KR102151128B1 - 질소 가스 가압식 조직 투명화 및 항체 침투 증진용 장치 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 조직의 3차원 이미지 획득을 위한 생체조직의 투명화 및 염색을 촉진시키는 장치 및 그 방법에 관한 것으로서, 본 발명의 방법은 투명화 용액 등을 압력 조건하에서 조직에 처리하여 생체 조직의 구조적 변형을 야기하지 않으면서 항체 등의 조직 침투력을 증가시켜 생체 조직의 심부까지 이미징할 수 있으며, 본 발명은 질소 가스 가압을 이용하여 산화에 의한 생체조직 손상을 방지할 수 있다. 또한, 본 발명의 장치는 상기 방법이 하나의 장치안에서 최적의 조건하에 연속적으로 이루어질 수 있도록 하여, 본 발명의 장치를 이용하여 빠르고 높은 재현성을 갖는 고퀄리티의 조직의 3차원 이미지를 획득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 장치 및 방법은 병리학적 진단뿐만 아니라 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내기 위한 연구에 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 질소 가스 가압식 조직 투명화 및 항체 침투 증진용 장치와 질소 압축가스를 이용한 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법 등에 관한 것이다.
현재 질병의 진단은 2차원 스캐닝을 통한 3차원으로의 재구성 기술에 의해 보다 정교하게 진단할 수 있는 기술로 발전하여 왔다. 그러나 현재 개발된 기술은 밀리미터 수준으로 세포 수준에서 분석이 가능한 정도의 기술은 매우 미흡한 실정이다.
즉, 생검 등의 생체조직을 고정한 후 파라핀 등으로 포매하여 마이크로미터 두께의 슬라이드를 만들어 광학이나 형광 등으로 미세 구조를 분석한다. 이러한 미세 구조에 대한 이미지 기술을 이용하여 3차원 이미지를 구성하기 위해서는 콘포칼과 같은 현미경을 이용해야 하며 이러한 경우 수십 마이크로미터 수준 두께의 정보를 획득할 수 있다. 그러나 이 모든 것은 광원이 침투할 수 있는 깊이에 의해 제한된다. 따라서, 보다 두꺼운 조직의 3차원 이미지를 획득하기 위해서는 조직을 연속적으로 절편하여 현미경으로 이미징 한 후 다시 재구성하는 과정이 필요하다.
조직 투명화 기술은 조직의 손상 없이 구조 및 단백질 발현 등을 확인할 수 있으므로 최근에 매우 다양한 방법으로 조직을 투명화할 수 있는 기술이 개발되었다. 기존의 조직 투명화 기술은 유기용매를 이용한 조직 투명화 방법인 Spatleholz, BABB, Scale S, iDISCO법과, 폴리머 주입법인 ACT(active CLARITY technology)법에 의해 처리된 조직의 항원 보존성이 보고된 바 있다. ACT를 제외한 다른 방법의 경우 형광과 항원의 보존성이 감소하는 문제가 있다. ACT의 경우 90% 이상의 항원 보존성을 가지며, 이는 클라리티(CLARITY)와 같이 고정된 단백질에 추가로 하이드로젤 폴리머와의 결합을 필요로 하는 방법에 비하면 보다 높은 보존성을 보인다. 그러나 강한 조직 고정 과정은 항원성의 손실을 유발하여, 사용할 수 있는 항체가 감소하는 등의 문제점을 고려해야 하므로, 여러 가지 기술의 개선이 필요하다.
최근에 개발된 클라리티(CLARITY)법은 조직 내 하이드로겔(hydrogel)을 넣어서 DNA나 단백질 등 진단에 중요한 물질을 붙잡아 주는 일종의 그물망 지지체를 만든 뒤 지질만을 선택적으로 제거하는 방법을 이용한다. 클라리티(CLARITY) 및 관류 도움 시약 방출방법(PARS)과 같이 광학적으로 투명하고 고분자 투과가 가능한 이미지를 창출할 수 있는 조직투명성 기술은 매우 향상된 기관계 이미징에 있어서 주요한 진전을 제공하였다.
