CN107703111B - 一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用。所述水凝胶包括A液及B液，A液：取0‑4重量份多聚甲醛、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，去离子水定容至NaCl浓度为0.008g/ml后55℃溶解；冷却至4℃后调节pH至6.8‑7.6；加入0.025‑0.15重量份荧光微球、5‑15重量份丙烯酰胺、0.025‑0.075重量份N,N‑亚甲基二丙烯酰胺，4℃溶解后加入0.078重量份四甲基乙二胺和0.05‑0.2重量份过硫酸铵并震荡混匀。该水凝胶具有超强的耐组织透明处理性，可对大组织内的血管结构进行稳定荧光标记。

Description

一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种梯度致密性荧光水凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
血管标记在解剖学和病理学的相关研究中具有极其广泛的应用。随着光学扫描层切技术和多种组织透明技术的发展及应用，在三维水平上对大组织中具有荧光信号的精细结构的三维重建在生命科学及医学方面的研究日趋广泛。要实现大组织中血管精细网络结构的三维重建，就需要对血管的精细结构进行荧光标记，且该荧光标记需对组织透明处理具有良好的耐受性。然而，针对目前已有的任何一种组织透明技术，尚没有这样一种对透明处理过程具有良好的耐受性又能对血管精细网络结构进行稳定荧光标记的方法。
已有的组织透明技术能在保持组织内原有荧光蛋白的荧光信号及蛋白和核酸原有结构特征的前提下实现大组织的透明，结合光学扫描层切技术可对大组织中具有荧光标记的结构进行三维重建。但这些技术不能同时荧光标记血管等精细结构。如能对血管精细结构进行透明耐受性处理并荧光标记，则可以实现大组织乃至整个器官中血管精细网络结构的三维重建。结合自身特定细胞表达特异性荧光蛋白的转基因动物及分通道扫描成像技术，更可进一步为评价血管与其它组织结构的相关关系提供可靠的研究方法。传统的血管标记途径包括对血管进行荧光染料填充和对血管进行特异性的免疫荧光染色。通过荧光染料填充法标记的血管在对组织进行透明处理后存在严重的染料流失和荧光淬灭现象，从而无法对精细的血管结构进行标记。在透明后的大组织中采用免疫荧光染色标记血管存在抗体难以渗入组织内部和免疫结合不完全等难题，无法实现精细血管结构的荧光标记。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，发明人等进行了深入研究，进而提供一种适用于对透明组织中精细血管网络进行荧光标记的新型梯度致密性荧光水凝胶，该新型梯度致密性荧光水凝胶具有超强的耐组织透明处理特性，并可对大组织内部的血管结构进行稳定的荧光标记。通过该水凝胶的应用可在组织透明处理后保留精细血管结构内的稳定荧光标记，进而可实现大组织中血管精细网络结构的三维重建。
具体地，本发明提供一种梯度致密性荧光水凝胶的制备方法，其包括下述步骤：
A液配制：将0-4重量份多聚甲醛、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12 H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用去离子水定容至NaCl的浓度为0.008g/ml后55℃溶解；冷却至4℃后调节pH至6.8-7.6；加入0.025-0.15重量份荧光微球、5-15重量份丙烯酰胺、0.025-0.075重量份N,N-亚甲基二丙烯酰胺，4℃溶解后加入0.078重量份四甲基乙二胺和0.05-0.2重量份过硫酸铵并震荡混匀，现配现用；
B液配制：取2-6重量份丙烯酰胺、0.25重量份VA-044、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12 H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用4℃去离子水定容到丙烯酰胺的浓度为0.02-0.06g/ml后4℃过夜溶解，调节pH至6.8-7.6。
其中，所述荧光微球的粒径为100-500nm。
此外，所述B液于0-4℃储存。
此外，所述荧光微球的荧光激发光谱为330-550nm。
