CN113717851B - 一种组织芯片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种组织芯片及其制备方法,包括芯片基底、电极、柔性传感器和培养腔体;电极和培养腔体设置在芯片基底上,位于培养腔体内的电极上有柔性传感器。本发明省去了测量组织收缩力所需的复杂的制作工艺,操作步骤简单。本发明制备了薄膜柔性传感器,使得组织跳动引起薄膜发生形变,通过检测阻抗发生的变化来反推组织收缩力,从而能够实现实时、长期、非侵入的检测组织的收缩性。
Description
技术领域
本发明属于组织芯片制作技术领域,特别涉及一种组织芯片及其制备方法。
背景技术
组织芯片是一种细胞培养微设备,与基因芯片、蛋白质芯片形成“生物芯片”家族。组织芯片的目的不是创建一个完整的器官,而是创建一个小单元,模拟特定组织的功能以预测在一定刺激下器官水平的反应。通过与组织工程相结合,器官芯片可以精确控制营养供应、微流体流动条件、剪切应力刺激和电特性。因此,组织工程、生物材料和微加工技术的进步带来了体外器官发育和基于芯片的器官平台领域的迅速发展也极大的拓展了体外平台的应用范围。目前,芯片上的器官研究已经允许制造许多微流体芯片来部分模拟器官的功能:芯片上的肝脏、心脏、肺、肠,甚至肿瘤。
对于心脏而言,收缩性是反映其功能的一个重要参数,反应了其泵血能力,对于调节细胞的机械特性和生理功能起着关键的作用。目前,虽已开发出多种用于心肌组织收缩的评估方法,但测试过程仍具有挑战。 比如,在组织工程领域,一般可通过钙离子染色来研究细胞收缩性,但这种方法处理起来相对比较麻烦。而在组织芯片层面上,开发了一系列包括光学拍摄、微柱偏转,荧光颗粒的位移等方法,但由于这些方法需要昂贵的光学测量设备、复杂的数据处理方法以及专业的微制造技术,且需要将细胞拿出培养箱,检测时间有限,使得其应用具有一定的局限性。
此外,对于心肌组织而言,心肌组织具有独特的电学微环境,窦房结中的起搏细胞发出的节律性电信号沿结间束、房室束、左右束支传播,然后经过具有网络结构和高导电性的浦肯野纤维,将电信号同步传播至心室区域的心肌组织。为提升体外心肌组织的仿生效果,需要体外对心肌组织电学微环境进行模拟。在组织工程领域已经有很多研究证明了导电生物支架材料可以促进心肌组织的黏附、生长和分化,从而促进心肌组织的功能性成熟。而在心肌组织芯片上,心肌组织电学微环境的构建的研究相对较少,因此需要对这方面进行研究以提升体外仿生效果。
发明内容
本发明的目的在于提供一种组织芯片及其制备方法,以解决上述问题。
为实现上述目的,本发明采用以下技术方案:
一种组织芯片,包括芯片基底、电极、柔性传感器和细胞生长腔室;电极和细胞生长腔室设置在芯片基底上,位于细胞生长腔室内的电极上有柔性传感器。
进一步的,电极为铂金电极;芯片基底为绝缘载玻片。
进一步的,柔性传感器为CNT/PDMS薄膜,PDMS为聚二甲基硅氧烷,CNT为导电材料碳纳米管。
进一步的,一种组织芯片的制备方法,包括以下步骤:
首先在绝缘载玻片上磁控溅射铂金电极,然后使用CNT和柔性聚合物材料为原料进行混合,制得复合物;
使用匀胶机在载玻片表面旋涂温敏材料薄膜,随后再旋涂CNT/柔性聚合物材料复合物,并进行固化处理;
使用接触印刷的方法在上述薄膜表面印刷粘连蛋白FN,然后在上述处理之后的载玻片上固定环状腔室,作为细胞生长腔室随后接种细胞进行培养,切割CNT/聚合物薄膜至特定形状,适当降温使得温敏材料溶解,得到组织芯片。
进一步的,绝缘载玻片上磁控溅射铂金电极的具体步骤包括:
1)准备厚度约为1mm的绝缘载玻片基片,依次采用丙酮、无水乙醇、去离子水进行超声清洗,清洗时间约为5min;
2)清洗完成后用压缩空气吹干基片表面水渍,置于100℃的烘箱中烘干,烘干时间约为30min;
3)采用匀胶机在基片表面旋涂正性光刻胶,慢速500 r/min,时间5s,快速4000 r/min,时间40s;旋涂完毕后置于烘箱中,设置115℃,前烘约30min;
4)使用曝光机对基片进行电极图案曝光,曝光时间为10s;曝光完成后在115℃温度下后烘约2min;
