KR102347035B1 - 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 키트, 이를 이용한 생체조직의 투명화 방법 및 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법 - Google Patents
전해수를 포함하는 생체조직 투명화 키트, 이를 이용한 생체조직의 투명화 방법 및 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 키트, 이를 이용한 생체조직 투명화 방법, 및 생체조직의 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 생체조직 투명화 용액 키트는 용액 성분으로 전해수를 포함하며, 이를 이용하여 생체조직을 투명화할 경우 전해수를 포함하지 않는 투명화 용액을 이용하는 경우에 비해 조직의 심부까지 투명화가 더 잘 일어나고, 투명화 시간을 단축시키는 효과가 있다. 또한, 다양한 항체를 활용한 면역염색 시 본 발명에 따른 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트를 이용하여 생체조직 내로 항체의 침투력을 향상시키고 선명한 3차원 형광 이미지를 획득할 수 있는 바, 생체조직을 보다 자세하게 관찰할 수 있어 다양한 질환의 진단 및 치료를 위한 개발 분야에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 키트, 이를 이용한 생체조직의 투명화 방법 및 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법에 관한 것이다.
현재 질병의 진단은 2차원 스캐닝을 통한 3차원으로의 재구성 기술에 의해 보다 정교하게 진단할 수 있는 기술로 발전하여 왔다. 그러나, 현재 개발된 기술은 밀리미터 수준으로 세포 수준에서의 분석이 가능한 정도의 기술은 매우 미흡한 실정이다.
즉, 생검 등의 생체조직을 고정한 후 파라핀 등으로 포매하여 나노미터 두께의 슬라이드를 만들어 광학이나 형광 등으로 미세 구조를 분석한다. 이러한 미세구조에 대한 이미지 기술을 이용하여 3차원 이미지를 구성하기 위해서는 콘포칼과 같은 현미경을 이용해야 하며 이러한 경우 수십 마이크로 미터 수준 두께의 정보를 획득할 수 있다. 그러나 이 모든 것은 광원이 침투할 수 있는 깊이에 의해 제한된다. 따라서, 보다 두꺼운 조직의 3차원 이미지를 획득하기 위해서는 조직을 연속적으로 절편하여 현미경으로 이미징 한 후 다시 재구성하는 과정이 필요하다.
조직 투명화 기술은 조직의 손상 없이 구조 및 단백질 발현 등을 확인 할 수 있으므로 최근에 매우 다양한 방법으로 조직을 투명화 할 수 있는 기술이 개발되었다. 기존의 조직 투명화 기술은 유기용매를 이용한 조직 투명화 방법인 Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO법과, 폴리머 주입법인 ACT(active CLARITY technology)법에 의해 처리된 조직의 항원 보존성이 보고된 바 있다. ACT를 제외한 다른 방법의 경우 형광과 항원의 보존성이 감소하는 문제를 가지고 있다. ACT의 경우 90% 이상의 항원 보존성을 가지며, 이는 클라리티(CLARITY)와 같이 고정된 단백질에 추가로 하이드로젤 폴리머와의 결합을 필요로 하는 방법에 비하면 보다 높은 보존성을 보인다. 그러나 강한 조직 고정 과정은 항원성의 손실을 유발하여, 사용할 수 있는 항체가 감소하는 등의 문제점을 고려해야 하므로, 여러 가지 기술의 개선이 필요하다.
최근에 개발된 클라리티(CLARITY)법은 조직 내 hydrogel을 넣어서 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 material 등을 붙잡아 주는 일종의 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다. 클라리티(CLARITY) 및 관류 도움 시약 방출방법(PARS)과 같이 광학적으로 투명하고 고분자 투과가 가능한 이미지를 창출할 수 있는 조직투명성 기술은 매우 향상된 기관계 이미징에 있어서 주요한 진전을 제공하였다.
그러나, 상기 클라리티 방법은 hydrogel 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 많아 더 조직이 단단해져서 지질의 제거가 어려워 지기 때문에 투명화하는데 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이는 조직 표면에 공기 및 검은 입자의 침착을 야기한다. 또한, 기존의 클라리티 법은 과정이 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 뿐만 아니라 한번에 한 조직만 투명화 할 수 있어 경제적, 시간적 손실을 유발하며 항체를 이용한 염색이 불안정한 문제가 있었다.
