KR20190116872A - 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 키트 및 이를 이용한 투명화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트 및 이를 이용한 투명화 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 투명화 키트는 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 및 혈관 등의 다양한 생체 조직의 면역염색 시 조직의 손상 없이 항체 등의 침투력을 증가시켜 기존의 생체조직 투명화 조성물을 사용하는 경우에 비해 고퀄리티의 3차원 형광 이미지 결과를 얻을 수 있으며, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되어, 투명화된 조직 내 항체 및 염색시료를 통한 염색이 가능한 바, 생체 조직의 구조적 이미지를 보다 자세하게 관찰할 수 있어 관찰하기 어려운 조직의 변화를 분석하는데 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트 및 이를 이용한 투명화 방법에 관한 것이다.
현재 질병의 진단은 2차원 스캐닝을 통한 3차원으로의 재구성 기술에 의해 보다 정교하게 진단할 수 있는 기술로 발전하여 왔다. 그러나, 현재 개발된 기술은 밀리미터 수준으로 세포 수준에서의 분석이 가능한 정도의 기술은 매우 미흡한 실정이다.
즉, 생검 등의 생체조직을 고정한 후 파라핀 등으로 포매하여 나노미터 두께의 슬라이드를 만들어 광학이나 형광 등으로 미세 구조를 분석한다. 이러한 미세 구조에 대한 이미지 기술을 이용하여 3차원 이미지를 구성하기 위해서는 콘포칼과 같은 현미경을 이용해야 하며 이러한 경우 수십 마이크로 미터 수준 두께의 정보를 획득할 수 있다. 그러나 이 모든 것은 광원이 침투 할 수 있는 깊이에 의해 제한된다. 따라서, 보다 두꺼운 조직의 3차원 이미지를 획득하기 위해서는 조직을 연속적으로 절편하여 현미경으로 이미징 한 후 다시 재구성하는 과정이 필요하다.
조직 투명화 기술은 조직의 손상 없이 구조 및 단백질 발현 등을 확인 할 수 있으므로 최근에 매우 다양한 방법으로 조직을 투명화 할 수 있는 기술이 개발되었다. 기존의 조직 투명화 기술은 유기용매를 이용한 조직 투명화 방법인 Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO법과, 폴리머 주입법인 ACT(active CLARITY technology)법에 의해 처리된 조직의 항원 보존성이 보고된 바 있다. ACT를 제외한 다른 방법의 경우 형광과 항원의 보존성이 감소하는 문제를 가지고 있다. ACT의 경우 90% 이상의 항원 보존성을 가지며, 이는 클라리티(CLARITY)와 같이 고정된 단백질에 추가로 하이드로젤 폴리머와의 결합을 필요로 하는 방법에 비하면 보다 높은 보존성을 보인다. 그러나 강한 조직 고정 과정은 항원성의 손실을 유발하여, 사용할 수 있는 항체가 감소하는 등의 문제점을 고려해야 하므로, 여러 가지 기술의 개선이 필요하다.
최근에 개발된 클라리티(CLARITY)법은 조직 내 hydrogel을 넣어서 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 material 등을 붙잡아 주는 일종의 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다. 클라리티(CLARITY) 및 관류 도움 시약 방출방법(PARS)과 같이 광학적으로 투명하고 고분자 투과가 가능한 이미지를 창출할 수 있는 조직투명성 기술은 매우 향상된 기관계 이미징에 있어서 주요한 진전을 제공하였다.
이러한 방법들은 나노 기공성 하이드로겔로 세포막 지질이중층을 대체하여 조직 투과성을 향상시키는 기술이다. 마이크로 단위로 절개시 조직 구조의 변형을 악화시키는 기계적인 마이크로 단위의 절개 방법과는 다르게, 클라리티는 뇌 조직의 구조를 손상없이 보존하여, 신경돌기 추적과 3차원(3D) 및 추적된 뉴런의 위상 재건을 가능하게 한다. PARS 역시 뇌 및 다른 8개 기관(뇌, 척수, 심장, 근육, 간, 폐, 신장, 대장 및 소장)에 고분자 투과 성 및 광학적(시각적) 투명성을 제공할 수 있다.
일반적인 광학 현미경을 사용하여 기관 전반에 걸친 세밀한 정보를 얻는 것은 엄청난 일이다. 예를 들어, 단일 광자 현미경은 기관 표면 아래 최대 50 nm 깊이까지의 이미지 촬영만 가능하며, 매우 최적화된 이광자 현미경은 대략 800 nm보다 더 깊은 곳은 이미지화가 불가능하다.