5)使用显影液显影40s左右,显影完成后用去离子水冲洗干净基片,并用压缩空气吹干;
6)将显影后的基片放入烘箱中,在100°C下后烘约60min,进行坚膜处理;
7)使用磁控溅射仪按照预设程序溅射Ta2/Pt/Ta2的电极结构;
8)进行去胶剥离操作,将基片放于丙酮溶液中浸泡约20min,去胶完成后将基片冲洗干净,并烘干。
进一步的,柔性聚合物为生物相容性良好的柔性聚合物,具体为聚二甲基硅氧烷(PDMS)或甲基丙烯酸化明胶(GelMA)。
进一步的,温敏材料薄膜为聚N-异丙基丙烯酰胺PIPAAm,匀胶机转速为4000-6000r/min,甩胶时间为0.5-2min。
进一步的,柔性传感器利用旋涂法制备,匀胶机转速为4500-10000r/min,甩胶时间为2.5-5min,制得的CNT/聚合物薄膜的厚度为10-25微米。
进一步的,接触印刷粘连蛋白的操作需要在无菌条件下进行,FN的浓度为25-50µg/ml,具体的操作步骤为:
1)将FN蛋白稀释至所需的浓度;
2)利用光刻法制备有序模具并用PDMS进行倒模,将FN蛋白溶液置于PDMS模具上于37℃下孵育1h并风干;
3)将PDMS模具接触CNT/聚合物材料1分钟,然后用1%的Pluronics F127水溶液覆盖5分钟;
4)用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3次并风干。
进一步的,腔室为无底的环状腔室,内径为所述载玻片基底的宽度,选用的材料包括:PDMS或聚苯乙烯;温敏材料溶解需降温至37℃以下。
与现有技术相比,本发明有以下技术效果:
本发明省去了测量组织收缩性所需的复杂制作工艺,操作步骤简单。本发明将心肌细胞培养于薄膜柔性传感器基底上,因为组织跳动将引起薄膜形变,因此可通过检测因形变引起的阻抗变化来评价组织的收缩性,从而能够实现实时、长期、非侵入的组织收缩性评价。
利用电阻变化评估组织收缩性,具体思路为:由于薄膜材料发生形变,使得薄膜材料与电极的接触面积发生变化,电阻随之改变。根据所测量的电阻,结合电极之间的距离、材料薄膜的厚度及材料的电导率,可以计算出与电极接触的薄膜材料的长度,随后可以计算出发生弯折的材料的长度,对该长度进行归一化处理,以此为标准来评估组织的收缩幅度,以电阻变化的频率来表示组织收缩频率。
其中,L为发生弯折的材料的长度,L0为材料初始总长度,ρ为材料电导率,l为电极之间的距离,R为所测电阻,d为材料厚度。
利用微接触印刷蛋白的方法可以定向引导心肌细胞生长成为各向异性心肌组织。
为在芯片上生长的心肌组织构建了连续的电学微环境从而促进心肌组织的功能性成熟,提升其在药物筛选或疾病模拟等应用方向上的准确性。
附图说明
图1为本发明实例中所述的检测组织收缩性的组织芯片的示意图。
图中1为芯片基底,2为电极,3为柔性传感器,4为细胞生长腔室。
具体实施方式
以下结合附图对本发明进一步说明:
为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本实施方式中的方案进行清楚、完整的描述,显然,所描述的实施例仅为本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下的所有实施例,都属于本发明的保护范围。
实施例1:测试阿霉素对心肌组织收缩力的影响:
利用该平台研究肾上腺素对心肌组织收缩力的影响,包括以下步骤:
步骤一,在厚度为1mm的绝缘载玻片上磁控溅射铂金电极;
步骤二,使用导电材料碳纳米管(CNT)和聚二甲基硅氧烷(PDMS)为原料进行混合,制得CNT/PDMS复合物;
步骤三,使用匀胶机在载玻片表面旋涂聚N-异丙基丙烯酰胺(PIPAAm)薄膜,匀胶机转速为6000r/min,甩胶时间为1min;
步骤四,使用匀胶机在步骤三的载玻片表面旋涂CNT/PDMS复合薄膜,匀胶机转速为10000r/min,甩胶时间为3min,制得的CNT/PDMS薄膜的厚度为18微米,然后在65℃下固化8小时;
步骤五,使用接触印刷的方法在CNT/PDMS薄膜表面印刷有序排列的浓度为50µg/ml的粘连蛋白(FN);