이러한 방법들은 나노 기공성 하이드로겔로 세포막 지질이중층을 대체하여 조직 투과성을 향상시키는 기술이다. 마이크로 단위로 절개시 조직 구조의 변형을 악화시키는 기계적인 마이크로 단위의 절개 방법과는 다르게, 클라리티는 뇌 조직의 구조를 손상없이 보존하여, 신경돌기 추적과 3차원(3D) 및 추적된 뉴런의 위상 재건을 가능하게 한다. PARS 역시 뇌 및 다른 8개 기관(뇌, 척수, 심장, 근육, 간, 폐, 신장, 대장 및 소장)에 고분자 투과성 및 광학적(시각적) 투명성을 제공할 수 있다.
일반적인 광학 현미경을 사용하여 기관 전반에 걸친 세밀한 정보를 얻는 것은 엄청난 일이다. 예를 들어, 단일 광자 현미경은 기관 표면 아래 최대 50 nm 깊이까지의 이미지 촬영만 가능하며, 매우 최적화된 이광자 현미경은 대략 800 nm보다 더 깊은 곳은 이미지화가 불가능하다.
그러나, 클라리티 또는 PARS는 다양한 기관을 손상시키지 않고, 더 깊은 곳까지 향상된 기관 구조 관찰 기술을 향상시킬 수 있으며, 뇌 및 손상되지 않은 다른 기관계로부터 통합적인 구조와 분자 정보의 접근을 가능하게 한다. 특히, 클라리티는 뇌에 전기력을 적용하여, 절개되지 않은 조직에 더욱 빠르고 투명하게 할 수 있으며, 투명화 과정 동안 조직 손상을 예방할 수 있다.
그러나, 상기 클라리티 방법은 하이드로겔의 농도가 높아지면 단백질과의 결합도가 많아 더 조직이 단단해져서 지질의 제거가 어려워지기 때문에 투명화하는데 시간이 오래 걸리는 단점이 있다. 이는 조직 표면에 공기 및 검은 입자의 침착을 야기한다. 또한, 기존의 클라리티 법은 과정이 복잡하고 부가적인 장비가 많이 필요하다. 뿐만 아니라 한번에 한 조직만 투명화할 수 있어 경제적, 시간적 손실을 유발하며 항체를 이용한 염색이 불안정한 문제가 있었다.
이에, 본 발명자들은 고가의 전기영동 장치를 필요로 하지 않고 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 및 혈관 등의 다양한 조직의 손상 없이 생체 조직의 투명성을 증가시켜 조직 내 항체 염색이 가능하여 조직을 3차원적으로 염색하여 이미지화 할 수 있는 키트를 개발하고, 상기 키트와 함께 조직에 질소 가스를 이용하여 압력을 가하는 경우 산화에 의한 생체조직 손상을 줄이고 조직 내 항체 침투력을 증진시키며 염색에 소요되는 시간을 혁신적으로 줄일 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명자들은 종래의 생체 조직 투명화 및 염색 방법의 문제점을 해결할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 질소가스 가압 조건에서 생체 조직 투명화 방법을 수행하는 경우 항체 등의 조직 내 침투에 필요한 시간을 단축시키고 보다 조직의 심부까지 항체 등이 침투할 수 있음을 확인하여, 조직 투명화 및 면역 염색이 가압 조건에 수행될 수 있도록 하는 장치를 개발하였다.
