CN105556309A - 用于完整全组织的表型分析的方法 - Google Patents

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杨斌
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Abstract

在多个实施方案中，本申请教导了用于组织透明化的方法和组合物，其中使得全器官和全身是大分子可渗透的并在光学上透明的，从而暴露它们的具有完整联系的细胞结构。在一些实施方案中，本申请教导了PACT，一种用于完整器官的被动组织透明化和免疫染色的方案。在其他实施方案中，本申请教导了RIMS，一种用于使厚组织成像的折射率匹配介质。在又其他实施方案中，本申请教导了PARS，一种用于全身透明化和免疫标记的方法。

Description

用于完整全组织的表型分析的方法
政府权利
本发明根据NIH基金IDP20D017782-01、1R01AG047664-01和R01HD075605在政府支持下完成。政府具有本发明中的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请根据35U.S.C.§119(e)要求来自2013年9月20日提交的美国临时申请号61/880,401和2014年5月12日提交的美国临时申请号61/992,103的优先权，所述两个申请通过引用全文并入本文。
发明领域
本发明一般地涉及组织制备和表征领域。
背景
以下描述包括可有助于理解本发明的信息。其不是对本文提供的任何信息是本申请请求保护的发明的现有技术或与其相关的承认。
在细胞、循环和器官范畴理解结构-功能关系需要3D解剖学和表型图，目前这对于跨物种的许多器官是不可得的。该知识空白的根源在于缺乏使全器官成像成为可能的方法。为了那个目的，组织透明化技术具有巨大的潜力。本领域对可被用于使得全器官和全身是大分子可渗透的并在光学上透明的，从而暴露它们的具有完整联系的细胞结构的组合物和方法存在需求。
发明概述
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于修改组织的结构和/或光学特征的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液施加到组织，从而形成固定的组织；以及将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液施加到所述固定的组织，从而形成水凝胶处理的组织。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液施加到固定的组织。在一些实施方案中，水凝胶单体溶液包含从1％到20％的丙烯酰胺。在某些实施方案中，所述方法还包括将水凝胶处理的组织放置到基本气密的室中，以及将氮气引入到所述基本气密的室中，从而形成脱气的组织。在一些实施方案中，所述方法还包括在从15℃到60℃孵育脱气的组织，从而形成孵育的组织。在一些实施方案中，所述方法还包括用PBS洗涤孵育的组织，从而形成洗涤且孵育的组织。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液施加到洗涤且孵育的组织，从而形成透明化的组织。在某些实施方案中，去垢剂溶液包含在从0.01M到1MPBS中的从1％到30％的SDS。在一些实施方案中，所述方法还包括将PBS施加到透明化的组织，从而形成透明化且洗涤的组织。在某些实施方案中，所述方法还包括将成像介质施加到透明化且洗涤的组织，其中成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。在一些实施方案中，1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。在一些实施方案中，组织获自活组织检查。在某些实施方案中，组织是癌性的或癌前的。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于免疫染色组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含一抗的溶液施加到透明化且洗涤的组织，从而形成抗体结合的组织。在一些实施方案中，所述方法还包括用缓冲溶液冲洗抗体结合的组织。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含二抗的溶液施加到已经用缓冲溶液洗涤的抗体结合的组织，其中所述二抗用可视化的标记物标记。在某些实施方案中，可视化的标记物是荧光性的。在一些实施方案中，一抗用可视化的标记物标记。在一些实施方案中，可视化的标记物是荧光性的。在某些实施方案中，本文描述的方法中的组织获自活组织检查。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于可视化免疫染色的组织方法。在一些实施方案中，所述方法包括利用显微镜可视化根据本文所描述的方法制备的免疫染色的组织。在某些实施方案中，利用显微镜进行选自由以下组成的组的一种形式的显微术：共聚焦显微术、转盘式显微术、落射荧光显微术、光场显微术、光片显微术、多光子显微术。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于原位修改组织的结构和/或光学特征的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液引入到受试者的循环系统中，从而在受试者内形成固定的组织；以及将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液引入到受试者的循环系统中，从而在受试者内形成水凝胶处理的组织。在某些实施方案中，水凝胶单体溶液包含从1％到20％的丙烯酰胺。在多个实施方案中，所述方法还包括将包含PBS的溶液引入到受试者的循环系统中，从而形成PBS洗涤的组织。在一些实施方案中，所述方法还包括将受试者放置到基本气密的室中，以及将氮气引入到室中，从而形成脱气的受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液引入到脱气的受试者的循环系统中。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液引入到受试者的循环系统中，从而在受试者内形成透明化的组织。在某些实施方案中，去垢剂溶液包含在从0.01M到1MPBS中的大约1％到30％的SDS。在某些实施方案中，所述方法还包括将PBS引入到受试者的循环系统中，从而在受试者内形成透明化且洗涤的组织。在某些实施方案中，本发明方法还包括将成像介质引入到受试者的循环系统中，其中成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。在某些实施方案中，1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。在一些实施方案中，组织包括脑组织。在一些实施方案中，组织包括脊髓组织。在以上描述的方法的某些实施方案中，(1)通过与泵连接的第一管将所述溶液的一种或更多种引入到受试者的循环系统中；(2)通过第二管将所述溶液的一种或更多种从受试者的循环系统移出，所述第二管与一种或更多种溶液被收集在其中的容器流体连通；以及任选地(3)泵从容器抽吸一种或更多种收集的溶液，并通过第一管将一种或更多种溶液引入到受试者的循环系统。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于原位免疫染色组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含一抗的溶液引入到已对其应用了上文描述的方法的受试者的循环系统中。在一些实施方案中，所述方法包括将缓冲溶液引入到受试者的循环系统中。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含二抗的溶液引入到受试者的循环系统中，其中二抗用可视化的标记物标记。在一些实施方案中，可视化的标记物是荧光性的。在某些实施方案中，一抗用可视化的标记物标记。在某些实施方案中，可视化的标记物是荧光性的。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于原位可视化免疫染色的组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括利用显微镜可视化根据上文描述的原位方法制备的已与组织缔合的标记物。
在某些实施方案中，本发明教导了一种组合物，所述组合物包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。在一些实施方案中，1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。
在某些实施方案中，本发明教导了一种用于原位修改脑组织的结构和/或光学特征的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液引入到受试者的脑脊髓液(CSF)中，从而在受试者内形成固定的脑组织；以及将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液引入到受试者的CSF中，从而在受试者内形成水凝胶处理的脑组织。在某些实施方案中，水凝胶单体溶液包含从1％到20％的丙烯酰胺。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含PBS的溶液引入到受试者的CSF中，从而形成PBS洗涤的脑组织。在一些实施方案中，所述方法还包括将受试者或受试者的头放置到基本气密的室中，以及将氮气引入到室中，从而形成脱气的受试者。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液引入到脱气的受试者的CSF中。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液引入到受试者的CSF中，从而在受试者内形成透明化的脑组织。在某些实施方案中，去垢剂溶液包含在从0.01M到1MPBS中的大约1％到30％的SDS。在某些实施方案中，所述方法还包括将PBS引入到受试者的CSF中，从而在受试者内形成透明化且洗涤的脑组织。在一些实施方案中，所述方法还包括将成像介质引入到受试者的CSF中，其中成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。在一些实施方案中，1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。在一些实施方案中，所述溶液的一种或更多种经由颅内脑分流器(anintracranialbrainshunt)施用。在某些实施方案中，所述溶液的一种或更多种经由被插入到硬脑膜下嗅球正上方的区域内的颅内脑分流器施用。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于原位修改脊髓组织的结构和/或光学特征的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液引入到受试者的脑脊髓液(CSF)中，从而在受试者内形成固定的脊髓组织；以及将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液引入到受试者的CSF中，从而在受试者内形成水凝胶处理的脊髓组织。在某些实施方案中，水凝胶单体溶液包含从1％到20％的丙烯酰胺。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含PBS的溶液引入到受试者的CSF中，从而形成PBS洗涤的脊髓组织。在某些实施方案中，所述方法还包括将受试者放置到基本气密的室中，以及将氮气引入到室中，从而形成脱气的受试者。某些实施方案中，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液引入到脱气的受试者的CSF中。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液引入到受试者的CSF中，从而在受试者内形成透明化的脊髓组织。在某些实施方案中，去垢剂溶液包含在从0.01M到1MPBS中的大约1％到30％的SDS。在某些实施方案中，所述方法还包括将PBS引入到受试者的CSF中，从而在受试者内形成透明化且洗涤的脊髓组织。在某些实施方案中，所述方法还包括将成像介质引入到受试者的CSF中，其中成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。在某些实施方案中，1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。在某些实施方案中，所述溶液的一种或更多种经由颅内脑分流器施用。在一些实施方案中，所述溶液的一种或更多种经由被插入到背侧下丘(dorsalinferiorcolliculus)正上方的颅内脑分流器施用。
附图简述
在参考的附图中阐明了示例性实施方案。预期本文公开的实施方案和附图被认为是示例性的而非限制性的。
图1展示了根据本发明的实施方案的A4P0组织-水凝胶杂交体的PACT透明化跨越多个器官实现了最佳的透明度和免疫组织化学兼容性。(A)透明化24h和48h的A2P0、A4P0和A4P4组织-水凝胶杂交体的3mm成年小鼠矢状块的光学透明度的比较。(B)与A4P4相比，A4P0组织-水凝胶杂交体显示更快的抗体渗透(n＝6个视场/样品)。(C)来自1mm小鼠脑切片的蛋白质损失的百分比(每种透明化条件n＝6个切片)；示出了每种条件对A4P08％SDS的统计学上的显著性(红色)。(D)未透明化和透明化的1mmThy1-eYFP小鼠脑切片(n＝6个切片)的以任意单位(A.U.)计的整体eYFP荧光强度。(E)与A4P4相比，A4P0水凝胶-组织杂交体在透明化后表现出更高的组织扩张和重量增加。(F-H)用Nissl染色的Thy1-eYFP小鼠切片：(F)1mm透明化的脑切片，前额皮质(PFC)区域(左图：z＝1mm成像堆栈深度)；(G)1mm未透明化的脑切片，PFC(左图：z＝100μm成像堆栈深度)；(H)1mm脊髓切片(z＝500μm)。(I)用抗酪氨酸羟化酶(TH)抗体染色的1mm小鼠脑切片的黑质致密部(SNc)(z＝1mm)。(J)用针对GFAP、小鼠-IgG和Iba1的抗体染色的1mm成年小鼠脑切片的PFC(z＝500μm)。(K)用抗整合素抗体、SYTO24和吖啶橙染色的小鼠肾(z＝150μm；箭头示出肾小球)、心脏(z＝320μm)、肺(z＝550μm)和肠(z＝350μm)的1mm切片。(L)用标记内皮细胞的抗广谱细胞角蛋白(anti-pan-cytokeratin)(AE1/AE3)AlexaFluor488的一抗及DAPI染色的来自基底细胞癌(BCC)的PACT透明化的人组织活组织检查物(700μm成像堆栈深度)。所有图以平均值±SEM示出统计学上的显著性：对成对样品：双尾学生t检验；对多重比较：单因素方差、随后为邦弗朗尼事后检验法(*p<0.05，**p<0.01，***p<0.005和****p<0.0001)。全部共聚焦成像；物镜参见方法。还参见图7-9及表1和2。
图2展示了根据本发明的实施方案，通过smFISH检测在PACT组织切片中的个体mRNA转录物。将100μm厚小鼠脑切片与针对β肌动蛋白mRNA的用Alexafluor594标记的二十四种20mer寡核苷酸探针杂交。(A)PACT透明化的smFISH脑切片。上图示出了30μm的最大密度投影(maximumintensityprojection)。在589nm照射下，对应于单个β肌动蛋白mRNA的大量衍射极限点(红色)在多达30μm的深度被容易地检测到。注意，明亮的无定型颗粒(黄色)是在589nm(红色)和532nm自发荧光(绿色)通道中出现的背景脂褐质囊泡，而smFISH信号只在红色通道中。(B)与PACT透明化的切片相比，未透明化的脑切片中的smFISH显示降低的对比度。(A和B中的下图示出在12um深度的0.5um的单层切片；使用相同的对比度程度和高斯拉普拉斯滤波(LaplacianofGaussianfiltering)从原始数据处理图像；原始数据参见图8D)(C)作为深度的函数的信噪比表明，与未透明化的组织相比，PACT透明化的组织增加了遍及样品的厚度的smFISH的信噪比。(D)smFISH强度在19个未透明化和PACT透明化的组织之间没有显示可感知的差异。p＝0.8722；双尾学生t检验。(E)未透明化和PACT透明化的组织之间的背景强度的比较表明，在PACT透明化的组织中背景荧光的显著降低。p＝0.0006；双尾学生t检验。所有图以平均值±SEM示出。显微术参见方法。