此外，所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球。
本发明提供一种如上所述的制备方法制得的梯度致密性荧光水凝胶。
本发明还提供一种如上所述的梯度致密性荧光水凝胶的应用，其以A液对血管进行填充，实现组织中精细血管结构的荧光标记；以B液对组织进行固定和包埋，在组织中形成低于血管中密度的水凝胶结构，锁定组织中的核酸与蛋白，然后对组织进行透明处理，利用荧光显微镜进行光学层切，实现透明的大组织中精细血管结构的三维荧光标记，结合三维重建技术进一步构建血管精细网络结构的三维模型。
其中，所述以水凝胶中的A液对血管进行填充，是在0-4℃的低温环境中，依次采用PBS和A液对组织进行灌流，灌流完成后立即将组织至于20-37℃环境中使A液发生聚合反应。
此外，所述以B液对组织进行固定和包埋，是在A液的聚合反应后，将组织置于4℃4％ PFA溶液中固定12h后置于B液中0-4℃过夜，然后将组织置于密闭容器中，抽真空后注入氮气，然后置于35-38℃摇床上使B液发生聚合反应。
用该水凝胶中的A液对血管进行填充，即可实现组织中精细血管结构的荧光标记。再用B液对组织进行固定和包埋以在组织中形成梯度致密性的水凝胶结构，然后对组织进行透明处理，最后利用荧光显微镜进行光学层切，则可实现透明的大组织中精细血管结构的三维荧光标记。结合三维重建技术可进一步构建血管精细网络结构的三维模型。该水凝胶的应用高效地解决了传统荧光染料填充法标记血管后在组织透明处理过程中染料流失问题。统计学分析显示，与传统荧光染料填充法相比，采用新型水凝胶标记的血管透明处理后其线密度增加了7.84倍，血管线分支点密度增加了19.74倍。
附图说明
图1是耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶有效标记血管的精细结构。图1A是组织中精细血管结构的荧光标记；图1B是荧光染料常规填充血管后进行透明处理会因染料大量流失而无法标记血管精细结构图；图1C是采用新型水凝胶标记的血管透明处理后其线密度；图1D是血管线分支点密度示意图。
图2是利用耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶进行大组织中血管精细网络结构的三维标记与重建示意图。图2A是耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶标记血管后获得大组织中血管精细网络结构的三维视图；图2B是图2A中白框区域的局部放大，显示精细血管网络的三维结构；图2C是图2B中血管网络结构的三维重建。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进行详述，但本发明并不限定于这些实施例。
一、梯度致密性荧光水凝胶反应体系的制备
实施例1
A液配制：(1)取4g多聚甲醛(PFA)、0.8g NaCl、0.3g Na2HPO4·12 H2O、0.02g KCl和0.02g KH2PO4，用去离子水定容至100ml后55℃溶解。冷却至4℃后调节pH至7.5。加入37.5mg聚苯乙烯荧光微球(粒径100-500nm)、10g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.05g N,N-亚甲基二丙烯酰胺(Sigma，CAS 110-26-9)，4℃溶解后加入100μl四甲基乙二胺和1ml10％过硫酸铵并震荡混匀。现配现用。
B液配制：取4g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.25g VA-044(都莱生物，AIBI25g)、0.8g NaCl、0.3g Na2HPO4·12 H2O、0.02g KCl和0.02g KH2PO4，用4℃去离子水定容到100mL后4℃过夜溶解，调节pH至7.5。在4℃存储，有效存储时间小于一周。
实施例2
A液配制：(1)取2g多聚甲醛(PFA)、0.8g NaCl、0.3g Na2HPO4·12 H2O、0.02g KCl和0.02g KH2PO4，用去离子水定容至100ml后55℃溶解。冷却至4℃后调节pH至6.8。加入25mg聚苯乙烯荧光微球(粒径100-500nm)、5g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.025g N,N-亚甲基二丙烯酰胺(Sigma，CAS 110-26-9)，4℃溶解后加入100μl四甲基乙二胺和2ml 10％过硫酸铵并震荡混匀。现配现用。