한편, 보통의 물은 10-13개의 물 분자 구조를 가지는 반면 전해수는 6개, 즉 육각수로 보통 물 분자 구조의 절반에 가깝기 때문에 전해수는 물 자체의 분자구조가 보통의 물보다 아주 미세하게 구성되어 있어 조직 내 흡수가 아주 빠를 것이라 사료된다. 또한 전해수는 계면활성제보다 유화현상이 뛰어나며, 이러한 현상은 OH- 이온이 물과 반응하여 H3O2 -가 되어 계면에너지가 감소하고 계면활성을 갖게 되어 표면장력이 작아져서 침투력이 향상되는 것으로 판단된다.
본 발명자들은 고가의 전기영동 장치를 필요로 하지 않고 다양한 조직의 손상 없이, 전해수를 이용하여 종래의 생체조직 투명화 방법에 비해 생체조직의 투명화 시간 및 투명화 정도가 개선되고 생체조직 내로의 항체 침투력을 증가시켜 고해상도의 3차원 형광 이미지 결과를 제공할 수 있는 최적의 용액 조성의 조합을 개발하고 다양한 질병의 진단 또는 치료 관련 연구 등에 활용하고자 하였다.
이찬우 and 배기서, 전해수의 특성에 관한 연구, 2006, Journal of the Korean Society of Dyers and Finishers, Vol. 18, No. 6, pp. 43-48
본 발명자들은 종래의 생체조직 투명화 방법의 문제점을 해결할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 노력한 결과, 생체조직의 투명화 및 면역조직화학법에 사용 시 기존의 투명화 용액에 비하여 생체조직의 투명화 속도 및 투명화 정도를 증가시키고 생체조직 내로 항체의 침투력을 증가시켜 고해상도의 3차원 면역염색 이미지를 제공하는 생체조직 투명화 용액 키트를 발명하였는 바, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트, 이를 이용한 생체조직 투명화 방법 및 생체조직의 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 수크로오스(sucrose)를 포함하는 고정 용액(fixing solution);
3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 및 전해수(electrolyzed water)를 포함하는 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution);
인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 세척 용액(washing solution); 및
3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 마운팅 용액(mounting solution)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 생체조직의 투명화 방법을 제공한다:
(a) 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 전해수를 포함하는 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 투명화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계; 및
(d) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 생체조직의 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법을 제공한다:
(a) 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 전해수를 포함하는 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 투명화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계;
(d) 상기 세척된 시료에 형광물질이 부착된 항체를 처리하는 단계; 및
(e) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 및 혈관으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 고정 용액에서 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 내지 100%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 조직 클리어링 용액에서 CHAPS는 농도가 10%(w/v) 내지 40%(w/v)이고, 우레아(urea)는 농도가 30%(w/v) 내지 70%(w/v)이고, 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 1%(w/v)이고, 전해수는 농도가 1%(w/v) 내지 50%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 세척 용액에서 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.5%(w/v)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 마운팅 용액에서 CHAPS는 농도가 20%(w/v) 내지 60%(w/v)이고, 상기 우레아(urea)는 농도가 10%(w/v) 내지 50%(w/v)이고, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 3%일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 따른 생체조직 투명화 용액 키트는 용액 성분으로 전해수를 포함하며, 이를 이용하여 생체조직을 투명화할 경우 전해수를 포함하지 않는 투명화 용액을 이용하는 경우에 비해 조직의 심부까지 투명화가 더 잘 일어나고, 투명화 시간을 단축시키는 효과가 있다. 또한, 다양한 항체를 활용한 면역염색 시 본 발명에 따른 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트를 이용하여 생체조직 내로 항체의 침투력을 향상시키고 선명한 3차원 형광 이미지를 획득할 수 있는 바, 생체조직을 보다 자세하게 관찰할 수 있어 다양한 질환의 진단 및 치료를 위한 개발 분야에서 유용하게 이용될 것으로 기대된다.