이에, 본 발명은 시료 제1고정단계, 투명화 단계, 세척 단계, 염색 단계, 및 제2고정단계를 포함하는 생체 조직 투명화 방법이 압력이 가해진 조건하에서 수행되도록 하여 생체조직 투명화 및 염색을 촉진하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 가압 조건하에서 상기 각 단계가 수행될 수 있도록 하는 생체조직에 항체 침투 증진용 장치를 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료를 담을 수 있는 본체; 상기 본체의 개방된 상부에 장착되어 개폐 가능한 덮개; 상기 덮개의 상단 또는 본체의 일 측면에 장착되어 본체 내부의 압력을 표시하는 압력계측기; 및 상기 본체의 일 측면에 장착되고, 본체 내부에 질소가스의 주입이 가능한 출입구를 가지며, 가스의 출입을 조절할 수 있는 밸브를 포함하는 커넥터(connector);를 포함하는, 질소 가스 가압식 항체 침투 증진용 장치를 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 장치는 상기 본체 내부가 덮개에 의해 밀폐될 수 있도록 고정하는 로커(locker)를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 커넥터는 일정한 길이로 이루어진 1 내지 5개의 가스 출입구를 가질 수 있으며, 상기 각 출입구는 일정한 지름의 통공을 가질 수 있고, 상기 각 출입구의 일 측면은 가스의 출입을 조절할 수 있는 밸브를 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 본체는 외부에서 내부의 시료 관찰이 가능하도록 일면 또는 다면이 투명한 재질로 이루어질 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 장치는 본체 내부의 온도 조절이 가능하도록 펠티에(peltier) 소자; 또는 열선 및 쿨러를 더 포함될 수 있으며, 상기 조절 가능한 온도 범위는 4 내지 60℃일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 장치는 본체 내부에 장착되고 본체와 별개로 회전 가능한 챔버를 추가로 포함하여 용액의 진탕이 가능한 장치일 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 고정 용액에 생체 조직 시료를 담그는 제1고정 단계; (2) 상기 시료를 클리어링 용액에 담그는 투명화 단계; (3) 상기 투명화 단계를 거친 시료를 세척 용액에 담그는 세척 단계; (4) 상기 세척 단계 이후의 시료에 항체 또는 염료를 처리하는 염색 단계; 및 (5) 상기 면연염색 단계를 거친 시료를 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 마운팅 용액에 담그는 제2고정 단계를 포함하고, 상기 각 단계는 가압조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 각 단계는 가스의 출입이 조절되는 밀폐공간 안에 질소 가스를 주입한 가압조건 하에서 수행될 수 있으며, 상기 가스에 의한 압력은 1.2 내지 5 기압(atm)일 수 있고, 바람직하게는 1.5 내지 3.5 기압, 보다 바람직하게는 2기압일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로서, 상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있으며, 상기 클리어링 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)을 포함할 수 있고, 상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있고, 상기 마운팅 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)을 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 고정 용액은 수크로오스를 20 내지 100 %(w/v)로 포함할 수 있고, 상기 클리어링 용액은 염화나트륨을 0.001 내지 1 %(w/v)로 포함할 수 있고, 상기 세척 용액은 아지드화나트륨을 0.001 내지 0.5 %(w/v) 포함할 수 있고, 상기 마운팅 용액은 염화나트륨을 0.001 내지 3 %(w/v)로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 제1고정 단계는 0 내지 10℃ 에서 수행될 수 있고, 상기 투명화 단계는 30 내지 40℃ 에서 수행될 수 있고, 상기 세척 단계는 0 내지 10℃ 에서 수행될 수 있고, 상기 염색 단계는 30 내지 40℃ 에서 수행될 수 있고, 상기 제2고정 단계는 30 내지 40℃ 에서 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 제1고정 단계는 12 내지 36 시간 동안 수행될 수 있고, 상기 투명화 단계는 24 내지 48 시간 동안 수행될 수 있고, 상기 세척 단계는 2 내지 6 시간 동안 수행될 수 있고, 상기 염색 단계는 12 내지 60 시간 동안 수행될 수 있고, 상기 제2고정 단계는 12 내지 36 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 투명화 단계, 세척단계, 염색 단계, 또는 제2고정 단계는 20 내지 80 rpm 회전 조건 하에서 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로서, 상기 각 단계는 본 발명의 질소 가스 가압식 항체 침투 증진용 장치 내부에서 수행되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직의 투명화 및 면역염색 촉진 방법은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 및 혈관 등의 다양한 생체 조직의 처리에 있어서 압력을 가하여 조직의 손상 없이 빠르게 투명화하고, 항체 등의 조직 침투력을 증가시켜 고퀄리티의 3차원 형광 이미지 결과를 얻을 수 있으며, 가압을 위하여 질소 가스를 이용하여 산화에 의한 생체조직의 변성을 최소화할 수 있다는 장점이 있다. 또한, 본 발명의 조직 투명화 키트를 이용하여 가압 조건하에서 생체조직 투명화 및 면역 염색을 수행하는 경우 버블 형성, 변색 및 검은 퇴적물이 나타나지 않고 생체 조직의 투명성이 향상되어, 투명화된 조직 내 항체 또는 염료를 통한 염색이 가능하며, 조직의 염색에 소요되는 시간을 획기적으로 단축시킬 수 있는바, 다양한 질환의 원인을 규명하고 치료법을 찾아내는 데 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 질소 가스 가압식 항체 침투 증진용 장치의 제공에 의해 상기 각 조직 투명화 방법이 하나의 장치 안에서 최적의 압력 조건과 적절한 온도 조건하에 수행될 수 있는바, 간단하고 빠르게 효율적인 3차원 면역분자 진단이 가능하고 높은 재현성을 나타내어 숙련된 임상병리사 없이도 면역분자 진단이 가능하여, 다방면에서 이용 가능한 면역분자 진단기기로 이용될 것으로 기대된다.
