KR101888782B1 - 피부 조직의 투명화 방법, 이를 이용한 피부 조직의 3차원 영상화 방법 및 평가 및 진단 방법 - Google Patents
피부 조직의 투명화 방법, 이를 이용한 피부 조직의 3차원 영상화 방법 및 평가 및 진단 방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 피부를 생검하는 단계; 상기 피부의 표피 조직을 분리하는 단계;
상기 표피 조직을 고정화하는 단계; 상기 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계; 진공상태에서 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계; 및 전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계; 를 포함하는 피부 조직의 투명화 방법, 이를 이용한 3차원 영상화 방법 및 진단 및 평가방법에 관한 것이다.
본 발명은, 피부 조직의 투명화 시간을 단축시키고, 이러한 피부 조직의 투명화를 매개로 절편과정 없이 온전한 내구 분자구조에 대한 고해상도 3차원 영상 및 정보를 제공할 수 있다.
상기 표피 조직을 고정화하는 단계; 상기 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계; 진공상태에서 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계; 및 전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계; 를 포함하는 피부 조직의 투명화 방법, 이를 이용한 3차원 영상화 방법 및 진단 및 평가방법에 관한 것이다.
본 발명은, 피부 조직의 투명화 시간을 단축시키고, 이러한 피부 조직의 투명화를 매개로 절편과정 없이 온전한 내구 분자구조에 대한 고해상도 3차원 영상 및 정보를 제공할 수 있다.
Description
본 발명은, 피부 조직의 투명화 방법, 이를 이용한 피부 조직의 3차원 영상화 방법 및 이를 이용한 평가 및 진단 방법에 관한 것이다.
사람피부는 외부환경으로부터 체내 공간을 분리시켜 주는 장벽기능을 하기에 물질 이동이 원활하지 않고, 비동질적인 조직 구성을 보이며, 다량의 세포외기질(extracellular matrix) 성분을 가진 치밀한 장기이다. 따라서 피부 내부의 임상정보를 얻기 위해서는 조직검사를 통해 피부 일부를 떼어낸 후 조직절편 과정(tissue section)을 거쳐 광원이 투과 가능하며, 선택적 표지자의 침투 및 결합이 용이하게 하는 것이 필수적이다.
예를 들어, 피부신경 조직검사에 기반한 기존의 말초신경병 진단 기준인 EFNS 가이드라인(Eur J Neurol 2005; 12: 747-758)에서 제시한 바와 같이, 피부 표본을 50~80㎛ 두께로 절편 후 얻은 피부 단면 이미지를 이용하여 특정 분위에 따라 분할된 표피-진피 경계부(dermoepidermal junction, DE junction)를 실선으로 통과한 말초신경섬유들만을 유의한 것으로 여기고 진단을 위한 집계에 이용한다. 이러한 방법은, 피부절편에서 얻은 2차원 평면 영상을 해석하여 얻어지기에, 복잡한 신경말단구조를 온전히 파악하는데 한계가 있으며, 절편 과정에서 발생하는 정보왜곡 및 3차원 공간정보의 2차원 이미징으로 인해 발생하는 정보 소실 또한 피할 수 없다. 이러한 생체조직 내 입체구조물의 2차원 영상화에 따른 한계를 개선하고자 고해상도의 3차원 영상기법이 제시되었다.
단일 세포 수준의 해상력(single-cell resolution)을 가지는 3차원 영상기법은 연구하고자 하는 생물체 또는 특정 장기를 구성하는 미세한 분자들의 체계적인 구조 및 연속성을 이해하는데 있어서 필수적이지만, 동시에 기술적 한계점을 가지고 있다.
특정 생체 공간 내 3차원 정보를 영상화하기 위해서는, 연속조직절편과 특정표지자 라벨링을 통해 연속적인 이차원 정보를 생산하고, 이를 다시 3차원으로 재구성해야하므로, 많은 시간과 노력이 소요되고, 3차원 영상의 재구성 과정에서 오차의 발생이 높은 문제점이 있다.
최근에는 생물체 자체 또는 해당 생물체 내 장기 전체를 투명화하여 특정 세포 구조와 신경계의 연속적인 분포를 영상화한 연구가 보고되었으며(Nature 2013; 497: 332-337 외 수 편), 조직 투명화를 통한 3차원적 온전한 생체 구조 영상화를 위해서는, 10일 이상에서 수 주 내지는, 수 개월에 이르기까지 많은 시간을 필요로 하므로, 빠른 진단이 필요한 임상 현장에 적용하기에는 기술적 어려움이 있다.
본 발명은 전술한 바와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 피부 조직 내의 단백질 구조의 손상을 최소화하고, 종래 기술에 비하여 짧은 기간 내에 피부 조직을 투명화할 수 있는, 피부 조직의 투명화 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법을 이용하는 피부 조직용 진단키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법을 이용하여, 피부 조직 내의 특정 분자구조물의 입체적인 분포를 3차원적으로 영상화할 수 있는, 피부 조직의 3차원 영상화 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은, 본 발명에 의한 피부 조직의 3차원 영상화 방법을 이용하여, 임상 현장에서 신속하게 적용가능한 진단 및 평가방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 하나의 양상은,
피부를 생검하는 단계; 상기 피부의 표피 조직을 분리하는 단계; 상기 표피 조직을 고정화하는 단계; 상기 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계; 진공상태에서 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계; 및 전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계를 포함하는, 피부 조직의 투명화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 표피 조직을 고정화하는 단계는, 조직 고정화 용액 내에서 0 ℃ 내지 30 ℃의 온도 및 1시간 내지 15시간 동안 상기 표피 조직을 고정화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계는, 3 ℃ 내지 5 ℃에서 1시간 내지 15시간 동안 상기 히드로겔 단량체 용액을 주입하고, 상기 단량체 용액은, 1 중량% 내지 20 중량%의 아크릴아마이드(acrylamide); 및 중합반응유도제를 포함하고, 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계는, -100 kPa 내지 -50 kPa 압력의 진공 상태 및 20 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 1시간 내지 5시간 동안 상기 히드로겔 단량체를 중합할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계는, 10 ℃ 내지 50 ℃의 온도 및 1.0 Å 내지 3 Å의 전류를 일정하게 유지하면서 전기영동에 의해 상기 지질을 제거하고, 1시간 내지 15시간 동안 상기 지질을 제거할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계; 상기 진공상태에서 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계; 및 전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계는, 0.5일 내지 2일 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 양상은, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법을 이용하는 피부 조직용 진단키트에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 양상은,
피부를 생검하는 단계; 상기 피부의 표피 조직을 분리하는 단계; 상기 표피 조직을 고정화하는 단계; 상기 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계; 진공상태에서 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계; 전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계; 상기 지질이 제거된 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계; 상기 염색된 표피 조직의 굴절계수를 보정하는 단계; 및 상기 굴절계수가 보정된 표피 조직의 3차원 영상을 촬영하는 단계; 를 포함하는, 피부 조직의 3차원 영상화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 선택적 표지자를 염색하는 단계는, 상기 지질이 제거된 피부의 표피 조직에 면역형광표지자를 처리하고, 원심력을 단계적으로 증가시켜 염색할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 선택적 표지자를 염색하는 단계는, 제1 면역형광표지자를 처리하고, 3000 rpm, 3500 rpm, 4000 rpm, 4500 rpm, 5000 rpm 및 5500 rpm의 원심력을 30분 단위로 단계적으로 증가시켜 염색하는 제1 염색 단계; 및 제2 면역형광표지자를 처리하고, 3000 rpm, 3500 rpm, 4000 rpm, 및 4500 rpm의 원심력을 30분 단위로 단계적으로 증가시켜 염색하는 제2 염색 단계; 를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따라, 상기 염색된 표피 조직의 굴절계수를 보정하는 단계는, 굴절계수보정용 용액(refractive index matching solution, RIMS) 내에서 20 ℃ 내지 25 ℃에서 0.5시간 내지 1.5시간 동안 상기 염색된 표피 조직의 굴절계수를 보정할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양상은, 본 발명에 의한 피부 조직의 3차원 영상화 방법으로 표피 조직의 3차원 영상을 획득하는 단계; 및 상기 3차원 영상을 분석하는 단계; 를 포함하는, 표피 조직의 3차원 영상을 이용한 진단 및 평가방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 상기 진단 및 평가방법은, 말초신경병, 피부 색소질환, 피부노화, 표피의 병적인 변화가 수반되는 피부질환들 중 1종 이상을 진단 및 평가할 수 있다.