图3展示了根据本发明的实施方案的PARS-CSF：一种用于使用原位灌注辅助的剂释放(PARS)经由脑脊髓液途径(CSF)快速全脑或脊髓透明化和标记的方案。(A)通过经由插入到嗅球正上方区域中的硬脑膜下(左图)或小脑延髓池内(或放置于背侧下丘的正上方，右图)的颅内脑分流器，将所有PARS试剂直接灌注进入CSF，可使得CNS组织变为透明的光学上透明的。连接灌注线路的套管可用牙科用丙烯酸类固定就位。(B)示出了来自PARS-CSF大鼠的在37℃透明化4天(脑)或2周(脊髓)的全脑和相应的2mm厚的切片(左图)和全脊髓(右图)。全脑透明化的程度取决于脑组织到套管的邻近度：额叶被赋予光学上透明的，而中后脑仅被微弱透明化(参见图右侧的2mm切片)。在RIMS中孵育24小时后，PARS-CSF脑切片被充分透明化用于成像而不需进一步制备切片。C)图像示出在500μmPARS-CSF透明化的冠状脑切片中的天然eGFP荧光，所述冠状脑切片从透明化前6个月接受AAV9:CAG-eGFP的IV注射的小鼠制备。皮质和海马的代表性切片在图框内用较高的放大倍率呈现(右图)。在层V冠状位(coronalview)中，AAV9转导的表达eGFP的神经胶质细胞和毗邻血管的eGFP神经元清晰可见。在海马(下图)中，表达eGFP的CA1神经元的更精细的神经元突起在高分辨率下可见，这表明在对细胞形态没有严重损害的情况下完成了PARS-CSF。显微术参见方法。还参见图10。
图4展示了根据本发明的实施方案，PARS实现全身透明化。(A)PARS透明化和免疫染色的图解。(B)PARS透明化之前和透明化之后的小鼠脑和外周器官的光学透明度的比较。(C)2周的PARS透明化之前(从左侧起第一个图框)和之后(第二个图框)的相对小鼠脑尺寸的代表性图像，示出了PARS在透明化过程中避免水凝胶膨胀和脑组织扩张。脑组织在浸入RIMS后逐渐扩张(第三个图框)，这种体积变化可经由在RIMS封固之前在4％PFA中后固定(post-fixing)PARS样品过夜被缓解(第四个图框)。(D)4天的PARS透明化之前(右图)和透明化4天之后(左图)的相对大鼠脑尺寸的代表性图像，示出了PARS如何作为一种可扩展的方法。大鼠全脑样品的冠状切片示出总体的组织形态，突出了无髓鞘区域可在基于PARS的透明化的4天以内被透明化。(E)与其他透明化方法相比，PARS透明化的蛋白质损失(每一种n＝4只小鼠)；图显示平均值±s.e.m.；单因素方差随后为邦弗朗尼事后检验法被用于确定相比于20到A4P08％SDSPARS透明化的统计学上的显著性。*表示p<0.05且**表示p<0.01。(B-D)的图像使用明场相机采集。还参见图10、13和9E。
图5展示了根据本发明的实施方案，PARS使得能够以亚细胞级分辨率对广泛和稀疏的基因编码的荧光信号进行全脑绘图。PARS透明化10天之后，成年Thy1-eYFP小鼠的(A)全脑图像(z＝6mm)和(B)深脑成像(z＝4mm)。右侧图框示出指定区域的高放大倍率图像。(C)PARS透明化2周后，成年Thy1-eYFP小鼠的脊髓图像(z＝2mm)。下图示出指定区域的高放大倍率图像(z＝1.2mm)。(D)图像示出从接受AAV9:CAG-eGFPIV注射的PARS透明化的小鼠制备的1mm冠状脑切片(左图)和肝脏(右图)中的天然eGFP荧光。每个冠状脑图像的右侧图柱示出正交视图(z＝0.5mm)。(E)从用肝脏脱靶的(detargeted)变体AAV9BD1:CAG-eGFP注射的PARS透明化的小鼠制备的1mm冠状脑切片(左图)和肝脏(右图)中的天然eGFP荧光。每个冠状脑图像的右侧图柱示出正交视图(z＝0.5mm)。显微术参见方法。还参见图11。
图6展示了根据本发明的实施方案，PARS允许对外周器官的快速和均一的透明化和免疫标记。透明化和免疫组织化学标记可通过单独PARS在整个小鼠中实现。(A)PARS透明化的小鼠肠用凝集素、亚甲蓝和DAPI染色，并成像直至500μm深度。下图示出上述透视图的最大密度投影，z＝50μm.(z＝500μm)。(B)将1mm厚的肾切片针对抗微管蛋白抗体和DRAQ5标记成像(左图)。右图示出指定区域的高放大倍率图像，及肾小球的结构，表明PARS使能够进行遍及全肾的基于抗体的标记(z＝1.2mm)。显微术参见方法。还参见图12和13。
图7展示了根据本发明的实施方案(涉及图1、3和4；及表2)，使用8％SDS的PACT透明化的A4P0组织-水凝胶杂交体表现出优异的光学透明度。所有样品进行PACT透明化3天。(A)使用不同百分比的SDS和10％脱氧胆酸钠进行PACT透明化的3mm小鼠脑冠状块的光学透明度的比较(箭头指示不完全透明化)。(B)示出与不同水凝胶百分比杂交的组织的孔的扫描电子显微术(SEM)图像；下方的柱状图指示每种条件的孔径的分布。(C)与A4P4相比，A4P0组织-水凝胶杂交体显示更大的组织扩张和光学透明度(1mm小鼠脑切片)。(B)和(C)的样品在8％的SDS中进行PACT透明化。(A)和(C)的图像用明场相机采集。
图8展示了根据本发明的实施方案(涉及图1和2)，PACT样品与总体组织病理学和精细的转录分析兼容。(A-C)人类基底细胞癌(BCC)组织活组织检查物的3mm厚的切片用PACT透明化，用抗广谱细胞角蛋白(AE1/AE3)抗体免疫标记，并用DAPI复染。(A)人类基底细胞癌(BCC)组织活组织检查物的未透明化(上图)和透明化的3mm厚的切片(下图)的图片(比例尺＝5mm)。(B)低放大倍率(5x)和(C)高放大倍率(25x)的3D透视图和最大密度投影，显示AE1/AE3阳性细胞和凋亡组织的角蛋白纤维残留(绿)相对于区域内的所有细胞(品红)的位置。(比例尺＝500μm和100μm)。(D)PACT透明化(上图)和未透明化(下图)的smFISH脑切片在处理前(除在DAPI通道的背景减除之外)(左图和中间图)和处理后(右图)图像之间的背景差别。左图：30μm最大密度投影(MIP)。中间图：3μm深度的单个0.5μm图像。右图：来自中间图的高斯拉普拉斯(LoG)滤波的对比度调整的图像。全部图像用同样的对比阈值和LoG滤波参数处理。显微术参见方法。
图9展示了根据本发明的实施方案(涉及图1和4，及表2)，sRIMS和RIMS通过匹配透明化的组织-水凝胶杂交体的折射率给出更好的光学透明度，并允许长期储存和成像。(A)在不同介质中封固并储存2周的PACT透明化的1mmThy1-eYFP小鼠脑冠状切片的光学透明度(上图，明场相机)和共聚焦图像(下图)。然而，封固在80％甘油中的样品的光学透明度非常差，RIMS和sRIMS(基于山梨醇溶液的封固介质(参见方法))，提高封固的样品的光学透明度和成像分辨率深度。发明人在已经被封固在甘油和FocusClearTM中多于1天的组织中检测到可能是溶解的盐的沉淀。(B)用多种浓度的HistodenzTM(在磷酸盐缓冲液中稀释)制备的RIMS的折射率。(C)在RIMS中孵育2个月后，未透明化的全脑组织在表面、髓鞘化不良的区域变为光学透明。因此，当期望对厚的切片的(～50-300μm)组织切片有优秀的分辨率时，RIMS浸没为较复杂的透明化方案提供更虽然缓慢但温和的替代选择。(D)A4P0和A4P4水凝胶-组织杂交体在RIMS中孵育1天(n＝4块)后，PACT透明化的(3天)3mmThy1-eYFP小鼠脑矢状块的代表性图像(明场相机)和组织收缩百分比的定量。(E)未透明化的Thy1-eYFP全脑和在RIMS中封固3个月的PARS透明化的Thy1-eYFP全脑之间的尺寸比较(明场相机)，和在RI1.43(60％Histodenzw/v)RIMS中长期储存后的eYFP荧光信号(z＝1mm)。显微术参见方法。
图10展示了根据本发明的实施方案(涉及图3和4)，用于全身透明化的PARS系统的研发。(A)左图：PARS在从吸管盒制备的定制灌注室中进行。在通过固定到左心室或升主动脉的进给针用4％的PFA灌注固定后，确保啮齿动物在吸管端格栅的顶上。为了当吸管盒填充有通过右心房中的损伤处流出啮齿动物身体的灌注液时排干吸管盒，确保导管的一个末端在吸头盒的底部。然后，将导管穿过蠕动泵，且相反的端被连接到进给针。这允许灌注液被虹吸出吸管盒，并通过心脏导管再循环回来，实现通过啮齿动物脉管系统的水凝胶单体、洗涤缓冲液、透明化去垢剂和组织学染色剂的持续灌注。注意的是，通过将导管附接到颅内套管而不是进给针，这种PARS装置可以被应用于PARS-CSF(参见图3A)。右图：紧临水凝胶聚合前，整个灌注室(连同导管连接的受试者)被密封在自封袋中用于组织脱气，且整个装置在剩余的PARS方案的整个过程中被放置在该袋中。该袋允许灌注室被放置在浅的水浴中–形成防止水淹没灌注室或PARS试剂污染水浴的屏障。(B)用Atto488缀合的GFAP纳米抗体(左图)和AlexaFluor647缀合的抗小鼠IgG抗体(右图)灌注啮齿动物，以经由PARS试剂的灌注研究全身脉管系统的可及性。具体地，PARS试剂必须能够循环通过主要血管以及组织微脉管系统，以实现中枢和外周器官、差的和良好血管化的组织等的均一、快速的透明化和标记。左图：围绕皮质中主要血管的大量神经胶质细胞。中间图：高放大倍率容量透视图，示出星形胶质细胞终足参与血脑屏障的形成。右图：1mm小鼠脑切片(皮质)的保存完好的脉管系统，其通过全部免疫球蛋白基于灌注的递送进入未透明化的组织实现。广泛标记的小鼠脉管系统显示PARS压力梯度可驱使抗体溶液通过主要血管。显微术参见方法。
图11展示了根据本发明的实施方案(涉及图4和5)的组织的保持和定量。(A)1mm厚的小鼠脑切片的明场图像，所述切片来自未透明化(左上图)，PARS透明化(右上图)，PARS透明化且RIMS浸没2周(左下图)，及PARS透明化、4％PFA后固定且RIMS封固的小鼠脑切片。注意，切片来自图4C中的全脑。(B)皮质、纹状体和丘脑中细胞之间的平均最近邻近距离(nearestneighhordistance)在未透明化、PARS透明化，及PARS透明化随后后固定的脑切片中被定量。相比未透明化的对照，PARS透明化的脑切片在脑的所有三个区域显示细胞间隔的小但显著的增加，及在皮质和丘脑中细胞尺寸的显著增加，而PARS透明化随后后固定的脑切片没有这种表现。统计学上的显著性：对于成对样品：双尾学生t检验；对于多重比较：单因素方差(**p<0.01，***p<0.005，且****p<0.0005，ns＝不显著)。
图12展示了根据本发明的实施方案(涉及图6)，PARS使主要外周器官在光学上透明。PARS透明化并灌注标记1周后，外周器官被切离，切割成1-2mm的切片，并在成像前浸入RIMS中24小时。(A)PARS透明化并染色的小鼠肝脏样品的500μm成像堆栈，扩散的凝集素和DAPI染色显示，尽管是肝脏组织的密度，PARS试剂能够到达整个器官。(B)PARS透明化并染色的小鼠肺样品的100μm成像堆栈和(C)PARS透明化并染色的小鼠胰腺样品的600μm厚的成像堆栈，两者都整体表现出高水平的凝集素、鬼笔环肽和DAPI荧光信号。在所有三个组织样品中观察到精细分辨率的细胞结构。凝集素染色(其标记血管)结合其他小分子染料的荧光信号证明了被染色的组织在紧邻组织脉管系统处。在外周器官中，免疫标记经由灌注液的脉管系统循环和被动扩散渗漏进入脉管系统周围的组织而发生(z＝100μm，比例尺＝100μm)。显微术参见方法。
图13展示了根据本发明的实施方案(涉及图4)，PARS能够进行全身透明化。用8％SDS进行PARS透明化1周后的整个Thy1-eYFP小鼠的(A)背侧(B)腹侧视图显示出全身良好的光学透明度。(B)中的箭头指向透明化的肾。(C)来自同一只小鼠的脑部图像。图像使用明场相机采集。
图14展示了根据本发明的实施方案的PARS和随后的3D成像的实施。
发明描述
本文所引用的所有参考文件通过引用被全文并入如同完全列出一样。除非另有定义，本文使用的技术和科学术语具有与本发明所属技术领域中的普通技术人员所通常理解的相同的含义。March,AdvancedOrganicChemistryReactions,MechanismsandStructure第5版；以及Guyton和Hall,TextbookofMedicalPhysiology第12版为本领域技术人员提供了本申请所使用的许多术语的一般性指导。
本领域技术人员将意识到可用于实践本发明的与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料。事实上，本发明不以任何方式限于描述的方法和材料。为了本发明的目的，某些术语定义如下：
如本文所使用的，PACT是PAssiveCLARITYTechnique(被动透明技术的首字母缩写。
如本文所使用的，PARS是Perfusion-assistedAgentReleaseinSitu(原位灌注辅助的剂释放)的首字母缩写。
如本文所使用的，RIMS是RefractiveIndexMatchingSolution(折射率匹配溶液)的首字母缩写。
如本文所使用的，“哺乳动物”指哺乳动物纲的任何成员，包括但不限于人类和非人灵长类，诸如黑猩猩和其他猿和猴的种类；家畜诸如牛、绵羊、猪、山羊和马；驯养的哺乳动物，诸如狗和猫；实验室动物，包括啮齿动物诸如小鼠、大鼠和豚鼠等。该术语不指示特定的年龄或性别。因此，预期将成年、新生受试者及未出生的受试者，无论雄性或雌性，包括在该术语的范围内。
如本文所使用的，“外周器官”可包括但不以任何方式限于，肌肉、心脏、肺、肾、结肠、肠(gut)、肠(intestine)等。
作为另外的背景，对完整组织的简易和有生理学上信息的光学接入长期以来都是生物学家的目标。早在十九世纪初，科学家诸如WernerSpalteholz的工作就揭示了使组织在光学上透明的用于解剖学和生物医学研究的效用(Spalteholz，1914)。尽管Spalteholz技术和它的变化形式引起对组织完整性和形态的破坏，它们在一个世纪之后仍被使用(Steinke和Wolff，2001)，突出了采用更新的组织透明化方法和现代的显微术技术的障碍。虽然不同的组织透明化方案在特定应用环境下具有优势，但没有一个能够完全克服最常见的挑战：确认的跨除了脑或胚胎以外的器官的普遍性、实行困难以及与内源荧光和/或事后(post-hoc)免疫组织化学不兼容(表1)。因此，改进组织透明化方案的动机持续围绕三个主要目标：1)中枢器官和外周组织二者的有效透明化；2)保留多种器官类型的细胞和亚细胞结构；和3)与内源荧光蛋白表达和DNA、RNA和蛋白质的后检测兼容。
这样的方法的益处是遍及大体积组织的光学接入，使得能够在保留的组织形态的环境中进行细胞与细胞的空间关系和远程神经连接的研究(Chung和Deisseroth，2013；Chung等，2013；Kim等，2013；Zhang等，2014)。与荧光示踪剂联合，组织透明化促进了对相互作用的细胞结构，包括遍及全身的在其靶位点处的发散或会聚的神经和脉管系统的鉴定。还能够在透明化的组织的环境中实现使用标准蛋白质和核酸探针的透明化的样品的精细尺度的亚细胞分析。
为改进以上描述的技术，在一些实施方案中，本发明教导了用于整个生物体透明化的方法，所述方法建立在现有技术诸如CLARITY、SCALE、SeeDB、ClearT、3DISCO、CUBIC、二苄醚(DBE)和BABB(Murray’sClear)上(Becker等，2012；Chung等，2013；Dodt等，2007；Erturk等，2012；Hama等，2011；Ke等，2013b；Kuwajima等，2013a；Susaki等，2014b)。这些技术中的每一种做出清楚的贡献：水凝胶嵌入以稳定组织结构(Chung等，2013)，荧光蛋白兼容的透明化试剂(Susaki等，2014b)和用于大的或具有挑战性的组织样品的成像方法(Becker等，2013；Tseng等，2009)。对于这些技术，存在几个特别重要的点。首先，在这些技术的每一种的最初的原理循证中，仅提出用于透明化脑组织并且偶尔用于脊髓(Erturk等，2012；Zhang等，2014)或全胚胎(Dodt等，2007；Hama等，2011)的详细的方法和优化的方案。迄今为止，3DISCO代表了外周组织中的透明化方法的最完整说明。然而，如许多之前的透明化方案(表1)的情况一样，3DISCO的透明化试剂(四氢呋喃和DBE)大幅度猝灭组织样品中的荧光信号(Erturk等，2012)。CLARITY(Chung等，2013)和CUBIC(Susaki等，2014b)绕开荧光猝灭的问题，但CLARITY在其最初形式中使用电泳组织透明化(ETC)以从大的样品中提取脂质，这可能难于实施，且可引起最终组织质量的可变性，包括表位和精细过程损伤和由于加热造成的组织变褐色。这导致使用被动脂质提取(Zhang等，2014，其方案在Tomer等，2014中详细描述)以及透明化的热加速和改进的成像的CLARITY的变化形式。CUBIC通过被动地清除磷脂也实现了组织透明，并且与水凝胶嵌入兼容。传统的被动透明化方法的主要弱点是它们的低速度，这使得他们不适于透明化大的组织体积或整个生物体。
如本文所描述的，在一些实施方案中，本发明的方法使用循环系统或脑脊髓液途径以直接递送透明化试剂，促进快速的全脑和全身的透明化。在发展这些方法的过程中，第一步是改进水凝胶嵌入、透明化和成像试剂，这产生了用于1-3mm厚的组织的更快速的被动脂质提取的PACT(被动透明技术)。为了成像PACT透明化的组织，研发了折射率匹配溶液(RIMS)—一种定制的经济配方，其效果与FocusClearTM类似(Chung等，2013；Moy等，2013；Tseng等，2009)。如本文更详细描述的，PACT试剂可经颅内或经由脉管系统递送以实现全脑和全身的透明化和标记。后者被称为PARS，意为原位灌注辅助的剂释放。PARS的所有步骤，包括保存、透明化和标记，在组织提取之前原位进行。如以下所示的，PARS与RIMS一起，将不透明的、完整的整个生物体转变成光学上透明的、荧光标记的样品，用于使用常规共聚焦显微术的可视化及在细胞、亚细胞以及甚至单分子转录水平的表型研究。