도 1은 본 발명의 일 구현예에 따른 전해수를 포함하는 조직 클리어링 용액(E-TC)을 이용하는 경우의 뇌 조직 투명화 결과를 전해수를 포함하지 않는 조직 클리어링 용액(TC)을 이용하는 경우와 비교하여 나타낸 도면이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC를 이용하여 획득한 GFP-transgenic 마우스의 뇌 조직 형광 이미지를 TC를 이용하는 경우와 비교하여 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 뇌 조직 투명화 과정에서 마운팅 용액(MS) 처리 7일 후 E-TC 및 TC 각각을 이용한 경우 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직의 light sheet 이미지를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC 및 TC를 각각 이용하여 1 mm 두께의 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직에서의 형광 신호 강도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC 및 TC를 각각 이용하여 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직의 후내측 피질의 편도체 핵(posteromedial cortical amygdala nucleus)에서의 형광 신호 강도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC 및 TC를 각각 이용하여 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직의 대뇌 피질의 뉴런 형태(neuronal morphology)에서의 형광 신호 강도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC 및 TC를 각각 이용하여 마우스 뇌 조직의 면역염색 후 뇌 조직으로의 항체 침투력을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC를 이용하여 획득한 GFP-transgenic 마우스의 뇌 조직 형광 이미지를 TC를 이용하는 경우와 비교하여 나타낸 도면이다.
도 3은 본 발명의 일 구현예에 따른 뇌 조직 투명화 과정에서 마운팅 용액(MS) 처리 7일 후 E-TC 및 TC 각각을 이용한 경우 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직의 light sheet 이미지를 나타낸 도면이다.
도 4는 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC 및 TC를 각각 이용하여 1 mm 두께의 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직에서의 형광 신호 강도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 5는 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC 및 TC를 각각 이용하여 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직의 후내측 피질의 편도체 핵(posteromedial cortical amygdala nucleus)에서의 형광 신호 강도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 6은 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC 및 TC를 각각 이용하여 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직의 대뇌 피질의 뉴런 형태(neuronal morphology)에서의 형광 신호 강도를 공초점 현미경으로 관찰한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일 구현예에 따른 E-TC 및 TC를 각각 이용하여 마우스 뇌 조직의 면역염색 후 뇌 조직으로의 항체 침투력을 확인한 결과이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 수크로오스(sucrose)를 포함하는 고정 용액(fixing solution);
3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 및 전해수(electrolyzed water)를 포함하는 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution);
인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 세척 용액(washing solution); 및
3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함하는 마운팅 용액(mounting solution)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 생체조직의 투명화 방법을 제공한다:
(a) 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 전해수를 포함하는 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 투명화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계; 및
(d) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 생체조직의 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법을 제공한다:
(a) 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 전해수를 포함하는 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
(c) 세척 용액으로 상기 투명화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계;
(d) 상기 세척된 시료에 형광물질이 부착된 항체를 처리하는 단계; 및
(e) 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
본 발명에 있어서, "생체조직"은 동물의 생체 중에 존재하는 조직이고, 혈관과 그 밖의 세포 등에 의해 형성된 조직을 말하며, 예컨대 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 및 혈관으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, 상기 동물은 인간, 비-인간 영장류, 마우스, 개, 고양이, 토끼, 말, 및 소로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 있어서, "전해수(electrolyzed water)"는 수도수나 식염수 등의 전해질 수용액을 약한 직류전압에서 전해 처리해서 얻어지는 수용액을 총칭하며, 전기 분해 방식으로 물을 분해하면 수소가 풍부한 수소 풍부수와 산소가 풍부한 산소 풍부수를 얻을 수 있는데, 수소 풍부수는 활성수소를 풍부하게 함유하고, 환원작용을 갖는 전해 환원수라 통칭하며, 산소 풍부수는 전자를 잃고 활성산소가 생기는 산화 산성수라 통칭할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 전해수는 한정되지 않으며 전해 환원수 또는 산화 산성수일 수 있다.