도 1a 내지 도 1d는 생체 조직 투명화 및 면역염색을 위한 온도 및 압력 조건을 조절할 수 있고, 각 용액과 시료가 충분히 반응할 수 있도록 shaking이 가능한 질소 가스 가압식 항체 침투 증진용 장치의 사시도(도 1a), 평면도(도 1b), 정면도(도 1c), 및 우측면도(도 1d)이다. 도 1b 및 도 1c에 표시된 숫자는 장치 및 부품의 바람직한 길이(mm)를 표시한 것으로서, 본 발명의 장치 크기는 도면의 표시에 의해 제한되지 아니한다.
도 2은 종래 조직 투명화 용액(좌)과 본 발명의 조직 투명화 용액(우)을 이용한 폐 조직 면역형광염색 결과이다.
도 3는 기압 조건을 달리한 뇌 조직의 화학적 염색 결과이다.
도 4는 기압 조건을 달리한 뇌 조직의 면역 화학적 염색 결과이다.
도 2은 종래 조직 투명화 용액(좌)과 본 발명의 조직 투명화 용액(우)을 이용한 폐 조직 면역형광염색 결과이다.
도 3는 기압 조건을 달리한 뇌 조직의 화학적 염색 결과이다.
도 4는 기압 조건을 달리한 뇌 조직의 면역 화학적 염색 결과이다.
본 발명은 시료를 담을 수 있는 본체; 상기 본체의 개방된 상부에 장착되어 개폐 가능한 덮개; 상기 본체와 덮개에 장착되어 본체 내부가 덮개에 의해 밀폐될 수 있도록 고정하는 로커(locker); 상기 덮개의 상단 또는 본체의 일 측면에 장착되어 본체 내부의 압력을 표시하는 압력계측기; 및 상기 본체의 일 측면에 장착되고, 본체 내부에 질소가스의 주입이 가능한 출입구를 가지며, 가스의 출입을 조절할 수 있는 밸브를 포함하는 커넥터(connector);를 포함하는, 질소 가스 가압식 항체 침투 증진용 장치를 제공한다.
상기 본체는 외부에서 내부를 관찰할 수 있도록 일면 또는 다면이 투명한 재질로 이루어질 수 있다.
상기 커넥터는 일정한 길이로 이루어져 있으며, 일정한 직경의 통관을 포함하여 가스의 출입이 가능하다. 또한, 상기 커넥터는 두 개 이상의 가스 출입구를 포함하여 가스의 유입과 유출을 별개 출입구로 조절할 수 있으며, 각 가스 출입구의 외 측면에는 밸브를 포함하여 가스의 출입을 조절할 수 있다.
본 발명의 일 구현예로서, 상기 커넥터의 일 가스 출입구에 펌프를 장착하여 본체 내부로 가스를 유입시킴으로써 본체 내부가 원하는 압력이 되도록 조절할 수 있으며, 이때 상기 압력계측기가 본체 내부의 압력을 측정하고 표시하여 본체 내부의 압력을 확인할 수 있다. 또한, 본 발명의 장치는 상기 커넥터를 통해 유입시키는 가스의 조성을 달리 하여 가압이 가능한 저산소 챔버(hypoxia chamber)로 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 장치는 본체 내부에 장착되고 본체와 별개로 진탕 가능한 장치를 추가로 포함하여, 상기 장치에 시료를 담아, 시료와 반응시키고자 하는 용액의 혼합을 용이하게 할 수 있다. 이때, 20 rpm 이하에서는 생체조직 투명화가 충분하게 일어나지 않으며, 100 rpm 이상에서는 충격에 의한 생체조직 손상과 용액의 넘침현상이 문제될 수 있는바, 상기 장치는 20 내지 100 rpm, 바람직하게는 20 내지 80 rpm, 더욱 바람직하게는 50 rpm의 속도로 진탕 할 수 있다.