본 발명은, 세포외기질이 풍부한 장기이고, 얇은 절편을 통해서 단면으로만 관찰 가능한 것으로 알려진 피부 조직을 대상으로, 절편 과정 없이 조직 내 온전한 분자구조물의 3차원 입체 형상을 영상화하는 것이 가능하고, 이를 이용하여 피부 조직에 대한 정보 분석 및 피부 또는 신경 질환에 대한 진단 또는 치료 방법을 제시할 수 있다.
본 발명은, 불투명한 피부를 절편과정 없이 짧은시간 이내에 투명화가 가능하고, 투명화된 피부 조직 내에 선택적 표지자의 침투율을 증가시킬 수 있다.
본 발명은, 피부신경 조직검사를 통한 말초신경병의 기존 진단기준이 피부조직의 절편 과정 및 제한된 범위의 평면 영상분석에 기반한다는 한계를 개선하여, 말초신경병에 대한 새로운 확진 방법(confirmative diagnosis)을 제시할 수 있다. 이외에도 기미(melasma)와 색소침착(pigmentation)과 같은 피부 색소질환의 진단 및 치료효과의 판정뿐만 아니라 레이저나 색소화장품과 같은 제품의 개발 및 효과 분석에 적용할 수 있다. 나아가 피부노화 정도 진단 및 관련 항노화 제품의 개발 및 효과 분석에 이용할 수 있다. 추가적으로 표피의 두드러진 병적인 변화가 수반되는 아토피 피부염 및 건선 환자의 진료와 관련하여 표피의 손상 정도 평가 및 경과 예측, 더불어 관련 치료제 및 특수 보습제의 개발 및 효과 분석에 활용할 수 있다.
도 1은, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법의 공정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 피부 조직의 3차원 영상화 방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270)에서 c-PRESTO 공정을 수동확산(passive diffusion)과 비교하여 예시적으로 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 진단 및 평가방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 실시예 1에 따라 1.0 M 소금분리피부방법(Sodium Split Skin Test, SSST)을 이용하여 분리된 사람 피부 표본의 표피(epidermis)와 진피(dermis)를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 실시예 1에 따라, 본 발명에 의한 전기영동조직투명화 과정 전의 표피 (A, C) 및 전기영동조직투명화 과정 후의 표피 (B, D)를 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 실시예 1에 따라, 본 발명에 의한 전기영동조직투명화 시간을 달리 하였을 때, (A) 투명화율의 변화 및 (B) 조직 면적의 변화를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 실시예 1에 따라, 전기영동조직투명화 시간을 달리 한 상태로 굴절계수정합용액에 넣었을 때 (A, B) 시간대 별 투명화율의 변화 및 (B, C) 시간 상수인 Tau 값을 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 실시예 1에 따라, (A) 조직투명화 및 굴절계수 보정 전의 표피 및 (B) 조직투명화 및 굴절계수보정 이후의 표피의 광학 이미지를 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 실시예 1에 따라, 온전한 표피조직 전체를 대상으로, 그 안에 분포하고 있는 말초신경섬유들의 입체적인 정보를 3차원 고해상도 영상을 나타낸 것으로, (A) PGP9.5 염색, (B) DAPI 염색, (C) 결합 이미지(Merged image), (D) 이미지 (C)의 x, y, z-축을 기준으로, x-좌표 값(각각 100㎛, 200㎛, 300㎛)에 해당하는 표피 단면(y-z plane) 내 말초신경섬유의 분포 양상이다.
도 12는, 본 발명의 실시예 1에 따라, 사람 표피 내 말초신경섬유들의 3차원 영상에서 공초점레이저현미경 상 200배 배율 하에 무작위적으로 3개의 위치를 선정하여 촬영한 영상을 기반으로 평균 표피 내 말초신경섬유밀도를 산출한 값을 나타낸 것이다.
도 13은, 본 발명의 실시예 1에 따라, 결절성 양진(prurigo nodularis)에 관련된, (A) 병변 주변부 및 (B) 병변부의 표피 내 말초신경섬유 영상 및 정량분석 수치를 나타낸 것이다.
도 14는, 본 발명의 실시예 1에 따라, 사람 표피 내 멜라닌세포들(melanocytes)의 3차원 영상화한 것으로, (A) Melan-A 염색 및 (B) Melan-A 및 DAPI 염색을 나타낸 것이다.
도 15는, 본 발명의 실시예 2에 따라, Eosin 염색을 추가하여, 표피 전체 공간 및 표피 내 말초신경섬유들을 3차원 영상화한 것으로, (A) Eosin 염색, (B) PGP9.5, DAPI 및 eosin 염색, (C) Eosin 염색, y-z 면(plane view), (D) DAPI 및 eosin 염색, y-z 면, (E) PGP9.5, DAPI 및 eosin 염색, y-z 면을 나타낸 것이다.
도 2는, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법의 공정을 예시적으로 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 피부 조직의 3차원 영상화 방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 4는, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270)에서 c-PRESTO 공정을 수동확산(passive diffusion)과 비교하여 예시적으로 나타낸 것이다.
도 5는, 본 발명의 일 실시예에 따른, 본 발명에 의한 진단 및 평가방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것이다.
도 6은, 본 발명의 실시예 1에 따라 1.0 M 소금분리피부방법(Sodium Split Skin Test, SSST)을 이용하여 분리된 사람 피부 표본의 표피(epidermis)와 진피(dermis)를 나타낸 것이다.
도 7은, 본 발명의 실시예 1에 따라, 본 발명에 의한 전기영동조직투명화 과정 전의 표피 (A, C) 및 전기영동조직투명화 과정 후의 표피 (B, D)를 비교하여 나타낸 것이다.
도 8은, 본 발명의 실시예 1에 따라, 본 발명에 의한 전기영동조직투명화 시간을 달리 하였을 때, (A) 투명화율의 변화 및 (B) 조직 면적의 변화를 나타낸 것이다.
도 9는, 본 발명의 실시예 1에 따라, 전기영동조직투명화 시간을 달리 한 상태로 굴절계수정합용액에 넣었을 때 (A, B) 시간대 별 투명화율의 변화 및 (B, C) 시간 상수인 Tau 값을 나타낸 것이다.
도 10은, 본 발명의 실시예 1에 따라, (A) 조직투명화 및 굴절계수 보정 전의 표피 및 (B) 조직투명화 및 굴절계수보정 이후의 표피의 광학 이미지를 나타낸 것이다.
도 11은, 본 발명의 실시예 1에 따라, 온전한 표피조직 전체를 대상으로, 그 안에 분포하고 있는 말초신경섬유들의 입체적인 정보를 3차원 고해상도 영상을 나타낸 것으로, (A) PGP9.5 염색, (B) DAPI 염색, (C) 결합 이미지(Merged image), (D) 이미지 (C)의 x, y, z-축을 기준으로, x-좌표 값(각각 100㎛, 200㎛, 300㎛)에 해당하는 표피 단면(y-z plane) 내 말초신경섬유의 분포 양상이다.
