CN117264763A - 一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片及其制备和应用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片及其制备和应用方法，微流控芯片包括表面加工出微结构通道的芯片主体和紧密贴合在芯片主体上的基板；芯片主体上的微结构通道包括一条中央细胞培养通道和若干个对称排列在中央细胞培养通道两侧的相互独立的细胞迁移单元；细胞迁移单元包括一条内侧的基质胶灌注通道和一条外侧的迁移细胞培养通道；中央细胞培养通道与各细胞迁移单元的基质胶灌注通道之间、以及同一细胞迁移单元的基质胶灌注通道与迁移细胞培养通道之间均设有截流结构。本发明实现了多种类型间充质干细胞和肿瘤细胞的同步共培养，操作简单，降低了实际样品的用量，具有制备简易、使用便携、经济、高效和准确的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种间充质干细胞的肿瘤趋化性的监测装置，尤其涉及一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片及其制备和应用方法。
背景技术
恶性肿瘤是目前严重威胁全人类健康的世界性难题，据美国癌症协会报道的数据显示2020年全球分别有将近1930万新确诊肿瘤患者和1000万肿瘤死亡的患者。铂类等化疗药物已广泛用于肿瘤治疗，但易引起全身毒性和耐药，因此，建立一种精准靶向地药物递送平台对实现肿瘤精准治疗具有重要意义。
间充质干细胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞群。MSCs组织来源广泛，易扩增，免疫原性低，且研究已证明MSCs对恶性肿瘤组织具有独特的迁移趋化性，表明MSCs是一种理想的药物靶向递送的载体。然而，尽管不同组织来源的MSCs具有相似的形态和免疫表型，它们在增殖、细胞因子分泌以及细胞迁移能力等生物学行为上存在差异。因此，比较并筛选出拥有最强肿瘤迁移趋化能力的MSCs尤为重要。
评价细胞迁移特性的模型分为体内和体外模型。体外细胞迁移模型较体内模型成本低、操作简单，可避免动物实验涉及的伦理问题，也可避免人类与实验动物种属特异性差异造成实验结果不一致的现象。传统的体外模型主要依赖于划痕实验法和transwell实验法，但划痕实验重复性较差，且易损伤细胞，Transwell实验操作复杂且不适合实时动态监测。
微流控芯片技术因其结构设计灵活和规模集成的优势，已在细胞操控和分析领域得到迅速发展。微流控芯片的管道尺寸在微米量级，细胞和试剂消耗少，且能较好地模拟体内微环境，不损伤细胞，适合动态观察。然而，目前用于监测细胞迁移的多为单通道芯片，具有通量低，集成度差，实验重复性差等缺陷。此外，在同一块微流控芯片上同时实现多种MSCs对肿瘤细胞迁移趋化性的监测和筛选的研究分析还处于空白阶段。
发明内容
本发明针对上述现有技术的不足，提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片及其制备和应用方法，该肿瘤微流控芯片实现了多种类型间充质干细胞和肿瘤细胞的同步共培养，操作简单，降低了实际样品的用量，并模拟人间充质干细胞对肿瘤细胞的趋化性并同步比较差异，能够为筛选肿瘤靶向治疗高效药物载体提供理论依据。
为实现上述目的，本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，具有这样的特征：包括表面加工出微结构通道的芯片主体和紧密贴合在芯片主体上的基板；芯片主体上的微结构通道包括一条中央细胞培养通道和若干个对称排列在中央细胞培养通道两侧的相互独立的细胞迁移单元；所述细胞迁移单元包括一条内侧的基质胶灌注通道和一条外侧的迁移细胞培养通道；中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道的两端均具有进样口和出样口；所述中央细胞培养通道用于肿瘤细胞的培养；基质胶灌注通道用于基质胶的填充；若干迁移细胞培养通道用于不同组织来源间充质干细胞的培养；所述中央细胞培养通道与各细胞迁移单元的基质胶灌注通道之间、以及同一细胞迁移单元的基质胶灌注通道与迁移细胞培养通道之间均设有截流结构，截流结构由若干间隔设置的柱状结构构成，中央细胞培养通道与各细胞迁移单元的基质胶灌注通道、以及同一细胞迁移单元的基质胶灌注通道与迁移细胞培养通道通过截流结构进行细胞之间的信号传输和相互作用以及细胞迁移。
进一步，本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，还可以具有这样的特征：其中，所述细胞迁移单元中，基质胶灌注通道和迁移细胞培养通道的两端均向外侧方向弯折。