또한, 본 발명은 (1) 고정 용액에 생체 조직 시료를 담그는 제1고정 단계; (2) 상기 시료를 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 클리어링 용액에 담그는 투명화 단계; (3) 상기 시료를 세척 용액에 담그는 세척 단계; (4) 상기 시료에 항체 또는 염료를 처리하는 염색 단계; 및 (5) 상기 시료를 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 마운팅 용액에 담그는 제2고정 단계를 포함하고, 상기 각 단계는 가압조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법을 제공한다.
본 발명은 상기 각 단계를 1.2 내지 5 기압(atm)의 압력조건 하에서 수행하여 생체조직을 빠르게 투명화 하고, 보다 깊은 곳까지 항체 등의 분자바이오 마커의 침투를 도와 효과적인 3차원 이미지 분석이 가능하고, 궁극적으로 분자진단의 정확한 판독을 가능하게 한다. 이때, 각 단계에서 가해지는 압력은 상이할 수 있으며, 바람직하게는 1.2 내지 5 기압, 보다 바람직하게는 1.5 내지 3.5 기압일 수 있다.
또한, 상기 각 단계에서 가해지는 압력은 질소 압축가스에 의한 것일 수 있으며, 이때 질소가스는 산화에 의한 생체조직 손상을 방지할 수 있다.
본 발명의 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법의 각 단계는 생체조직의 구조적 변형이 발생하지 않는 온도라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는 상기 제1고정 단계는 0 내지 10℃ 에서 수행될 수 있고, 상기 투명화 단계는 30 내지 40℃ 에서 수행될 수 있고, 상기 세척 단계는 0 내지 10℃ 에서 수행될 수 있고, 상기 염색 단계는 30 내지 45℃ 에서 수행될 수 있고, 상기 제2고정 단계는 30 내지 40℃ 에서 수행될 수 있다. 보다 바람직하게, 각 단계는 차례로 4℃, 35℃, 4℃, 36℃, 36℃에서 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법에 각 단계는 시료와 각 단계에서의 용액이 충분히 반응할 수 있는 정도의 시간이라면 제한되지 아니하나, 바람직하게는, 상기 제1고정 단계는 12 내지 36 시간 동안 수행될 수 있고, 상기 투명화 단계는 24 내지 48 시간 동안 수행될 수 있고, 상기 세척 단계는 2 내지 6 시간 동안 수행될 수 있고, 상기 염색 단계는 12 내지 60 시간 동안 수행될 수 있고, 상기 제2고정 단계는 12 내지 36 시간 동안 수행될 수 있다. 보다 바람직하게, 각 단계는 순서대로 24시간, 36시간, 4시간, 48시간, 12시간 동안 수행될 수 있다.
또한, 본 발명의 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법의 각 단계는 시료와 각 단계에서의 용액이 충분히 혼합될 수 있도록 20 내지 80 rpm 회전 조건하에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에서 염색 단계는 항체를 이용한 면역염색(immunostaining)방법에 의해 수행될 수도 있고, 일반적인 염료를 이용한 염색방법에 의해 수행되는 것일 수도 있다. 면역염색방법에 의해 수행되는 경우 이미지화 하고자 하는 생체조직에서 특이적으로 발현하는 항원에 대한 항체를 1차 항체로 처리하고, 상기 1차 항체를 표적으로 하는 형광부착물질을 처리하여 각 조직 특이적 3차원 형광 이미지를 얻을 수 있다. 따라서, 상기 염색 단계는 1차 항체 처리 단계 이후에 상기 형광부착물질 처리 단계를 포함하며, 상기 각 단계 이후에, 12 내지 36 시간 동안의 세척 단계를 추가로 포함할 수 있다. 1차 항체 또는 형광부착물질(2차 항체 등) 처리 단계 이후에 세척은 본 발명의 세척 단계에서 이용되는 세척 용액을 이용할 수 있으며, 조직 특이적 항원과 결합하지 않은 항체 및 형광부착물질을 제거할 수 있도록 20 내지 80 rpm 회전 조건하에서 세척할 수 있다.
상기 염색 단계에서 이용되는 염료는 투명화된 조직의 가시화를 위해 색을 나타내는 것이라면 제한되지 아니하며, 조직의 당류 또는 단백질을 특이적으로 염색하는 것일 수 도 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 다당류를 청색으로 염색하는 blue dextran를 이용하였다.
또한, 본 발명의 각 단계는 각 단계가 목적하는 조직의 제1고정, 조직 투명화, 조직 염색, 및 제2고정이 충분히 일어날 수 있도록 2회 이상 반복할 수도 있다. 보다 바람직하게 투명화 단계는 2번 수행하고, 투명화 단계 이후의 세척 단계는 4번 수행하고, 제2고정 단계는 2번 수행할 수 있다.