도 12는, 본 발명의 실시예 1에 따라, 사람 표피 내 말초신경섬유들의 3차원 영상에서 공초점레이저현미경 상 200배 배율 하에 무작위적으로 3개의 위치를 선정하여 촬영한 영상을 기반으로 평균 표피 내 말초신경섬유밀도를 산출한 값을 나타낸 것이다.
도 13은, 본 발명의 실시예 1에 따라, 결절성 양진(prurigo nodularis)에 관련된, (A) 병변 주변부 및 (B) 병변부의 표피 내 말초신경섬유 영상 및 정량분석 수치를 나타낸 것이다.
도 14는, 본 발명의 실시예 1에 따라, 사람 표피 내 멜라닌세포들(melanocytes)의 3차원 영상화한 것으로, (A) Melan-A 염색 및 (B) Melan-A 및 DAPI 염색을 나타낸 것이다.
도 15는, 본 발명의 실시예 2에 따라, Eosin 염색을 추가하여, 표피 전체 공간 및 표피 내 말초신경섬유들을 3차원 영상화한 것으로, (A) Eosin 염색, (B) PGP9.5, DAPI 및 eosin 염색, (C) Eosin 염색, y-z 면(plane view), (D) DAPI 및 eosin 염색, y-z 면, (E) PGP9.5, DAPI 및 eosin 염색, y-z 면을 나타낸 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 따라서, 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
본 발명은, 피부 조직의 투명화 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법은, 불투명하고 치밀하여 조직 투명화 및 선택적 표지자 투과가 어려운 피부 조직을 빠른시간 이내에 손상을 최소화하면서 투명화할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 도 1을 참조하여 설명하며, 도 1은, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것으로, 도 1에서 상기 피부 조직의 투명화 방법은, 피부를 생검하는 단계(S110); 피부의 표피 조직을 분리하는 단계(S120); 표피 조직을 고정화하는 단계(S130); 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계(S140); 히드로겔 단량체를 중합하는 단계(150); 히드로겔 단량체가 주입된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계(S160); 를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 피부를 생검하는 단계(S110)는, 포유류의 피부를 펀칭 생검하여 피부 표본을 획득하는 단계이다. 예를 들어, 상기 피부는 포유류의 전영역의 피부 중 일부분이며, 바람직하게는 인간의 피부일 수 있다.
예를 들어, 피부를 생검하는 단계(S110)에서 생검된 피부 표본은, 생검 이후에 바로 다음 단계로 진행되는 것이 바람직하지만, 액체 질소 내에서 보관 및/또는 냉장보관될 수 있다. 즉, 3차원 영상에서 분석 대상에 따라 손상/파괴를 최소화하기 위해서 적절하게 보관 방법을 선택할 수 있으며, 예를 들어, 말초신경섬유의 3차원 영상화인 경우에는, 액체질소 내에서 일정기간 보관하거나 또는 멜라닌형성세포의 3차원 영상화인 경우에는, 멜라닌형성세포의 저온 노출에 따른 손상/파괴를 방지하기 위해서 보관 용액, 예를 들어, 생리식염수 용액 내에서 단기간 냉장 보관될 수 있다.
본 발명의 일 예로, 피부의 표피 조직을 분리하는 단계(S120)는, 피부를 생검하는 단계(S110)에서 획득한 피부 표본에서 표피(epidermis)를 진피(dermis) 이하의 층으로부터 분리하는 단계이며, 이를 통해 얇은 표피조직으로 대상을 특정화함으로써 보다 조직투명화기술을 효과적으로 적용할 수 있고, 선택적 표지자 투과를 용이하게 한다는 점에서 의의를 가진다.
예를 들어, 인간 피부는 여러 층들로 이루어져 있으며, 이들은 크게 가장 바깥쪽의 각질층을 포함하는 표피와 그 하부의 진피로 나눌 수 있다. 상기 진피는 주로 세포외기질로 이루어진 치밀한 조성을 보이는 반면, 상기 표피는 중간섬유(intermediate filament)의 일종인 각질(keratin) 및 이를 생성하는 각질형성세포(keratinocyte)들이 부착연접(adherent junction), 밀착연접(tight junction) 등의 강력한 연접 구조를 통해 치밀한 조성을 이루고 있다. 하지만, 표피는 진피에 비해 지질 함량이 높고, 세포외기질 성분이 적을 뿐 아니라 절대적인 두께가 얇아 조직투명화 기법을 적용했을 때, 빠른시간 안에 더 높은 투명화율을 달성할 수 있다.
예를 들어, 사람 피부에서 진피 이하 부위를 선택적으로 분리하고 표피를 대상으로 조직투명화를 진행한다면, 대상 조직으로부터 보다 빠른 시간 안에 효과적으로 내부의 지질을 제거 할 수 있고, 촬영 대상의 두께 자체가 얇아지면서 투과한 빛의 산란이 감소되므로, 광학적 촬영기구를 통한 영상화가 더욱 용이할 수 있다. 더욱이, 절대 두께가 얇아지고, 지질의 제거로 인한 공극율(porosity)이 커지면서, 항체와 같은 선택적 표지자의 침투는, 결합 조직의 최심부까지 이루어질 수 있다.
예를 들어, 피부의 표피 조직을 분리하는 단계(S120)는, 1.0 M 소금분리피부 (sodium split skin test, SSST) 방법을 이용하여 표피를 진피로부터 분리할 수 있고, 표피 조직의 분리 시간을 단축시킬 수 있다.
예를 들어, 상기 피부 표본을 1.0 M 염화나트륨(NaCl) 수용액에 넣고, 0 ℃ 내지 6 ℃; 또는 3 ℃ 내지 5 ℃의 냉장 환경 하에서 10시간 이상; 10시간 내지 48시간 동안; 10시간 내지 15시간; 또는 24시간 내지 48시간 동안 셰이킹(shaking)하면서 표피 및 진피를 분리할 수 있다.
예를 들어, 피부의 표피 조직을 분리하는 단계(S120)에서 분리 시간은, 피부 표본에 따라 적절하게 선택할 수 있으며, 예를 들어, 손 및 발 이외의 피부 표본은 10시간 내지 15시간 동안 염화나트륨 수용액 안에서 셰이킹 후 표피를 진피로부터 손상 없이 분리할 수 있으며, 이 과정에서는 용액 교환이 필요하지 않다. 예를 들어, 손 및 발의 피부 또는 병적인 상황으로 표피가 비후된 피부 표본인 경우에는, 24시간 내지 48시간 동안에 2회 내지 3회의 염화나트륨 수용액 교환을 한 후, 표피를 진피로부터 온전히 분리할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 도 2를 참조하여 설명하며, 도 2는 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법의 공정을 예시적으로 나타낸 것으로, 도 2의 A에서 표피 조직을 고정화하는 단계(S130)는, 분리하는 단계(S120)에서 진피 이하의 피부 조직과 분리된 표피 조직을 조직 고정화 용액 내에서 고정화하는 단계이다. 예를 들어, 도 2의 A를 참조하면, 조직 고정화 용액 내에서 0 ℃ 내지 30 ℃의 온도; 0 ℃ 내지 25 ℃의 온도; 0 ℃ 내지 10 ℃; 또는 2 ℃ 내지 5 ℃의 온도에서 1시간 내지 15시간; 2시간 내지 12시간; 또는 2시간 내지 5시간; 동안 상기 피부 조직을 고정화할 수 있다.
예를 들어, 상기 고정화 용액은, 포름알데하이드를 포함하는 용액이며, 4 % 파라포름알데하이드(pafaformaldehyde, PFA) 용액, 또는 잠보니 용액(zamboni solution)일 수 있다.