进一步，本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，还可以具有这样的特征：其中，所述芯片主体的材料为聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯；所述基板的材料为玻璃或硅片。
进一步，本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，还可以具有这样的特征：其中，所述芯片主体与基板通过等离子体键合工艺实现两者之间的紧密贴合。
进一步，本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，还可以具有这样的特征：其中，所述中央细胞培养通道和迁移细胞培养通道培养肿瘤细胞和间充质干细胞前涂覆有培养基质，培养基质为明胶、壳聚糖、丝素蛋白、鼠尾胶原蛋白、纤维蛋白胶、基质胶中的一种或几种。
进一步，本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，还可以具有这样的特征：其中，所述芯片主体的中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道均位于同一平面，且宽度和高度均相同，分别为1000μm和100μm；基质胶灌注通道的长度为1.0cm，迁移细胞培养通的长度为0.8cm，中央细胞培养通道的长度根据细胞迁移单元的数量而定；所述截流结构由5个六棱柱结构等间距排列而成，各六棱柱结构的边长为100μm，六棱柱结构之间的间距为50μm。
本发明还提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的制备方法，具有这样的特征：包括以下步骤：步骤一、用计算机辅助软件设计和绘制所述芯片主体的微结构通道图形；步骤二、通过微加工技术制备具有微结构通道的芯片主体，通过手动打孔器制备中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道的进样口及出样口；步骤三、将芯片主体和基板用无水乙醇清洗后，进行高压灭菌处理，最后进行等离子体键合，得到微流控芯片。
本发明还提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的应用方法，具有这样的特征：包括以下步骤：
步骤一、微流控芯片的预处理：取三个微流控芯片，分别为实验用微流控芯片、正常细胞对照用微流控芯片和空白对照用微流控芯片；涂覆培养基质：对于各微流控芯片，向所述中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道填充培养基质溶液，然后将微流控芯片置于37℃恒温箱中1小时，使中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道的表面涂覆上培养基质；恢复疏水性：对于各微流控芯片，用无菌水冲洗中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道中多余的培养基质溶液，将微流控芯片置于80℃的烘箱中1-2小时，使微流控芯片干燥并恢复疏水性；
步骤二、荧光标记细胞：取生长状态良好的肿瘤细胞株、与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞株和不同组织来源间充质干细胞，用活细胞示踪剂分别标记肿瘤细胞、与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞和各间充质干细胞，其中，标记肿瘤细胞、与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞的活细胞示踪剂的颜色与标记间充质干细胞的活细胞示踪剂的颜色不同；
步骤三、接种及培养细胞：对于各微流控芯片，将基质胶注入基质胶灌注通道，将微流控芯片放入37℃培养箱30分钟，促进基质胶固化；将活细胞示踪剂标记的肿瘤细胞和与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞分别加入培养基配制成细胞悬液，然后分别种植于实验用微流控芯片和正常细胞对照用微流控芯片的中央细胞培养通道；将培养基灌入空白对照用微流控芯片的中央细胞培养通道；将各活细胞示踪剂标记的间充质干细胞分别加入培养基配制成细胞悬液，然后分别种植于各微流控芯片的不同细胞迁移单元的移细胞培养通道，三个微流控芯进行相同的种植；将三个微流控芯片放入培养箱孵育；