예컨대, 물을 전기분해 했을 때 양극에서는 2H2O(l) → O2(g)+4H+(aq)+4eH+의 증가와 OH-의 감소로 산성수가 된다. 음이온이 모여들며 이들은 전자(e)를 양극전극에 빼앗기는 반응이 일어나 2Cl-+2e → Cl2, Cl2+2H2O → 2HClO+2H++2e의 반응이 일어나고, 염소가스(Cl2)와 차아염소산(HClO)이 발생한다. 음극에서는 4H2O(l)+4e- → 2H2(g)+4OH-(aq)으로, OH-의 증가와 H+ 감소에 의해 알칼리수가 되어 양이온이 모여들며, 이들은 음극전극으로부터 전자(e)를 받는 반응이 일어난다(https://patents.google.com/patent/KR20160004051A/ko).
본 발명에 있어서, "면역조직화학법" 또는 "면역염색"은 세포 또는 조직 등에서 특정한 단백질의 국재를 연구하는 방법으로 개발한 항체를 사용하는 염색법을 말한다. 1차 항체에 형광색소 등의 형광물질을 부가한 2차 항체를 작용시켜 광학현미경으로 관찰한다. 세포 또는 조직을 고정하여 관찰하기 때문에 통상 얻게 되는 정보는 정적인 것이지만 형광색이 다른 2차 항체를 사용하면, 복수인 단백질의 공동국재도 연구할 수 있는 점에서 분자세포생물학에 있어서도 매우 중요한 기술로 인식되고 있다. 본 발명에 있어서, 상기 면역조직화학법에 사용되는 항체의 종류에는 제한이 없으며, 예컨대 본 발명의 일 실시예에 따르면 1차 항체로 뇌 신경 마커인 신경교 섬유질 산성 단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP)에 대한 항체를 이용하고, 2차 항체로 Goat anti rabbit(alexa fluor 647) 항체를 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서, “항체”는 항원에 특이적으로 결합하여 인식하는 면역글로불린 유전자 또는 이의 단편에서 유래하는 프레임워크 영역을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 인식된 면역글로불린 유전자는 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론, 및 뮤 불변 영역 유전자를 비롯하여, 무수한 면역글로불린 가변 영역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류되며, 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타, 또는 엡실론으로 분류되고, 결과적으로 각각 면역글로불린 부류 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 한정한다. 전형적으로, 항체의 항원-결합 영역은 결합 특이성 및 친화성에서 가장 핵심적이게 된다. 일부 실시형태에서, 항체 또는 항체의 단편은 인간, 마우스, 래트, 염소, 토끼, 햄스터, 낙타 등을 포함한, 상이한 유기체에서 유래될 수 있다.
본 발명에 있어서, “항체 침투력”은 유의하거나 또는 효과적인 양으로 조직 또는 세포 외 환경으로부터 조직 또는 세포를 통과하는 항체의 능력을 의미한다.
이 때, 본 발명에서 상기 “유의하거나 또는 효과적인 양”은 원하는 생물학적 효과가 달성되기 위해 필요한 양 또는 충분한 양을 의미하는 것으로, 예컨대, 생체조직 시료로 면역조직화학법을 수행할 경우 항원에 대해 항체가 반응하여 발색을 나타내기에 충분한 양을 의미한다.
본 발명에 있어서, "형광물질"은 특정한 파장의 빛을 흡수하여 검출 가능한 영역의 빛을 방출하는 물질을 의미하며, 예컨대 형광 단백질, 형광 화합물 등이 포함되고, 상기 검출 가능한 영역이라 함은 육안 또는 다양한 계측기기를 사용하여 방출되는 빛의 수준을 정량할 수 있는 영역을 의미한다. 본 발명에 있어서 상기 형광물질의 종류에는 제한이 없다.