예를 들어, 상기 고정화 용액은, 표피 조직에서 분석 대상에 따라 적합한 고정화 용액을 선택할 수 있으며, 분석 대상이 표피 내 말초신경섬유인 경우에는 잠보니 용액(zamboni solution)을 이용하여 고정화하고, 이는 말초신경섬유의 선상 구조가 끊어지지 않고(파편화가 적은), 연속된 형상을 유지한 채로 3차원 영상화를 가능하게 하며, 이를 통해 해당 신경섬유들의 입체적 분포 양상의 분석이 가능하다. 또한, 분석대상이 표피 내 멜라닌세포인 경우에는, 4% PFA 용액을 이용하여 고정화하여, 조직투명화를 거쳐 멜라닌세포의 고해상도 3차원 영상을 획득할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계(S140)는, 고정화하는 단계(S130)에서 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체(hydrogel monomer)를 주입(infusion)하는 단계이다.
예를 들어, 도 2의 B를 참조하여 설명하며, 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계(S140)는, 1 ℃ 내지 25 ℃; 1 ℃ 내지 10 ℃ 온도; 또는 2 ℃ 내지 5 ℃에서 1시간 내지 15시간; 5시간 내지 10시간; 또는 5시간 내지 8시간 동안 히드로겔 단량체 용액을 상기 고정화된 피부 조직 내에 주입하는 단계이다.
예를 들어, 상기 히드로겔 단량체 용액은, 1 중량% 내지 20 중량%; 또는 1 중량% 내지 5 중량%의 아크릴아마이드(acrylamide) 및 중합반응유도제 (polymerization initiator)를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 히드로겔 단량체를 중합하는 단계(S150)는, 진공상태에서 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계이다.
예를 들어, 도 2의 C를 참조하여 설명하며, 히드로겔 단량체를 중합하는 단계(S150)는, -100 kPa 내지 -50 kPa; 또는 -80 kPa 내지 -60 kPa 압력의 진공 상태 및 20 ℃ 내지 50 ℃의 온도; 또는 30 ℃ 내지 40 ℃의 온도에서 1시간 내지 5시간; 또는 2시간 내지 3시간 동안 상기 히드로겔 단량체를 중합할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계(S160)는, 전기영동을 이용하여 히드로겔 단량체의 주입 및 중합 과정을 거친 표피 조직을 전기영동과정을 통해 투명화하는 단계(electrophoretic tissue clearing, ETC)이다.
예를 들어, 도 2의 D 및 E를 참조하면, 전기 영동장치의 버퍼 용액, 온도 조절패널 및 전극을 포함하는 전기영동 챔버 내에서 10 ℃ 내지 50 ℃; 30 ℃ 내지 40 ℃; 또는 35 ℃ 내지 40 ℃의 온도 및 1.0 Å 내지 3 Å; 또는 1.5 Å 내지 2 Å의 전류를 일정하게 유지하면서 전기영동에 의해 표피 조직 내의 지질을 제거하여 투명화율을 증가시킬 수 있다. 즉 본 발명은, 상기 온도 및 상기 전류의 범위 내에서 온도 및 전류를 안정적으로 유지하면서, 표지 조직 내의 지질을 효과적이고 균일하게 제거하여 조직 손상 없이 높은 투명화율을 보다 짧은 시간 내에 달성할 수 있다.
예를 들어, 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계 (S160)는, 1시간 내지 10시간; 2시간 내지 8시간; 또는 2시간 내지 5시간 동안 지질을 제거할 수 있고, 상기 시간 범위 내에 포함되면, 전기영동조직투명화 효과를 최대화할 뿐만 아니라, 조직의 손상 및 변성 가능성을 최소화할 수 있다.
예를 들어, 히드로겔 단량체 주입 및 중합과정을 거친 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계(S160)는, 버퍼 용액 내에서 지질을 제거하며, 상기 버퍼 용액은, SDS (sodium dodecyl sulfate) 40g 및 200mM 붕산[boric acid in 1L dH2O (pH 8.5)]를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 상기 피부 조직의 투명화 방법은, 1일 내지 4일 동안; 1일 내지 3일 동안; 0.5일 내지 2일 또는 0.8일 내지 1.5일 동안 수행될 수 있으며, 바람직하게는 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계(S140); 히드로겔 단량체를 중합하는 단계(S150); 및 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계(S160)는, 0.5일 내지 2일 동안; 0.5일 내지 1.5일; 또는 0.5일 내지 1일 동안 수행될 수 있다.
본 발명은, 피부 조직의 3차원 영상화 방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법에 의해서 투명화된 피부 조직을 이용하여 선택적 표지자의 투과 깊이를 확장하여 표피 조직 내의 목표 구조물 정보를 효과적으로 시각화하고, 추가적인 투명화율을 증대시켜 절편과정 없이 피부 조직의 고해상도의 3차원 영상을 제공할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 도 3을 참조하여 설명하며, 도 3은, 본 발명에 의한 피부 조직의 3차원 영상화 방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것으로, 도 3에서 상기 피부 조직의 3차원 영상화 방법은, 피부를 생검하는 단계(S210); 피부의 표피 조직을 분리하는 단계(S220); 표피 조직을 고정화하는 단계(S230); 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계(S240); 히드로겔 단량체를 중합하는 단계(S250); 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계(S260); 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270); 염색된 표피 조직의 굴절계수를 보정하는 단계(S280); 및 3차원 이미지를 촬영하는 단계(S290); 를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 피부를 생검하는 단계(S210); 피부의 표피 조직을 분리하는 단계(S220); 표피 조직을 고정화하는 단계(S230); 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계(S240); 히드로겔 단량체를 중합하는 단계(S250); 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계(S260)는, 도 1 내지 도 2에서 언급한 바와 같다.
본 발명의 일 예로, 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270)는, 지질이 제거된 표피 조직에 선택적 표지자를 처리하고, 원심력을 가하여 선택적 표지자를 염색하는 단계이다.
예를 들어, 상기 선택적 표지자는, 1종 또는 2종 이상의 선택적 표지자를 포함할 수 있고, 상기 표피 조직 내의 목표 대상의 효과적인 시각화를 위해서 적절하게 선택할 수 있다. 바람직하게는 상기 선택적 표지자는, 면역형광표지자이며, 예를 들어, 표피 내 신경섬유(Intraepidermal nerve fiber)의 염색 시 PGP9.5(Protein gene product 9.5); 표피의 기저막(basement membrane), 즉 진피-표피 경계부 염색 시 제 4형 콜라겐; 멜라닌 세포(melanocyte) 염색 시 HMB-45, MART-1(melanoma antigen recognized by T-cell, Melan-A) 등을 이용할 수 있다. 상기 언급한 선택적 표지자 이외에도 대비 염색을 위해 핵염색인 DAPI stain 및 표피의 여러 층 중 각질층을 두드러지게 나타내기 위해 eosin stain 등을 선택적 표지자와 함께 이용할 수 있다.
예를 들어, 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270)는, 상기 지질이 제거된 표피 조직에 선택적 표지자를 처리하고, 원심분리기 내에서 원심력을 단계적으로 증가시켜 투과 효율을 증가시킬 수 있다. 또한, 선택적 표지자의 염색으로 표피 조직 내의 목표 구조물 정보를 효과적으로 시각화할 수 있다.
즉, 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270)는, 표피 조직의 절평과정을 거치지 않아 상대적으로 두꺼워진 조직 내에 선택적 표지자, 예를 들어, PGP9.5 등과 같은 선택적 표지자를 효과적으로 투과시키기 위해 원심분리기를 이용한 c-PRESTO 방법을 이용하는 것이다. 예를 들어, 도 4를 참조하면, 도 4의 A와 B는 일반적으로 면역형광표지자 라벨링을 할 때 이용되는 수동확산(passive diffusion) 방법을 이용하는 것을 나타낸 것이고, C는 본 발명에서 적용한 c-PRESTO 방법을 적용한 것을 나타낸 것이다. 도 4의 A에서 볼 수 있듯이, 상대적으로 얇은 두께의 피부 조직 절편에서는 선택적 표지자의 수동확산에 의한 투과에 어려움이 없으며, 선택적표지자 라벨링이 효과적으로 일어날 수 있다. 하지만 도 4의 B에서 볼 수 있듯이, 상대적으로 두께가 두꺼운 온전한 피부 조직을 대상으로는 선택적 표지자의 수동확산만으로는 투과할 수 있는 깊이에 제약을 받기 때문에, 선택적표지자 라벨링이 조직표면에 국한된다. 따라서 이를 해결하기 위해 도 4의 C에서 볼 수 있듯이, 원심분리기의 원심력에 근간한 압력을 가하여 선택적 표지자의 투과력을 높일 수 있으며, 본 발명의 전기영동조직투명화에 따른 효과와 더불어, 조직의 내부 전층에 걸쳐 고르게 선택적 표지자 라벨링을 할 수 있다.