考虑到上述因素，本申请的另外的具体实施方案在下文中描述。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于修改组织的结构和/或光学特征的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液施加至组织，从而形成固定的组织，以及随后将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液施加到固定的组织，从而形成水凝胶处理的组织。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液施加到固定的组织(0.01％-10％(w/v)。本领域技术人员将容易地理解，还可使用替代性的光引发剂。仅仅作为非限制性实例，可使用水溶性偶氮类引发剂化学品种类的任何化合物。可使用的有效化学品可包括，但不以任何方式限于，2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]脱水二硫酸盐(disulfatedehydrate)；2,2'-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐；2,2'-偶氮双[N-(2-羧乙基)-2-甲基丙脒]水合物；2,2'-偶氮双{2-[1-(2-羧乙基)-2-咪唑啉-2-基]丙烷}二盐酸盐；2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]；2,2'-偶氮双(1-亚氨基-1-吡咯烷-2-乙基丙烷)二盐酸盐；2,2'-偶氮双{2-甲基-N-[1,1-二(羟甲基)-2-羟乙基]丙酰胺}；2,2'-偶氮双[2-甲基-N-(2-羟乙基)丙酰胺]等等。在一些实施方案中，光引发剂溶液的浓度从0.05％到10％(w/v)。在某些实施方案中，水凝胶单体溶液包含在PBS中的从1％到20％的丙烯酰胺。在一个优选的实施方案中，水凝胶单体溶液包含在PBS中的4％的丙烯酰胺。在一些实施方案中，水凝胶溶液包含蛋白质水凝胶。在一些实施方案中，使用的水凝胶可以是如在Sun等PNASPhysicalSciences-Engineering-BiologicalSciences-Biochemistry:SynthesisofbioactiveproteinhydrogelsbygeneticallyencodedSpyTag-SpyCatcherchemistry(2014)中描述的水凝胶。本领域技术人员将容易地理解，PBS可以被具有相似特性的另一种缓冲液代替。在一些实施方案中，所述方法还包括将水凝胶单体处理的组织放置到基本气密的室中，并将氮气引入到基本气密的室中，从而形成脱气的组织。在某些实施方案中，氮气被引入到室中，持续0.1到60分钟。本领域技术人员将容易地理解，应选择具有适应待被处理的组织的合适尺寸的室用于所述方法的这个方面。仅仅作为示例，可以使用实施例部分中描述的室。在可选的实施方案中，可以使用具有关于气体转移的相似特征的室。在某些实施方案中，所述方法还包括在从15℃到60℃孵育脱气的组织，持续0.5到24小时的时间段，从而形成孵育的组织。在一些实施方案中，所述方法还包括用PBS洗涤孵育的组织，从而形成洗涤且孵育的组织。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液施加至洗涤且孵育的组织，从而形成透明化的组织。在某些实施方案中，去垢剂溶液包含在pH为从6到10的0.01M到1MPBS中的0.5％到30％的SDS(w/v)。在某些实施方案中，在15℃到60℃，组织在去垢剂溶液中被孵育，持续0.1到60天。在一些实施方案中，在孵育过程中摇动组织。在某些实施方案中，所述方法还包括在0.1到76小时的过程中用PBS洗涤透明化的组织一次或更多次，从而形成透明化且洗涤的组织。在一些实施方案中，所述方法还包括将成像介质施加到透明化并洗涤的组织。在某些实施方案中，成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。在某些实施方案中，1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度从10％到100％w/v。在某些实施方案中，组织获自活组织检查。在某些实施方案中，组织是癌性的或癌前的。在某些实施方案中，组织是哺乳动物组织。在一些实施方案中，组织是人组织。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于免疫染色根据以上描述的方法制备的组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含一抗的溶液施加到如以上描述的透明化且洗涤的组织，从而形成抗体结合的组织。在某些实施方案中，所述方法还包括用缓冲溶液冲洗抗体结合的组织。在一些实施方案中，缓冲溶液包含PBS。本领域技术人员将容易地理解，具有可比较的特征的替代性缓冲溶液可在该步骤代替PBS。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含二抗的溶液施加到已经用缓冲溶液洗涤的抗体结合的组织，其中二抗用可视化的标记物标记。在某些实施方案中，可视化的标记物是荧光性的。本领域技术人员将认识到适合用于标记抗体的许多可视化标记物的任一种可被用作荧光标记物的替代物。在多个实施方案中，一抗用可视化的标记物标记。在某些实施方案中，组织获自活组织检查。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于可视化免疫染色的组织的方法。在某些实施方案中，所述方法包括利用显微镜可视化根据本文描述的任何方法制备的免疫染色的组织。在某些实施方案中，利用显微镜实施一种形式的显微术，所述显微术包括，但不以任何方式限于，落射荧光显微术、共聚焦显微术、多光子显微术、转盘式共聚焦显微术、光片显微术、光场显微术、荧光塔尔博特显微术(FluorescenceTalbotMicroscopy，FTM)。
以上和以下描述的用抗体免疫标记的实施方案仅代表本领域已知的用于询问组织和细胞的许多可能技术中有限的实例。而许多另外的技术，包括利用多种类型的标记探针，在实施例部分具体列出，它们不预期以任何方式进行限制。事实上，预期将用于可视化组织、细胞或亚细胞结构或过程(无论标记或未标记)的任何已知方法，都包括在本发明的范围内。
在多个实施方案中，本发明教导了一种原位修改组织的结构和/或光学特征的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液进入受试者的循环系统，从而在受试者内形成固定的组织；以及将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液进入受试者的循环系统，从而在受试者内形成水凝胶处理的组织。在某些实施方案中，在本发明的这个方面所使用的固定和水凝胶单体溶液与以上部分(及在实施例部分)描述的固定和水凝胶单体溶液相同。在一些实施方案中，将固定溶液引入到受试者的循环系统中，持续0.1到48小时。在某些实施方案中，将水凝胶单体溶液引入到受试者的循环系统中，持续0.1到48小时的时间段。在某些实施方案中，所述方法还包括随后将包含PBS的溶液进入受试者的循环系统，持续0.1到48小时的时间段，从而在受试者内形成PBS洗涤的组织。在某些实施方案中，所述方法还包括将受试者放置到基本气密的室中，并将氮气进入到室中，从而形成脱气的受试者。在某些实施方案中，引入氮气持续0.5和120分钟之间的时间段。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液进入脱气的受试者的循环系统。在一些实施方案中，光引发剂溶液具有与如在以上部分和在实施例部分所描述的用于制备组织的光引发剂溶液相同的特征。在一些实施方案中，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液引入到受试者的循环系统中，从而在受试者内形成透明化的组织。在某些实施方案中，去垢剂溶液包含在0.01M到1M的PBS中的大约0.5％到30％的SDS。在一些实施方案中，在20℃到60℃将去垢剂溶液引入到受试者的循环系统中，持续0.5到30天。在一些实施方案中，所述方法还包括将PBS引入到受试者的循环系统中，从而在受试者内形成透明化且洗涤的组织。在一些实施方案中，引入PBS持续0.5到30天。在某些实施方案中，所述方法还包括将成像介质引入到受试者的循环系统中。在某些实施方案中，成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。在一些实施方案中，1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度从10％到100％w/v。在一些实施方案中，引入成像介质持续0.1到14天的时间段。在某些实施方案中，组织包括脑组织。在某些实施方案中，组织包括脊髓组织。在一些实施方案中，组织是哺乳动物组织。在一些实施方案中，组织是人组织。
在本文所描述的方法的多个实施方案中，(1)通过连接至泵的第一管将本文描述的溶液的一种或更多种引入到受试者的循环系统中；(2)通过第二管将所述溶液的一种或更多种从受试者的循环系统移出，所述第二管与一种或更多种溶液被收集在其中的容器流体连通；以及任选地(3)泵从容器抽吸一种或更多种收集的溶液，并通过第一管将所述一种或更多种溶液引入到受试者的循环系统中。
在多个实施方案中，本发明教导了一种用于原位免疫染色组织的方法。在一些实施方案中，所述方法包括将包含一抗的溶液进入到已经根据以上所描述的方法的任一种被处理的受试者的循环系统中。在一些实施方案中，在使用成像介质之前进行免疫染色。在一些实施方案中，引入包含一抗的溶液持续0.5到14天的时间段。在一些实施方案中，所述方法还包括将缓冲溶液引入到受试者的循环系统中。在一些实施方案中，缓冲溶液是PBS。在一些实施方案中，引入缓冲溶液持续0.5和14天之间的时间段。在某些实施方案中，所述方法还包括将包含二抗的溶液引入到受试者的循环系统，其中二抗用可视化的标记物标记。在一些实施方案中，引入包含二抗的溶液持续0.5和14天之间的时间段。在某些实施方案中，可视化的标记物是荧光性的。在一些实施方案中，一抗用可视化的标记物标记。在一些实施方案中，组织是哺乳动物组织。
在一些实施方案中，本发明教导了一种组合物，所述组合物包含(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。在某些实施方案中，1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。
本文描述的PARS、PACT和相关方法可用于任何动物，且不以任何方式限于本文具体列出的那些实例。此外，本文描述的方法可用于从胚胎到成年动物的整个生物体。
本领域技术人员将认识到，与本文描述的方法和材料类似或等同的许多方法和材料可用于实践本发明。事实上，本发明不以任何方式限于本文描述的方法和材料。本发明的另外的非限制性实施方案被包括在以下的实施例中。
实施例
实施例1
结果
用于全器官的被动透明化和免疫染色的方法
在一些实施方案中，在三个主要步骤中使得厚的组织在光学上透明以用于成像。首先，组织被交联并杂交到水凝胶单体以稳定生物大分子。其次，使用离子去垢剂从组织-水凝胶基质中提取组织脂质。第三，将透明化的组织包埋在RIMS中以用于成像或用于长期储存。尽管全身透明化是首要目的，但要认识到处理小的或特别脆弱的样品和器官将通过温和、被动的透明化方案被最好地完成。研发出PACT以用于使得啮齿动物全器官、它们的1-3mm厚的切片，包括脑、脊髓、肾、心脏、肺和肠，或人组织活组织检查物透明。透明化的速度部分取决于去垢剂胶束溶解脂质的速率，及去垢剂胶束在组织中扩散的速率(Hoffman,2002)。然而，除非施加力量加速它们扩散通过组织，诸如在CLARITY’sETC中的电场(Chung等，2013；Tomer等，2014)，通过大胶束的脂质提取是相对慢的。测试在不同浓度的不同去垢剂以确认它们经过三天的孵育被动地透明化3mm冠状(coronal)的小鼠脑块的能力。相对于其他去垢剂，所有浓度的十二烷基硫酸钠(SDS)对于脂类溶解和从脑组织的移出是较好的，并且此外，只有8％的SDS浓度实现了遍及整个3mm块的均一透明化(图7A)。
假设组织-水凝胶的交联密度的降低将促进脂质提取和在随后的免疫组织化学过程中大分子渗透进入厚的、高度有髓鞘的或纤维组织。为检验这个假设，将3mm脑切片用多种组合和浓度的甲醛、丙烯酰胺和双丙烯酰胺灌输、脱气和在37℃聚合。当使用较低浓度的甲醛和丙烯酰胺时，且当用于CLARITY的丙烯酰胺交联剂双丙烯酰胺(Tomer等，2014)从水凝胶单体混合物中被排除时，组织透明化的效率(图1A)和抗体渗透的深度(图1B)显著增加。在用较低丙烯酰胺浓度制备的组织-水凝胶中观察到组织透明度的定性增加(图1A)之后，测定不同PACT组织制备物在透明化过程中的蛋白质损失、组织完整性和重量和体积的变化，以确保最低限度的交联方案足以保持组织形态和分子信息。从组织中渗出到SDS透明化缓冲液的蛋白质的量在在PBS中孵育作为对照的4％PFA固定的、未透明化的组织样品(A0P4)与用4％丙烯酰胺(A4P0)或用4％丙烯酰胺加4％PFA(A4P4)制备的那些透明化的组织-水凝胶基质之间是统计学上不可区分的(图1C)。值得注意的是，在8％SDS透明化浴溶液中记录的所有水凝胶嵌入的样品的蛋白质的量低于仅用4％PFA保持并在包含温和去垢剂的缓冲液PBS-0.1％TritonX-100中孵育的样品的蛋白质损失(每mg总重量0.57±0.11mg)。这暗示水凝胶单体有效地交联并稳定组织蛋白质，这通过以下发现结果被进一步支持：在8％SDS中孵育的未聚合的、PFA固定的组织显示出差的蛋白质保留(每mg总重量0.63±0.02mg蛋白质损失)(图1C)。
为证实关于在PACT组织中保持分子含量的这些结果，在来自Thy1-eYFP转基因小鼠的PACT脑样品中可视化并定量天然eYFP荧光的相对水平。虽然在两种水凝胶制剂(A4P0，A2P0)下观察到平均荧光强度的降低，针对组织扩张标准化荧光测量值之后(图7C)，PACT样品相对于未透明化的组织显示相当的总强度(图1D)。事实上，使用单独的丙烯酰胺制备的组织-水凝胶基质(A4P0)表现出比A4P4对应物高的分别为～174％和～223％的组织重量和体积改变(图1E)。但是，在组织样品从透明化溶液转移到封固介质后，PACT样品在几小时内收缩回至它们的原始尺寸(图9D)。这种组织扩张-收缩已在之前的脑透明化方案中被证明(Chung等，2013；Hama等，2011；Susaki等，2014b)，其中得出如下结论：这些尺寸变化，尽管非最理想的，未表现出对总体组织形态或细胞架构的负面影响。为可视化PFA对组织-水凝胶基质中的交联密度的作用，假设作用是限制组织扩张，PACT透明化的脑切片经由扫描电子显微术(SEM)成像(图7B)。注意到A2P0基质具有最大的孔径，然后是A4P0，而A4P4具有最小的可视化的孔径；孔径直接影响扩散速率，孔越大，组织-水凝胶基质中的大分子扩散时间越快。相对于常规组织学处理，在PACT处理和封固过程中的组织变形(即扩张和收缩)未表现出对样品的整体细胞组织或蛋白质含量的影响(图1F-1L)。因此，考虑到A4P0在透明化速度、蛋白质保持和中间孔径的组织之间的平衡，选择A4P0用于PACT，这有助于组织学过程中的大分子组织渗透。
PACT试剂与组织学和内源荧光染料兼容
为确保来自基因编码的荧光蛋白的信号强度在整个PACT处理过程中被保持，1mm厚的Thy1-eYFP组织切片被A4P0杂交、PACT透明化，并使用共聚焦显微术成像。尽管采用PACT透明化且重要地，厚的样品的缓慢的图像采集时间，基因表达的eYFP在整个样品中被容易的检测到(图1F，1H)。此外，组织-水凝胶基质还允许对厚的透明化的切片的均一的尼氏染色(图1F，与图1G中的未透明化的80μm切片相比)。如尼氏染色(红色)揭示的，透明化的和未透明化的切片之间整体细胞架构保持不变，这平息了关于组织的连续膨胀以及然后收缩引起永久的组织变形的顾虑。
不仅是包括维持组织样品的结构完整性的那些在内的天然蛋白质，在透明化过程中被组织-水凝胶基质保留(图1C，1F，1H)，而且透明化的组织块还是大分子充分可渗透的以允许使用多种常见组织学标记物(例如抗体、小分子、mRNA探针)对肽和核酸表位的标记。例如，除尼氏以外，来自小鼠脑和脊髓的1mmPACT切片用针对抗酪氨酸羟化酶(TH)(图1I)；胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、鼠免疫球蛋白G(IgG)和离子钙结合接头蛋白分子1(Iba1)(图1J)的抗体免疫标记。这些靶向的部分代表占据多种多样的细胞位置的抗原：膜定位的和胞质、神经元和非神经元的抗原。PACT透明化减少组织样品中的光散射，使得在单光子荧光成像过程中遍布整个1mm切片的所有标记物容易地被分辨。