본 발명에서 시료는 생체조직 시료를 의미하며, 상기 생체조직은 뇌, 간, 폐, 신장, 장, 심장, 근육, 또는 혈관일 수 있고, 상기 시료는 생체조직의 집합일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함할 수 있다. 이때, 상기 수크로오스의 농도는 20%(w/v) 이상으로 하여 시료를 탈수시키고 포름알데하이드(formaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정할 수 있으나, 상기 농도에 한정되는 것은 아니다.
상기 클리어링 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 포함할 수 있다. 이 때, 상기 염화나트륨(NaCl)은 농도를 0.001 내지 1.0%(w/v)로 하여 삼투압에 의한 조직의 변형과 ion strength를 안정화시켜 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 할 수 있으나, 상기 농도에 제한되지는 않는다.
상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함할 수 있다. 이때, 상기 아지드화나트륨(sodium azide)은 농도를 0.001 내지 0.5%(w/v)로 하여 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척할 수 있으나, 상기 농도에 제한되지는 않는다.
상기 마운팅 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 우레아(urea)를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 마운팅 용액의 굴절률을 1.45로 맞추기 위해 상기 CHAPS 및 우레아의 조성은 각각 40%(w/v)로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 첨부도면을 참조하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.
실시예 1. 3차원 이미지 획득을 위한 용액의 최적의 배합 조건 확인
1-1. 고정 용액,
클리어링
용액, 세척 용액, 및
마운팅
용액의 제조
3차원 이미지 획득을 위하여 필요한 고정 용액, 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액에 있어서, 선명한 이미지를 획득할 수 있는 최적의 성분 및 그 성분의 비를 확인하고자 하였다. 종래 조직 투명화 이미지 획득에 이용되는 용액의 구성 성분은 하기 표 1에 나타내었으며, 본 발명의 용액의 구성 성분은 하기 표 2에 나타내었다. 보다 구체적으로, 생체조직 시료를 탈수시키고 PFA(paraformaldehyde)로 유기물간 공유결합된 시료를 좀 더 강하게 고정시키기 위해, 기존의 생체조직 투명화 조성물의 고정 용액(fixing solution)의 구성 성분인 수크로오스(sucrose)를 20%(w/v) 이상으로 하여 본 발명의 고정 용액(fixing solution)을 제조하였다. 또한, 삼투압에 의한 조직의 변형과 ion strength를 안정화시켜 생체조직 시료에 있는 형광 물질의 변성을 최소화 하기 위해, 종래 클리어링 용액(clearing solution)의 구성 성분인 20%(w/v) CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 40%(w/v) 우레아(urea)에 0.1 내지 0.5%(w/v) 농도의 염화나트륨(NaCl)을 추가하여, 본 발명의 클리어링 용액을 제조하였다. 이어서, 투명화 후 탈수된 생체조직 시료에 최대 30%까지 함수율을 증가시킨 후 15%를 탈수하여 조직에 붙어있는 이미징에 방해되는 유기물을 세척시킬 수 있도록 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS)에 0.1%(w/v)의 아지드화나트륨(sodium azide)을 첨가하여 세척 용액(washing solution)을 제조하였다. 또한, 40%(w/v)의 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트) 및 30%(w/v) 우레아(urea)로 마운팅 용액(mounting solution)을 제조하여 굴절률을 1.45로 맞추었다.