예를 들어, 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270)는, 조직의 손상 및 변형을 최소화할 수 있는 원심력을 가하고, 바람직하게는 2000 rpm 내지 6000 rpm의 원심력을 단계적으로 가하고, 10분 내지 1시간 단위로 100 rpm 내지 1000 rpm 단위의 원심력을 단계적 증가시킬 수 있다. 이러한 원심력의 단계적 적용은, 비교적 크기가 작은 표피 조직 내에 선택적 표지자의 침투력을 증가시켜 효율적인 선택적 표지자의 염색을 가능하게 할 수 있고, 조직의 손상 및 변형을 최소화할 수 있다.
예를 들어, 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270)는, 동일하거나 또는 상이한 선택적 표지자 및 동일하거나 또는 상이한 조건에서 1회 이상 반복할 수 있다.
예를 들어, 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계(S270)는, 제1 면역형광표지자(primary antibody)를 처리하고, 3000 rpm, 3500 rpm, 4000 rpm, 4500 rpm, 5000 rpm 및 5500 rpm의 원심력을 30분 단위로 단계적으로 증가시켜 염색하는 제1 염색 단계(primary stain); 및 제2 면역형광표지자(secondary antibody)를 처리하고, 3000 rpm, 3500 rpm, 4000 rpm, 및 4500 rpm의 원심력을 30분 단위로 단계적으로 증가시켜 염색하는 제2 염색 단계; 를 포함할 수 있다. 예를 들어, 제1 염색 단계(secondary stain) 및 제2 염색 단계는, 동일하거나 또는 상이한 면역형광표지자를 적용할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 표피 조직의 굴절계수를 보정하는 단계(S280)는, 염색된 표피 조직을 굴절계수보정용 용액(RIMS)을 이용하여 굴절계수를 보정하는 단계이다.
예를 들어, 굴절계수보정용 용액내에서 20 ℃ 내지 25 ℃에서 0.5시간 내지 1.5시간 동안 상기 염색된 표피 조직의 굴절계수를 보정할 수 있다. 표피 조직은, 상이한 구성 성분에 따라 부위별로 상이한 굴절계수를 가지므로, 굴절계수의 보정을 통하여 표피 조직의 투명화율을 더 높일 수 있으며, 예를 들어, 투명화율이 200 % 이상 향상(분리된 직후의 표피 조직에 비교하여)되므로, 3차원 영상을 보다 효과적으로 촬영할 수 있다.
예를 들어, 굴절계수보정용 용액은, Histodenz 용액(Histodenz (40g) in 0.02 M phosphate buffer (pH 7.5) with sodium azide)일 수 있다.
본 발명의 일 예로, 3차원 이미지를 촬영하는 단계(S290)는, 굴절계수가 보정된 표피 조직의 3차원 영상을 촬영하는 단계이다. 예를 들어, 광학촬영기구를 이용하여 관련 영상을 획득하며, 상기 광학촬영기구로는, 공초점레이저 현미경, 다광자 레이저 스캐닝 현미경 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명은, 본 발명에 의한 피부 조직의 3차원 영상화 방법에서 획득한 이미지를 이용하는 진단 및 평가방법에 관한 것으로, 본 발명의 일 실시예에 따라, 본 발명에 의한 진당방법은, 온전한 표피 구조의 고해상도 3차원 영상을 이용하여, 분석 대상의 정량화 및 정성 분석이 가능하고, 피부 질환, 피부 상태 등에 대한 진단 및 치료에 대한 정확도를 높이고, 임상 현장에 신속하게 적용할 수 있다.
본 발명의 일 실시 예에 따라, 상기 기술은, 말초신경병(peripheral neuropathy)의 확진(confirmative diagnosis) 및 피부 색소질환의 진단과 치료효과의 판정, 관련 기기나 제품의 개발 및 효과 분석에 적용할 수 있다. 나아가 피부노화 진단 및 관련 제품의 개발 및 효과 분석에 이용할 수 있다. 부가적으로 표피의 병적인 변화가 수반되는 피부질환들과 관련하여 치료제의 개발 및 효과 분석에 활용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따라, 도 5를 참조하여 설명하며, 도 5는 본 발명에 의한 진단 및 평가방법의 흐름도를 예시적으로 나타낸 것으로, 도 5에서 상기 진단 및 평가방법은, 피부 조직의 3차원 영상을 획득하는 단계(S310); 및 3차원 영상을 분석하는 단계(S320); 를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 피부 조직의 3차원 영상을 획득하는 단계(310)는, 도 1 내지 도 4에서 언급한 바와 같고, 진단대상에 따라 선택적 표지자를 적용하여 3차원 영상을 획득할 수 있다.
본 발명의 일 예로, 3차원 영상을 분석하는 단계(S320)는, 피부 조직의 3차원 구조의 형태 또는 밀도, 및 선택적 표지자의 염색 부위 또는 염색 밀도 중 어느 하나를 분석하여 진단할 수 있다.
예를 들어, 3차원 영상을 분석하는 단계(S320)는, 말초신경병, 피부 색소질환, 피부노화, 표피의 병적인 변화가 수반되는 피부질환들 중 1종 이상을 진단하거나 진단을 내리는 데 중요한 결과를 제시할 수 있으며, 이외에도 중증도(severity) 및 예후 등을 평가하는 데 이용할 수 있다.
예를 들어, 상기 말초신경병은, 당뇨병성 말초신경병(diabetic neuropathy), 소섬유 말초신경병(small Fiber neuropathy), 맥관염의 신경병증(vasculitic neuropathy), HIV 신경병증(HIV neuropathy), 대상포진 후 신경병(post-herpetic neuropathy) 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 피부 색소질환은 피부 내 멜라닌 색소 침착이 저하하는 질환과 증가하는 질환들을 모두 포함하며, 전자에는 대표적으로 백반증(vitiligo), 진행 저색소반(progressive macular hypomelanosis) 등이 있고, 후자에는 대표적으로 기미(melasma), 흑색점(lentigo) 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 피부노화에 관련하여서는 내인성 노화(intrinsic aging)와 외인성 노화(extrinsic aging)에 따른 변화로 범위를 나눌 수 있으며, 전자에는 표피의 두께, 상피돌기(rete ridge)의 굴곡 정도 등이 있고, 후자에는 각질형성세포들의 3차원적인 배열 및 모양의 변화, 색소 침착의 증가 등일 수 있다. 특히 광노화(photo-aging)에 의한 외인성 피부노화의 경우, 각질형성세포들의 개별 모양 및 3차원 배열 변화를 통해 피부암으로의 진행 가능성을 예측할 수 있다.
예를 들어, 표피의 병적인 변화가 두드러지는 피부질환들로는, 피부 장벽 변화와 면역계 변화가 모두 수반되면서 장기간 지속되는 아토피 피부염(atopic dermatitis), 건선(psoriasis) 등일 수 있다.