본 발명에 있어서, 상기 고정 용액에서 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 내지 100%(w/v), 20%(w/v) 내지 70%(w/v), 20%(w/v) 내지 30%(w/v), 30%(w/v) 내지 40%(w/v), 40%(w/v) 내지 50%(w/v), 50%(w/v) 내지 60%(w/v), 60%(w/v) 내지 70%(w/v), 70%(w/v) 내지 80%(w/v), 또는 80%(w/v) 내지 100%(w/v)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 수크로오스의 농도를 20%(w/v) 이상으로 하여 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정할 수 있으나, 상기 농도에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 조직 클리어링 용액에서 CHAPS는 농도가 10%(w/v) 내지 40%(w/v) 또는 10%(w/v) 내지 30%(w/v)일 수 있고, 우레아(urea)는 농도가 30%(w/v) 내지 70%(w/v) 또는 40%(w/v) 내지 60%(w/v)일 수 있고, 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 1%(w/v) 또는 0.01%(w/v) 내지 1%(w/v)일 수 있고, 전해수는 농도가 10%(w/v) 내지 100%(w/v), 10%(w/v) 내지 70%(w/v) 또는 10%(w/v) 내지 40%(w/v)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 조직 클리어링 용액은 20%(w/v)의 CHAPS, 50%(w/v)의 우레아를 포함할 수 있고, 0.1%(w/v) 내지 0.5%(w/v)의 염화나트륨을 포함하여 삼투압에 의한 조직의 변형과 ion strength를 안정화시켜 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 할 수 있다. 또한, 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 조직 클리어링 용액은 10%(w/v) 내지 30%(w/v)의 전해수를 시약을 녹이는 용매로 포함하며, 상기 전해수의 추가로 인해 생체조직의 투명화 시간을 단축할 수 있고, 이를 생체조직의 면역염색에 이용할 경우 생체조직 내로의 항체 침투력을 향상시켜 높은 해상도의 3차원 형광 이미지를 획득할 수 있으나, 상기 농도에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 세척 용액에서 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.5%(w/v) 또는 0.01%(w/v) 내지 0.5%(w/v)일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 상기 세척 용액은 0.1%(w/v)의 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하여 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척할 수 있으나, 상기 농도에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 마운팅 용액에서 CHAPS는 농도가 20%(w/v) 내지 60%(w/v) 또는 30%(w/v) 내지 50%(w/v)일 수 있고, 우레아(urea)는 농도가 10%(w/v) 내지 50%(w/v) 또는 20%(w/v) 내지 50%(w/v)일 수 있고, 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 3% 또는 0.01%(w/v) 내지 2%일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면 상기 마운팅 용액의 굴절률을 1.45로 맞추기 위해 각각 40%(w/v), 40%(w/v)의 CHAPS 및 우레아를 포함할 수 있으며, 0.1 내지 1%(w/v)의 염화나트륨(NaCl)을 포함할 수 있으나, 상기 농도에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 실시예에서는, 생체조직의 투명화를 위한 고정 용액, 조직 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액을 포함하는 생체조직의 투명화 용액 키트를 제조하였으며(실시예 1 및 표 1 참조), 이를 이용하여 생체조직을 투명화하였다(실시예 2 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, 조직 클리어링 용액에 전해수를 포함하는 본 발명의 투명화 용액 키트를 사용할 경우 전해수를 포함하지 않는 용액을 사용하는 경우에 비해 투명화 시간이 단축되고, GFP transgenic 마우스 뇌 조직에서 나타나는 형광 강도가 더 뛰어난 것을 확인하였으며, 상기 투명화 용액 키트를 이용하여 생체조직을 투명화하고 면역염색을 실시한 결과, 조직 클리어링 용액에 전해수를 포함하는 본 발명의 투명화 용액 키트를 사용할 경우 전해수를 포함하지 않는 용액을 사용하는 경우에 비해 생체조직으로의 항체 침투력을 향상시켜 조직의 심부까지 형광을 나타내고 높은 해상도의 3차원 면역염색 이미지를 획득할 수 있음을 확인함으로써, 상기 제조한 투명화 용액 키트의 조성이 생체조직 투명화 및 3차원 형광 이미지화를 위한 최적의 조건임을 확인하였다(실시예 3 참조).
본원 명세서 전체에서 "포함하는" 이라는 용어가 사용될 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 본원 명세서 전체에서 사용되는 정도의 용어 “~(하는) 단계” 또는 “~의 단계”는 “~ 를 위한 단계”를 의미하지 않는다.