| 구성 | 구성 성분 | |
| 1 | Fixing solution | Sucrose(20%(w/v)) |
| 2 | Clearing solution | CHAPS(20%(w/v)), Urea(40%(w/v)) |
| 3 | Mounting solution | CHAPS(40%(w/v)), Urea(40%(w/v)) |
| 구성 | 구성 성분 | |
| 1 | Fixing solution | Sucrose(20%(w/v)이상) |
| 2 | Clearing solution | CHAPS(20%(w/v)), Urea(50%(w/v)), NaCl(0.1 내지 0.5%(w/v)) |
| 3 | Washing solution | PBS, sodium azied(0.1%(w/v)) |
| 4 | Mounting solution | CHAPS(40%(w/v)), Urea(30%(w/v)), NaCl(0.1 내지 1%(w/v)) |
1-2. 고정 용액,
클리어링
용액, 세척 용액, 및
마운팅
용액의 최적의 배합 조건 확인
상기 실시예 1-1에서 제조한 기존의 용액과 본 발명의 용액을 각각 이용하여 마우스 폐 조직의 투명화 및 면역 염색을 통해 3차원 형광 이미지를 획득하였다. 구체적으로, 24주령 마우스를 개복하여 심장으로부터 4% PFA(파라포름알데하이드: paraformaldehyde)를 이용하여 perfusion 하여 고정하면서 체내 혈액을 제거한 후 폐 조직을 얻었다. 4% PFA에 고정된 폐 조직 시료를 고정 용액(fixing solution)에 넣고 4℃/50 rpm에서 침전될 때까지 shaking incubation 하였다. 침전된 상기 폐 조직 시료를 클리어링 용액(clearing solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 36시간 동안 shaking incubation하고, 동일한 조건으로 1회 반복하였다. 반응이 끝난 상기 폐 조직 시료에 50ml의 세척 용액(washing solution)을 넣고 4℃/50 rpm에서 4시간 동안 shaking incubation하였다(3회 반복). 상기 washing이 끝난 폐 조직 시료는 마운팅 용액(mounting solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 12시간 shaking incubation 하였으며, 동일한 조건으로 1회 반복하였다. 이어서 상기 마운팅 용액으로 처리한 폐 조직 시료를 1200 rpm에서 30분 동안 centrifuge하여 시료 내 bubble을 제거하고, 폐 조직 시료를 image chamber에서 보관하거나 1X PBS에 4℃에서 보관하였다. 상기 방법으로 투명화가 완료된 폐 조직을 in vivo imaging system (Fluorescence-labeled organism bioimaging instrument)에 넣고 형광량을 측정하였다.
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이, 표 1에 나타낸 기존의 생체조직 투명화 용액을 이용하여 면역염색한 폐조직 3차원 형광 이미지(도 2의 좌측 이미지)에 비해 본 발명의 생체조직 투명화 용액를 이용하여 면역염색한 폐조직 3차원 형광 이미지(도 2의 우측 이미지)가 더 선명한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 3차원 이미지 획득을 위한 최적의 압력 조건 확인
2-1. 실험 방법
상기 실시예 1에서는 조직의 3차원 이미지 획득을 위한 고정 용액, 클리어링 용액, 세척 용액, 및 마운팅 용액의 최적의 배합 조건을 확인하였다. 본 실시예 2에서는 상기 조건의 용액을 이용하여 보다 선명한 조직의 3차원 이미지를 보다 빠르게 획득하기 위한 압력 조건을 확인하고자 하였다.
구체적으로, 24주령 마우스를 개복하여 뇌를 꺼내고, 상기 뇌를 4% 포름알데하이드(formaldehyde)를 이용하여 perfusion 하여 고정하면서 체내 혈액을 제거한 후 뇌 조직을 얻었다. 이어서, 4% 포름알데하이드에 고정된 뇌 조직 시료를 고정 용액(fixing solution)에 넣고 4℃/24 시간 고정하였다. 상기 뇌 조직 시료를 클리어링 용액(clearing solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 36시간 동안 shaking incubation하고, 동일한 조건으로 1회 반복하였다. 반응이 끝난 상기 뇌 조직 시료에 50ml의 세척 용액(washing solution)을 넣고 4℃/50 rpm에서 4시간 동안 shaking incubation하였다(3회 반복). 세척된 상기 뇌 조직 시료를 blue dextran 또는 NeuN 항체를 처리하여 염색하고, 염색이 끝난 뇌 조직 시료는 마운팅 용액(mounting solution)에 넣고 35℃/50 rpm으로 12시간 shaking incubation 하였으며, 동일한 조건으로 1회 반복하였다. 이어서, 상기 시료는 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다. 마우스 개복과 뇌 적출을 제외한 모든 과정은 도 1a 내지 도 1d에 나타낸 장치 안에서 수행되었으며, 장치의 커넥터를 통해 질소 가스를 주입하여 장치 내부의 압력을 1 또는 2기압으로 유지한 후 수행하였다.