为证实PACT方法对外周组织也是有效的，将Thy1-eYFP小鼠的肾、心脏、肺和肠切下、透明化，并用抗整合素抗体、吖啶橙(AO)和/或SYTO24标记(图1K)。如在中枢器官样品中观察到的(图1F，1H-J)，小分子染料和抗体等快速地扩散通过外周器官的1-3mm厚的A4P0交联的和PACT透明化的切片。虽然完全免疫标记厚的切片的时间取决于若干因素，包括组织类型、水凝胶孔径(图7B)和脂质去除的程度(图1A，7A)，通过7-12天的孵育实现了遍及PACT样品的均一的抗体渗透。然而，对于仅需要用小分子荧光染料标记的研究，分别使用单个过夜到3天的孵育人们就可获得对1-3mmPACT脑切片的快速染色。一些外周组织的染色甚至更快，其中，在低于一个小时内获得未切片的小鼠肠组织(～400um厚)中的个体细胞核的AO标记(图1K)。下一个问题是确定PACT是否能够被应用于病理学样品。将人皮肤癌活组织检查物(图8A)透明化，并用广谱细胞角蛋白(pan-cytokeratin)染色以可视化肿瘤细胞(图1L，图8B-C)。总结来说，使用标准免疫组织化学方法和常规荧光显微术，整个PACT透明化的组织块在低至亚细胞水平至分子询问(interrogation)是可及的。
为确定PACT是否与已建立的程序兼容以可视化单个mRNA转录物，使PACT处理的组织经历单分子荧光原位杂交，smFISH(Femino等，1998；Raj等，2008)。smFISH的方法能够高特异性地检测固定的细胞中的单个RNA分子，且它的高灵敏度允许对RNA丰度的测量和亚细胞定位。然而，由于组织自发荧光引起的低信噪比，在组织切片中的smFISH仍具有挑战性。本文中，在100μm厚的透明化的小鼠脑切片中的β肌动蛋白转录物使用针对β肌动蛋白mRNA的24Alexa594标记的20mer寡核苷酸探针被标记。组织样品在包含4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)的介质中被封固在载玻片上，并经由单光子显微术成像。确实，在整个PACT和smFISH处理过程中β肌动蛋白转录物被保留在神经元的细胞质中，且尽管β肌动蛋白在细胞中的高拷贝数以及被成像的脑切片的相当大的厚度，单个荧光点能够被区分(Buxbaum等，2014；Raj等，2008)(图2A)。相对于未透明化的组织，PACT组织遍及整个组织表现出衍射极限点(diffraction-limitedspot)的显著增强的对比(图2C)。确定了smFISH强度在PACT透明化的和未透明化的组织之间显示出极小的差别，同时背景强度被显著降低(图2A-B，2D和2E，8D)。这些发现结果连同在PACT透明化的组织中所观察到的smFISH信噪比的增加一起，表明在厚的样品中的背景自发荧光是在未透明化的组织中使smFISH信号模糊不清的主要因素。
用于成像和长期保存透明化的组织的折射率匹配溶液的配方
有效的成像取决于样品在封固介质中的浸入，所述样品在封固介质中的浸入减少异质组织中折射率(RI)的变化性并缓和组织、封固介质和镜头浸入介质界面之间的RI不匹配。为了对高昂的成本和传统产品的有限的可用性作出回应，配制了较便宜的替代品：RIMS，折射率匹配溶液(RefractiveIndexMatchingSolution)，其具有适合组织成像的RI(RI＝1.38-1.49)、生物安全性和对于组织保存的生物相容性(参见补充实验程序)。为测试RIMS，将PACT处理的样品封固在80％的甘油、FocusClear或RIMS中，并随后在相同的条件下成像(图9A)。RIMS提供了用于荧光显微术的良好的光学透明(图9C)，且在3个月的时间段中引起最小的eYFP信号猝灭(图9E)。由于它的性能显示出等同或优于FocusClear(图9A)，且它提供封固成本的>10倍的降低，RIMS被用于接下来所有的PACT和8个PARS实验。确切的RIMS配方可以以对于组织样品的RI的情况特异性的方式被优化(图9B)。
在成年啮齿动物中使用脉管系统的全身透明化
PACT方案使用4％丙烯酰胺单体溶液以产生最终组织水凝胶，并导致蛋白质保持、透明化的速度和简易度及光学透明的良好组合。然而，被动扩散对于大体积或整个生物体透明化是缓慢、遥不可及的。还需要注意，丙烯酰胺水凝胶在去垢剂透明化阶段显著扩张(图1A，7C)。这两个缺点对于大部分透明化方案是普遍的，促使代替性方法的研发以加速透明化且同时最小化透明化过程中的组织膨胀。利用现有的脉管系统网络，如在心脏灌注固定中常规进行的(Gage等，2012；Jonkers等，1984)，以通过进行原位整体固定和透明化程序将剂直接引入到组织中。该方法被称为原位灌注辅助的剂释放(或PARS)。PARS利用动物完整的脉管系统直接灌输水凝胶单体和透明化溶液，其随后扩散遍及感兴趣的组织。为研究灌注液是否到达主要血管和整个生物体的微脉管系统(Leong和Ling，1990；Li等，2012)，将针对小鼠免疫球蛋白的AlexaFluor647缀合的抗体(图10B，右图)或针对GFAP的Atto488缀合的纳米抗体(图10B，左图)通过心脏导管灌输-再循环，持续24小时。小鼠脑脉管系统被广泛标记，说明血管对于灌注液的可到达性(图10B)。如通过额外的脉管系统GFAP标记所示出的，还观察到灌注液扩散进入周围组织中(图10B)。
为了再循环PACT试剂进入脑CSF或通过全身脉管系统持续几天到几周，研发了闭合环路灌注系统。使用这种定制的PARS室(图10A)，经由称为PARS-CSF的方法持续颅内灌注8％的SDS进入CSF(图3)，在4天内得到全脑的透明化(图3A-3B)。将插管更近尾部地插入小脑延髓池中(图3A，右图)允许透明化大鼠脊髓的全长(图3B)。接下来，用插入在嗅球正上方的硬膜下插管(图3A，左图)制备AAV9-eGFP注射的成年小鼠，并在37℃再循环8％SDS4天后，靠近CSF循环的无髓鞘的和致密有髓鞘的小鼠脑区域(皮质的大部分、下丘脑、脑室附近的区域和脊髓)都被透明化。对单个神经元、神经元突起和神经胶质细胞的GFP标记在整个脑部清晰可见(图3C)。
确定了PARS-CSF同样的灌注透明化方法可被扩展至原位透明化全身。此外，相对于个体切离的完整器官的基于PACT的透明化，在脂质提取和抗体扩散过程中在组织上施加压力梯度分别能够获得加速透明化和免疫标记步骤的额外的益处。透明化试剂通过全身脉管系统循环(参见时间线，图4A)，在1周和2周内分别实现小鼠和大鼠等的所有外周器官和中枢神经系统的完全透明化(图4B-4D，13)。PARS灌注液的最低蛋白质含量和来自A0P4灌注的小鼠的灌注液的较高蛋白质含量(图4E)显示，整个生物体的水凝胶聚合对于稳定总体器官结构和大分子含量是必需且充足的。为确认PARS与可视化在多种器官稀疏地标记的细胞中定位的荧光蛋白表达是兼容的，通过全身施用腺相关病毒(AAV)递送GFP转基因。在成年小鼠中经由脉管系统递送AAV9:CAG-eGFP(图5D)或AAV9BD1:CAG-eGFP(图5E)，所述AAV9BD1:CAG-eGFP为AAV9的变体，其以与AAV9类似的程度转导CNS神经元但表现出减少的星形胶质细胞和肝细胞转导。在脑和肝脏中，天然eGFP的表达可被容易地检测，且与AAV9相比减少的肝脏肝细胞被AAV9BD1的转导被容易地检测到(图5D对比5E)。
与PACT相比，预测PARS处理过程中的组织体积变化将降低，因为肌肉骨骼结构，诸如颅骨、脊柱和肌肉壁，将在物理上约束组织扩张。事实上，啮齿动物脑的基于PARS的透明化被实现，具有在透明化过程中的有限的水凝胶膨胀和组织扩张(图4C-4D、11A)。尽管PARS处理的脑在将它们从颅骨中提取出并放置在PBS或RIMS中后确实会轻微膨胀(图11A)，没有证据显示由于PARS处理和PARS后(post-PARS)扩张发生的神经形态总体改变(图5B)。然而，通过在RIMS封固前在4％PFA中后固定PARS样品过夜，尝试减轻在RIMS中的组织膨胀。为通过体积变化评价整体组织架构被改变的程度，测量未透明化的、PARS透明化的和后固定的PARS透明化的样品的不同脑区域(皮质、纹状体、丘脑)中的细胞间距离和平均细胞尺寸(图11B)。预测个体区域可被PARS处理或RIMS孵育差异性地影响；例如，源自灌注相关的颅内压的任何剪力可对较少有髓鞘的组织发挥出更大的损害或引起脑室崩溃。后固定PARS样品显著地防止在整个PARS样品中检测到的细胞尺寸和细胞间距离的增加。在测定的所有脑区域中，未透明化的样品和后固定的样品之间在细胞尺寸或细胞间隙中不存在显著差异(图11B)。
整个生物体PARS使得能够以器官到器官的方式进行表型分析和成像
全身PARS处理和标记后，主要器官被切离、制备厚切片，并用共聚焦显微术成像(图5、6、12)。使Thy1-eYFP小鼠的PARS透明化的全脑(图5A-B)和脊髓(图5C)成像，并确定PARS处理使整个器官在光学上透明至可以以细胞级分辨率可视化深组织结构的程度。通过分别可视化遍及透明化的全脑(图5A-B)和肾(图6B)的个体神经元和肾元，显示实现了这种光学透明同时保持精细细胞结构的完整性，部分是由于原位组织-水凝胶聚合在稳定组织架构、保持蛋白质含量和内源荧光、及维持亚细胞和细胞组织成分之间的空间关系上的成功(图5A-B)。例如，分辨出了个体肾元的个体荧光标记的肾小球，这建立了PARS通过完整的脉管系统进入外周器官的能力(图6B、12)。
重要的是，这还包括所有免疫组织化学溶液的递送，包括封闭溶液、一抗和荧光标记的二抗混合物、或荧光标记的小分子、以及洗涤缓冲液。使用PARS的免疫标记是靶特异性的，遍及外周器官均一分布，并表现出低的背景，如通过在PARS处理的小鼠肾切片中的微管蛋白和DRAQ5标记所示出的(图5B)，和通过在肝、肺、胰腺中的血管使用凝集素、丝状肌动蛋白探针鬼笔环肽以及核酸染色剂DAPI的基于灌注的标记所示出的(图12)。
实施例2
讨论
在一些实施方案中，本发明教导了PARS，一种使得完整的整个生物体透明以用于以单细胞级的分辨率成像，同时保持荧光和基于蛋白质的信号及组织架构的方法。起点CLARITY方法(Chung等，2013)为科学家提供了脑处理平台，用于阐明全部3D细胞排布和连接组。在CLARITY之前十年内，很多实验室已经在先报道了新的透明化试剂，然而这些试剂中的许多是高度应用特异性的或组织特异性的(总结在表1中)。相比之下，CLARITY引入了两种可广泛应用的与组织保持(水凝胶嵌入)和透明化效率(电泳组织透明化，ETC)有关的技术，两者都可被并入到其他透明化程序的设计或再设计中。
传统上，使组织透明是一种需要大约数周到数月溶剂孵育的过程，如在其他透明化方法中报道的(Hama等，2011)。然而，ETC挑战了以下的流行观点：组织透明化速率仅能够通过测定大量有机溶剂以确定它们快速溶解组织的能力来加速。常常，在这些筛选中测试的候选溶剂实现了快速的组织透明化，但损害了组织结构(Hama等，2011)或猝灭了天然荧光(Becker等，2012；Erturk等，2012；Susaki等，2014b)。尽管比较起来由CLARITY引入的试剂更温和，但快速透明化所需要的ETC步骤实施起来复杂，且由于样品加热引起组织降解。尽管这些挑战可通过使用被动CLARITY(Tomer等，2014)绕开，慢的透明化速率使该技术用于扩大规模或用于全身绘图不切实际。
以快速透明化整个生物体同时在整个过程中仍使用温和去垢剂和不会猝灭荧光的试剂为目的，在CLARITY的基本原理上研发了PARS，但其旨在绕开对ETC的需求同时保持比通过被动扩散更快的透明化。首先，通过去除双丙烯酰胺并将去垢剂浓度增加到8％SDS(PACT试剂)改进透明化剂用于被动CLARITY。重新设计组织透明化步骤使得CLARITY使用的用于驱动快速脂质提取的电泳力被基于灌注的压力梯度取代。PACT试剂通过完整组织脉管系统的受控的流动，在2-3天内将大部分外周器官转变为光学上透明的组织，而在1-2周内使得整个小鼠和整个大鼠的脑透明。此外，原位透明化的自含特性(self-containednature)还在单体输注和脂质移除过程中减少组织扩张。
PARS允许对全器官和整个生物体的高表型含量的绘制。出于这种考虑，大组织块的快速、低分辨率的扫描能够指引研究者到限制的区域，所述限制的区域值得缓慢、高表型含量的分析，包括smFISH；长期保持荧光标记物的方法在这方面特别有价值。PACT和PARS两种方法相对于原始CLARITY过程是可扩展的、有成本效益的，且表现出可转移到其他模式生物体或人类组织。事实上，虽然使用在啮齿动物中的心脏灌注描述了PARS，该总体的方法论也可被应用到其中足够大的血管用于在更大、更高级的哺乳动物中包括分离的人类组织中产生灌注途径诸如全器官的灌注是可获得的情况。PARS实现了增加的透明化速度和减少的膨胀而不损坏组织(表1)，同时本方法的另一个显著优势在于它的可扩展性。例如，数据证明在系统地递送后PARS可被用于在细胞水平上评价多种器官中的AAV介导的转导。
通过消除对将个体组织切片的需求，PARS方法可加快努力来筛选多种AAV血清型和/或用于在感兴趣的细胞类型中优化表达的基因调控元件。除了改进筛选通量和速度外，基于PARS的全身方法还可抵消由于采样不足的误差引起的低估靶组织中的AAV转导的风险。相似地，PARS可改进在外周神经的靶全器官的水平上对外周神经的理解。复杂长距离纤维束诸如迷走神经的复杂长距离纤维束的精确图(George等，2000)，可辅助报告现有疗法中的改进或激励完全新颖的治疗策略的研发，诸如关于生物电子医学的研发(Famm，2013)。PARS还可促进脑与身体相互连接中、用于偏离靶和中靶剂(off-andon-targetagents)的全身筛选实验中及对稀疏元素诸如癌细胞或干细胞的全器官绘图中的生物医学工作。最后，PARS方法与填充有细胞的内骨骼结构兼容。通过将PARS与CLARITY的前身TEMPEST(Deisseroth和Gradinaru，2014)组合，在感兴趣的群体中长期保持的角蛋白丝的体内表达(其比细胞自身的存活时间久，同时保持形态的忠实蓝本)可促进全脑范围的长期退化的细胞的准确死后定量和绘图。
此处介绍的方法建立在CLARITY中先前工作的基础上，以通过使用内在循环系统将组织透明化和表型分析扩展到整个生物体。因为血管网络是不均匀的，导致非均一的灌注流，感兴趣的器官将以不同速率被透明化。
相对于外周(periphery)，血脑屏障可能对将特别大的分子诸如抗体(150kDa)有效的基于灌注的转运到脑提出挑战。然而不希望束缚于任何一种特定理论，为改进灌注效率，一种解决方案将可能是研发(或利用，当已经可获得时)较小的抗体支架以用于免疫标记；这些包括免疫球蛋白的片段抗原结合形式(Fab～50kDa)和纳米抗体、衍生自骆驼抗体的单结构域抗体，它们的较小的尺寸(～12-15kDa)促进组织渗透性(Harmsen和DeHaard，2007)。
改进的成像平台也将与最近的组织透明化工作相得益彰(Becker等，2012；Chung等，2013；Dodt等，2007；Ertürk等，2012；Ertürk和Bradke，2013；Hama等，2011；Ke等，2013a；Kuwajima等，2013b；Susaki等，2014a)。为了获得厚的透明化组织中的细胞和亚细胞信息，利用折射率匹配的、长工作距离物镜同时仍保持高数值孔径是重要的。扫描速度是另外的障碍，透明化的组织块的完全成像会耗费许多天--共振扫描仪或光片显微术(Tomer等，2014)可加速这个过程同时保持高分辨率的数据。
考虑到在脑和外周器官之间联系方面增加的兴趣(Birmingham等，2014)，对完整身体的未分段的观察将是重要的，其中脑和外周器官之间的结构连接保持完整。通过PARS和使其能够实现的技术(纳米抗体，成像平台)的研发，将有可能不仅促进神经科学家创建脑连接组的首要目标，还促进对脑与身体和背部连接组的阐明以及在健康或患病的身体内的所有其他器官系统的表型分析。
另外的应用
本领域技术人员将容易地理解，存在限制器官扩张的多种方式。仅通过非限制性实例的方式，经由将组织包装在有槽的或网格形的室中限制器官扩张，由于所述有槽的或网格形的室可通过3D打印容易地生产，可允许混合PACT-PARS透明化程序的进行。
此外，如果这样的室由盖片级玻璃或光纤维(Willis等，2012)制成，则无需完全移除包装物就可进行成像，这允许样品保持其原始形状和尺寸。事实上，虽然在本文中使用啮齿动物的心脏灌注描述了PARS，该总体的方法论也可被应用到其中足够大的血管用于在更大、更高级的哺乳动物中包括分离的人类组织中产生灌注途径诸如全器官的灌注是可获得的情况。
该技术的另外的应用包括病毒播散绘图和外周神经系统绘图。
另一个重要的考虑因素是PARS室可被重复多至快速平行透明化/标记所需要的次数。
用于PARS探针的研发