步骤六,在上述处理之后的载玻片上固定直径为2.5厘米的环状聚苯乙烯腔室,作为细胞生长腔室随后分离2-3天的SD大鼠的心肌细胞,进行培养和接种;
步骤七:将心肌细胞培养3天后,暴露于10 µM的阿霉素5天;
步骤八:切割CNT/PDMS薄膜至特定形状,将温度降至37℃下使得牺牲层溶解,利用铜线连接电极,与外部检测系统相连。
步骤一所述的制备线状铂金电极的具体步骤包括:
1)准备厚度约为1mm的载玻片基片,依次采用丙酮、无水乙醇、去离子水进行超声清洗,清洗时间约为5min;
2)清洗完成后用压缩空气吹干基片表面水渍,置于100℃的烘箱中烘干,烘干时间约为30min;
3)采用匀胶机在基片表面旋涂正性光刻胶,慢速500 r/min,时间5s,快速4000 r/min,时间40s;旋涂完毕后置于烘箱中,设置115℃,前烘约30min;
4)使用曝光机对基片进行电极图案曝光,曝光时间为10s;曝光完成后在115℃温度下后烘约2min;
5)使用显影液显影40s左右,显影完成后用去离子水冲洗干净基片,并用压缩空气吹干;
6)将显影后的基片放入烘箱中,在100°C下后烘约60min,进行坚膜处理;
7)使用磁控溅射仪按照预设程序溅射Ta2/Pt(电极)/Ta2的电极结构;
8)进行去胶剥离操作,将基片放于丙酮溶液中浸泡约20min,去胶完成后将基片冲洗干净,并烘干;
步骤二所述的CNT和PDMS的混合步骤具体包括:
1)将0.09g碳纳米管和13ml氯仿进行混合,然后在杆式超声细胞破碎仪下超声分散1h;
2)将3g PDMS和6ml氯仿进行混合,然后以150r/min的速度常温搅拌20min;
3)将上述1)和2)所得到的分散体系进行混合,然后加热搅拌使得有机溶剂完全挥发,制得CNT/PDMS复合物。
步骤五中所述的蛋白接触印刷的具体的操作步骤为:
1)将FN蛋白稀释至所需的浓度;
2)利用光刻法制备模具并利用PDMS进行倒模,将FN蛋白溶液置于PDMS模具上于37℃下孵育1h并风干;
3)将PDMS模具接触CNT/PDMS材料1分钟,然后用1%的Pluronics F127水溶液覆盖5分钟;
4)用PBS溶液清洗3次并风干。
步骤六中所述的心肌细胞分离与培养步骤具体包括:
1)提前在3个培养皿中预冷PBS溶液,标号1、2、3;
2)剪刀于胸骨偏右2 mm处斜剪至心脏,取心脏上部,放入标号为1的培养皿(共取10只老鼠的心脏);
3)标号1的培养皿中的心脏去除杂质,转移至标号为2的培养皿,清洗,转移至标号为3的培养皿,清洗,转移至空培养皿;
4)在空培养皿中剪碎心脏;
5)剪碎后加入2ml胶原酶进行细胞裂解,随后进行7次(前4次分别为5分钟,后3次分别为7分钟)摇晃裂解。在离心管里加入30ml培养基。每次裂解结束后吸出上清液加入到培养基中。
6)将所得含细胞的溶液用200目筛网过滤,随后平分为两管1000rpm离心7分钟;
7)轻轻拿出离心好的两管,倒掉液体,每管加2 mL F12++,移液枪来回吹50次以上,尽量保证无气泡,两管混合;
7)将含细胞的液体加入培养瓶中,并补充15ml培养基,随后贴壁1.5h;
8)将细胞进行计数,按照5×10^5个/cm2的密度进行接种。
实施例2:测试异丙肾上腺素药物不同浓度对心肌组织收缩性的影响:
本实施例与实施例1大部分操作步骤相同,不同之处在于:步骤七中,将心肌细胞培养3天后,将心肌细胞暴露于异丙肾上腺素15分钟,且异丙肾上腺素药物浓度逐步增加(10-12-10-6M),随后进行药物浓度-反应实验,研究不同浓度的异丙肾上腺素对心肌组织收缩性的影响。
本发明的工作原理是:将细胞接种在所制备的薄膜材料上,由于薄膜材料是柔性的且足够薄,细胞的跳动会带动薄膜发生形变;由于薄膜材料优良的导电性,使得薄膜形变引起阻抗发生变化,从而使得示波器能够实时采集到信号的变化,实现对组织收缩性的实时、长期、非侵入的检测。
最后应说明的是:以上所述仅为本发明的优选实施案例而已,并不用于限制本发明,尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中的部分技术特征进行同等替换。凡在本发明的精神和原则之内,所做的任何修改、同等替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种组织芯片的制备方法,其特征在于,基于一种组织芯片,