B液配制：取2g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.25g VA-044(都莱生物，AIBI25g)、0.8g NaCl、0.3g Na2HPO4·12 H2O、0.02g KCl和0.02g KH2PO4，用4℃去离子水定容到100mL后4℃过夜溶解，调节pH至6.8。在4℃存储，有效存储时间小于一周。
实施例3
A液配制：(1)取1g多聚甲醛(PFA)、0.8g NaCl、0.3g Na2HPO4·12 H2O、0.02g KCl和0.02g KH2PO4，用去离子水定容至100ml后55℃溶解。冷却至4℃后调节pH至7.6。加入150mg聚苯乙烯荧光微球(粒径100-500nm)、15g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.075g N,N-亚甲基二丙烯酰胺(Sigma，CAS 110-26-9)，4℃溶解后加入100μl四甲基乙二胺和0.5ml10％过硫酸铵并震荡混匀。现配现用。
B液配制：取6g丙烯酰胺(Sigma，V900845-1KG)、0.25g VA-044(都莱生物，AIBI25g)、0.8g NaCl、0.3g Na2HPO4·12 H2O、0.02g KCl和0.02g KH2PO4，用4℃去离子水定容到100mL后4℃过夜溶解，调节pH至6.8。在4℃存储，有效存储时间小于一周。
二、以实施例1中制得的梯度致密性荧光水凝胶为实验组对小鼠大脑中精细血管网络结构进行荧光标记和三维重建
1.采用梯度致密性荧光水凝胶对血管进行特异性荧光标记并对组织进行固定和包埋(以厚度为600μm的小鼠大脑组织为例)。
按20μl/g的剂量腹腔注射氨基甲酸乙酯溶液深度麻醉小鼠后将其仰面固定于处于低温环境的蜡盘中。剪开胸腔暴露心脏。剪破其右心耳后先向其左心房灌注20ml 4℃预冷PBS，再迅速灌注15ml A液。将小鼠在37℃摇床上放置30min以使A液发生完全的聚合反应。剪下小鼠头并小心剥去颅骨并保证小鼠脑组织不受机械损伤，取出的大脑组织浸泡在盛有4％ PFA的离心管中4℃过夜。采用振动切片机对小鼠大脑进行冠状切片，切片厚度设定为600μm。将获得的脑片置于盛有约30ml B液的离心管中4℃过夜后将脑片连同B液置于一密闭试剂瓶中。采用真空泵对密闭试剂瓶抽气5min后通10min氮气以完全置换瓶中的氧气。将处理好的试剂瓶密封后置于37℃摇床上50rmp/min摇3h以使B液发生完全的聚合反应。
2.采用组织透明技术对脑片进行透明处理
从试剂瓶中取出脑片后置于37℃含有8％ SDS的PBS溶液中，并在转速为80rmp/min的42℃摇床上清洗至脑片透明。将透明后的脑片置于PBS溶液中并在转速为50rmp/min的摇床上室温清洗以去除脑片中的SDS。
3.透明脑片中血管网络的三维成像(以四方酸为荧光标记物的聚苯乙烯荧光微球配制A液为例)
清洗完成后的脑片以70％山梨醇溶液为封片剂封片。采用配备有10×物镜(NA，0.4)的Olympus FV1000 MPE激光共聚焦显微镜扫描成像。Z轴步距为1.25μm，XY平面尺寸为1024像素×1024像素，立体像素尺寸为1.25μm×1.25μm×1.25μm，激发光波长为559nm，Z向扫描深度约为600μm。
4.脑片中血管网络结构的三维重建。
采用Imaris 8.0(Bitplane)软件的Filaments Tracer模块根据血管在三维空间中的连续性特征进行追踪，最终实现了透明后脑组织中精细血管网络结构的三维重建。
基于重建后的血管三维模型可实现血管网络结构的三维量化与分析。结合具有细胞特异性荧光标记的转基因小鼠和荧光显微镜分通道光学层切技术，可实现同一透明组织中血管和其它结构的分通道同步扫描深度成像，进而可在三维水平上针对大组织中血管结构和其它细胞结构进行空间位置相关关系等方面的量化分析。
5.对照组
在以荧光染料填充血管中，除了A液中不加丙烯酰胺、N,N-亚甲基二丙烯酰胺、四甲基乙二胺和过硫酸铵以外，与实施例1相同。