步骤四、观察和监测细胞的迁移：待间充质干细胞贴壁后，取出微流控芯片在倒置荧光显微镜下观察并记录不同间充质干细胞在各基质胶灌注通道的迁移情况，记为0小时；继续培养n小时后，取出微流控芯片在倒置荧光显微镜下观察并记录不同间充质干细胞在相应基质胶灌注通道的迁移情况，记为n小时；用软件测量并比较n小时内不同间充质干细胞向肿瘤细胞、与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞及培养基的趋化迁移的迁移面积和最大迁移距离。
进一步，本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的应用方法，还可以具有这样的特征：其中，涂覆培养基质前，对微流控芯片进行无菌处理；无菌处理方法为：用75％酒精(体积分数)润洗中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道，然后将微流控芯片置于紫外光照射下灭菌过夜，待75％酒精完全挥发后再涂覆培养基质。
进一步，本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的应用方法，还可以具有这样的特征：其中，步骤三中，种植于中央细胞培养通道的肿瘤细胞和与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞的细胞悬液的细胞密度为2×106/ml；种植于移细胞培养通道的间充质干细胞的细胞悬液的细胞密度为1×106/ml。
本发明的有益效果在于：本发明从MSCs特异的肿瘤趋化性出发，依托微流控芯片技术，提供了一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片及其制备和应用方法，该微流控芯片实现了多种类型MSCs和肿瘤细胞的同步共培养，并可实现同步比较不同类型MSCs趋化性的差异。具体的：
一、本发明的微流控芯片包含多个通道，所有通道尺寸均在微米量级，细胞和试剂消耗量极少，降低成本，减少细胞损伤；
二、本发明涉及的微流控芯片包含一条用于肿瘤细胞培养的中央细胞培养通道和多个对称排列在中央细胞培养通道两侧的独立的细胞迁移单元集成度高，能够同时实现对多种组织来源MSCs迁移特性的观察和监测，和划痕实验及transwell实验相比，降低了成本，提高实验效率，且实验重复性更好；
三、本发明的微流控芯片的各细胞迁移单元均包含一条基质胶灌注通道，可在三维层面观测不同MSCs的迁移能力；
四、本发明的微流控芯片实现了多种类型MSCs和肿瘤细胞的同步共培养，操作简单，降低了实际样品的用量，并模拟人间充质干细胞对肿瘤细胞的趋化性并同步比较差异，能够为筛选肿瘤靶向治疗高效药物载体提供理论依据。
附图说明
图1是本发明微流控芯片的结构示意图；
图2是图1中A区域的放大图；
图3是本发明微流控芯片的生物相容性检测结果图；
图4是不同组织来源的MSCs在微流控芯片上对宫颈癌细胞趋化性的观察和比较结果图。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施例对本发明的上述方案作进一步说明。
下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所用的试剂、方法和设备，如无特殊说明，均为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明提供一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，包括表面加工出微结构通道的芯片主体和紧密贴合在芯片主体上的基板，微结构通道形成于芯片主体与基板间。
如图1所示，芯片主体上的微结构通道包括一条中央细胞培养通道1和四个对称排列在中央细胞培养通道1两侧的相互独立的细胞迁移单元2，细胞迁移单元2包括一条内侧的基质胶灌注通道21和一条外侧的迁移细胞培养通道22。其中，“内”和“外”分别是指相对靠近和远离中央细胞培养通道1的方向。细胞迁移单元2也可以设置若干个，对称排列在中央细胞培养通道1两侧即可。
中央细胞培养通道1和各基质胶灌注通道21、迁移细胞培养通道22的两端均具有沿芯片主体厚度方向的进样口和出样口。
中央细胞培养通道1用于肿瘤细胞的培养，基质胶灌注通道21用于基质胶的填充，若干迁移细胞培养通道22用于不同组织来源间充质干细胞的培养。
中央细胞培养通道1与各细胞迁移单元2的基质胶灌注通道21之间、以及同一细胞迁移单元2的基质胶灌注通道21与迁移细胞培养通道22之间均设有截流结构3，截流结构3由若干间隔设置的柱状结构31构成，中央细胞培养通道1与各细胞迁移单元2的基质胶灌注通道21、以及同一细胞迁移单元2的基质胶灌注通道21与迁移细胞培养通道22通过截流结构3进行细胞之间的信号传输和相互作用以及细胞迁移。