예를 들어, 상기 진당방법은, 임상진료현장에서 사용 가능한 프로토콜을 확립할 수 있다. 예를 들어, 외래 및 진료현장에서 특정 질병이 임상적으로 의심되어 진단이 필요하거나, 경과의 추적관찰, 치료 효과 판정 등이 필요할 때, 본 발명에 의한 진당 방법을 이용하여 1일 이상; 2일 내지 5일; 또는 4일 내지 5일 이내에 환자의 피부조직으로부터 표피 내 특정 구조물의 3차원 영상을 획득하고, 이를 분석하여 임상진료에 신속하게 적용할 수 있다.
본 발명은, 본 발명에 의한 피부 조직의 투명화 방법을 이용하는 피부 조직 진단을 위한 진단키트에 관한 것이다.
본 발명의 일 예로, 상기 진단키트는, 신속하게 피부 조직의 투명화가 가능하므로, 현장 및 임상에서 피부 조직의 진단 및 평가를 위해 적용될 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고, 하기의 특허 청구의 범위, 발명의 상세한 설명 및 첨부된 도면에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있다.
실시예 1
(1) 표피 및 진피 분리
1.0 M 소금분리피부방법(sodium split skin test, SSST)을 이용하고, 원하는 부위에서 펀치 생검(punch biopsy)한 피부 표본(3mm x 3mm)을 4 ℃, 1.0 M 염화나트륨 수용액에 넣어, 4 ℃ 냉장 환경하에 셰이커 기기(shaker) 위에서 셰이킹하며, 12시간 이상(또는 overnight) 보관한 후 익일 조직 손상 없이 표피와 진피를 분리하였다. 그 결과는 도 6에 나타내었다. 실시예 1에서 사용한 사람 피부 표본은 고려대학교 의과대학 해부학 시신기증센터 (Korea University Anatomical Donation Program)에 연구 및 교육용 목적으로 기증된 37세 남자 시신(cadaver)의 복부 피부에서 생검하였으며, 당뇨와 같은 피부말초신경밀도가 감소할 만한 질환에 이환된 경력이 보고된 바 없었다.
(2) 조직 고정화
상기 소금분리피부방법을 통해 분리한 온전한 표피 표본을 고정액인 Zamboni solution에 넣고, 4℃ 냉장고에서 12시간 이상(또는 overnight) 셰이킹하여 고정화하였다.
(3) 생체 조직 투명화
Ⅰ) 히드로겔 단량체 주입
본 단계에서는 히드로겔 단량체 용액(4% acrylamide in 1X PBS, A4P0 수용액)을 이용하였다. 상기 A4P0 수용액을 pH 7.4-7.5 조건 하에서 중합반응유도제 (polymerization initiator)인 2,2'-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane]dihydrochloride (VA-044, Wako Pure Chemical Industires, Ltd. Tokyo, Japan)를 최종 농도가 0.25%가 될 수 있도록 첨가하여 혼합 후, 피부 표본을 넣어 4 ℃ 냉장환경에서 10시간 이상(또는 overnight) 셰이킹 하며 주입하였다.
Ⅱ) 중합
Ⅰ) 이후에, A4P0 용액에서 포매를 마친 후, -70 kPa, 37 ℃의 일정한 조건을 유지할 수 있는 진공챔버에서 2시간 동안 중합반응을 유도하였다.
Ⅲ) 전기영동조직투명화(ETC)과정:
중합과정 이후에 조직 투명화를 위한 전기영동조직투명화(ETC) 조건으로, 1.5 Å, 37.0 ℃ 값을 설정하여 일정하게 유지되도록 하며 버퍼 용액(SDS, sodium dodecyl sulfate, 40g + 200mM boric acid in 1L dH2O (pH 8.5)) 하에서 전기영동조직투명화 과정을 4시간 동안 진행하여 표피 조직 내 지질을 제거하였다. 전기영동조직투명화 과정 후에는 표면에 남아 있을 수 있는 잔여 지질 성분의 제거를 위해 PBS washing을 실시하였다.
전기영동조직투명화(ETC)과정의 전후의 표피 조직의 투명화를 비교하여, 도 7에 나타내었다. 도 7을 살펴보면, 전기영동조직투명화 과정을 통해 지질 성분을 제거한 이후의 조직(도 7의 B와 D)은, 지질 성분을 제거하기 이전(도 7의 A와 C)의 조직에 비하여 투명화가 증가된 것으로 확인할 수 있다.
또한, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간 동안 전기영동조직투명화 (ETC)과정을 거친 표피 조직에 대한 투명화도 및 면적 변화율을 측정하여 도 8에 나타내었다. 도 8을 살펴보면, 도 8의 (A)에서 볼 수 있듯이 전기영동조직투명화 과정의 시간을 변수로 실험을 진행한 결과 투명화 정도에 있어서 전기영동을 하지 않았을 때보다 전기영동을 한 군 모두에서 투명화율의 유의한 상승을 보였다. 전기영동을 시행한 군만을 대상으로 보면, 24시간 이상 전기영동을 한 경우 외에는 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 군 간의 유의한 차이가 없었다. 하지만 도 8의 (B)에서 볼 수 있듯이 굴절계수정합까지 과정을 마쳤을 시점에서 면적변화량을 비교한 결과 8시간, 12시간, 24시간 군에서 유의한 면적 감소가 나타났다. 따라서 전기영동조직투명화의 효과를 최대화 하면서, 조직 변성의 가능성을 최소화하고, 추후 3차원 영상 분석 시 목표 구조물의 밀도 등 정량화에 있어서의 정확성을 훼손하지 않기 위한 값인 4시간을 선택하였다.
또한, 2시간, 4시간, 8시간, 12시간 및 24시간 동안 전기영동조직투명화 (ETC) 과정을 거친 표피 조직을 굴절계수정합용액(refractory index matching solution, RIMS, histodenz (40g) in 0.02 M phosphate buffer (pH 7.5) with sodium azide)에 넣은 이후, 시간대 별 투명화율의 변화를 측정하고, 이를 통해 Tau 값을 계산하여 도 9에 나타내었다. 도 9의 (A)에서 볼 수 있듯이, 1시간, 2시간, 4시간, 24시간을 거쳐 단계적으로 투명화율이 증가하는 전기영동을 하지 않은 군(non-ETC)과는 달리, 전기영동조직투명화를 진행한 군에서는 모두, 1시간 내에 최대치의 투명화율에 도달하였다. 도 9의 (B)에서는 전기영동조직투명화를 진행한 군들만을 대상으로 굴절계수정합용액에 넣고 1시간 이내의 투명화율 변화를 세부적으로 살펴보았으며, 이를 통해 최대투명화율에 도달하는 시간과 연관된 상수인 Tau 값을 도출하였다. 이를 바탕으로 도 9의 (C)에서 볼 수 있듯이, 전기영동조직투명화를 진행한 시간 별 Tau 값을 비교할 수 있었으며, 전기영동조직투명화를 진행한 시간이 길수록 Tau 값이 낮게 나타났고, 결과적으로 전기영동조직투명화 2시간, 4시간, 8시간, 12시간, 24시간 군 모두에서 굴절계수정합용액에 들어간 후 30분에서 1시간 이내에 최대의 투명화값을 보였다.
(4) 면역형광표지자 라벨링
I) 선택적 표지자 투과 효율화 방법(c-PRESTO)의 적용
생체 조직 투명화 과정 다음으로, 사람 피부 표피 내 신경섬유를 염색하기 위해서 PGP9.5 항체(anti-human PGP9.5 antibody)로 면역형광표지자 라벨링(labeling)을 하였으며, 대비염색(counter stain)을 위해 DAPI를 추가로 라벨링 하였다.
상기 면역형광표지자 라벨링은, 원심분리기 내에서 총 3시간, 30분 단위로 3000/3500/4000/4500/5000/5500(rpm) 순서로 단계적으로 회전력을 증가시켜 진행하였다. 다음으로, 이차항체염색(Secondary stain)을 총 2시간, 30분 단위로 3000/3500/4000/4500(rpm) 순서로 단계적으로 회전력을 증가시켜 진행하였다.