为改进灌注效率，一种解决方案将是研发(或利用，当已经可获得时)较小的抗体支架用于免疫标记；这些包括免疫球蛋白的片段抗原结合形式(Fab～50kDa)和纳米抗体(～12-15kDa)、衍生自骆驼抗体的单域抗体，它们的较小的尺寸促进组织渗透性(Harmsen和DeHaard，2007)。研究者目前建立用于生物医学应用的针对相关人类表位的大型纳米抗体文库的工作将鼓励科学家采用CLARITY、PARS、CUBIC和其他类似方法，所述科学家的研究依赖于对稀疏的靶的灵敏标记。本领域技术人员将进一步理解，可将单抗体(monobodies)与本文描述的本发明的方法和组合物联合使用。
通过PARS和PACT独特地可行的另外的生物医学的应用
PARS可允许改善我们对在其靶器官处的外周神经的理解，并且可允许促进对脑-身体相互连接的绘图。关于前者，复杂长距离纤维束诸如迷走神经的复杂长距离纤维束的精确图(George等，2000)，可辅助报告现有疗法中的改进，或激励完全新颖的治疗策略的研发，诸如关于生物电子医学的研发(Famm，2013)。在此，潜在的应用包括研究神经回路如何检测到外周器官中的疼痛(Iyer等，2014)或甚至调节外周中的癌症结果(Magnon等，2013)。关于后者，神经活动还可对外周可塑性和运动机能具有深远影响。例如，已经表明前运动皮层刺激触发少突胶质细胞发生(oligodendrogenesis)和髓鞘形成，且这种神经可塑性(nerveplasticity)和神经可塑性(neuroplasticity)与相应肢体的改进的运动机能相关(Gibson等，2014)。在以可识别的神经解剖学病理为特征的疾病中，诸如在脱髓鞘紊乱(多发性硬化或创伤性脑损伤之后的损伤)或心理行为病理(自闭症)中，PARS可被用于筛淘(pan)疾病的外周症状，分别诸如外周神经脱髓鞘(Zoukos等，1992)或外周免疫活化(Hsiao等，2012；Hsiao和Patterson，2011；Lucas等，2006；Zoukos等，1992)。对于与神经发育相关的脑-身体相互连接的其他最近的描述是胎盘-胎儿连接(Hsiao和Patterson，2012)、脑-肠轴以及针对自闭(Hsiao等，2013)或焦虑(Foster和McVeyNeufeld，2013)行为的肠道菌群(Flight，2014)。
同样的，许多外周解剖图在全器官框架内缺乏精细尺度的分辨率。例如，尽管研究已经表明生物膜的形成与人类中的许多慢性感染诸如中耳感染(Hall-Stoodley等，2006)和导管相关的尿路感染(Cole等，2014)相关，由于周围厚的细胞外聚合物质和在生物膜中的不同层的高度复杂性，用于成像组织内的生物膜结构的方法仍有局限(Ramsey和Wozniak，2005；Tan等，2014)。然而，考虑到抗生素无法容易地渗透生物膜以去除人体中的有害细菌感染的报道(George等，2009；Jain等，2008)，这样的成像能力将会大有益处。此外，外周组织的高分辨率的结构信息还有助于我们研究有时稀疏地嵌在组织内的干细胞龛，诸如位于小肠隐窝中的肠道干细胞的微环境信号传导调控(Bach等，2000；Barry等，2013)。
重要的是，PARS还可促进全身筛选疗法以确定偏离靶和中靶的结合，以及用于对施用的剂的生物分布成像，作为一种用于定性确认它们的药代动力学-药效动力学(PK/PD)特性的方法。类似的，本文展示的数据证明，PARS可用于在系统递送后在细胞水平上评价多个器官中的AAV介导的转导。通过消除对制备个体组织并对个体组织切片的需求，PARS方法可加快努力来筛选多种AAV血清型和/或用于在感兴趣的细胞类型中优化表达的基因调控元件。此外，使用PARS的全器官的筛选不仅可以提高这种PK/PD筛选的通量，还可抵消由于采样不足的误差引起的低估靶组织中的AAV转导的风险。
使全器官透明化和快速表型分析全器官的能力还可推进生物医学研究并通过监测组织病理中的变化促进对疾病进展的研究。PARS的医学上相关的用途在于它对于用于病理学或诊断目的的全组织和整个生物体绘图的应用，所述目的分别诸如研究在疾病或发育状态过程中发生的进展性全身生理变化，或对肿瘤构筑进行绘图(Birmingham等，2014)。多种3D肿瘤成像平台已经被报道用于追踪癌症进展(Colomba和Ridley，2014)。尽管存在这些新平台且尽管存在已被证实的解剖病理在医学中(例如，在确定肿瘤边缘中(Fukamachi等，2010))的诊断利用，由于费用和时间的限制，常规的组织学处理以及新鲜和冷冻的活组织检查样品的切片仍按照惯例。在大多数情况下，仅一部分切片被可视化，这可导致关键特征的采样不足和潜在的误诊(Zarbo等，2005)。如以上强调的，基于PACT或PARS的组织样品的透明化可有助于抵消这些风险。另外，PARS还可使动物模型中的整个肿瘤形态的研究，特别是组织水平上的血管形成、遍及肿瘤的细胞和亚细胞细节中的异质性(例如，边缘对核心)且重要地，跨越整个生物体的转移灶的研究成为可能。尽管用于肿瘤透明化的方法(3DISCO(Erturk等，2012b))先前已经被描述，在RIMS-2中的荧光标记物延长的寿命以及PARS易于扩展到整个生物体，使PARS成为一种优选的替代选择(表1)。
最后，PARS方法与细胞填充的内骨骼结构兼容。例如，目前神经退行性研究(帕金森、阿尔兹海默症、癫痫、中风)的一个瓶颈是难于准确绘制啮齿动物模型中退化细胞的分布，因为不可能看到死亡已久且被巨噬细胞清除的退化细胞。另外，切除实验(ablationexperiment)是研究确定的神经元集群(紧密或稀疏分布)和脑活动与行为之间的因果关系的流行方式：用毒素破坏这类细胞，但因为它依赖于与用安慰剂处理的脑进行比较且不可能知道切除的细胞的准确分布，后定量(post-quantification)很少准确。通过将PARS与CLARITY的前身TEMPEST(Deisseroth和Gradinaru，2014)组合，在感兴趣的群体中长期保持的角蛋白丝的体内表达(其比细胞自身的存活时间久，同时保持形态的忠实蓝本)可促进全脑范围的长期退化的细胞的准确的死后定量和绘制。
实施例3
方法
PACT透明化
将4％多聚甲醛(PFA)固定的组织切片在补充有0.25％光引发剂2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(VA-044，WakoChemicalsUSA，Inc.)的水凝胶单体溶液A4P0(在PBS中的4％丙烯酰胺)中于4℃孵育过夜。将A4P0输注的样品用氮气脱气1-5分钟，并随后在37℃孵育2-3小时以启动组织-水凝胶杂交。经由简单的PBS洗涤去除过量的水凝胶后，组织-水凝胶基质被转移到含有在0.1MPBS中的8％SDS(pH7.5)的50mL锥形管中，并且，取决于组织尺寸在37℃振荡孵育2-5天。关于免疫染色，将1-3mm厚的PACT处理的样品在PBS中洗涤，在一天期间更换缓冲液4-5次，并随后转移到含有小分子染料的缓冲溶液中或转移到含有一抗随后是荧光缀合的二抗溶液中(1:200-400，在含有2％普通驴血清、0.1％TritonX-100和0.01％叠氮化钠的PBS中)持续3-7天，或对于小分子染料则持续1-3天。抗体或小分子染料溶液需要每天更换。与之前一样，未结合的抗体通过PBS洗涤去除，并随后将样品与二抗(优选Fab片段二抗，1:200-400)一起孵育2-5天，然后在PBS或磷酸盐缓冲液(PB)中洗涤1天，然后在成像介质(RIMS)中孵育。所有染色和封固步骤在室温在温和振荡下进行。
水凝胶单体性质
尽管报道了作为在本文进行的实验中使用的特定水凝胶组合物。固定剂/水凝胶组合物可包含任何便利的水凝胶亚单位，诸如，但不限于聚(乙二醇)及其衍生物(例如PEG-二丙烯酸酯(PEG-DA)、PEG-RGD)、聚脂肪族聚氨酯、聚醚聚氨酯、聚酯聚氨酯、聚乙烯共聚物、聚酰胺、聚乙烯醇、聚丙二醇、聚氧化四亚甲(polytetramethyleneoxide)、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚(羟乙基丙烯酸酯)、和聚(羟乙基甲基丙烯酸酯)、胶原蛋白、透明质酸、壳聚糖、葡聚糖、琼脂糖、明胶、海藻酸盐、蛋白质聚合物、甲基纤维素等。在一些情况下，水凝胶亚单位可被修饰以将特定性质添加到水凝胶；例如，可掺入肽序列以诱发降解(参见，例如，West和Hubbell，1999，Macromolecules，32:241)或以修饰细胞粘附(参见，例如，Hem和Hubbell，1998，J.Biomed.Mater.Res.，39:266)。剂诸如亲水性纳米颗粒，例如，聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PLG)、聚(乳酸-共-乙醇酸酸)(PLGA)、聚苯乙烯、聚(二甲基硅氧烷)(PDMS)等，可被用于改进水凝胶的渗透性同时保持定型能力(patternability)(参见，例如，美国专利申请号13/065,030；LeeW.等2010Proc.Natl.Acad.Sci.107，20709-20714)。物质诸如PEG的嵌段共聚物、可降解的PEO、聚(乳酸)(PLA)和其他相似物质可用于将特定性质添加到水凝胶(参见，例如，Huh和Bae，1999，Polymer，40:6147)。可包含交联剂(例如双丙烯酰胺、二吖丙啶等)和引发剂(例如偶氮双异丁腈(AIBN)、核黄素、L-精氨酸等)以在随后的聚合步骤中促进相互作用的大分子之间的共价键合。
水凝胶网络性质
典型地，水凝胶亚单位和改性剂的浓度和分子量将取决于选择的聚合物和它们将聚合到其中的水凝胶网络的期望的特征，例如，孔径、膨胀特性、导电性、弹性/刚度(杨氏模量)、生物降解性指数等。例如，可以期望水凝胶包含足够尺寸的孔以允许大分子例如蛋白质、核酸或小分子通过(如在下面更详细描述的)而进入样品。普通技术人员将意识到孔径通常随水凝胶亚单位浓度的增加而减小，并通常随水凝胶亚单位与交联剂的比的增加而增大，并将制备包含允许此类大分子通过的一定浓度的水凝胶亚单位的固定剂/水凝胶组合物。作为另一个实例，可以期望水凝胶具有特定的刚度，例如，以在处理嵌入的样品中提供稳定性，例如，约2-70kN/m2的杨氏模量，例如，约2kN/m2、约4kN/m2、约7kN/m2、约10kN/m2、约15kN/m2、约20kN/m2、约40kN/m2但通常不多于约70kN/m2的杨氏模量。普通技术人员将意识到水凝胶网络的弹性可受多种因素影响，包括聚合物的支化、水凝胶亚单位的浓度及交联的程度，并将制备包含一定浓度的水凝胶亚单位以提供此类期望的弹性的固定剂/水凝胶组合物。
水凝胶单体
固定剂/水凝胶组合物可包含从约1％w/v到约20％w/v，例如，约2％到约15％、约3％到约10％、约4％到约8％浓度的丙烯酰胺单体，和在约0.01％到约0.075％范围内，例如，0.01％、0.02％、0.025％、0.03％、0.04％、0.05％、0.06％或0.075％浓度的双丙烯酰胺交联剂；或，例如，固定剂/水凝胶组合物可包含从约1％w/w到约50％w/w的范围内，例如，1％或更大、5％或更大、7.5％或更大、10％或更大、15％或更大、20％或更大、30％或更大、40％或更大并且通常不大于约50％的浓度的PEG预聚物，所述PEG预聚物具有从至少约2.5K到约50K范围内，例如，2.5K或更大、3.5K或更大、5K或更大、7.5K或更大、10K或更大、15K或更大、20K或更大，但通常不大于约50K的分子量。可通过现有技术中的方法或如在以下工作实施例中所描述的方法容易地确定提供期望的水凝胶特征的水凝胶亚单位和改性剂的浓度。
固定剂/水凝胶溶液可通过任何适当的方法被递送到样品，例如，灌注、注射、滴注、吸收、敷用、浸入/浸没等。样品通常将在水凝胶存在下被固定15分钟或更长，例如，30分钟或更长、1小时或更长、2小时或更长、4小时或更长、6小时或更长、12小时或更长、在一些情况下16小时或更长、20小时或更长或24小时或更长。
水凝胶聚合
在固定样品后，水凝胶亚单位可被聚合，即，共价或物理交联以形成水凝胶网络。聚合可通过任何方法进行，包括但不限于热交联、化学交联、物理交联、离子交联、光交联、辐射交联(例如，x射线、电子束)等，并可基于使用的水凝胶类型和本技术领域知识选择。例如，将未聚合或部分聚合的树脂与特定交联化学品混合，导致形成交联的化学反应。可通过暴露于辐射源在通常为热塑性的材料中诱发交联，所述辐射源诸如电子束暴露、伽马射线或UV光；例如，电子束处理被用于聚合C型的交联聚乙烯。其他类型的交联聚乙烯通过在挤压过程中添加过氧化氢(A型)或通过在挤压过程中添加交联剂(例如乙烯基硅烷)和催化剂，并随后进行挤压后固化而制成。
通过自由基清除剂抑制聚合
通常当暴露于大气氧时，许多聚合物经历氧化交联。在一些情况下，反应比期望的更快速，并因此聚合反应可涉及抗氧化剂的使用以减缓氧化交联的形成。在其他情况下，例如，当期望通过氧化的交联更快速形成时，氧化剂诸如过氧化氢可用于加速进程。聚合的时间长度将取决于使用的水凝胶亚单位的类型和选择的聚合方法，但通常将为约15分钟到约48小时，例如，15分钟或更长、1小时或更长、2小时或更长、3小时或更长、4小时或更长、6小时或更长、12小时或更长、16小时或更长、24小时或更长，或在一些情况下，48小时。最佳的时间和试剂的组合将是普通技术人员已知的或可凭经验确定或从许多公众可获得的来源(例如，在万维网piercenet.com；还参见，MacroporousPolymers:ProductionPropertiesandBiotechnological/BiomedicalApplications.BoMattiasson、AshokKumar和IgorYu编辑.Galeaev.CRCPress2010；和CrosslinkingReagentsTechnicalHandbook，PierceBiotechnology，Inc.，2006)确定。
透明化
聚合后，水凝胶嵌入的(即，水凝胶杂交的)样品可被透明化。“透明化”样品意为使得样品基本上是光可透过的，即，透明。换言之，用于照射样品的约70％或更多的可见(即，白)光、紫外光或红外光将穿过样品并仅照射其中被选择的细胞成分，例如，75％或更多的光、80％或更多的光、85％或更多的光、在一些情况下90％或更多的光、95％或更多的光、98％或更多的光例如100％的光将穿过样品。样品的光学性质的这种改变提供了组织内部的细胞和亚细胞结构的可视化。
迫使细胞成分例如脂质离开样品、从样品抽出细胞成分例如脂质、或引起样品内细胞成分例如脂质分解即溶解的任何处理可用于透明化样品，包括而不限于暴露于有机溶剂诸如二甲苯、乙醇或甲醇，暴露于去垢剂诸如皂苷、TritonX-100和吐温-20，暴露于离子表面活性剂例如十二烷基硫酸钠(SDS)–尤其是如本文所描述的、电泳、水动压力、超声振动、溶质对比、微波辐射、血管循环等。在一些情况下，透明化使用不会猝灭荧光蛋白的溶剂进行。已知猝灭荧光蛋白的有机溶剂的实例包括四氢呋喃、己烷、苯甲醇/苯甲酸苄酯(BABB)和二苄醚。因此，为保持多种蛋白质的荧光，在一些实施方案中，使用以上列出的那些以外的溶剂进行透明化，例如，使用非有机溶剂进行透明化。
RIMS成像介质(RI1.46)
在具有0.1％吐温-20和0.01％叠氮化钠的30ml的0.02MPB中的40gSigmaD2158(Histodenz)，用NaOH调节pH到7.5–这产生88％Histodenzw/v的终浓度。样品在RIMS中孵育直到透明(对于PACT样品～1天，对于PARS透明化的脑多达1周)，随后在新鲜RIMS中封固。
smFISH
根据公布的方案(Buxbaum等，2014；Lyubimova等，2013)，100μmPACT切片被乙醇透性化、用针对B-肌动蛋白的24Alexa594标记的20mer寡探针标记(在37℃孵育过夜)、洗涤并通过SlowfadeGold+DAPI洗涤并盖片。应用半径为3的高斯拉普拉斯滤波可视化在透明化和未透明化的两种样品中的转录物。
PARS方案
在用4％PFA(在PBS中，pH7.4)的标准心脏灌注后立即将固定的啮齿动物转移到灌注室上(图10A)，所述灌注室经由蠕动泵持续不断地(1ml/min)再循环所有随后的PACT和免疫标记试剂(如上)通过啮齿动物脉管系统。灌注管将室连接到进给针(feedingneedle)，所述进给针穿过左心室插入到主动脉并松散地就地缝合。用4％PFA后固定啮齿动物1小时，并随后用PBS灌注洗涤1小时。过夜循环A4P0单体通过脉管系统、随后用PBS灌注洗涤2小时。在聚合前，且不断开灌注线路，将灌注室放置于自封袋中(图10A)，并将包含室和啮齿动物的袋在氮气条件下脱气2分钟。经由在37℃灌注再循环200mL的在PBS中的0.25％VA-044引发剂2-3小时引发聚合。通过在37-42℃用在pH7.5的PBS中的8％SDS灌注≤2周，随后为大量PBS灌注洗涤2-3天，透明化全身。随后经由3天的灌注和1天的洗涤递送抗体和小分子染料(如以上在PACT中的)。对于脑或脊髓透明化的PARS-CSF变化形式(图3A-B)，经心脏(transcardially)固定的啮齿动物被断头，并将硬膜下套管插入到感兴趣的区域上方并接合到颅骨。以与PARS同样的顺序和时间表以1ml/min递送所有PACT试剂。
AAV制备和系统递送