在一优选的实施例中，细胞迁移单元2中的基质胶灌注通道21和迁移细胞培养通道22的两端均向外侧方向弯折，该弯折结构可以增加各通道进样口和出样口的距离，一方面便于加工各通道的进样口和出样口，另一方面便于各通道细胞的接种或基质胶的灌注。
芯片主体的材料为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，也可以为聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)或聚碳酸酯(PC)；基板的材料为玻璃，也可以为硅片。芯片主体与基板通过等离子体键合工艺实现两者之间的紧密贴合。
中央细胞培养通道1和迁移细胞培养通道22培养肿瘤细胞和间充质干细胞前涂覆有培养基质；培养基质为明胶、壳聚糖、丝素蛋白、鼠尾胶原蛋白、纤维蛋白胶、基质胶(Matrigel)中的一种或几种。
芯片主体的中央细胞培养通道1和各基质胶灌注通道21、迁移细胞培养通道22均位于同一平面，且宽度和高度均相同，分别为1000μm和100μm；基质胶灌注通道21的长度为1.0cm，迁移细胞培养通22的长度为0.8cm，中央细胞培养通道1的长度根据细胞迁移单元2的数量而定，本实施例在中央细胞培养通道1的长度方向上排列有两个细胞迁移单元2，中央细胞培养通道1的长度为2.6cm。优选的，截流结构3由5个六棱柱等间距排列而成，各六棱柱结构的边长为100μm，六棱柱结构之间的间距为50μm。
本发明用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、用计算机辅助软件(CAD)设计和绘制芯片主体的微结构通道图形；
步骤二、依次通过光刻、软光刻法、模塑法等微加工技术制备具有微结构通道的芯片主体，通过手动打孔器制备中央细胞培养通道1和各基质胶灌注通道21、迁移细胞培养通道22的进样口及出样口；
步骤三、将芯片主体和基板用无水乙醇清洗后，进行高压灭菌处理，最后进行等离子体键合，得到微流控芯片。
本发明用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的生物相容性检测：采用三个微流控芯片分别对与宫颈癌细胞(SiHa细胞)、正常宫颈上皮细胞(ECT1/E6E7细胞)和脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived MSCs,AT-MSCs)的生物相容性进行检测。
首先，依次对三个微流控芯片进行无菌处理、涂覆培养基质及恢复疏水性的处理。然后，采用红色荧光活细胞示踪剂(CellTrackerTM Red CMTPX)标记SiHa细胞和ECT1/E6E7细胞，采用绿色荧光活细胞示踪剂(CellTrackerTM Green CMFDA)标记MSCs。最后，取经CellTrackerTM Red CMTPX标记后的SiHa细胞和ECT1/E6E7细胞，经胰酶消化离心后，加入培养基(DMEM培养基，下同)配制成密度为2×106/ml的细胞悬液；用移液枪将配制好的SiHa细胞和ECT1/E6E7细胞的细胞悬液分别加入两个微流控芯片的中央细胞培养通道中，控制加样速度，使细胞悬液缓慢注入中央细胞培养通道。取经CellTrackerTM Green CMFDA标记后的AT-MSCs，经胰酶消化离心后，加入培养基配制成密度为1×106/ml的细胞悬液；用移液枪将配制好的AT-MSCs的细胞悬液加入另一个微流控芯片的迁移细胞培养通道，控制加样速度，使细胞悬液缓慢注入迁移细胞培养通道。将三个微流控芯片重新放入培养皿，用PBS填充芯片周围的培养皿，放入37℃恒温培养箱培养。待细胞贴壁后，分别于孵育0、24、和48h后，取出芯片，在倒置荧光显微镜下观察记录SiHa细胞、ECT1/E6E7细胞和AT-MSCs的生长状况，结果均显示SiHa细胞、ECT1/E6E7细胞和AT-MSCs在微流控芯片上生长良好，如图3所示，结果表明该微流控芯片具有良好的生物相容性。在其他实施例中，微流控芯片的生物相容性的检测也可通过DAPI/PI，Calcein-AM/PI等活细胞、死细胞原位双染法进行。
本发明用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的应用方法，包括以下步骤：
步骤一、微流控芯片的预处理：
取三个微流控芯片，分别为实验用微流控芯片、正常细胞对照用微流控芯片和空白对照用微流控芯片。