II) 굴절계수보정
면역형광 표지자 라벨링 I) 이후에, 피부 표본을 굴절계수보정용액(refractory index matching solution, RIMS, histodenz (40g) in 0.02 M phosphate buffer (pH 7.5) with sodium azide)에 넣어 20 ℃ 내지 25 ℃에서 1시간 이상 셰이킹하며 유지하였다. 굴절계수 보정 시행 후의 피부 조직 표본의 투명화율(transparency) 변화를 광학측정장비[EVOS® FL Bioimaging system(Life Technologies, CA, USA), X20]를 이용하여 측정하였고, 도 10에 나타내었다.
도 10에서 볼 수 있듯이, 도 10의 (A)는 생체조직 투명화 공정으로 처리하기 전의 표피 표본이며, 도 10의 (B)는 전기영동조직투명화 과정 및 굴절계수정보정 과정을 거친 표피 표본이다. 도 10의 (B)의 표본은, 본 발명에 의한 생체조직 투명화 공정에 의해서 투명화율이 투명화 전보다 약 216% 향상된 것을 확인할 수 있다.
(5) 표피 내 목표 구조물의 온전한 3차원적 영상화
굴절계수보정 과정까지 마친 피부 시료 내 신경섬유의 온전한 3차원 구조를 공초점레이저현미경(confocal laser scanning microscope)을 이용하고, 공초점레이저현미경의 z-stack imaging 기능을 통해 PGP9.5 항체로 면역형광염색된 사람 표피 시료 내부의 단층 스캔 정보를 집적하여, 온전한 표피 내 말초신경의 고해상도 3차원 구조 영상을 구현할 수 있다. 그 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11의 (A)는 PGP9.5 항체가 선택적으로 결합한, 표피 내 말초신경섬유다발들 전체의 온전한 입체 구조를 영상화한 결과이며, (B)는 표피 내 DAPI 염색에 양성인 즉 세포핵(nucleus)이 존재하는 기저층부터 과립층까지의 표피를 나타낸 영상이다. 그리고 (C)는 (A)와 (B)에서 각각 표현된 PGP9.5와 DAPI에 양성을 보인 영상을 합친 merged image이며, (D)는 이미지 (C)의 x축 좌표 값(도 11의 (C)에서 x=100, 200, 300㎛)에 해당되는 표피 단면(y-z planes) 내 말초신경섬유의 분포 양상을 나타낸 것으로, 해당 y-z 면의 가장 아래쪽이 표피-진피 경계부이며, 가장 윗쪽이 표피의 바깥쪽이고, z축 지표값은 표피의 깊이에 해당된다(파란색 선: 도 11의 (C)에서 z=40㎛에 해당).
도 11를 살펴보면, PGP9.5 와DAPI 형광신호영상들을 이용하여, 표피의 기저부에서 상부로 주행하는 표피 내 말초신경들의 입체적인 분포 및 형상을 확인할 수 있다(도 11의 (A)). 특별한 피부병변이 없는 사람 표피 표본에서 DAPI는 핵이 없는 각질층을 제외한 표피의 전 층에 염색이 되며, 사람 표피 특유의 고랑(furrow) 및 언덕(ridge)이 교차되는 굴곡 형상들이 관찰된다[도 11의 (B)]. 표피 내 말초신경의 주행경로가 표피-진피 경계부위에서 시작하여 표피의 과립층(granular layer)에서 끝나기에, DAPI가 염색된 도 11의 B 영상은 표피 내에서 말초신경들이 분포할 수 있는 공간을 선택적으로 나타내고 있다. 따라서 PGP9.5 및 DAPI의 결합 이미지인 도 11의 C에서 일부 존재할 수 있는 비특이적인 형광신호들을 배제할 수 있다. 또한, 제작한 표피 내 말초신경의 3차원 영상을 무작위적으로 재분할하여, 기존의 진단기준에서 활용한 피부의 2차원 단면 이미지를 얻을 수 있다[도 11의 (D)].
따라서, 본 발명에 의해 얻어진 3차원 영상 정보를 활용하는 것은, 기존의 정보 왜곡 및 소실이 발생할 수 있는 제한된 평면정보만을 활용하는 것을 개선하여, 피부 조직 내에 위치한 특정 구조물의 온전한 공간 정보를 제시함으로써 이를 활용한 보다 정확한 진단 및 평가 도구로 활용할 수 있다는 데에 의의가 있다.
(6) 표피 내 목표 구조물의 3차원적 영상의 정량분석(quantitative analysis)
사람 표피 내 말초신경섬유의 3차원 영상을 정량분석(quantitative analysis)하기 위해, PGP9.5로 염색된 3㎜ 직경의 원형 사람 표피 표본 중, 무작위로 총 3곳에서 촬영한 200배 배율 영상들로부터 (도 12의 A, B, C) 정량 분석을 통해 얻은 결과값들의 평균치를 활용하였다. 영상분석 프로그램을 활용하여, 3차원 영상정보 내에서 개개의 말초신경섬유들의 연속성 및 독립성을 분석하여 표피 내 말초신경섬유밀도를 산출하였고, 그 결과는 도 12에 나타내었다.
(7) 표피 내 신경섬유 3차원 영상화 및 정량분석의 임상적 적용
I) 결절성 양진(prurigo nodularis) 조직의 영상화
피부 병변부위의 표피 내 말초신경섬유밀도가 비병변부에 비해 감소되어 있다고 보고 되어 있는 결절성 양진(prurigo nodularis) 조직을 대상으로 동일한 실시예 1의 피부 조직 투명화 과정을 거쳐 3차원 영상화하였고, 그 결과 도 13에 나타내었다. 도 13을 살펴보면, 3차원 영상화 과정은 병변 주변부(perilesional area, 도 13의 (A))와 병변부(lesional area, 도 13의 (B))로 나누어 진행하였으며, 기존의 보고와 일치하는 결절성 양진 병변부위의 표피 내 신경섬유밀도가 병변 주변부에 비하여 감소한 것을 3차원 영상들간의 비교 및 정량분석수치값의 차이를 통해 확인할 수 있다.
II) 표피 내 멜라닌세포(melanocyte)들의 3차원 영상화
실시예 1에서 4% 파라포름알데하이드(pafaformaldehyde, PFA) 고정액을 이용하여 4℃ 온도로 12시간 이상(또는 over night) 셰이킹 하여 고정화하고, 멜라닌세포에 특이적으로 결합하는 항체인 Melan-A 항체(anti-human melan-A antibody) 및 DAPi로 염색한 것 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 표피 시료를 제조하고, 3차원 영상화하여 도 14에 나타내었다.
도 14에 나타난 영상을 얻은 사람 피부 표본은 고려대학교 의과대학 해부학 시신기증센터 (Korea University Anatomical Donation Program)에 연구 및 교육용 목적으로 기증된 80세 남자 시신(cadaver)의 넓적다리(thigh) 피부에 위치한 색소성 모반(pigmented nevus) 부위에서 생검하였다.
도 14의 (A)는 Melan-A 항체가 선택적으로 결합한, 표피 내 멜라닌 세포들 전체의 온전한 입체 구조를 영상화한 결과이며, (B)는 표피 내 DAPI로 염색된 표피를 나타낸 영상이다. 그리고 (C)는 (A)와 (B)에서 각각 표현된 Melan-A와 DAPI의 merged image이며, 표피 내 멜라닌 세포들의 세포체(cell body) 및 멜라닌세포 수상돌기(melanocytic dendrite) 등 온전한 입체적인 구조 및 분포를 영상화할 수 있음을 확인할 수 있다. (D)는 이미지 (C)의 x축 좌표 값[도 14의 (C)에서 x=18, 52, 72㎛)에 해당되는 표피 단면(y-z planes) 내 멜라닌세포들의 분포 양상을 나타낸 것으로, 해당 y-z 면의 가장 아래 쪽이 표피-진피 경계부이며, 가장 윗쪽이 표피의 바깥쪽이고, z축 지표값은 표피의 깊이에 해당된다(파란색 선: 도 14의 (C)에서 z=17㎛에 해당).