如(Lock等，2010)所描述的制备并纯化包装进AAV9或AAV9变体衣壳AAV2/9BD1中的单链ssAAV-CAG-eGFP载体。AAV2/9BD1衣壳从AAV2/9(U.Penn)修饰而来，除其他的以外，具有N498Y突变以减少肝脏转导(Pulicherla等，2011)。将每种病毒的1x1012载体基因组(vg)静脉递送到小鼠中，并且6个月后通过PARS评价组织的天然eGFP荧光。
荧光显微术
在室温根据样品厚度使用从0.5mm–7mm的垫片将透明化的组织样品在RIMS中封固(iSpacer,SunJinLabCo.；SiliconeIsolator,ElectronMicroscopySciences,PA)，并盖上盖玻片。对于图3B，使用具有LeicaHCFLUOTARL25x/1.00IMMCORR物镜(工作距离，w.d.6.0mm)的LeicaTCSSP8双光子显微镜通过LeicaMicrosystems成像样品。使用具有Fluar5x/0.25M27干式物镜(w.d.12.5mm)、Plan-Apochromat10x/0.45M27空气物镜(w.d2.0mm)、LDSCPlan-Apochromat20x/1.0CorrM3285mm规模浸没式(scale-immersion)物镜(w.d.5.6mm)或LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8ImmCorrDICM27多浸没式(multi-immersion)物镜(w.d0.57mm)的ZeissLSM780显微镜采集其他图像。图像重建使用Imaris成像软件(Bitplane)进行。成像后，将样品室温储存在RIMS中。
扩展的补充程序&另外的试剂和缓冲液
表1–过去十年的主要透明化方案的方法考虑
表2–用于PACT、PARS和RIMS的示例性试剂。
表3PARS和PACT的生物医学应用
1在中枢和外周神经系统两者中，髓磷脂主要包括脂质(以干重计75-80％)(Morell和Quarles，1999)。髓磷脂碱性蛋白(MBP)是目前髓鞘中最丰富的蛋白质，根据物种的不同，占总蛋白质含量的约60-80％。与MBP不同，其他髓磷脂蛋白通常不溶于水性溶液并因此不易提取。但，可以使用膜蛋白分离的标准方案使用SDS将这些同MBP一起提取。因此，透明化方案的主要关注点是不充分的PFA和/或水凝胶单体交联以稳定组织样品中的髓磷脂蛋白质。然而，对髓磷脂相关蛋白(MAP)的免疫标记的描绘仍可以是可行的，例如，在透明化的组织中的轴突或神经纤维，如在CLARIFIED人类组织中所示出的(Chung等，2013)，仍不确定的是，在PACT/PARS处理的组织中对脱髓鞘和髓鞘再生的定量研究是否可被准确评估，其中一些髓磷脂成分可能在透明化过程中被洗去。事实上，一些作者由于对溶解和去除富含脂质的髓鞘的这种担忧，已经在他们关于髓鞘形成的研究中特别地报道避免透明化组织(Jung等，2014)。在多种已公布的透明化方案中，SeeDB、CLARITY和PACT/PARS具有保持某些髓磷脂结构要素的完整性的最大潜力。也就是说，SeeDB(Ke等，2013)已经证明与亲脂性染料兼容，同时CLARITY/PACT/PARS都包括水凝胶-组织嵌入步骤，预期该步骤在用SDS透明化的过程中防止髓磷脂蛋白质的损失。最后，在研究光学透明显微术对于重建脑皮层纤维结构的应用的研究中，将脑样品进行光学透明化并在OCM前用ScaleA2封固(Leahy等，2013)。然而，因为作者们没有提供关于他们的透明化方法的细节，人们不能评价组织在ScaleA2中是否被广泛透明化，或者ScaleA2是否被主要用作折射率封固介质，其中髓磷脂损失的风险将是最小的。2最近，报道了一种用于使用光谱共聚焦反射系数显微术(SCoRe)的有髓鞘的轴突的无标记体内成像的方法，作为一种对弥散张量成像(DTI)的更简单易行的替代选择(Schain等，2014)。得益于富含脂质的髓磷脂的高折射率，SCoRe方法允许仅用常规激光扫描共聚焦显微镜对在轴突髓鞘形成中的变化进行精细尺度的成像。清楚的是，可实施一种新的离体成像方法，所述方法使用在PARS处理的且免疫标记的样品中物质的基于整个生物体PARS的转移代替了活生物体中物质的扩散。
动物
将野生型小鼠(C57BL/6N和FVB/N，雄性和雌性二者)、Thy1-YFP小鼠(品系H)和Th-cre(1Tmd/J)小鼠用于新颖的透明化方案和透明化试剂的研发和测试。将Thy1-YFP小鼠用于评价内源荧光信号在多周的透明化步骤过程中和在RIMS中长期样品储存下的保持。将青年至成年的野生型大鼠(Long-Evans和Wistar，雄性和雌性二者)用于优化透明化方案用于较大的组织样品，以及用于描述在漫长的基于灌注的透明化和抗体染色步骤过程中脉管系统的保持。对于经心脏灌注，用过量的Euthasol(100mg/kgIP注射)深度麻醉受试者，之后首先使用含有0.5％NaNO2的肝素化的PBS(在0.1MPBS中的10U/mL肝素)并随后用4％PFA进行经心脏灌注。对于PACT，将脑和/或期望的器官切下并在4％PFA中后固定数小时，之后进行水凝胶单体输注和透明化步骤。对于基于PARS的全身透明化，将心脏内导管插入到左心室，伸长到刚好越过主动脉瓣，用松散的缝合线环稳定在主动脉中。对于基于PARS的全脑透明化，将降主动脉用微夹结扎。对于涉及AAV9-CAG-eGFP转导的细胞的可视化的实验，用病毒经由眼球后窦注射年轻成年雌性C57Bl/6小鼠，并在用于病毒转导和eGFP表达的6个月延迟之后，将小鼠处死以用于PACT和PARS研究。
AAV制备和系统递送
通过用携带荧光标记的转基因的腺相关病毒载体注射小鼠，可能观察到，PARS处理和RIMS封固与相比由Thy1启动子驱动的荧光标记更稀疏、局部的荧光标记的兼容性(图5A-C对图5D-E)。特定神经元类型和神经胶质的稀疏的标记以及不同器官中局部eGFP表达(例如肝脏和海马，图5D-E)清晰可见。如(Lock等，2010)所描述制备并纯化包装进AAV9或AAV9变体衣壳AAV2/9BD1中的单链ssAAV-CAG-eGFP载体。AAV9BD1衣壳从AAV2/9(U.Penn)修饰而来，具有以下突变(VP1编号)：1)进行N498Y突变以减少肝脏转导(Pulicherla等，2011)，2)将氨基酸序列AAADSPAHPS(Chen等，2009)插入到AA588-589之间，和3)进行Y731F突变(Pulicherla等，2011)。将每种病毒的1x1012载体基因组(vg)经由眼球后窦静脉递送进到年轻成年雌性C57Bl/6小鼠中，并在6个月后将小鼠处死用于通过PARS评价天然eGFP荧光。在RIMS中的2周组织储存后进行来自AAV9注射的小鼠的PARS脑和肝脏组织的所有成像。
PACT和PARS试剂的选择
为了筛选不同的水凝胶单体配方和透明化条件，用过量的Euthasol(100mg/kg，IP注射)麻醉数只成年C57和Thy-1eYFP小鼠(Jackson)，并首先使用含有0.5％NaNO2和10U/mL肝素的PBS并随后使用在PBS中的4％的多聚甲醛(PFA)进行经心脏灌注。将切下的全脑切成1mm和3mm的矢状切片和冠状切片，于室温在4％PFA中后固定2-6小时(在4℃后固定全脑和切片过夜也是有效的选择)，并随后将切片在A2P0(在PBS中的2％丙烯酰胺和0％多聚甲醛)、A4P0(在PBS中的4％丙烯酰胺和0％多聚甲醛)或A4P4(在PBS中的4％丙烯酰胺和4％多聚甲醛)水凝胶单体溶液中4℃孵育过夜，每种含有0.25％的光引发剂2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐(VA-044，WakoChemicalsUSA，Inc.)。当仍浸没在水凝胶单体中时，通过使氮气冒泡通过vacutainer或5mLEppendorf管中的样品-水凝胶溶液持续1分钟使水凝胶输注的样品脱气。应注意，由于在最初的和改进的CLARITY方案(Chung等，2013；Tomer等，2014)中被认为是必须的，进行了使用惰性气体替换氧气氛围的若干更加严格的方法的实验(例如，1.将含有样品的vacutainer置于冰上；2.用室内真空(housevacuum)线路脱气vacutainer，同时温和涡旋几分钟；3.将样品从冰上移除并使氮气冒泡通过水凝胶单体溶液持续数分钟；4.重复步骤1-3数次)。然而，确定的是，简单的1分钟的将氧气交换为氮气支持了适当的聚合：残留的氧气可能已阻碍了组织和丙烯酰胺单体之间的完全杂交，然而组织-水凝胶基质足以保持组织架构和蛋白质含量。为聚合水凝胶-组织基质，将样品转移到37℃水浴或加热块，并在该升高的温度下孵育2-3小时。用PBS将聚合的样品简单洗涤以除去过量的水凝胶，转移到50mL锥形管，并在37℃在PBS、在PBS中的0.1％tritonX-100或透明化溶液中振荡孵育2-5天，所述透明化溶液为：4％SDS、8％SDS、20％SDS或10％脱氧胆酸盐，全部都在pH7.5的0.1MPBS中制备。在24小时和48小时采集3mm脑切片的图像(图1A)以示出在用低PFA浓度制备的组织水凝胶基质的更大的组织膨胀与用高PFA(和丙烯酰胺)浓度制备的组织-水凝胶基质的更加缓慢的组织透明化之间的权衡；选择了A4P0水凝胶配方用于后续的PACT和PARS实验的一般使用。脑切片在8％的SDS透明化溶液中孵育72小时产生优秀的组织透明化(图7A)，并因此选择了8％透明化溶液用于后续的PACT和PARS实验。关于透明化时间，该参数必须以情况特定的方式被优化。24小时的透明化对小组织样品或高孔隙度的组织可以是足够，但更大、高度有髓鞘的或致密组织切片以及全器官可需要>96小时。必须小心不要过度透明化样品，并且如果长期储存样品还要定期检查过度膨胀，因为在长期过程中膨胀确实促成水凝胶软化并分解，产生样品损失的风险。这通过在样品制备和处理过程中的升高的温度和机械应力来加速。温和处理组织-水凝胶样品以及向孵育溶液中添加抗微生物剂允许水凝胶保持稳定多达两周。还确认了在透明化后的另一轮的用1-2％PFA的组织交联或组织-水凝胶再聚合有益于抵消在封固介质中的组织膨胀和组织分解二者。
PACT免疫组织化学
为免疫染色PACT处理的组织，一天更换4-5次的PBS洗涤透明化的样品以去除残留的SDS。然后，将样品与在含有2％普通驴血清、0.1％TritonX-100和0.01％叠氮化钠的PBS中的一抗(1:200-400)一起在室温振荡孵育3-7天。在24小时、48小时和72小时，从这些抗体孵育物中移出六个A4P0聚合的和六个A4P4聚合的3mm矢状切片，以测量IgG在透明化的组织中的渗透深度(参见图1B)。对于剩下的切片，通过在一天期间内在更换4-5次的PBS缓冲液中洗涤切片以移除未结合的一抗。然后，将样品与在含有2％普通驴血清、0.1％TritonX-100和0.01％叠氮化钠的PBS中的二抗(优选Fab片段二抗，1:200-400)一起在室温振荡孵育2-5天。在用一天更换4-5次的PBS洗涤后，将样品在室温在RIMS溶液(30mL的含有0.01％叠氮化钠的0.02M磷酸盐缓冲液中的40g的SigmaD2158(HistodenzTM)，将pH用NaOH调至7.5—这产生88％Histodenzw/v的终浓度)中孵育直到它们变为透明。在将组织在抗体、小分子染色剂或RIMS中长期孵育(>4天)的过程中，在孵育的中途将溶液更换为新鲜的。作为另外的预防措施并为了防止细菌生长，在每次缓冲液更换的情况下可以将组织转移到新的50ml锥形管或染缸中。建议在清洁环境中进行RIMS孵育和封固以最小化细菌污染，所述清洁环境是在防护罩(hood)中或通过在火焰上将RIMS倾倒在新的锥形瓶中。
用于被动染色的一抗是鸡抗酪氨酸羟化酶(TH)IgY、鸡抗胶质纤维酸性蛋白(GFAP)IgY(AvesLabs，Tigard，OR)、兔抗离子钙结合接头蛋白分子1(Iba1)IgG(Biocaremedical，Concord，CA)、兔抗整合素b4、b5IgG和兔抗β微管蛋白IgG(SantaCruzBiotechnology，Dallas，Texas)。将AlexaFluor647缀合的驴抗小鼠IgG(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)用于抗体渗透实验(图1B)。用NeuroTrace530/615红色荧光Nissl染色剂(在PBS中的1∶50稀释，LifeTechnologies，GrandIsland，NY进行Nissl染色；将样品在RT孵育过夜并然后在PBS中洗涤，然后封固。对于使用吖啶橙的小分子染色，将样品放置在100μg/mL吖啶橙溶液中10分钟，随后在PBS中冲洗一小时。然后在成像前将组织放置在RIMS溶液中4小时。所有步骤在室温进行。
PARS室设计
为了灌注PARS试剂通过脉管系统用于透明化和免疫标记步骤，必需制造简单装置以在脂质提取和抗体扩散过程中对组织使用持续压力梯度再循环试剂持续数天到数周。因此，使用传统心脏灌注固定技术(Gage等，2012；Jonkers等，1984)作为递送方法，设计了由以下部件组成的PARS室：1)进给针导管，其就地夹在受试者的左心室内，2)灌注液收集孔(吸管盒)以捕捉穿过损伤的右心房流出脉管系统的再循环试剂，和3)导管(PTFE管)，其经由其穿过蠕动泵的通道将再循环试剂从收集孔转移返回到受试者的脉管系统(图10A)。为确认这种装置对整个生物体的透明化是有功能的，将几种不同的去垢剂，包括几种不同百分比的SDS、多种浓度的月桂酰肌氨酸钠和脱氧胆酸钠，经由颈动脉连续灌注通过整个小鼠和大鼠，持续长达2周。当在PACT中时(图7A)，仅SDS能够有效使得组织透明以用于光学成像。同样，当使用PARS室装置递送时，8％SDS能够有效溶解组织深处的脂质并实现对大组织样品的均一透明化。因此，采用PARS室装置用于随后的PARS实验。
PARS透明化和染色
对于成年小鼠或大鼠的经心脏灌注固定，将进给针插入通过左心室并到主动脉中，并松散地就地缝合在主动脉弓水平的血管处。如对于PACT所总结的，在用PBS和4％PFA灌注后，将固定的整个啮齿动物转移到定制的灌注室，其中将室中的溶液灌注进入啮齿动物并通过蠕动泵再循环。在室温用4％PFA通过相同的进给针以1mL/min的流速进入主动脉持续1-2h，将啮齿动物后固定。对于大鼠的脑和脊髓的透明化，将动脉循环系统地结扎，保持颈动脉完整并移除未通过这些血管直接灌注的组织。为了防止PFA交联丙烯酰胺单体，在RT灌注PBS2小时以洗去残留的PFA，并在RT灌输在PBS中的4％丙烯酰胺(A4P0)过夜。第二天，再次灌注PBS以去除脉管系统中的任何剩余的PFA/丙烯酰胺的聚合物/单体。在聚合前，且不用断开灌注线路，将灌注室置于自封袋中，并通过单独的连接件将氮气输注入灌注室以使样品脱气。通过添加200mL的具有PBS的0.25％VA-044引发剂，并将脱气的灌注室浸没在37-42℃的水浴中2-3小时，以引发聚合过程。将吊锤放置在灌注室的上方以防止其翻倒。聚合后，将该溶液用在0.1MPBS中的8％SDS，pH7.5透明化缓冲液替换，并灌注小鼠/大鼠长达2周。对于PARSIHC，首先在整个2天期间用200mLPBS(进行8次缓冲液更换)灌注透明化的小鼠/大鼠，以去除残留的SDS。然后，使用在PACT方案中描述的相同的抗体配方，进行3天的用一抗混合物的灌注、1天的用PBS洗涤液的灌注、3天的用二抗混合物的灌注和1天的PBS洗涤，以染色透明化的小鼠/大鼠的外周器官。
用于脑和脊髓透明化的PARS-CSF方法
对于限制到脑和脊髓绘制的应用，研发了颅骨内PARS策略，其通过将水凝胶单体和透明化试剂经由颅内脑分流器直接输注到CSF中允许全脑和全脊髓的彻底透明化。在特定情况下(例如，在来自体内药理学、神经生物学或光感基因学研究的受试者中预先存在可用的引导套管)，PARS-CSF将允许全脑的透明化和组织学，对于存在的套管的附近区域其被自动优化，并需要比同等的全器官的PACT程序少的时间和试剂。本文中，用于颅内递送PARS试剂的两种途径被证实。为了使脊髓透明化，可将套管插进入小脑延髓池或降低穿过颅骨(通过在感兴趣的区域钻孔并使用镊子在硬脑膜上制造一个开口)，到蛛网膜下腔的水平，在背侧下丘的正上方(参见图3A)。当在升高的温度和持续更长的透明化时间段进行PARS-CSF时，可将大鼠脊髓样品(右图)透明化。为使全脑透明化，可将套管降低穿过颅骨，穿透硬脑膜，并放置在嗅球正上方的区域(参见图3B)。将套管(21G，PlasticsOne)使用牙科用丙烯酸类(C&B-Metabond，ParkellInc.)就地接合在颅骨表面上。随后将PARS程序施用到该颅内制品：与心脏供给管相反，将导管连接到硬膜下套管，且使用如在PARS中同样的顺序和时间表以1ml/min输注所有PACT试剂。对于全脑透明化，将受试者经心脏灌注固定并断头，仅将头部转移到PARS室并与输注线路连接。吸管盒和导管线路预先填充有4％丙烯酰胺单体溶液(A4P0)，将管连接到套管，并在室温将A4P0以1ml/min的流速颅内输注过夜(图10A，左图)。冲洗脑的未结合的PFA和丙烯酰胺单体后(2小时的PBS输注)，全脑经由将PARS室转移进入自封袋并将室放置在惰性气氛(N2)中两分钟被脱气(图10A，右图)，所述冲洗对于确保脉管系统保持未聚合状态十分重要。随后将装入袋中的PARS室转移到37-42℃的水浴，并且持续整个2-3h的孵育将补充有热引发剂的脱气的PBS输注通过脑。该全脑水凝胶基质形成后，颅骨内组织透明化经由持续4天的恒定的8％SDS灌注-再循环通过套管实现，在整个过程中PARS室保持在37-42℃水浴中。最后，在大量的PBS洗涤后(2-3天)，将导管线路断开，且脑被移出、进行切片并封固在RIMS中用于成像(图3B)。