无菌处理：对于各微流控芯片，用75％酒精(体积分数)润洗中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道，然后将微流控芯片置于紫外光照射下灭菌过夜，待75％酒精完全挥发后再涂覆培养基质。
涂覆培养基质：对于各微流控芯片，向中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道填充稀释后的鼠尾胶原蛋白I型溶液，然后将微流控芯片置于37℃含5v/v％CO2恒温箱中1小时，使中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道的表面涂覆上鼠尾胶原蛋白I型，以促进细胞贴壁。
恢复疏水性：对于各微流控芯片，用无菌水冲洗中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道中多余的鼠尾胶原蛋白I型溶液，将微流控芯片置于80℃的烘箱中1-2小时，使微流控芯片干燥并恢复PDMS疏水性。
步骤二、荧光标记宫颈癌细胞(SiHa细胞)、正常宫颈上皮细胞(ECT1/E6E7细胞)和不同组织来源的间充质干细胞(MSCs)：
进行荧光标记处理前，用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)将绿色荧光活细胞示踪剂(CellTrackerTM Green CMFDA)和红色荧光活细胞示踪剂(CellTrackerTM RedCMTPX)配制成10mM的原始溶液，再将原始溶液加入培养基中，配置成终浓度为5μM的活细胞示踪剂工作液。取处于对数生长期且生长状态良好的SiHa细胞、ECT1/E6E7细胞和各组织来源的MSCs，弃去培养液，用PBS缓冲液清洗2次。用移液枪分别向SiHa细胞和ECT1/E6E7细胞的培养皿中缓慢加入6ml的CellTrackerTM Red CMTPX，用移液枪向各组织来源的MSCs的培养皿中缓慢加入6ml的CellTrackerTM Green CMFDA工作液，将上述培养皿置于37℃含5％CO2的培养箱孵育1h。孵育结束后，取出培养皿，置于倒置荧光显微镜下观察荧光标记情况，结果显示SiHa细胞、ECT1/E6E7细胞和各组织来源的MSCs的均成功携带了荧光示踪标记。随后，弃去示踪剂工作液，用PBS缓冲液清洗细胞1次后，加入相应的培养基，放入37℃含5％CO2的培养箱继续培养。
步骤三、接种及培养细胞：对于各微流控芯片，用移液枪分别从各基质胶灌注通道的进样口处缓慢注入冰上预冷的基质胶∶培养基(体积比1∶1)稀释液，将微流控芯片置于培养皿中，放入37℃含5％CO2的培养箱30分钟，促进基质胶固化。
取经CellTrackerTM Red CMTPX标记后的SiHa细胞和ECT1/E6E7细胞，经胰酶消化离心后，加入培养基配制成密度为2×106/ml的细胞悬液。取出各微流控芯片，用移液枪将SiHa细胞的细胞悬液、ECT1/E6E7细胞的细胞悬液和不含细胞的DMEM培养基分别加入实验用微流控芯片、正常细胞对照用微流控芯片和空白对照用微流控芯片的中央细胞培养通道中，控制加样速度，使SiHa细胞的细胞悬液、ECT1/E6E7细胞的细胞悬液和不含细胞的DMEM培养基缓慢流入相应的中央细胞培养通道。将各微流控芯片重新放入培养皿，用PBS填充芯片周围的培养皿，放入37℃恒温培养箱孵育6～8h。待SiHa细胞和ECT1/E6E7细胞贴壁后，取经CellTrackerTM Green CMFDA标记后的不同组织来源的MSCs，经胰酶消化离心后，加入培养基配制成密度为1×106/ml的细胞悬液。取出各微流控芯片，用移液枪将不同组织来源的MSCs的细胞悬液分别加入各微流控芯片的不同细胞迁移单元的移细胞培养通道中，控制加样速度，使各种MSCs的细胞悬液缓慢注入各移细胞培养通道。将各微流控芯片重新放入培养皿，放入37℃含5％CO2的培养箱继续孵育。
步骤四、观察和监测细胞的迁移(间充质干细胞肿瘤趋化性的观察和比较)：
MSCs接种结束后，将各微流控芯片放入37℃含5％CO2的培养箱中孵育6～8h，待各种MSCs贴壁后，取出微流控芯片，在倒置荧光显微镜下观察并记录SiHa细胞、ECT1/E6E7细胞和各组织来源的MSCs的生长状态，以及观察并记录各基质胶灌注通道中不同组织来源的MSCs的迁移行为，记为0h。将各微流控芯片放入37℃含5％CO2的培养箱中继续培养，待孵育24h后，取出微流控芯片，在倒置荧光显微镜下观察并记录SiHa细胞、ECT1/E6E7细胞和各组织来源的MSCs的生长状态，观察并记录各基质胶灌注通道中不同组织来源的MSCs的迁移行为，记为24h。用Image-Pro Plus软件测量并比较24小时内不同MSCs在基质胶灌注通道内向SiHa细胞、ECT1/E6E7细胞及不含细胞的DMEM培养基趋化迁移的迁移面积和最大迁移距离。