또한, 본 발명에서 "~으로 이루어진" 이라는 용어는 "포함하는" 이라는 용어의 바람직한 실시양태인 것으로 간주된다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 고정 용액, 조직 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액의 제조
생체조직의 투명화를 위해 필요한 고정 용액(fixing solution), 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution), 세척 용액(washing solution), 및 마운팅 용액(mounting solution)을 제조하여 이들을 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트를 제조하였으며, 각 용액의 구성 성분은 하기 표 1에 나타내었다.
구체적으로, 생체조직 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정시키기 위해, 농도가 20%(w/v) 이상인 수크로오스(sucrose)를 구성성분으로 하는 고정 용액(fixing solution)을 제조하였다.
또한, 삼투압에 의한 조직의 변형과 ion strength를 안정화시켜 생체조직 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 하기 위해, 20%(w/v) CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 50%(w/v) 우레아(urea)에 0.1 내지 0.5%(w/v) 농도의 염화나트륨(NaCl)을 추가하였으며, 상기 성분들을 녹이는 용매로서 10%(w/v) 내지 30%(w/v)의 전해수를 사용하여 본 발명의 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)을 제조하였다.
이어서, 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척시킬 수 있도록 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)에 0.1%(w/v)의 아지드화나트륨(sodium azide)을 첨가하여 세척 용액(washing solution)을 제조하였다.
또한, 40%(w/v)의 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 40%(w/v) 우레아(urea), 및 0.1 내지 1%(w/v) NaCl로 마운팅 용액(mounting solution)을 제조하여 굴절률을 1.45로 맞추었다.
| 구성 | 구성 성분 | |
| 1 | Fixing solution | Sucrose(20%(w/v)이상) |
| 2 | Tissue clearing solution | CHAPS(20%(w/v)), Urea(50%(w/v)), NaCl(0.1 내지 0.5%(w/v)), 전해수(10 내지 30%(w/v)) |
| 3 | Washing solution | PBS, sodium azied(0.1%(w/v)) |
| 4 | Mounting solution | CHAPS(40%(w/v)), Urea(40%(w/v)), NaCl(0.1 내지 1%(w/v)) |
실시예 2. 생체조직 투명화
상기 실시예 1에서 제조한 고정 용액, 조직 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액을 각각 이용하여 The Jackson Laboratory로부터 구입한 GFP-transgenic 마우스의 뇌 조직을 투명화하였다.
구체적으로, 6주령 마우스를 개복하여 심장으로부터 4% PFA(파라포름알데하이드: paraformaldehyde)를 이용하여 관류(perfusion)하여 고정하면서 체내 혈액을 제거한 후 뇌 조직을 얻었다. 4% PFA에 고정된 뇌 조직 시료를 고정 용액(fixing solution)에 넣고 4℃/50 rpm에서 침전될 때까지 진탕 배양(shaking incubation)하였다. 침전된 상기 뇌 조직 시료를 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 36시간 동안 진탕 배양하고, 동일한 조건으로 1회 반복하였다. 반응이 끝난 상기 뇌 조직 시료에 50ml의 세척 용액(washing solution)을 넣고 4℃/50 rpm에서 4시간 동안 진탕 배양하였다(3회 반복). 상기 washing이 끝난 뇌 조직 시료는 마운팅 용액(mounting solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 12시간 진탕 배양하였으며, 동일한 조건으로 1회 반복하였다. 이어서 상기 마운팅 용액으로 처리한 뇌 조직 시료를 1200 rpm에서 30분 동안 원심분리(centrifuge)하여 시료 내 bubble을 제거하고, 뇌 조직 시료를 image chamber에서 보관하거나 1X PBS에 4℃에서 보관하였다.