실시예 2
사람 표피 전체를 면역염색하여, 표피 전체 공간 내 말초신경섬유들의 분포 양상을 영상화하기 위해, 임상병리현장에서 가장 흔히 사용하는 H&E(hematoxylin and eosin) 염색 방법 중 eosin(eosin Y) 염색을 앞에서 제시한 선택적 표지자 염색 과정 후에 추가한 후 굴절률정합 및 현미경촬영을 한 것 외에는 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였다.
3차원 영상화된 이미지는 도 15에 나타내었다. 도 15의 (A)와 (C)는, 표피를 eosin 염색한 것이며, 표피의 가장 하부인 기저층에서부터 가시층, 과립층을 거쳐, 가장 상부인 각질층에 이르기까지 전층을 시각화한 것이고, 각질층 특유의 'basket weave' pattern이 두드러지게 관찰할 수 있다. 또한, 도 15의 (B)는, PGP9.5 (녹색) 및 DAPI 염색과 eosin 염색 양상을 영상화 한 것이다. 도 15의 (C), (D), (E)는 3차원 영상 중 y-z 면을 나타낸 것으로 각각 eosin 염색, DAPI 염색, PGP9.5와 DAPI, eosin 염색된 것에 해당한다. 도 15의 (C)와 (D)를 비교하며 살펴보면, DAPI 염색의 경우 표피의 기저층에서부터 과립층까지만 염색이 되며, 정상적인 상태에서는 핵이 없는 각질층은 eosin으로만 염색된 것을 확인할 수 있다. 도 15의 (E)를 살펴보면, 표피 내 말초신경섬유들이 표피-진피 경계부에서부터 DAPI 신호들은 없고 eosin으로만 염색된 부위가 시작되는 각질층 하부까지 주행하는 것을 확인할 수 있다.
이는, 기존의 DAPI 염색이 기저층에서 과립층에 이르기까지 대부분의 표피층을 효과적으로 나타낼 수 있었으나, 정상적으로 핵이 없는 각질층은 염색이 되지 않아 각질층 전층을 영상화하는데 어려움이 있었지만, 본 발명은, eosin 염색으로 표피 전층을 염색할 뿐만 아니라(도 15의 (A) 및 (C)), 표피 내 말초신경섬유들이 분포하는 기저층에서부터 과립층을 DAPI 로 구분지을 수 있으므로[도 15의 (D)], 표피 전체 공간과 표피 내 말초신경섬유들이 분포하는 공간간의 유기적인 관계를 시각화[도 15의 (E)]할 수 있다. 이는 표피 내 말초신경섬유들뿐만 아니라 멜라닌세포 등과 같은 표피 내 목표 구조물들의 '단위 공간' 내 밀도와 같은 정량값을 산출하는 근거를 제공할 수 있다는데 의의가 있다.
Claims (12)
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- 피부를 생검하는 단계;
상기 피부의 표피 조직을 분리하는 단계;
상기 표피 조직을 고정화하는 단계;
상기 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계;
진공상태에서 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계;
전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계;
상기 지질이 제거된 표피 조직에 선택적 표지자를 염색하는 단계;
상기 염색된 표피 조직의 굴절계수를 보정하는 단계; 및
상기 굴절계수가 보정된 표피 조직의 3차원 영상을 촬영하는 단계;
를 포함하고,
상기 고정화된 표피 조직에 히드로겔 단량체 용액을 주입하는 단계; 상기 진공상태에서 상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계; 및 전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계는, 0.5일 내지 2일 동안 수행되는 것인,
피부 조직의 3차원 영상화 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 히드로겔 단량체를 중합하는 단계는, -100 kPa 내지 -50 kPa 압력의 진공 상태 및 20 ℃ 내지 50 ℃의 온도에서 1시간 내지 5시간 동안 상기 히드로겔 단량체를 중합하고,
상기 전기영동에 의해 상기 히드로겔 단량체가 중합된 표피 조직에서 지질을 제거하는 단계는, 10 ℃ 내지 50 ℃의 온도 및 1.0 Å 내지 3 Å의 전류를 일정하게 유지하면서 전기영동에 의해 상기 지질을 제거하고, 1시간 내지 4시간 동안 상기 지질을 제거하고,
상기 선택적 표지자를 염색하는 단계는,
상기 지질이 제거된 피부의 표피 조직에 면역형광표지자를 처리하고, 원심력을 단계적으로 증가시켜 염색하는 것인, 피부 조직의 3차원 영상화 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 선택적 표지자를 염색하는 단계는, 제1 면역형광표지자를 처리하고, 3000 rpm, 3500 rpm, 4000 rpm, 4500 rpm, 5000 rpm 및 5500 rpm의 원심력을 30분 단위로 단계적으로 증가시켜 염색하는 제1 염색 단계; 및
제2 면역형광표지자를 처리하고, 3000 rpm, 3500 rpm, 4000 rpm, 및 4500 rpm의 원심력을 30분 단위로 단계적으로 증가시켜 염색하는 제2 염색 단계; 를 포함하는 것인, 피부 조직의 3차원 영상화 방법.
- 제7항에 있어서,
상기 염색된 표피 조직의 굴절계수를 보정하는 단계는, 용액(refractive index matching solution, RIMS) 내에서 20 ℃ 내지 25 ℃에서 0.5시간 내지 1.5시간 동안 상기 염색된 표피 조직의 굴절계수를 보정하는 것인, 피부 조직의 3차원 영상화 방법.
- 제7항의 방법으로 표피 조직의 3차원 영상을 획득하는 단계; 및
상기 3차원 영상을 분석하는 단계; 를 포함하는,
표피 조직의 3차원 영상을 이용한 진단 및 평가방법.
- 제11항에 있어서,
상기 진단 및 평가방법은, 말초신경병, 피부 색소질환, 피부노화, 표피의 병적인 변화가 수반되는 피부질환들 중 1종 이상을 진단 및 평가하는 것인, 진단 및 평가방법.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023029425A1 (zh) * | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 西湖大学 | 一种生物组织透明膨胀方法和成像方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011047726A (ja) * | 2009-08-26 | 2011-03-10 | Kyoto Univ | 皮膚バリア機能の測定方法 |
| KR20150043241A (ko) * | 2012-08-09 | 2015-04-22 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 | 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물 |
| KR20150071856A (ko) * | 2013-12-19 | 2015-06-29 | 코웨이 주식회사 | 지질 염색을 이용한 피부의 장벽 기능 평가방법 |
| KR20160058900A (ko) * | 2013-09-20 | 2016-05-25 | 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 온전한 전체 조직의 표현형분석을 위한 방법 |
-
2017
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2011047726A (ja) * | 2009-08-26 | 2011-03-10 | Kyoto Univ | 皮膚バリア機能の測定方法 |
| KR20150043241A (ko) * | 2012-08-09 | 2015-04-22 | 더 보드 오브 트러스티스 오브 더 리랜드 스탠포드 쥬니어 유니버시티 | 현미경적 분석을 위한 생물학적 표본을 준비하기 위한 방법과 조성물 |
| KR20160058900A (ko) * | 2013-09-20 | 2016-05-25 | 캘리포니아 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 온전한 전체 조직의 표현형분석을 위한 방법 |
| KR20150071856A (ko) * | 2013-12-19 | 2015-06-29 | 코웨이 주식회사 | 지질 염색을 이용한 피부의 장벽 기능 평가방법 |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2023029425A1 (zh) * | 2021-09-01 | 2023-03-09 | 西湖大学 | 一种生物组织透明膨胀方法和成像方法 |
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