流体流路と前記第2の流体流路との間に配置される、第2の骨組と
をさらに備える、請求項40または41に記載の方法。 - デバイスを製造する方法であって、
a)液体骨組材料を、第1の流体流路、第2の流体流路、および支柱を備える基板に接触させるステップと、
b)光透過性材料を該基板に動作可能に接続するステップと
を含む、方法。 - 前記液体骨組材料は、単量体コラーゲンを含む、請求項43に記載の方法。
- 前記基板を前記液体骨組材料に接触させる前に、該基板を修正し、それにより、該基板の疎水性、親水性、細胞親和性、または骨組付着性を改変するステップをさらに含む、請求項43または44に記載の方法。
- 前記基板を修正する前記ステップは、該基板をポリ−D−リシンに暴露するステップ、または該基板をプラズマに暴露するステップを含む、請求項45に記載の方法。
- 前記液体骨組材料を前記基板に接触させる前記ステップは、該液体骨組材料を、前記第1および第2の流体流路と実質的に隣接していない該基板の画定された領域へ圧力下で注入するステップを含む、請求項43〜46のうちのいずれか一項に記載の方法。
- 浸透性を測定する方法であって、
a)
i)第1の流体流路と、第2の流体流路とを備える基板に連結される、光透過性材料と、
ii)該基板および該光透過性材料に接触させ、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組と
を備える、デバイスを提供するステップと、
b)第1の物質を該第1の流体流路に導入するステップと、
c)該骨組の中への該第1の物質の該浸透性を測定するステップと
を含む、方法。 - 前記第1の物質は、流体または小分子である、請求項48に記載の方法。
- 前記骨組は、細胞単層を含む、請求項48または49に記載の方法。
- 前記第1の物質は、細胞を含む、請求項48に記載の方法。
- 前記細胞は、内皮細胞である、請求項51に記載の方法。
- 前記骨組は、第2の細胞を含む、請求項48、51、または52のうちのいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の細胞は、腫瘍細胞である、請求項53に記載の方法。
- 前記第1の物質は、細胞を含み、該細胞は、内皮細胞であり、前記骨組は、第2の細胞を含み、該第2の細胞は、腫瘍細胞であり、該内皮細胞および該腫瘍細胞は、同じ被験体から得られる、請求項48に記載の方法。
- 細胞追跡剤を評価するための方法であって、
a)
i)第1の流体流路と、第2の流体流路とを備える基板に連結される、光透過性材料と、
ii)該基板および該光透過性材料に接触させる、三次元空間において少なくとも1μmの寸法を有する骨組と
を備える、デバイスを提供するステップと、
b)細胞追跡剤を該第1の流体流路に導入するステップと、
c)該骨組の中への該細胞追跡剤の拡散を測定するステップと
を含む、方法。
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