실시예 3. 생체조직의 우수한 3차원 이미지 획득을 위한 용액의 최적의 배합 조건 확인
3-1. 생체조직의 투명화 및 형광 강도 확인
상기 실시예 2의 방법으로, 도 1에 나타낸 바와 같이 전해수를 포함하는 본 발명의 조직 클리어링 용액(E-TC)을 사용하여 뇌 조직을 투명화한 경우 전해수를 포함하지 않는 조직 클리어링 용액(TC)을 사용한 경우에 비해 투명화 시작 후 투명화 속도가 훨씬 빠른 것을 확인하였으며, E-TC처리 후 이틀만에 대뇌 피질(cortex) 및 소뇌(cerebellum)가 투명해지고, 가운데 시상(thalamus)이 훨씬 더 투명하게 보이는 것을 관찰하였다. 이후 마운팅 용액(MS)을 처리한 후에도 E-TC를 사용한 경우 같은 시간이 지났을 때 더 투명한 것을 확인하였다.
상기 실시예 2의 과정을 거친 GFP-transgenic 마우스의 뇌 조직을 in vivo imaging system (Fluorescence-labeled organism bioimaging instrument)에 넣고 형광량을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 E-TC를 사용한 경우 TC에 비해 투명화 속도가 훨씬 빨라, 형광의 양이 많고 더 선명하게 나타났으며, E-TC처리 후 이틀만에 대뇌 피질의 형광이 앞쪽(anterior)에서 뒤쪽(posterior) 방향으로 잘 관찰됨을 확인하였고, 선조체(striatum)의 형광 역시 전해수를 포함하는 E-TC를 처리하였을 때 훨씬 더 잘 관찰되었으며, MS 처리 후 5일까지 형광이 그대로 유지되는 것을 확인하였다.
또한, 상기 GFP-transgenic 마우스의 뇌 조직 투명화 과정에서 마운팅 용액(MS) 처리 7일 후, light sheet image를 통해 뇌 조직을 관찰한 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 TC에 비해 전해수를 포함하는 E-TC를 처리하였을 때 형광의 신호가 강하고 더욱 뚜렷하게 보이는 것을 관찰하였으며, 대뇌 피질의 형광이 앞쪽에서 뒤쪽 방향으로 잘 관찰됨을 확인하였다.
도 4 내지 도 6에는 상기 GFP-transgenic 마우스 뇌 조직의 투명화 과정에서 E-TC를 처리한 후 1일만에 마운팅 용액(MS)을 처리한 다음 공초점 현미경으로 뇌 조직을 촬영한 이미지를 나타내었으며, 그 결과, TC에 비해 전해수를 포함하는 E-TC를 처리하였을 때 형광 신호의 강도(intensity)가 1.4배이상 높게 관찰되었고(도 4), TC에 비해 전해수를 포함하는 E-TC를 처리하였을 때 후내측 피질의 편도체 핵(posteromedial cortical amygdala nucleus)의 형광 신호 관찰에서 강도가 2.2배 이상 높게 관찰되었으며(도 5), TC에 비해 전해수를 포함하는 E-TC를 처리하였을 때 대뇌 피질의 뉴런 형태(neuronal morphology)의 형광 신호 관찰에서 강도가 1.7배 이상 높게 관찰되었다(도 6). 이때, 상기 도 4 내지 도 6에 나타나는 녹색 형광은 GFP의 발현도를 나타내며, 도 5 및 도 6의 빨간색 형광은 신호가 과다노출(over-expose)된 척도로서 일반 TC보다 E-TC를 처리하였을 때 녹색 및 빨간색 형광의 강도가 높음을 확인할 수 있었다.
이로부터, 조직 클리어링 용액에 전해수를 포함하여 제조하고 이를 생체조직 투명화에 이용할 경우, 전해수를 포함하지 않는 용액을 이용한 경우에 비해 투명화 시간이 단축되고 조직의 3차원 형광 이미지가 더 선명하게 관찰되는 것을 확인하였으며, 상기 표 1에 나타낸 용액의 조성이 생체조직 투명화 및 3차원 형광 이미지 획득을 위한 최적의 조건임을 확인하였다.