所述组织芯片包括:
芯片基底(1)、电极(2)、柔性传感器(3)和细胞生长腔室(4);电极(2)和细胞生长腔室(4)设置在芯片基底(1)上,位于细胞生长腔室(4)内的电极(2)上有柔性传感器(3);
电极(2)为铂金电极;芯片基底(1)为绝缘载玻片;
柔性传感器(3)为CNT/PDMS薄膜,PDMS为聚二甲基硅氧烷,CNT为导电材料碳纳米管;
所述方法包括以下步骤:
首先在绝缘载玻片上磁控溅射铂金电极,然后使用CNT和柔性聚合物材料为原料进行混合,制得复合物;
使用匀胶机在载玻片表面旋涂温敏材料薄膜,随后再旋涂CNT/柔性聚合物材料复合物,并进行固化处理;
使用接触印刷的方法在上述薄膜表面印刷粘连蛋白FN,然后在上述处理之后的载玻片上固定环状腔室,作为细胞生长腔室随后接种细胞进行培养,切割CNT/聚合物薄膜至特定形状,适当降温使得温敏材料溶解,得到组织芯片;
绝缘载玻片上磁控溅射铂金电极的具体步骤包括:
1)准备厚度为1mm的绝缘载玻片基片,依次采用丙酮、无水乙醇、去离子水进行超声清洗,清洗时间为5min;
2)清洗完成后用压缩空气吹干基片表面水渍,置于100℃的烘箱中烘干,烘干时间为30min;
3)采用匀胶机在基片表面旋涂正性光刻胶,慢速500 r/min,时间5s,快速4000 r/min,时间40s;旋涂完毕后置于烘箱中,设置115℃,前烘30min;
4)使用曝光机对基片进行电极图案曝光,曝光时间为10s;曝光完成后在115℃温度下后烘2min;
5)使用显影液显影40s,显影完成后用去离子水冲洗干净基片,并用压缩空气吹干;
6)将显影后的基片放入烘箱中,在100°C下后烘60min,进行坚膜处理;
7)使用磁控溅射仪按照预设程序溅射Ta2/Pt/Ta2的电极结构;
8)进行去胶剥离操作,将基片放于丙酮溶液中浸泡20min,去胶完成后将基片冲洗干净,并烘干。
2.根据权利要求1所述的一种组织芯片的制备方法,其特征在于,柔性聚合物为生物相容性良好的柔性聚合物,具体为聚二甲基硅氧烷PDMS或甲基丙烯酸化明胶GelMA。
3.根据权利要求1所述的一种组织芯片的制备方法,其特征在于,温敏材料薄膜为聚N-异丙基丙烯酰胺PIPAAm,匀胶机转速为4000-6000r/min,甩胶时间为0.5-2min。
4.根据权利要求1所述的一种组织芯片的制备方法,其特征在于,柔性传感器利用旋涂法制备,匀胶机转速为4500-10000r/min,甩胶时间为2.5-5min,制得的CNT/聚合物薄膜的厚度为10-25微米。
5.根据权利要求1所述的一种组织芯片的制备方法,其特征在于,接触印刷粘连蛋白的操作需要在无菌条件下进行,FN的浓度为25-50µg/ml,具体的操作步骤为:
1)将FN蛋白稀释至所需的浓度;
2)利用光刻法制备有序模具并用PDMS进行倒模,将FN蛋白溶液置于PDMS模具上于37℃下孵育1h并风干;
3)将PDMS模具接触CNT/聚合物材料1分钟,然后用1%的Pluronics F127水溶液覆盖5分钟;
4)用磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗3次并风干。
6.根据权利要求1所述的一种组织芯片的制备方法,其特征在于,腔室为无底的环状腔室,内径为所述载玻片基底的宽度,选用的材料包括:PDMS或聚苯乙烯;温敏材料溶解需降温至37℃以下。
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PB01 | Publication | ||
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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GR01 | Patent grant | ||
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