本实施例选取了四种组织来源的MSCs，包括脂肪间充质干细胞(Adipose tissue-derived MSCs,AT-MSCs)、脐带间充质干细胞(Umbilical cord-derived MSCs,UC-MSCs)、羊膜间充质干细胞(Amniotic membrane-derived MSCs,AM-MSCs)和绒毛膜间充质干细胞(Chorionic plate-derived MSCs,CP-MSCs)。结果如图4所示，首先，通过比较实验用微流控芯片与正常细胞对照用微流控芯片和空白对照用微流控芯片的结果，可以看出各MSCs对SiHa细胞具有趋化能力；其次，通过比较实验用微流控芯片各细胞迁移单元的结果，可以看出CP-MSCs对SiHa细胞趋化能力最强，因此可作为后续宫颈癌靶向治疗研究的潜在药物载体。在本实施例中，微流控芯片的观察时间点可选择培养过程中的任一时刻，本例以培养24h为例。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，其特征在于：
包括表面加工出微结构通道的芯片主体和紧密贴合在芯片主体上的基板；
芯片主体上的微结构通道包括一条中央细胞培养通道和若干个对称排列在中央细胞培养通道两侧的相互独立的细胞迁移单元；所述细胞迁移单元包括一条内侧的基质胶灌注通道和一条外侧的迁移细胞培养通道；
中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道的两端均具有进样口和出样口；
所述中央细胞培养通道用于肿瘤细胞的培养；基质胶灌注通道用于基质胶的填充；若干迁移细胞培养通道用于不同组织来源间充质干细胞的培养；
所述中央细胞培养通道与各细胞迁移单元的基质胶灌注通道之间、以及同一细胞迁移单元的基质胶灌注通道与迁移细胞培养通道之间均设有截流结构，截流结构由若干间隔设置的柱状结构构成，中央细胞培养通道与各细胞迁移单元的基质胶灌注通道、以及同一细胞迁移单元的基质胶灌注通道与迁移细胞培养通道通过截流结构进行细胞之间的信号传输和相互作用以及细胞迁移。
2.根据权利要求1所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，其特征在于：
其中，所述细胞迁移单元中，基质胶灌注通道和迁移细胞培养通道的两端均向外侧方向弯折。
3.根据权利要求1所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，其特征在于：
其中，所述芯片主体的材料为聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯或聚碳酸酯；
所述基板的材料为玻璃或硅片。
4.根据权利要求1所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，其特征在于：
其中，所述芯片主体与基板通过等离子体键合工艺实现两者之间的紧密贴合。
5.根据权利要求1所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，其特征在于：
其中，所述中央细胞培养通道和迁移细胞培养通道培养肿瘤细胞和间充质干细胞前涂覆有培养基质，培养基质为明胶、壳聚糖、丝素蛋白、鼠尾胶原蛋白、纤维蛋白胶、基质胶中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片，其特征在于：
其中，所述芯片主体的中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道均位于同一平面，且宽度和高度均相同，分别为1000μm和100μm；基质胶灌注通道的长度为1.0cm，迁移细胞培养通的长度为0.8cm；
所述截流结构由5个六棱柱结构等间距排列而成，各六棱柱结构的边长为100μm，六棱柱结构之间的间距为50μm。
7.如权利要求1-6任意一项所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的制备方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一、用计算机辅助软件设计和绘制所述芯片主体的微结构通道图形；
步骤二、通过微加工技术制备具有微结构通道的芯片主体，通过手动打孔器制备中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道的进样口及出样口；