실시예 3. 면역조직화학법에 의한 3차원 이미지 획득
1차 항체로 뇌 신경 마커인 GFAP에 대한 항체(항-GFAP 항체)를 이용하고, 2차 항체로 Goat anti rabbit(allexa fluor 647)을 이용하여 면역조직화학적 염색을 실시하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2의 투명화 방법에서 세척 용액(washing solution)으로 세척된 마우스 뇌 조직 시료에 1:200으로 희석한 항-GFAP 항체를 처리하여 24시간 동안 배양(36℃/50rpm)한 후 세척 용액으로 다시 24 시간 동안 세척(36℃/50rpm)하였다. 이어서 1:200으로 희석한 2차 항체를 처리하여 배양(36℃/50rpm)한 후 세척 용액으로 24 시간 동안 세척(36℃/50rpm)하였다. 세포 내 핵은 DAPI로 염색하였다. 상기 염색된 시료에 마운팅 용액을 처리하여 고정시킨 다음, 1 mm 간격으로 절단하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
공초점 현미경을 통해 전해수를 포함하는 E-TC 및 TC의 단백질 소실 정도를 비교하여 관찰하였으며, 이는 면역염색을 실시할 경우 항체가 결합할 수 있는 항원이 많이 남아 있는 것을 의미하고 보다 면역염색이 잘 될 가능성을 제시하는 결과이다. 전해수를 포함하는 E-TC를 사용하여 뇌 조직 투명화 후 면역염색을 수행한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이 DAPI로 염색된 세포 내 핵은 파란색 형광으로 나타났으며, 신경조직에서 신경교세포 중 별아교세포(astrocyte) 내 GFAP가 염색되어 빨간색 형광으로 나타났다. 이때, 마우스 대뇌 1 mm 조직의 가운데 (400-500 μm)까지 GFAP 라벨링(labeling)되어 빨간색 형광이 나타나는 것을 확인하였으며, 이로부터 E-TC를 사용할 경우 면역염색시 뇌 조직으로 항체의 침투(penetration)가 더 잘 되는 것을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야 한다.
Claims (8)
- 수크로오스(sucrose)를 포함하는 고정 용액(fixing solution);
3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 염화나트륨(NaCl), 및 전해수(electrolyzed water)를 포함하는 조직 클리어링 용액(tissue clearing solution);
인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하는 세척 용액(washing solution); 및
3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 마운팅 용액(mounting solution)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 및 혈관으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 고정 용액에서 수크로오스(sucrose)는 농도가 20%(w/v) 내지 100%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 조직 클리어링 용액에서 CHAPS는 농도가 10%(w/v) 내지 40%(w/v)이고, 우레아(urea)는 농도가 30%(w/v) 내지 70%(w/v)이고, 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 1%(w/v)이고, 전해수는 농도가 1%(w/v) 내지 50%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 세척 용액에서 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 0.5%(w/v)인 것을 특징으로 하는, 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트.
- 제1항에 있어서,
상기 마운팅 용액에서 CHAPS는 농도가 20%(w/v) 내지 60%(w/v)이고, 상기 우레아(urea)는 농도가 10%(w/v) 내지 50%(w/v)이고, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도가 0.001%(w/v) 내지 3%인 것을 특징으로 하는, 전해수를 포함하는 생체조직 투명화 용액 키트.
- 하기 단계를 포함하는, 생체조직의 투명화 방법:
(a) 수크로오스(sucrose)를 포함하는 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 염화나트륨(NaCl), 및 전해수를 포함하는 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
(c) 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하는 세척 용액으로 상기 투명화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계; 및
(d) 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
- 하기 단계를 포함하는, 생체조직의 3차원 이미지화를 위한 면역염색 방법:
(a) 수크로오스(sucrose)를 포함하는 고정 용액으로 생체조직 시료를 고정시키는 단계;
(b) 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 염화나트륨(NaCl), 및 전해수를 포함하는 조직 클리어링 용액으로 상기 고정된 생체조직 시료를 투명화 시키는 단계;
(c) 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하는 세척 용액으로 상기 투명화한 시료에 부착되어 있는 유기물을 씻어내는 단계;
(d) 상기 세척된 시료에 형광물질이 부착된 항체를 처리하는 단계; 및
(e) 3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트(3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate, CHAPS), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 마운팅 용액으로 상기 세척된 시료를 고정시키는 단계.
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