图1A：耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶标记小鼠脑组织中血管的精细结构，图1a-d为图1A中白色方框区域的放大图，显示脑组织中任意部位的精细血管结构均能被荧光标记。图1B：荧光染料常规填充血管后进行透明处理会因染料大量流失而无法标记血管精细结构。图1e-h为图1B中白色方框区域的放大图。图1C：统计学分析耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶标记血管(实验组)和荧光染料填充血管(对照组)对透明后小鼠脑组织中血管线密度的影响。图1D：统计学分析耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶标记血管(实验组)和荧光染料填充血管(对照组)对透明后小鼠脑组织中血管分支点密度的影响。双尾t检验，***p<0.0001,n＝5。
图2利用耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶进行大组织中血管精细网络结构的三维标记与重建。
图2A：耐组织透明处理的梯度致密性荧光水凝胶标记血管后获得大组织中血管精细网络结构的三维视图。图2B:图2A中白框区域的局部放大，显示精细血管网络的三维结构。图2C：图2B中血管网络结构的三维重建。

Claims (9)

1.一种梯度致密性荧光水凝胶的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
A液配制：取0-4重量份多聚甲醛、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用去离子水定容至NaCl的浓度为0.008g/ml后55℃溶解；冷却至4℃后调节pH至6.8-7.6；加入0.025-0.15重量份荧光微球、5-15重量份丙烯酰胺、0.025-0.075重量份N ,N-亚甲基二丙烯酰胺，4℃溶解后加入0.078重量份四甲基乙二胺和0.05-0.2重量份过硫酸铵并震荡混匀，现配现用；
B液配制：取2-6重量份丙烯酰胺、0.25重量份VA-044、0.8重量份NaCl、0.3重量份Na2HPO4·12H2O、0.02重量份KCl和0.02重量份KH2PO4，用4℃去离子水定容到丙烯酰胺的浓度为0.02-0.06g/ml后4℃过夜溶解，调节pH至6.8-7.6。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧光微球的粒径为100-500nm。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述B液于0-4℃储存。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧光微球的荧光激发光谱为330-550nm。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球。
6.一种如权利要求1-5中任意一项所述的制备方法制得的梯度致密性荧光水凝胶。
7.一种如权利要求6所述的梯度致密性荧光水凝胶的应用，其特征在于，以A液对血管进行填充，是在0-4℃的低温环境中，依次采用PBS和A液对组织进行灌流，灌流完成后立即将组织置于20-37℃环境中使A液发生聚合反应，实现组织中精细血管结构的荧光标记；以B液对组织进行固定和包埋，在组织中形成低于血管中密度的水凝胶结构，锁定组织中的核酸与蛋白，然后对组织进行透明处理，利用荧光显微镜进行光学层切，实现透明的大组织中精细血管结构的三维荧光标记，结合三维重建技术进一步构建血管精细网络结构的三维模型。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述以水凝胶中的A液对血管进行填充，是在0-4℃的低温环境中，依次采用PBS和A液对组织进行灌流，灌流完成后立即将组织至于20-37℃环境中使A液发生聚合反应。
9.根据权利要求所7述的应用，其特征在于，所述以B液对组织进行固定和包埋，是在A液的聚合反应后，将组织置于4℃4％PFA溶液中固定12h后置于B液中0-4℃过夜，然后将组织置于密闭容器中，抽真空后注入氮气，然后置于35-38℃摇床上使B液发生聚合反应。
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