步骤三、将芯片主体和基板用无水乙醇清洗后，进行高压灭菌处理，最后进行等离子体键合，得到微流控芯片。
8.如权利要求1-6任意一项所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的应用方法，其特征在于：
包括以下步骤：
步骤一、微流控芯片的预处理：取三个微流控芯片，分别为实验用微流控芯片、正常细胞对照用微流控芯片和空白对照用微流控芯片；
涂覆培养基质：对于各微流控芯片，向所述中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道填充培养基质溶液，然后将微流控芯片置于37℃恒温箱中1小时，使中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道的表面涂覆上培养基质；
恢复疏水性：对于各微流控芯片，用无菌水冲洗中央细胞培养通道和各迁移细胞培养通道中多余的培养基质溶液，将微流控芯片置于80℃的烘箱中1-2小时，使微流控芯片干燥并恢复疏水性；
步骤二、荧光标记细胞：取生长状态良好的肿瘤细胞株、与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞株和不同组织来源间充质干细胞，用活细胞示踪剂分别标记肿瘤细胞、与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞和各间充质干细胞，其中，标记肿瘤细胞、与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞的活细胞示踪剂的颜色与标记间充质干细胞的活细胞示踪剂的颜色不同；
步骤三、接种及培养细胞：对于各微流控芯片，将基质胶注入基质胶灌注通道，将微流控芯片放入37℃培养箱30分钟，促进基质胶固化；
将活细胞示踪剂标记的肿瘤细胞和与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞分别加入培养基配制成细胞悬液，然后分别种植于实验用微流控芯片和正常细胞对照用微流控芯片的中央细胞培养通道；将培养基灌入空白对照用微流控芯片的中央细胞培养通道；
将各活细胞示踪剂标记的间充质干细胞分别加入培养基配制成细胞悬液，然后分别种植于各微流控芯片的不同细胞迁移单元的移细胞培养通道；
将三个微流控芯片放入培养箱孵育；
步骤四、观察和监测细胞的迁移：待间充质干细胞贴壁后，取出微流控芯片观察并记录不同间充质干细胞在各基质胶灌注通道的迁移情况，记为0小时；继续培养n小时后，取出微流控芯片观察并记录不同间充质干细胞在相应基质胶灌注通道的迁移情况，记为n小时；测量并比较n小时内不同间充质干细胞向肿瘤细胞、与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞及培养基的趋化迁移的迁移面积和最大迁移距离。
9.根据权利要求8所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的应用方法，其特征在于：
其中，涂覆培养基质前，对微流控芯片进行无菌处理；
无菌处理方法为：用75％酒精润洗中央细胞培养通道和各基质胶灌注通道、迁移细胞培养通道，然后将微流控芯片置于紫外光照射下灭菌过夜，待75％酒精完全挥发后再涂覆培养基质。
10.根据权利要求8所述的用于间充质干细胞迁移筛选的肿瘤微流控芯片的应用方法，其特征在于：
其中，步骤三中，种植于中央细胞培养通道的肿瘤细胞和与肿瘤细胞同器官来源的正常细胞的细胞悬液的细胞密度为2×106/ml；
种植于移细胞培养通道的间充质干细胞的细胞悬液的细胞密度为1×106/ml。
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2022
- 2022-10-18 CN CN202211270154.3A patent/CN117264763A/zh active Pending
- 2022-12-22 WO PCT/CN2022/140871 patent/WO2024082430A1/zh unknown
- 2022-12-22 LU LU505383A patent/LU505383B1/en active IP Right Grant
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2024082430A1 (zh) | 2024-04-25 |
| LU505383B1 (en) | 2024-04-26 |
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