그러나, 클라리티 또는 PARS는 다양한 기관을 손상시키지 않고, 더 깊은 곳까지 향상된 기관 구조 관찰 기술을 향상시킬 수 있으며, 뇌 및 손상되지 않은 다른 기관계로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 한다. 특히, 클라리티는 뇌에 전기력을 적용하여, 절개되지 않은 조직에 더욱 빠르고 투명하게 할 수 있으며, 투명화 과정 동안 조직 손상을 예방할 수 있다(한국등록특허 제 1563826호 참조).
그러나, 상기 클라리티 방법은 hydrogel 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 많아 더 조직이 단단해져서 지질의 제거가 어려워 지기 때문에 투명화하는데 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이는 조직 표면에 공기 및 검은 입자의 침착을 야기한다. 또한, 기존의 클라리티 법은 과정이 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 뿐만 아니라 한번에 한 조직만 투명화 할 수 있어 경제적, 시간적 손실을 유발하며 항체를 이용한 염색이 불안정한 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 고가의 전기영동 장치를 필요로 하지 않고 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 및 혈관 등의 다양한 조직의 손상 없이 생체 조직의 투명성을 증가시켜 조직 내 항체 염색이 가능하여 조직을 3차원적으로 염색하여 이미지화 할 수 있는 키트를 발명하였다.
본 발명자들은 종래의 생체 조직 투명화 방법의 문제점을 해결할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 항체 등의 조직 내 침투력을 증가시켜 보다 우수한 3차원의 조직 투명화 현미경 이미지를 얻을 수 있는 키트를 발명하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 고정 용액, 조직 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액을 포함하는 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 투명화 키트를 이용한 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 생체조직 시료를 고정시키는 고정 용액;
상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 조직 클리어링 용액;
상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 용액; 및
상기 세척된 시료를 고정시키는 마운팅 용액;
을 포함하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트를 제공한다.
본 발명의 일구현예로서, 상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관일 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예로서, 상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 조직 클리어링 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001 내지 1.0%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001 내지 0.5%(w/v)일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 마운팅 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예로서, 상기 마운팅 용액의 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001 내지 2%(w/v)일 수 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 방법을 제공한다:
(a) 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계; 및
(d) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
본 발명에 따른 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트는 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 및 혈관 등의 다양한 생체 조직의 면역염색 시 조직의 손상 없이 항체 등의 침투력을 증가시켜 기존의 생체조직 투명화 조성물을 사용하는 경우에 비해 고퀄리티의 3차원 형광 이미지 결과를 얻을 수 있으며, 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되어, 투명화된 조직 내 항체 및 염색시료를 통한 염색이 가능한 바, 생체 조직의 구조적 이미지를 보다 자세하게 관찰할 수 있어 관찰하기 어려운 조직의 변화를 분석할 수 있으며, 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일구현예에 따른 생체조직 투명화 키트를 이용하여 폐조직을 면역염색한 결과(우)를 표 1에 나타낸 기존의 생체조직 투명화 조성물을 이용한 폐조직 면역염색 결과(좌)와 비교하여 나타낸 도면이다.
본 발명은 생체조직 시료를 고정시키는 고정 용액;
상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 조직 클리어링 용액;
상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 용액; 및
상기 세척된 시료를 고정시키는 마운팅 용액;
을 포함하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트를 제공한다.
이 때, 상기 투명화 키트에는 시료를 보관할 수 있는 이미지 챔버(image chamber)가 더 포함될 수 있다.
본 발명에서 상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 수크로오스의 농도는 20%(w/v) 이상 100%(w/v)이하로 하여 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정할 수 있으나, 상기 농도에 한정되는 것은 아니다.
상기 조직 클리어링 용액은 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도를 0.001 내지 1.0%(w/v)로 하여 삼투압에 의한 조직의 변형과 ion strength를 안정화시켜 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 할 수 있으나, 상기 농도에 제한되지는 않는다.
상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도를 0.001 내지 0.5%(w/v)로 하여 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척할 수 있으나, 상기 농도에 제한되지는 않는다.
상기 마운팅 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다.
이 때, 상기 마운팅 용액의 굴절률을 1.45로 맞추기 위해 상기 CHAPS 및 우레아의 조성은 각각 40%(w/v), 30%(w/v)로 할 수 있으며, 염화나트륨(NaCl)의 농도를 0.001 내지 2%(w/v)로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 방법을 제공한다:
(a) 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계; 및
(d) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
본 발명의 일실시예에서는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트를 제조하였다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 상기 투명화 키트를 이용하여 폐 조직 시료를 투명화 시키고 면역염색을 수행한 후 3차원 형광 이미지를 확인하였다(실시예 2 참조).