使用IV注射有AAV9-eGFP的小鼠，就以下条件验证了用于全器官透明化的PARS-CSF程序：1)相对于套管布置，在区域被透明化到何种程度方面仅有有限偏差，2)在接近套管的区域没有由于引起高颅内压的过度液压造成的结构损坏，所述过度液压来自过高的流速或灌注液体的不充分排放，3)亚细胞结构形态的保持，以及4)稀疏标记的细胞群和荧光的良好可见性。其可对进行以下研究的科学家具有特殊意义：已经涉及使用脑内(IC)或脑室内(ICV)放置套管的小鼠或大鼠受试者的研究及要求对每个受试者进行死后(post-mortem)脑组织学的研究。
抗体渗透
将四个经心脏灌注并用4％PFA后固定的成年小鼠(4-12周龄)脑切成2mm矢状切片，并使这些切片经PACT处理。具体地，每个PFA固定的脑的一半用A4P4水凝胶杂交，而另一半在4A0P水凝胶中杂交。如在PACT方案中所描述的，将所有样品用在PBS中的8％SDS被动地透明化，且将残留的SDS通过用PBS洗涤1天去除。随后将样品在一抗混合物(驴抗小鼠IgG抗体，1：200，在包含2％普通驴血清、0.1％Triton-X100和0.01％叠氮化钠的PBS中)中孵育时间段跨越24-72小时的范围。随后将样品用1天进行4-5次缓冲液更换的0.1MPBS洗涤，并封固在RIMS溶液中。图像使用WPlan-Apochromat20x/1.0DICM27(工作距离1.8mm)用ZeissLSM780共聚焦显微镜采集。抗体渗透的深度(图1B)使用具有Reslice和Z项目插件的Fiji在y-z投影的图像上描绘出。
用于PACT和PARS样品的RIMS(折射率匹配溶液)
作为用于成像的组织制备的最后步骤，样品封固包括将组织切片浸入介质，所述介质将有助于匹配物镜、镜头浸入介质和组织的折射率，这给予了更高的分辨率和成像深度。为了在封固PACT和PARS中避开过分昂贵的试剂FocusClearTM的使用，配制了新的封固溶液替代物。基于组织光学透明化的原理，合理地筛选了具有以下的光学透明化剂的期望特征的两组主要化学品(糖醇和放射性造影剂)(高水溶性、低粘度、高密度、低克分子渗透压浓度、低自发荧光、无荧光团猝灭、生物兼容的、低成本。鉴定了山梨醇，一种可负担且广泛可获得的糖醇。以70-80％(w/v)的溶液，山梨醇能够有效透明化200μm厚的未透明化的和多达1mm厚的PACT透明化的脑切片，具有极少的荧光猝灭。该制剂(称为sRIMS，描述参见下文)后被调整为包含0.02-0.05M磷酸盐缓冲液(保持pH)、0.1％吐温-20(提高组织渗透性)和叠氮化钠(防腐剂以抑制细菌生长)。除糖醇外，还评价了放射性造影剂，特别是血管内递送的非离子碘造影剂(也被批准用作密度梯度介质)，因为它们的物理和化学性质良好匹配于理想的折射率匹配介质的物理和化学性质。基于成本和可获得性，测试碘克沙醇(Optiprep)和它的单体碘海醇(Nycodenz，还作为HistodenzTM(碘海醇的衍生物)可获得)，并且发现碘海醇在匹配大的多的PARS透明化的样品方面优于山梨醇。
接下来，进行通常使用的/市售可获得的封固选择：80-90％甘油和FocusClearTM，与本文描述的介质封固介质制剂：sRIMS和RIMS(被优化用于使用标准共聚焦显微术的我们的成像装置的成像介质)之间的并行比较(参见图9A)。RIMS溶液经由在具有0.01％叠氮化钠的0.02M磷酸盐缓冲液中溶解40g的HistodenzTM(SigmaD2158)至总体积30mL，用NaOH调节pH至7.5来制备，其产生88％Histodenz(w/v)的终浓度，RI＝1.46(除非另行注明，贯穿本研究被使用)。
值得注意的是，RIMS的折射率(RI)可以被调节以匹配特定的组织/成像系统：期望的是，RIMS的RI可以在从1.38(30％Histodenzw/v)到1.48(95％Histodenzw/v)的范围以得到非常好的样品分辨率。使用ReichertAR200折射计测量RIMS中的透光率(图9B)。关于RIMS封固，首先将样品室温浸没在RIMS中直到它们变为透明。在这个过程中，透明化的样品在最初几个小时首先收缩(参见图3B、9D)。在RIMS中的连续孵育将导致随时间推移的逐步的组织扩张直到RIMS完全渗透组织(参见4C、11A)；观察到最大的样品(例如大鼠全脑)在RIMS浸入的一周内变为透明，其后它们的扩张停止。然而，通过于室温在4％PFA中后固定透明化并染色的样品1-2小时(小样品)或多达过夜(大样品)、然后进行RIMS孵育，成功地限制了组织扩张(参见图4C，右图框；图11A，右下图框)。尽管后固定PARS组织减少逐步的组织体积扩张(图9)，另外的交联还促成组织透明度的轻微减少(图11A)。然而，荧光强度、细胞表型分析或成像的可分辨深度并未被不良地影响。
sRIMS：RIMS的经济有效的基于山梨醇的替代物
具有0.01％叠氮化钠的0.02M磷酸盐缓冲液中的70％山梨醇(w/v)(SigmaS1876)，pH用NaOH调到7.5；净成本$0.2/ml。尽管在某些进行的实验中在可分辨的图像深度方面RIMS优于sRIMS，山梨醇是跨越科学实验室通常可获得的化学品，并因此提供了基于甘油的封固溶液的方便、经济有效且出色的替代物。
脉管系统保持
用肝素化的PBS、4％PFA及最后地另外的PBS洗涤液经心脏灌注大鼠。随后，在任何的水凝胶单体输注或如在PARS中透明化之前，将大鼠经由其主动脉内导管用100mLAtto488缀合的抗GFAP纳米抗体(在PBS中1:100)室温灌注过夜。GFAP纳米抗体根据公布的方法制备(Li等，2012)。在使用之前将其缀合到Atto488荧光染料。将脑从颅骨中移出，并于4℃在4％的PFA中过夜孵育以交联纳米抗体。随后将脑切成1mm的冠状切片并根据标准PACT方案处理，包括水凝胶单体输注、杂交及在37℃在0.1MPBS，pH7.5中的8％SDS中持续3天的被动样品透明化。将透明化的样品在RIMS溶液中孵育一天，并在RIMS溶液中封固用于成像。图像使用LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8ImmCorrDICM27多浸没式物镜使用ZeissLSM780共聚焦显微镜采集。在小鼠中重复以上方法，用于用AlexaFluor647缀合的抗小鼠IgG标记脉管系统。简要地，使用安装用于4％PFA固定的相同的主动脉内导管，用AlexaFluor647缀合的抗小鼠IgG经心脏灌注4％PFA固定的小鼠过夜。将脑切离，于4℃在4％PFA中后固定过夜，切成1mm的冠状切片，并在37℃在0.1MPBS，pH7.5中的8％SDS中PACT透明化3天。将透明化的样品在RIMS溶液中孵育一天，并在RIMS溶液中封固用于成像。
切片的组织的扩张和重量增加测量
将PFA固定的成年小鼠(4-12周龄)脑切成六个1mm厚的冠状切片。来自脑的一半的切片储存在PBS中，而来自脑的另一半的切片进行持续4天的PACT透明化。在透明化之前和之后将切片称重并用常规照相机成像。切片的尺寸被描绘出并使用ImageJ计算。组织扩张和重量增加通过计算切片的尺寸和重量在透明化之前和之后的变化来确定(图1E)，并将它们针对PACT前的测量值归一化。
蛋白质损失测量
每个样品的蛋白质损失的百分比(图1C、2E)通过以下获得：用相应溶液空白化的NanoDrop测量收集自PACT或PARS透明化的透明化溶液中的总蛋白质的量，并针对透明化之前的小鼠重量(对于PARS)或切片重量(对于PACT)进行归一化。
全脑组织形态保持和定量
为观察PARS处理和RIMS封固对脑体积的影响，PFA固定的成年小鼠脑被立刻提取(未透明化的对照)或PARS处理；并随后根据以下条件的一种来处理来自这两组的脑：在PBS中孵育1天、在PBS中孵育1周、在RIMS中封固1天、在RIMS中封固2周或后固定并在RIMS中封固2周。随后，对来自所有条件的透明化的和未透明化的脑拍照以评价它们的相对尺寸变化(图4C)，切成切片以可视化透明化深度(图11A)，进行切片封固，并经由共聚焦显微术成像以评价组织架构的总体变化(例如主要脑区域的形态变形、脑室和脉管系统的结构完整性)(图11B)。每个样品的蛋白质损失的百分比(图1C、2E)通过经由NanoDrop测量在组织的PACT或PARS处理后收集的透明化溶液等分试样的蛋白质浓度获得。随后，基于该浓度和已知的在处理过程中使用的透明化溶液的总体积，可评价净蛋白质损失。每个样品的蛋白质损失的量针对透明化之前的小鼠重量(对于PARS)或组织切片重量(对于PACT)进行归一化，以使样品间和组织处理条件间的蛋白质损失可被比较。
单分子RNAFISH
通过在光真空下脱水1小时，将组织样品粘附到氨基硅烷处理的盖玻片上。在杂交前样品根据以下方案透性化：首先，将样品在100％乙醇中室温洗涤两次，持续10分钟。接下来，将样品在95％乙醇中室温洗涤10分钟。随后将样品在70％乙醇中4℃孵育2小时。在孵育之后，在室温将组织放置在0.5％的硼氢化钠(w/v)的70％乙醇溶液中10分钟。最后，用三次PBS洗涤使组织再水化。杂交在37℃在杂交缓冲液中过夜进行，所述杂交缓冲液含有10％硫酸葡聚糖(w/v，SigmaD8906)、10％甲酰胺(v/v)、包含1nM的针对B肌动蛋白的24Alexa594标记的20mer寡探针的每一种的2XSSC。次日，将样品在30％甲酰胺2XSSC中室温洗涤30分钟，随后用2XSSC洗涤四次。洗涤之后，将样品与SlowfadeGold+DAPI(LifeS36938)一起封固在两个盖玻片之间。将样品用AndorIkon-M照相机和60X/1.4NAPlanApoλ物镜以另外的1.5x放大倍率在NikonTiEclipse显微镜上成像。图像被获取作为具有0.5μm步幅尺寸的超过30μm的Z-堆栈。将样品用由ShanghaiDreamLaser生产的589nm(SDL-589-XXXT)、532nm(SDL-532-200TG)和405nm(SDL-405-LM-030)激光器激发。
使用记录在MATLAB中的图像分析脚本分析smFISH图像(图2)。为确定样品的平均背景，将图像使用50x50像素内核(kernel)进行中值滤波，且中心200x200像素子图像的平均像素强度被用作图像的平均背景值。通过以下发现smFISH点：应用高斯拉普拉斯滤波器、基于平均背景值阈值化图像、并将所得图像与扩大的图像进行比较以发现局部极大值。使用得到的测量结果的标准偏差计算误差棒。
人类组织活组织检查的准备
在适当的知情同意之后且在UCLAIRB#12-01195的批准下，从经历他们的癌症的切除的患者获得人类基底细胞癌皮肤组织样品。组织样品从肿瘤切片获得，不必然用于诊断或边缘控制目的，且取决于原始皮肤癌的尺寸而在尺寸方面不同。利用如对于啮齿动物描述的PACT方法论处理活组织检查的肿瘤样品，使用4％丙烯酰胺溶液(A4P0)以产生固定的组织的水凝胶支持基质。随后在8％SDS中在37℃被动透明化聚合的组织水凝胶基质2-7天(即，取决于组织厚度)。通常来说，3mm厚的人类皮肤切片能够在3-4天内变为透明。
用1:100稀释的抗广谱细胞角蛋白(AE1/AE3)AlexaFluor488一抗(eBiosciences)免疫标记PACT处理的样品2天，随后在PBS中洗涤1天。所有标记和洗涤步骤在室温进行，且将最终的PACT处理的活组织检查样品在RIMS中封固。如以上描述的，成像用20x长工作距离物镜在Zeiss780共聚焦显微镜上进行。尽管测试了用于组织水凝胶样品的一定范围的透明化时间(在8％SDS中2-7天)，由于脂肪细胞中的所有堆积的脂质的不完全胶束溶解，皮下层(主要由脂肪细胞组成)耐受一贯的透明化(黄色组织，图8A)。
扫描电子显微术
样品在FEIQuanta200F环境扫描电子显微镜(ESEM)上以ESEM模式成像。将PACT处理的脑组织的薄切片放置在室中的样品架上，并使用气体二次电子探测器(GSED)以3或4的孔径在5kV电压和在7.7-8.3mm之间的工作距离成像。请注意在切割/SEM处理过程中的拉伸将使组织-水凝胶杂交体的孔更大。SEM图像的实际有效孔径应小于在此展示的孔径。
定量方法
平均最近邻近距离(NND)：将1mm厚的冠状切片用DAPI染色并用10x0.45N.A.plan-apo物镜成像。24张3μm厚的图像从皮质、丘脑和纹状体的不同区域采集。30像素滚球半径减法滤波器被用于去移背景。所有图像被各自阈值化并转化为二进制图像。二进制分水岭分割(binarywatershedsegmentation)被应用以划分聚集在一起的细胞。得到的图像通过在ImageJ上分析粒子选项(particleoption)来定量。每个细胞的质心在测量中被鉴定出，NND通过在imageJ上应用“nnd”插件来计算。
GFP尺寸定量：用5x0.25N.A.Fluar物镜成像注射AAV9-eGFPIV的小鼠脑的1mm厚的冠状切片。Z-堆栈的最大投影被用于定量。将每个GFP阳性神经元的区域分离并通过在ImageJ上分析粒子选项来定量。
最近邻近距离测量和GFP尺寸计算二者对在未透明化的、PARS透明化的和PARS透明化的随后后固定的小鼠脑切片中的以下三个脑区域进行：皮质、纹状体和丘脑(代表性脑切片参见图11A且数据结果参见图11B)。计算每个区域的所有计数的细胞的平均细胞尺寸和平均NND，并分析数据以确定在区域之间的细胞尺寸或NND中的统计学上的显著差异。
荧光显微术
透明化的组织样品在RIMS溶液中孵育一天。随后使用具有盖玻片的7.0mm或3.0mm垫片(iSpacer，SunJinLabCo.)或0.5mm或2.5mm垫片(SiliconeIsolator，ElectronMicroscopySciences，PA)将样品封固在各自的溶液中。将盖盖玻片的样品储存在室温并在成像前避光。注意，大多数荧光图象和最初的样品可视化在具有Fluar5x/0.25M27干式物镜(工作距离12.5mm)、Plan-Apochromat10x/0.45M27空气物镜(工作距离2.0mm)、LDSCPlan-Apochromat20x/1.0CorrM3285mm规模浸没式物镜(工作距离5.6mm)或LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8ImmCorrDICM27多浸没式物镜(工作距离0.57mm)的常规显微镜(ZeissLSM780)上进行。唯一的例外是对于smFISH实验，其使用具有AndorIkon-M照相机和60X/1.4NAPlanApol物镜的NikonTiEclipse显微镜，且对于展示在图3C中的图像的获取，其中样品通过使用具有LeicaHCFLUOTARL25x/1.00IMMCORR物镜(工作距离6.0mm)的LeicaTCSSP8双光子显微镜的LeicaMicrosystems成像。使用Imaris成像软件(Bitplane)进行图像重建。成像之后，将样品室温嵌入RIMS中用于储存。
按照附图总结用于所有共聚焦成像的物镜：
图1：(F左图)Fluar5x/0.25M27干式物镜；(F右图；G；H；K)LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8ImmCorrDICM27多浸没式物镜；(I、J)LDSCPlan-Apochromat20x/1.0CorrM3285mm规模浸没式物镜。(L)ZeissPlan-Apochromat10x/0.45空气物镜。
图2：(A-B)样品以另外的1.5x放大倍率用AndorIkon-M照相机和60X/1.4NAPlanApo1物镜在NikonTiEclipse显微镜上成像。图像被获取作为具有0.5μm步幅尺寸的超过30μm的Z-堆栈。样品用640nmCoherentCube、和532nm(SDL-532-200TG)和405nm(SDL-405-LM-030)激光器激发。
图3：(C)LeicaHCFLUOTARL25x/1.00IMMCORR物镜。图5：(A)Fluar5x/0.25M27干式物镜；(B)LeicaHCFLUOTARL25x/1.00IMMCORR物镜，工作距离6.0mm；(C)上图：Fluar5x/0.25M27干式物镜及下图(插图)：LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8ImmCorrDICM27多浸没式物镜；(D)LeicaHCFLUOTARL25x/1.00IMMCORR物镜；(E)LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8ImmCorrDICM27多浸没式物镜。图6：(A)具有10x0.45N.A.Plan-Apochromat的ZeissLSM780共聚焦显微镜；(B)LDSCPlan-Apochromat20x/1.0CorrM3285mm规模浸没式物镜(工作距离5.6mm，Zeiss)。