2-2. 조직 화학적 염색을 이용한 압력 조건에 따른 염료의 조직 침투 정도 확인
마우스의 전체 뇌에 blue dextran을 처리하여, 압력 조건에 따른 염료의 조직 내 침투 정도를 비교하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-1의 방법에서 세척 용액으로 세척된 상기 뇌 조직 시료를 20mg/ml의 blue dextran에 담가 24시간 동안 실온에서 incubation 하여 염색하였다. 염색된 시료는 마운팅 용액을 이용한 제2고정 단계를 거친 후, 2mm 간격으로 절단하여 blue dextran의 침투 정도를 관찰하였다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 2기압 조건 하에서 염료(blue dextran)의 조직 내 침투력이 현저하게 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
2-3. 면역 조직 화학적 염색에 의한 3차원 이미지 획득
1차 항체로 뇌 신경 마커인 NeuN 항체를 이용하고, 2차 항체로 Goat anti rabbit(allexa fluor 488)을 이용하여 면역 조직 화학적 염색을 실시하고, 압력 조건에 따른 항체의 조직 내 침투력을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 2-1의 방법에서 세척 용액으로 세척된 상기 뇌 조직 시료에 1:200으로 희석한 NeuN antibody를 처리하여 24시간 동안 incubation(36℃/50rpm)한 후 세척 용액으로 24 시간 동안 세척(36℃/50rpm)하였다. 이어서 1:200으로 희석한 2차 항체를 처리하여 incubation(36℃/50rpm)한 후 세척 용액으로 24 시간 동안 세척(36℃/50rpm)하였다. 상기 염색된 시료는 마운팅 용액을 이용한 제2고정 단계를 거친 후, 1mm 간격으로 절단하여 공초점 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 2기압 조건하에서 항체의 조직 내 침투력이 현저하게 증가하여, 면역염색 결과 조직 전체적으로 고루 발광하는 것을 확인할 수 있었다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (13)
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- 고정 용액에 생체 조직 시료를 담그는 제1고정 단계;
상기 시료를 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 클리어링 용액에 담그는 투명화 단계;
상기 투명화 단계를 거친 시료를 세척 용액에 담그는 세척 단계;
상기 세척 단계를 거친 시료에 항체 또는 염료를 처리하는 염색 단계; 및
상기 염색 단계를 거친 시료를 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 마운팅 용액에 담그는 제2고정 단계를 포함하고,
상기 각 단계는 가스의 출입이 조절되는 밀폐공간 안에 질소 가스를 주입한 가압조건 하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 3차원 형광 이미지화를 위한 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 각 단계에서 가해지는 압력은 1.2 내지 5 기압(atm)인 것을 특징으로 하는, 생체 조직 투명화 및 염색 촉진 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 고정 용액은 수크로오스(sucrose)를 포함하고,
상기 클리어링 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)을 포함하고,
상기 세척 용액은 인산완충식염수(phosphate buffer saline; PBS) 및 아지드화나트륨(sodium azide)을 포함하고,
상기 마운팅 용액은 CHAPS(3-[(3-콜아미도프로필)디메틸암모니오]-1-프로판설포네이트), 우레아(urea), 및 염화나트륨(NaCl)을 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법.
- 제9항에 있어서,
상기 고정 용액은 수크로오스를 20 내지 100 %(w/v)로 포함하고,
상기 클리어링 용액은 염화나트륨을 0.001 내지 1 %(w/v)로 포함하고,
상기 세척 용액은 아지드화나트륨을 0.001 내지 0.5 %(w/v) 포함하고,
상기 마운팅 용액은 염화나트륨을 0.001 내지 3 %(w/v)로 포함하는 것을 특징으로 하는, 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 제1고정 단계는 0 내지 10℃ 에서 수행되고,
상기 투명화 단계는 30 내지 40℃ 에서 수행되고,
상기 세척 단계는 0 내지 10℃ 에서 수행되고,
상기 염색 단계는 30 내지 40℃ 에서 수행되고,
상기 제2고정 단계는 30 내지 40℃ 에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 제1고정 단계는 12 내지 36 시간 동안 수행되고,
상기 투명화 단계는 24 내지 48 시간 동안 수행되고,
상기 세척 단계는 2 내지 6 시간 동안 수행되고,
상기 염색 단계는 12 내지 60 시간 동안 수행되고,
상기 제2고정 단계는 12 내지 36 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는, 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 투명화 단계, 세척단계, 염색 단계, 또는 제2고정 단계는 20 내지 80 rpm 회전 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 생체조직 투명화 및 염색 촉진 방법.
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