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예
1. 생체조직 투명화
키트의
제조
생체조직 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정시키기 위해, 하기 표 1에 나타낸 기존의 생체조직 투명화 조성물의 고정 용액(fixing solution)의 구성 성분인 수크로오스(sucrose)를 20%(w/v) 이상으로 하여 본 발명의 고정 용액(fixing solution)을 제조하였다.
삼투압에 의한 조직의 변형과 ion strength를 안정화시켜 생체조직 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 하기 위해, 하기 표 1의 조직 클리어링 용액(Tissue clearing solution)의 구성 성분인 20%(w/v) CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트)에 50%(w/v) 우레아(urea) 및 0.1 내지 0.5%(w/v) 농도의 염화나트륨(NaCl)을 추가하여, 본 발명의 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)을 제조하였다.
투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척시킬 수 있도록 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)에 0.1%(w/v)의 아지드화나트륨(sodium azide)을 첨가하여 세척 용액(washing solution)을 제조하였다.
40%(w/v)의 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 30%(w/v) 우레아(urea)에 0.1 내지 1%(w/v) 농도의 염화나트륨(NaCl)을 추가해 마운팅 용액(mounting solution)을 제조하여 굴절률을 1.45로 맞추었다.
기존의 생체조직 투명화 조성물의 구성 및 구성 성분을 표 1에 나타내었고, 상기 방법으로 제조한 본 발명의 생체조직 투명화 키트의 구성 및 구성 성분은 표 2에 나타내었다.
| 구성 | 구성 성분 | |
| 1 | Fixing solution | Sucrose(20%(w/v)) |
| 2 | Tissue clearing solution | CHAPS(20%(w/v)), Urea(40%(w/v)) |
| 3 | Mounting solution | CHAPS(40%(w/v)), Urea(40%(w/v)) |
| 구성 | 구성 성분 | |
| 1 | Fixing solution | Sucrose(20%(w/v)이상) |
| 2 | Tissue clearing solution | CHAPS(20%(w/v)), Urea(50%(w/v)), NaCl(0.1 내지 0.5%(w/v)) |
| 3 | Washing solution | PBS, sodium azied(0.1%(w/v)) |
| 4 | Mounting solution | CHAPS(40%(w/v)), Urea(30%(w/v)), NaCl(0.1 내지 1%(w/v)) |
실시예
2. 생체조직 투명화
키트를
이용한 형광 이미지 확인
24주령 마우스를 개복하여 심장으로부터 4% PFA를 이용하여 perfusion 하여 고정하면서 체내 혈액을 제거한 후 폐 조직을 얻었다.
4% PFA에 고정된 폐 조직 시료를 고정 용액(fixing solution)에 넣고 4℃/50 rpm에서 침전될 때까지 shaking incubation 하였다.
침전된 폐 조직 시료를 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 36시간 동안 shaking incubation하고, 동일한 조건으로 1회 반복하였다.
반응이 끝난 폐 조직 시료에 50ml의 세척 용액(washing solution)을 넣고 4℃/50 rpm에서 4시간 동안 shaking incubation하였다(3회 반복).
상기 washing이 끝난 폐 조직 시료는 마운팅 용액(mounting solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 12시간 shaking incubation 하였으며, 동일한 조건으로 1회 반복하였다.
상기 마운팅 용액으로 처리한 폐 조직 시료를 1200 rpm에서 30분 동안 centrifuge하여 시료 내 bubble을 제거하고, 폐 조직 시료를 image chamber에서 보관하거나 1X PBS에 4℃에서 보관하였다.
상기 방법으로 투명화가 완료된 폐 조직을 in vivo imaging system (Fluorescence-labeled organism bioimaging instrument)에 넣고 형광량을 측정하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 표 1에 나타낸 기존의 생체조직 투명화 조성물을 이용하여 면역염색한 폐조직 3차원 형광 이미지(도 1의 좌측 이미지)에 비해 본 발명의 생체조직 투명화 키트를 이용하여 면역염색한 폐조직 3차원 형광 이미지(도 1의 우측 이미지)가 더 선명한 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (10)
- 생체조직 시료를 고정시키는 고정 용액;
상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 조직 클리어링 용액;
상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 세척 용액; 및
상기 세척된 시료를 고정시키는 마운팅 용액;
을 포함하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관인 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 제3항에 있어서,
상기 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 이상인 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 조직 클리어링 용액은 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 제5항에 있어서,
상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001 내지 1.0%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 제7항에 있어서,
상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001 내지 0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 마운팅 용액은 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 키트.
- 하기 단계를 포함하는 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 방법:
(a) 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 시료에 있는 형광물질의 변성을 최소화하는 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 형광물질의 변성을 최소화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계; 및
(d) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
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| KR20230050917A (ko) | 2021-10-08 | 2023-04-17 | 서울대학교병원 | 현장 평가용 조직 염색 키트 |
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