图8：(B-C)具有Zeiss5x0.25N.AFluar物镜和LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8N.A.多浸没式物镜的Zeiss780共聚焦显微镜。(D)以另外的1.5x放大倍率在具有AndorIkon-M照相机和60X/1.4NAPlanApo1物镜的NikonTiEclipse显微镜上成像的smFISH样品。
图9：(A)LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8ImmCorrDICM27多浸没式物镜。(E)Fluar5x/0.25M27干式物镜。
图10：(B)左图：LDLCIPlan-Apochromat25x/0.8ImmCorrDICM27多浸没式物镜；右图：具有10x0.45N.A.Plan-Apochromat的ZeissLSM780共聚焦显微镜。
图12：具有10x0.45N.A.Plan-Apochromat的ZeissLSM780共聚焦显微镜。
以上描述的多种方法和技术提供实施本发明的许多方式。当然，应当理解不是必然地所有描述的目的或优势都可根据本文描述的任一特定实施方案实现。因此，例如，本领域技术人员将知晓方法可以以实现或优化如本文教导的一种优势或一组优势的方式进行，而不必然实现如本文教导或提出的另外的目的或优势。本文提到多种替代选择。应当理解一些优选的实施方案具体地包括一种、另一种或几种特征，而其他实施方案具体地排除一种、另一种或几种特征，而仍然其他实施方案通过包括一种、另一种或几种有益特征减少特定特征。
此外，本领域技术人员将知晓来自不同实施方案的不同特征的适用性。相似地，以上讨论的不同元素、特征和步骤，以及每个这样的元素、特征或步骤的其他已知的等同物，可被本领域普通技术人员以多种组合采用以进行根据本文描述的原理的方法。在不同实施方案中，该不同元素、特征和步骤之中的一些将被具体地包括且其他将被具体地排除。
尽管在某些实施方案和实施例环境下公开了本申请，本领域技术人员将理解本申请的实施方案从具体公开的实施方案延伸到其他替代性实施方案和/或用途和其修改形式和等同物。
在一些实施方案中，术语“一(a)”、“一(an)”、“该(the)”和描述本申请的特定实施方案的上下文(尤其是以下权利要求的某些的上下文)中使用的相似的指代，可解释为覆盖单数形式和复数形式两者。本文中值的范围的列举仅预期用作具体地提及落入所述范围的每个单独值的速记方法。除非本文另外指明，否则将每一个个体值并入到说明书中，如同其在本文被单独列出。除非本文另外指明或另外与上下文明显矛盾，否则本文所描述的全部方法可以以任何合适顺序进行。关于本文某些实施方案所提供的任何以及全部实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅预期更好地说明本申请并且对另外要求保护的本申请的范围不造成限制。说明书中的语言不应解释为表明任何未要求保护的要素对实践本申请是必不可少。
本文描述了本申请的优选实施方案，包括本发明人已知用于进行本申请的最佳模式。在阅读前述描述后，那些优选的实施方案的变化形式对于本领域普通技术人员将变得明显。预期技术人员可视情况而定采用此类变化形式，并且本申请可以以不同于本文本具体描述的方式实施。因此，本申请的许多实施方案包括此处所附的被适用法律许可的权利要求中列举的主题的所有修改形式和等同物。此外，除非本文另外指明或另外与上下文明显矛盾，否则以上描述的要素以其所有可能的变化形式的任何组合被本申请包含。
本文引用的所有专利、专利申请、专利申请的公开物和其他材料，诸如文章、书籍、说明书、出版物、文件、事物和/或类似物，在此通过该引用整体并入本文用于所有目的，除非与它们相关的任何起诉文件历史、它们的任一个与本文件不一致或矛盾、或它们的任一个可能对与本文件相关的现在的或以后的权利要求的最大范围具有限制作用。通过示例的方式，如果与任何并入的材料相关的术语的描述、定义和/或使用和与本文件相关的术语的描述、定义和/或使用之间的存在任何不一致或矛盾，则应以本文件中的术语的描述、定义和/或使用为准。
最后，应当理解，本文公开的本申请的实施方案是对本申请的实施方案的原理的说明。可被使用的其他修改形式可在本申请的范围内。因此，通过示例的方式但不限制，本申请的实施方案的替代性配置可根据本文的教导被利用。因此，本申请的实施方案不限于如精确显示和描述的那些。
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Claims (69)

1.一种用于修改组织的结构和/或光学特征的方法，所述方法包括：
将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液施加到所述组织，从而形成固定的组织，以及
将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液施加到所述固定的组织，从而形成水凝胶处理的组织。
2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液施加到所述固定的组织。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述水凝胶单体溶液包含从1％到20％的丙烯酰胺。
4.根据权利要求3所述的方法，所述方法还包括：
将所述水凝胶处理的组织放置到基本气密的室中，以及
将氮气引入到所述基本气密的室中，从而形成脱气的组织。
5.根据权利要求4所述的方法，所述方法还包括在从15℃到60℃孵育所述脱气的组织，从而形成孵育的组织。
6.根据权利要求5所述的方法，所述方法还包括用PBS洗涤所述孵育的组织，从而形成洗涤且孵育的组织。
7.根据权利要求6所述的方法，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液施加到所述洗涤且孵育的组织，从而形成透明化的组织。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述去垢剂溶液包含在0.01M到1MPBS中的从1％到30％的SDS。
9.根据权利要求8所述的方法，所述方法还包括将PBS施加到所述透明化的组织，从而形成透明化且洗涤的组织。
10.根据权利要求9所述的方法，所述方法还包括将成像介质施加到所述透明化且洗涤的组织，其中所述成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；以及任选地(5)氢氧化钠。
11.根据权利要求10所述的方法，其中1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述组织获自活组织检查。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述组织是癌性的或癌前的。
14.一种用于免疫染色组织的方法，所述方法包括将包含一抗的溶液施加到根据权利要求9所述的透明化且洗涤的组织，从而形成抗体结合的组织。
15.根据权利要求14所述的方法，所述方法还包括用缓冲溶液冲洗所述抗体结合的组织。
16.根据权利要求15所述的方法，所述方法还包括将包含二抗的溶液施加到已经用所述缓冲溶液洗涤的所述抗体结合的组织，其中所述二抗用可视化的标记物标记。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述可视化的标记物是荧光性的。
18.根据权利要求14所述的方法，其中所述一抗用可视化的标记物标记。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述可视化的标记物是荧光性的。
20.根据权利要求14-18中任一项所述的方法，其中所述组织获自活组织检查。
21.一种用于可视化免疫染色的组织的方法，所述方法包括：
利用显微镜可视化根据权利要求16所述的方法制备的免疫染色的组织。
22.根据权利要求21所述的方法，其中利用所述显微镜进行选自由以下组成的组的一种形式的显微术：共聚焦显微术、转盘式显微术、落射荧光显微术、光场显微术、光片显微术、多光子显微术。
23.一种用于原位修改组织的结构和/或光学特征的方法，所述方法包括：
将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液引入到受试者的循环系统中，从而在所述受试者内形成固定的组织；以及
将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液引入到所述受试者的循环系统中，从而在所述受试者内形成水凝胶处理的组织。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述水凝胶单体溶液包含从1％到20％的丙烯酰胺。
25.根据权利要求24所述的方法，所述方法还包括将包含PBS的溶液引入到所述受试者的循环系统中，从而形成PBS洗涤的组织。
26.根据权利要求25所述的方法，所述方法还包括：
将所述受试者放置到基本气密的室中，以及
将氮气引入到所述室中，从而形成脱气的受试者。
27.根据权利要求26所述的方法，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液引入到所述脱气的受试者的循环系统中。
28.根据权利要求27所述的方法，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液引入到所述受试者的循环系统中，从而在所述受试者内形成透明化的组织。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述去垢剂溶液包含在从0.01M到1M的PBS中的大约1％到30％的SDS。
30.根据权利要求29所述的方法，所述方法还包括将PBS引入到所述受试者的循环系统中，从而在所述受试者内形成透明化且洗涤的组织。
31.根据权利要求30所述的方法，所述方法还包括将成像介质引入到所述受试者的循环系统中，其中所述成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。
32.根据权利要求31所述的方法，其中1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述组织包括脑组织。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述组织包括脊髓组织。
35.根据权利要求32所述的方法，其中(1)通过与泵连接的第一管将所述溶液的一种或更多种引入到所述受试者的循环系统中；(2)通过第二管将所述溶液的一种或更多种从所述受试者的循环系统移出，所述第二管与一种或更多种溶液被收集在其中的容器流体连通；以及任选地(3)所述泵从所述容器抽吸一种或更多种收集的溶液，并通过所述第一管将所述一种或更多种溶液引入到所述受试者的循环系统中。
36.一种用于原位免疫染色组织的方法，所述方法包括：
将包含一抗的溶液引入到已对其应用根据权利要求30所述的方法的受试者的循环系统中。
37.根据权利要求36所述的方法，所述方法还包括将缓冲溶液引入到所述受试者的循环系统中。
38.根据权利要求37所述的方法，所述方法还包括将包含二抗的溶液引入到所述受试者的循环系统中，其中所述二抗用可视化的标记物标记。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述可视化的标记物是荧光性的。
40.根据权利要求36所述的方法，其中所述一抗用可视化的标记物标记。
41.根据权利要求39所述的方法，其中所述可视化的标记物是荧光性的。
42.一种用于原位可视化免疫染色的组织的方法，所述方法包括：
利用显微镜可视化根据权利要求38的方法制备的已与组织缔合的标记物。
43.一种组合物，所述组合物包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。
44.根据权利要求43所述的组合物，其中1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。
45.一种用于原位修改脑组织的结构和/或光学特征的方法，所述方法包括：
将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液引入到受试者的脑脊髓液(CSF)中，从而在所述受试者内形成固定的脑组织；以及
将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液引入到所述受试者的CSF中，从而在所述受试者内形成水凝胶处理的脑组织。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述水凝胶单体溶液包含从1％到20％的丙烯酰胺。
47.根据权利要求46所述的方法，所述方法还包括将包含PBS的溶液引入到所述受试者的CSF中，从而形成PBS洗涤的脑组织。
48.根据权利要求47所述的方法，所述方法还包括：
将所述受试者或所述受试者的脑放置到基本气密的室中，以及
将氮气引入到所述室中，从而形成脱气的受试者。
49.根据权利要求48所述的方法，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液引入到所述脱气的受试者的CSF中。
50.根据权利要求49所述的方法，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液引入到所述受试者的CSF中，从而在所述受试者内形成透明化的脑组织。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述去垢剂溶液包含在从0.01M到1M的PBS中的大约1％到30％的SDS。
52.根据权利要求51所述的方法，所述方法还包括将PBS引入到所述受试者的CSF中，从而在所述受试者内形成透明化且洗涤的脑组织。
53.根据权利要求52所述的方法，所述方法还包括将成像介质引入到所述受试者的CSF中，其中所述成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。
54.根据权利要求53所述的方法，其中1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。
55.根据权利要求45-54中任一项所述的方法，其中所述溶液的一种或更多种经由颅内脑分流器施用。
56.根据权利要求45-54中任一项所述的方法，其中所述溶液的一种或更多种经由被插入到硬脑膜下嗅球正上方的区域内的颅内脑分流器施用。
57.一种用于原位修改脊髓组织的结构和/或光学特征的方法，所述方法包括：
将包含多聚甲醛(PFA)的固定溶液引入到受试者的脑脊髓液(CSF)中，从而在所述受试者内形成固定的脊髓组织；以及
将包含丙烯酰胺和磷酸盐缓冲盐水(PBS)的水凝胶单体溶液引入到所述受试者的CSF中，从而在所述受试者内形成水凝胶处理的脊髓组织。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述水凝胶单体溶液包含从1％到20％的丙烯酰胺。
59.根据权利要求58所述的方法，所述方法还包括将包含PBS的溶液引入到所述受试者的CSF中，从而形成PBS洗涤的脊髓组织。
60.根据权利要求59所述的方法，所述方法还包括：
将所述受试者放置到基本气密的室中，以及
将氮气引入到所述室中，从而形成脱气的受试者。
61.根据权利要求60所述的方法，所述方法还包括将包含2,2'-偶氮双[2-(2-咪唑啉-2-基)丙烷]二盐酸盐的光引发剂溶液引入到所述脱气的受试者的CSF中。
62.根据权利要求61所述的方法，所述方法还包括将包含十二烷基硫酸钠(SDS)的去垢剂溶液引入到所述受试者的CSF中，从而在所述受试者内形成透明化的脊髓组织。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述去垢剂溶液包含在从0.01M到1M的PBS中的大约1％到30％的SDS。
64.根据权利要求63所述的方法，所述方法还包括将PBS引入到所述受试者的CSF中，从而在所述受试者内形成透明化且洗涤的脊髓组织。
65.根据权利要求64所述的方法，所述方法还包括将成像介质引入到所述受试者的CSF中，其中所述成像介质包含：(1)1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺，(2)磷酸盐缓冲液；(3)吐温-20；(4)叠氮化钠；及任选地(5)氢氧化钠。
66.根据权利要求65所述的方法，其中1-N,3-N-二(2,3-二羟丙基)-5-[N-(2,3-二羟丙基)乙酰氨基]-2,4,6-三碘苯-1,3-二甲酰胺或5-(N-2,3-二羟丙基乙酰氨基)-2,4,6-三碘-N,N′-二(2,3-二羟丙基)异酞酰胺的浓度为从10％到100％w/v。
67.根据权利要求57-66中任一项所述的方法，其中所述溶液的一种或更多种经由颅内脑分流器施用。
68.根据权利要求57-66中任一项所述的方法，其中所述溶液的一种或更多种经由被插入到背侧下丘正上方的颅内脑分流器施用。
69.一种如说明书中所描述的方法。
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